KR20040087054A

KR20040087054A - 비피더스 유래의 프로모터 유전자를 이용한비피도박테리움에서 외래 유전자 발현 시스템

Info

Publication number: KR20040087054A
Application number: KR1020030021294A
Authority: KR
Inventors: 지근억; 박명수; 조상희
Original assignee: 주식회사 비피도
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2003-04-04
Publication date: 2004-10-13
Also published as: KR100539059B1

Abstract

본 발명은 인간과 동물의 장내 세균중 유익균으로 알려진 비피도 박테리아 (Bifidobacteria)에서 분리한 플라스미드와 강력한 프로모터를 이용하여 외래 유전자 발현 유용한 단백질을 생산하기 위한 외래 유전자 발현 벡터 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 유전자 발현을 위하여 비피도박테리움에서 유래한 베타-갈락토시다제 유전자 (β-galactosidase gene)의 프로모터와 리보좀 결합부위(RBS)를 포함하는 신규한 벡터 및 16S rRNA의 프로모터와 리보좀 결합부위를 포함하는 신규한 벡터 및 이를 이용한 외래 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.및 이를 이용한 외래 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.

본 발명은 비피더스 유래의 강력한 프로모터가 도입된 비피더스 발현벡터를 개발하였으며 여기에 유용한 외래 유전자를 도입하여 비피도 박테리움을 형질전환시킴으로서 유용한 단백질의 생산을 통한 기능성 유산균의 개발 및 이를 이용한 제품을 만드는 데 기반기술을 제공할 수 있을 것이다.

Description

비피더스 유래의 프로모터 유전자를 이용한 비피도박테리움에서 외래 유전자 발현 시스템{FOREIGN GENE EXPRESSION SYSTEM IN Bifidobacterium species USING BIFIDUS PROMOTER GENE}

본 발명은 인간과 동물의 장내 세균중 유익균으로 알려진 비피도 박테리아 (Bifidobacteria)에서 분리하여 개발한 플라스미드 벡터인 pBES2를 이용하여 유용한 단백질을 생산하기 위한 외래 유전자 발현 벡터 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 유전자를 효율적으로 발현하기 위하여 비피도박테리움의 베타-갈락토시다제 유전자 (β-galactosidase gene)의 프로모터와 리보좀 결합부위(RBS) 및 16S rRNA의 프로모터와 리보좀 결합부위(RBS)를 포함하는 신규한 벡터 및 이를 이용한 외래 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.

비피도박테리움은 인간, 동물, 곤충 등의 장내에서 살아가는 미생물로 티시어(Tissier)에 의해 처음으로 발견되었다. 비피도박테리움은 그람양성, 절대혐기성, GC-rich 등의 특성을 가지며 모유아의 장내의 우세균총으로 발견된다. 비피도박테리아는 잘 알려진 유산균 계열인 락토바실라이(lactobacilli), 락토코카이 (lactococci)등 과는 다른 액티노마이세스 (Actinomycetes)계열로 코리네박테리아(Corynebacteria) 나 스트렙토마이세스(Streptomyces), 미코박테리아(Mycobacteria) 등과 분류학적으로 가깝게 위치한다. 또한 유산 생성균주로써 대사산물로 젖산:아세트산을 3:2비율로 생산하며, pH의 조절을 통해 외래 침입 병원균을 막아주는 역할을 한다. 이러한 특성들은 장내 정상균총의 균형을 유지하는데 주요 역할을하는 것으로 알려졌다. 비피도박테리움으로 발효한 우유를 섭취하였을 때 유당불내증을 완화시키는 작용이 있고, 최근 연구에 따르면 콜레스테롤의 저하, 면역기능 강화, 항암활성 등 의 유용한 기능이 알려져 있다. 또한 장 점막에 흡착력이 우수하며 세계적으로 관심이 증가하고 있으며 비피도박테리움을 이용한 유제품개발에 열기가 높아가고 있다.

현재까지 비피도박테리움의 연구방향은 균주의 동정 및 계수, 스크리닝 방법 개발, 내산, 내담즙성, 박테로신 등을 분비하는 균주의 스크리닝, 균주 자체 생화학적 특성 분석, 비피도박테리움 유래의 플라스미드 분석과 특징적인 효소의 클로닝 및 생화학적 분석 등이 주류를 이루고 있다. 또한 인간과 동물의 장내에 서식하는 젖산 균주들에서 유전자의 발현과 벡터 시스템의 개발 및 유전적 특성에 관한 연구가 발표되고 있으며 특별히 유산균주 중에서 락토콕사이(lactococci),락토바실라이(lactobacilli) 등의 유산균 분야에서 활발히 연구가 진행되고 있다.

1970년대 락토콕사이(lactococci)에서 유용한 기능을 코딩하고 있는 플라스미드가 동정되고 분석되었으며, 1980년대 유전자 재조합 기술의 발달과 함께 유산균주 들의 대사에 관련된 여러 유전자가 분석되었다. 이 시기부터 유산균에서 분자생물학적 수준에서의 연구가 시작되기 시작하였다. 유산균주와 장내세균들의 축적된 이해를 바탕으로 공업적으로 좀더 효율적인 균주의 개량과 돌연변이 연구가 계속적으로 진행되어 왔다. 일반적으로 장내세균에서 플라스미드가 많이 발견되고 있지만 비피도박테리움에서는 드물게 발견되며 발견되는 것들은 대부분 작은 크기의 플라스미드를 보유하는 것으로 알려져 있다.

현재 유산균에서는 플라스미드 벡터를 이용하여 IL-2, lL-12, 성장인자 (growth factor), 박테리오신 (bacteriocin) 등 다양한 유용한 단백질 생산한다. 이는 기존의E. coli에서 단백질발현 시스템을 유산균으로 전환 시킨 것으로 식품화 가능한 단백질 생산의 가능성을 제시하고 있다. 그러나 유산균 계열에 비하여 비피도박테리아 (Bifidobacteria)는 장 점막세포를 자극하는 성질이 우수하여 뛰어난 면역활성 기능을 갖는 것으로 보고되고 있다.

비피도박테리움에서 플라스미드를 보유하는 것으로 알려진 균주는B. breve, B. longum, B. asteroides, B. indicum, B. globosum등이 있다. 그러나 비피도박테리움에서 발견되는 플라스미드들이 가지는 기능은 아직 명확하지는 않으며 좀 더 연구가 필요하다. 비피도박테리움에서 플라스미드의 연구는 스고바티 비 일동(Sgorbati Bet al.)에 의하여 시작되었다.B. longum,B. asteroides에서는 다중 플라스미드가 일반적으로 발견되며B. globosum, B. indicum의 약 60%는 하나의 플라스미드를 보유하고 있다.B. longum에서 약 123 균주의 플라스미드 특징을 서던 블로팅 (Southern blotting)으로 분석하였을 때 유사한 구조를 이루고 있음이 확인 되었다(Sgorbati B et al. 1982). 그 플라스미드 중 pMB1 (1.9 Kb)이B. longum에서 분리되었으며 분석되었다. 또한E. coli와의 셔틀벡터로 pMR3, pDG7이 만들어 졌으며 암피실린(ampicillin), 크로람페니콜(chloramphenicol) 저항 유전자를 보유하고 있다(Matteuzzi D. 1990). pRM2 역시E. coli-B. longum셔틀벡터로엔테로코칼 스펙티노마이신(enterococcal spectinomycin) 저항 유전자를 보유하고 있다(Missich R. 1994).pMB1 레플리콘(replicon)을 바탕으로 pLF5(chloramphenicol), pCLJ15(erythromycin), pSPEC1(spectinomycin) 등이 개발되었다. 현재 우리나라에서는B. longum KJ로부터 pKJ50,pKJ36 이 스크리닝 되었으며 셔틀벡터인 pMS50, pMS36으로 구축되었고 되었다. (Park et al. 1997)

현재까지 비피도박테리아에서 트랜스알돌라제 (transaldolase), -glucosidase(알파-글루코시다제), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase), 프럭토즈-6-포스패이트(fructose-6-phosphate) 포스포케토라제(phosphoketolase), L-락테이트 디하이드로게나제(L-lactate dehydrogenase), 담즙산염 하이드로라제(bile salt hydrolase) 등이 클로닝되고 분석되었다. 또한 센 프로모터 (strong promoter)를 보유하는 유전자의 프로모터를 이용하여 다른 유전자의 발현에 이용하는 것으로, 베타-갈락토시다제(β -galactosidase) 유전자로부터 프로모터 부분을 분석한 후 자가 클로닝을 하여 유당을 유일한 탄소원으로 이용할 수 없는 영양요구체 비피도박테리아에서 유당을 이용할 수 있게 한 연구가 있었다. (Nucleotide sequence, expression and transcriptional analysis ofthe Bifidobacterium longum MB 219 lacZ gene. Rossi M, Altomare L, Gonzalez Vara y Rodriguez A, Brigidi P, Matteuzzi D. Arch Microbiol 2000 Jul-Aug;174(1-2):74-80 ). 그러나 아직까지 비피도박테리아에서 외래 유전자 발현에 관한 연구는 보고 되고 있지 않다.

본 발명은 비피도 박테리움에서 유래한 베타-갈락토시다제 유전자의 프로모터 부분의 염기서열 및 16S rRNA 유전자의 프로모터 부분의 염기서열을 제공하는데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 염기서열 및 리보좀 결합 부위를 클로닝하여 이를 비피도박테리아에서 분리한 플라스미드 벡터인 pBES2에 도입한 신규한 발현 벡터 pBESBR1 및 pBES16PR를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 발현벡터에 외래 유전자를 융합시킨 신규한 발현벡터인 pBESBR1-CHOL, pBESBR1-ENDO 및 pBES16PR-CHOL를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 벡터로 형질 전환된 비피도박테리아 등의 미생물체에서 유용한 외래 유전자를 발현케 하는 유용한 외래 유전자의 생산방법을 제공하는 데에 있다.

도 1 은 비피도박테리움 유래의 베타-갈락토시다제 유전자의 프로모터 및 리보좀 결합부위를 포함하는 발현벡터 pBESBR1의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 2 는 비피도박테리움 유래의 16S rRNA 유전자의 프로모터 및 리보좀 결합부위를 포함하는 발현벡터 pBES16PR의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 3 은 발현벡터 pBESBR1-ENDO 및 pBESBR1-CHOL의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 4 는 발현벡터 pBES16PR-CHOL의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 5 는 발현벡터 pBESBR1-ENDO로 형질전환시킨 비피도박테리움에서 웨스턴 브로팅을 이용하여 인간 유래의 엔도스타틴 유전자의 발현정도를 실험한 결과이다.

도 6 은 발현벡터 pBESBR1-CHOL로 형질전환시킨 비피도박테리움에서 Amplex TM red Cholesterol Assay Kit을 이용하여 콜레스테롤 산화효소의 발현정도를 실험한 결과이다.

도 7 은 발현벡터 pBES16PR-CHOL로 형질전환시킨 비피도박테리움에서 Amplex TM red Cholesterol Assay Kit을 이용하여 콜레스테롤 산화효소의 발현정도를 실험한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 서열 1 및 서열 2에 개시된 비피도 박테리움에서 클로닝한 베타-갈락토시다제 및 16S rRNA의 프로모터 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리아에서 분리한 플라스미드 벡터인 pBES2에 이 프로모터 부분 및 리보좀 결합 부위가 코딩된 DNA를 클로닝한다. 이때, 비피도 박테리아에서 유래한 베타-갈락토시다제 유전자가 삽입된 벡터를 주형으로 하고 하기의 서열을 시발체로 하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 한다.

정방향 시발체(GAL-f) : 5' CCGCTCTAGACGTGGAGTTTGCGG 3',

역방향 시발체(GAL-r) : 5' TCATGGTACCTCCTTTGTTTTTTGTTAGC 3'

정방향 시발체는XbaI 부위가 존재하고, 역방향 시발체는KpnI 부위가 존재하도록 디자인 하였다.

또한, 본 발명은 비피도박테리아에서 분리한 플라스미드 벡터인 pBES2에 비피도 박테리아에서 유래한 16S rDNA의 프로모터 유전자 및 리보좀 결합 부위가 코딩된 DNA를 클로닝한다.

이때, 클로닝하는 과정은 아래와 같다.

비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 공지의 16S rDNA의 5'부분의 염기서열로부터 상류방향으로 시발체를 제작하여 PCR을 통해 16S rDNA 프로모터 부분을 클로닝하고, 염기서열을 분석하였다. 이 염기서열 및 발현을 위해 16S rDNA 서열로부터 리보솜 결합부위를 찾아낸 후 프로모터의 다음에 리보솜 결합부위가 위치하도록 디자인 하였다.

이들 시발체를 이용하여 PCR을 통하여 베타-갈락토시다제 프로모터 유전자 및 16S rRNA 프로모터 유전자를 증폭한 후 이 증폭된 유전자 및 pBES2 셔틀벡터를 동일한 제한효소로 처리한 후 결합 등의 공지의 방법을 통하여 결합 혼합물을 생성하였다. 그 후 이를 대장균에 형질전환 시켜서 최종적으로 본 발명의 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 벡터를 구성하였다.

이때 사용된 pBES2 셔틀벡터는 특허 출원 제 2001-0009526호에 개시된 바와 같이, 상업용E. coli벡터인 pUC19과B. longumMG1에서 분리한 pMG1을PstI site로융합시켜 구성된 셔틀벡터이다. 이 pBES2는 약 7.6 Kb 크기이며 pUC19에서 유래한 암피실린 저항 유전자와 스테필로코코스(Staphylococcus)에서 유래한 클로람페니콜 저항유전자가 코딩되어 있다.

본 발명의 유전자 발현벡터의 작동 유무를 확인하기 위하여 외래 유전자 발현시켰다. 발현하고자 하는 외래 유전자란 인간의 단백질을 포함하여, 질병치료에 사용되거나, 또는 산업적으로 이용이 가능한 모든 단백질을 의미하고, 본 발명의 실시 예에서는 항암 활성을 갖는 인간 유래의 엔도스타틴(endostatin)과 콜레스테롤의 저하기능을 갖는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)유래의 콜레스테롤 옥시다제 (cholesterol oxidase) 유전자를 사용하여 베타 갈락토시다제 프로모터 유전자 및 16S rRNA 프로모터 유전자의 리보좀 결합 부위가 포함된 부분 이하에 외래 유전자를 융합하여 발현시켰다.

이들 외래 유전자는 각각의 시발체를 합성한 후 중합효소 연쇄 반응으로 이들을 증폭시키고 이와 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터를 각각 동일한 제한 효소를 처리한 후 결합하여 각각 외래 유전자를 함유하는 발현벡터를 구성하였다. 이들 결합 혼합물을E. coli에 형질전환 시킨 후 각각의 외래 유전자가 들어있는 클론을 스크리닝하여 클론에서 플라스미드를 획득하였다.

획득한 플라스미드의 외래유전자 발현 유무를 확인하기 위하여, 이들을 비피도박테리움, 대장균, 유산균, 효모 등 적당한 세포를 형질전환 시킨 후, 상기 발현벡터의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고 각각의 유전자 발현을 분석하였다. 단백질의 생성여부는 효소의 역가를 측정하거나 웨스턴 블롯팅 등의 방법을 이용하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하면 하기와 같다. 하기의 실시예들은 구체적인 설명을 하기 위하여 제고되는 것일 뿐이고 본 발명의 범위를제한하지는 않는다.

하기 실시예에 사용된 실험방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

주형 DNA 1㎕, dNTP 혼합용액(dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 5㎕, 2배 GC 중합효소 완충용액 25㎕, 정방향 및 역방향 시발체 각각 50 pmole 및 Taq 중합효소 (LA Taq, TAKARA, Japan) 0.5㎕에 탈이온수 17.5㎕를 가하여 총 부피를 50㎕로 하여 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

[참조예 2]

결합 반응 (ligation)

벡터 DNA 0.5㎕, 삽입 DNA 1㎕, T4 DNA 리가제 완충용액 1㎕, 및 T4 리가제 1㎕ 에 탈이온수 6.5㎕을 첨가하여 총 부피를 10㎕로 한 후 16 에서 12시간 결합 반응을 수행하였다.

[참조예 3]

발현 벡터의 획득

각각의 결합 혼합물을E. coliDH5 로 CaCl2법으로 형질전환시켜서 LB플레이트(Luria-bertani 브로쓰에 1.5 % 아가 및 암피실린 50㎍/㎖ 포함)에 도말하여 37 에서 12시간 정치 배양하여 형질전환체를 얻고, 이중 삽입 DNA가 들어 있는 클론을 스크리닝하여 각각의 클론에서 플라스미드 벡터를 획득하였다.

[참조예 4]

비피도 박테리움에서 외래 유전자 발현의 분석

각각의 외래 유전자가 융합된 발현 벡터를 가지는 형질전환체를 0.05% L-시스테인를 함유한 MRS 배지에서 배양한 후 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 수확하였다. 세포 펠렛은 PBS (pH7.4)로2회 세수한 후 PBS 400㎕에 현탁하여 초음파 파쇄하였고 그 후 1,400rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 분석을 위하여 새 마이크로퓨지 튜브에 옮겼다.

[실시예1]

비피도 박테리아 유래의 베타-갈락토시다제 프로모터 유전자를 이용한 발현벡터 pBESBR1의 제조

비피도박테리움에서 유래한 베타-갈락토시다제(약 3.2kb) 유전자를 셧 건 클로닝 (shot gun cloning) 방법으로 pBR322의EcoRI 부위에 삽입하여 pBIG를 구성하였다. 비피더스 유래의 베타-갈락토시다제 유전자 염기서열은 특허출원 10-2001-0045531에 공지된 바와 같다. 그 후 비피도 박테리움으로부터 유래한 베타-갈락토시다제 유전자의 프로모터 부분과 리보좀 결합 부위 부분을 pBES2에 클로닝하기 위하여 PCR 하였다. 이때, pBIG를 PCR 주형으로 사용하였고, 사용된 시발체는 다음과 같다.

정방향 시발체(GAL-f) : 5' CCGCTCTAGACGTGGAGTTTGCGG 3',

역방향 시발체(GAL-r) : 5' TCATGGTACCTCCTTTGTTTTTTGTTAGC 3'

정방향 시발체에는XbaI 부위가 존재하도록 디자인하였고, 역방향 시발체에는KpnI 부위가 존재하도록 디자인한 후 참조예 1과 같은 PCR을 1. 95 에서 5분, 2. 95 에서 30초, 3. 40 에서 1분, 4. 72 에서 1분 30초, 5. 72 에서 10분, 6. 4 로 진행 한 후 2-4번을 30번 반복하였다.

PCR 후 Wizard PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고XbaI 과KpnI 을 처리하였다. 또한, pBES2 역시 같은 제한효소로 처리하고 겔 DNA 정제 키트(GelDNA purification kit, QIAXII, Qiagen)를 이용하여 정제한 후 송아지 장에서 분리한 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 다음 단계로 참조예 2와 같이, 벡터 DNA와 삽입 DNA의 결합반응을 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이 수행하여 베타-갈락토시다제 유전자의 프로모터 부분 및 리보좀 결합 부위가 코딩된 300 bp DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였고, 최종적으로 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 비피도박테리아 발현벡터인 pBESBR1을 구성하였다. 이는 도 1에 도시된 바와 같다.

[실시예 2]

비피더스 유래의 16S rRNA 프로모터의 클로닝과 이를 이용한 비피더스 발현벡터pBES16PR의 제조 (도 2 참조)

비피도 박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)의 염색체 DNA를 준비하여 이를PstI 으로 처리하고 겔 퓨리피케이션 (gel purification)으로 다시 정제하였다.

pUC19 플라스미드 벡터 또한 같은 효소로 처리한 후 (plasmid vector pUC19 20 ul, 10X 완충용액 3 ul, 제한효소 1 ul, 탈이온수 6 ul), 겔 퓨리피케이션 (gel purification)으로 정제하였고, 다시 탈인산화 반응을 실시하였다. (pUC19 20 ul, 완충용액 3 ul, 탈인산화 효소 1 ul, 탈이온수 6 ul)

다음 단계로 참조예 2와 같이, 준비한 DNA와 탈인산화된 pUC19 벡터의 결합 반응을 수행하여 이 결합물을 주형으로 사용하고, pUC19 벡터에서 이용하는 M13 정방향 시발체와 16P 클로너 역방향시발체 (cloner primer)로 하여 참조예 1과 같은 PCR을 95 30 초, 48 30 초, 72 2 분씩 30 번 반복하였다.

PCR 결과 약 1.2 Kb 크기의 DNA 단편이 증폭되었고, 이 단편을 겔일루션 (gel elution) 하여 pGEM T easy 벡터 (미국 Promega, USA에서 획득)에 참조예 2과 같이 결합반응을 수행하였다. 결합 조건은 참조예 2와 동일하나, 삽입 DNA 1.5 ul, 벡터 0.5 ul, 2 X 완충용액 5 ul, T4 DNA 리가제 0.5 ul, 탈 이온수 2.5 ul를 사용하여 25 , 2 시간 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이, 형질전환을 수행하여 바르게 형질전환된 대장균 클론을 스크리닝 한 후 염기서열을 분석하여 약 600 bp 정도의 16S rDNA의 프로모터 부분을 클로닝 및 염기서열분석을 하였다.

이 염기서열을 바탕으로 정방향 시발체인 16XF2 (XbaI site 함유)를 디자인하였다. 또한 16S rDNA 서열로부터 3' 끝에 위치한 Shine-Dalgarno 서열 (리보좀 결합 부위)를 찾았고 이를 클로닝한 16S rDNA 프로모터 부분을 하류로 두기위해 16 RBS 역방향 시발체 (BamHI site 함유)를 디자인하였다. 본 실험에 사용된 시발체의 서열은 다음과 같다.

16P cloner: 5'- TGATGGATCCCGTTCGAATTCCATGTGTTAAGCACG C-3'

16XF2: 5'-GATCTCTAGATAATGGTTCTTATCGGTGTACTGG-3'

16RBS: 5'-TTCGGGATCCACCTCCTTTCTACGCCGCCAGCGTTCATCC-3'

상기한 시발체를 이용하여 참조예 1과 같이 PCR 한 후 Wizard PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고XbaI및BamHI을 처리하였다. 또한, pBES2 벡터 역시 같은 제한 효소로 처리한 후 겔 DNA 정제 키트(Gel DNA purification kit, QIAXII, Qiagen)를 이용하여 정제한 후 송아지 장에서 분리한 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 다음 단계로 참조예 2와 같이, 벡터 DNA와 삽입 DNA의 결합반응을 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이, 수행하여 16S rRNA 유전자의 프로모터및 리보좀 결합 부위가 삽입되었음을 확인하였다. 최종적으로 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 비피도 박테리아 발현벡터인 pBES16PR을 구성하였고 이는 한국미생물보존센터에 2002년 11월 27일자에 기탁하였고, 기탁번호는 KCCM -10451이다.

[실시예 3]

외래 유전자의 준비

본 발명의 발현벡터인 pBESBR1 및 발현벡터인 pBES16PR의 작동 유무를 확인하기 위하여 외래유전자를 비피도박테리움에서 발현시켜보았다. 외래유전자로는 인간 유래의 엔도스타틴 유전자(0.55 Kb)와 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 콜레스테롤 산화효소 유전자를 사용하였다.

[실시예 3-1]

인간 유래의 엔도스타틴 유전자의 준비

인간 유래의 엔도스타틴 유전자는 약 0.55 Kb의 크기(GeneBank accession number: AF184060)이며 pET-15b에 클로닝되어 있는 것을 사용하였다. 먼저 유전자를 PCR하기 위하여 다음과 같이 시발체를 디자인하였다.

정방향 시발체 (ENDO-f):

5'GATCGGTACCATGCACAGCCACCGCGACTTCC3'

역방향시발체 (ENDO-r):

5'TATGGAATTCTCACTACTTGGAGGCAGTCATG3'

정방향 시발체에는KpnI site, 역방향 시발체에는EcoR I site가 들어가도록 디자인하여 번역 시작코돈 부위인 ATG부터 종료 코돈까지 PCR을 하였다. PCR의 조건은 참조 예1과 동일하나, 주형을 0.5㎕사용하고, 탈이온수 대신 탈이온화 중류수를 18㎕사용하여 진행하였고, 43 에서 1분동안 아닐링하였다.

PCR 후 DNA 단편을 위자드 PCR 정제 키트 (wizard PCR purification kit, Promega, USA)로 정제하고KpnI과EcoR I 제한효소로 처리하였다.

[실시예 3-2]

콜레스테롤 산화 효소 유전자의 준비

스트렙토마이세스 유래의 콜레스테롤 산화 효소 유전자가 코딩되어 있는 벡터인 pCO100-A를 PCR 주형으로 사용하였다. 콜레스테롤 산화 효소 유전자의 경우 choA (GeneBank accession number : J03356)와 choP(M31939)의 2가지이며 오페론을 이루고 있다.

정방향 시발체(CHOL-f)

: 5'AAGGGGTACCATGACCCAGGCTGCGCCGGTGACC3'

역방향 시발체(CHOL-r)

: 5'CGGTGAATTCTTACTACGCCGTGACGTCCTGCTTG3'

정방향 시발체에는KpnI site, 역방향 시발체에는EcoR I site가 들어가도록 디자인하여 choA의 시작코돈부터 choP의 종료 코돈까지 PCR 하였다. PCR의 조건은 실시예 2-1과 동일하게 진행하였고 45 에서 2분간 아닐링 하였다.

PCR후 DNA 단편을 겔 정제 키트(Gel purification Kit QIAXII, Qiagen)로 정제하고KpnI과EcoR I 제한효소로 처리하였다.

[실시예 4]

외래 유전자와 pBESBR1이 결합된 pBESBR1-ENDO 및 pBESBR1-CHOL의 구성 (도 3 참조)

KpnI과EcoR I으로 처리된 엔도스타틴 과 콜레스테롤 각각의 유전자와 KpnI과 EcoRI으로 처리되고 CIAP로 탈인산화된 pBESBR1을 결합시켰다. 이때, 외래유전자는 비피도박테리움에서 클로닝한 베타-갈락토시다제 유전자의 프로모터 부분 및 리보좀 결합부위가 포함된 약 300 bp DNA 부분 이하에 융합되었다.

결합 조건은 참조예 2와 동일하나, 삽입 DNA 0.5㎕ 및 탈이온수 5.5 ㎕을 사용하여16 에서 12 시간 수행하였다.

참조예 3의 방법으로 각각의 클론에서 플라스미드를 획득하였고, 이를 각각 pBESBR1-ENDO 및 pBESBR1-CHOL로 명명하였다.

[실시예 5]

외래 유전자와 pBES16PR이 결합된 pBES16PR-CHOL의 구성 (도 4 참조)

BamHI과EcoR I으로 처리된 콜레스테롤 유전자와BamHI과EcoRI으로 처리되고 CIAP로 탈인산화된 pBES16PR을결합시켰다. 이때, 외래유전자는 비피도박테리움에서 클로닝한 16S rDNA promoter 부분 및 리보좀 결합부위가 포함된 약 600bp DNA 부분 이하에 융합되었다.

참조예 3의 방법으로 각각의 클론에서 플라스미드를 획득하였고, 이를 각각 pBES16PR-CHOL로 명명하였다.

[실시예 6]

비피도 박테리움으로 형질전환

비피도 박테리움을 0.05% L-시스테인 및 0.2M 슈크로스가 포함된 MRS 배지에 접종하여 OD600 0.2 까지 37 에서 혐기성 조건으로 배양하였다. 상기 배양액을 6,000 rpm으로 10분동안 원심분리하고 0.2M 수크로스 용액으로 2회 수세한 후 최초 배지 부피의 1/320의 0.2M 수크로스 용액에 재현탁하여, 비피도 박테리아의 컴피턴트(competent)세포를 제조하였다. 상기 컴피턴트 세포 약 80 ul를 새 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)에 옮긴후 각각 1 ug DNA (pBESBR1-ENDO, pBESBR1-CHOL 및 pBES16PR-CHOL)를 넣고 잘 섞어준 후 2.0 KV, 25 uF, 200 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행하였다. 펄스를 준 후 0.05% L-시스테인, 0.2M 슈크로스가 포함된 미리 가열된 MRS 배지 800ul와 섞어 37 에서 3시간 정치배양한 후 0.05% L-시스테인, 0.2M 슈크로스 및 3㎍/ml 클로람페니콜에 도말하고 5일간 혐기 배양하여 수득된 형질전환체 중 몇 개의 콜로니를 선택하여 외래유전자 발현 분석에 사용하였다.

[실시예 7]

pBESBR1-ENDO 벡터로 형질전환된 비피도박테리움에서 인간 유래의 엔도스타틴 유전자 발현 분석

참조예 4와 같은 방법을 이용하여 pBESBR1-ENDO로 형질전환된 형질전환체를 초음파 파쇄하여 원심분리후 상징액을 웨스턴 블로팅(western blotting)하였다. 웨스턴 블로팅은 일반적인 Sambrook et al 방법으로 하고, 엔도스타틴에 대한 제 1 항체로는 토끼유래의 항 인간 엔도스타틴 항체를 사용하고, Amersham parmercia의 ECL 키트를 사용하였고, 그 결과는 도 3과 같다.

도 5 에서 알 수 있듯이, 웨스턴 블로팅 결과 양성 대조군인 인간 유래의 엔도스타틴과 유사한 밴드를 얻을 수 있었으며, 음성 대조군인 pBESBR1 벡터를 갖는 비피도 박테리움에서는 이러한 밴드를 발견할 수 없었다.

[실시예 8]

pBESBR1-CHOL 벡터 및 pBES16PR-CHOL 벡터로 형질전환된 비피도박테리움에서 스트렙토마이세스 유래의 콜레스테롤산화효소 유전자 발현분석

참조예 4와 같은 방법을 이용하여 pBESBR1-CHOL 및 pBES16PR-CHOL 벡터로 형질전환된 형질전환체를 초음파 파쇄하여 원심분리후 그 상징액을 콜레스테롤 산화효소 분석하기 위하여 AmplexTM Red Cholexterol Assay Kit (Molecular Probes. USA)를 사용하여 그 프로토콜에 따라 수행하였다. 이 키트는 콜레스테롤 산화효소 존재시 분홍색 발생을 하는데, 이를 pBESBR1-CHOL 및 pBES16PR-CHOL 벡터로 형질전환시킨E.coli와 비교시 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이,E.coli에서 발현시켰을 때 보다 비피도 박테리움에서 발현시 훨씬 높은 발현정도를 나타냄을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 비피도박테리움 유래의 베타-갈락토시다제 및 16S rRNA 유전자의 프로모터 및 리보좀 결합부위를 포함한 벡터를 제조하여 여기에 유용한 외래 유전자를 삽입하여 외래 유전자를 함유하는 발현벡터를 제조한 후 이를 이용하여 비피도 박테리움을 형질전환시킴으로서 비피더스에서 유용한 단백질의 생산을 할 수 있었다. 이와 같은 연구결과는 다양한 유용 유전자에 응용하여 기능성 유산균의 개발과 제품을 만드는 데 이용할 수 있을 것이다.

<110> BIFIDO CO., LTD. <120> FOREIGN GENE EXPRESSION SYSTEM IN BIFIDOBACRTERIUM SPECIES USING BIFIDUS PROMOTOR GENE <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 309 <212> DNA <213> Bifidobacterium sp. <400> 1 tctagacgct tccgacgtgg agtttgcggc aaccgccgaa tatcatgcct ggctcaagca 60 gggccgtcag cttccggcgt tcatgtattc caagaaggaa cgtcagcagc tcggcatcga 120 agcctgattt cattcagttt cagtttccgg cttctgtata cgaaaagacg tcttttcgat 180 tgtgttttgc aacacatctg aaagacgtct ttttgtttat gttgtttgat ttctgggatt 240 tggacttgcg gtaattgtcg tcaaaagata aatttgttag ggaagctaac aaaaaacaaa 300 ggaggtacc 309 <210> 2 <211> 594 <212> DNA <213> Bifidobacterium sp. <400> 2 tctagataat ggttcttatc ggtgtactgg accaatgatg attccgataa ttggcggtgc 60 gccgcatgcg ccgtaagagg tgattcgcga cacgcccatc ggccaaattt ttcaatccgt 120 ttttcgacga tgtccggttc tggactgaag atatgggcgt gcgaaacgtc gatttcgaca 180 cgccgatgga acgccgtcgt ttcaacgatt ctggcgtgtt ttttcatgcc tgatttgcgc 240 gagtccgcga atgcgtgtaa gttatctcct tgctgccgct cagcgagtgg ttctccttcc 300 ggagggctgc gaggtgggtg agtggtggtg gtttgagaac tcaagagcgt gtttgtacta 360 cttctttata gtcaatgatt gccagttcat tcctcgcctg attgcctgtc gtggtggttg 420 ggtacccggg agggtttgat gaggggtgag gttttttgag ggcgtccttc cttaaggacg 480 tgctcgtcaa tttttgtttt gagagtcatc tattcggatg cttttcatga agttttttgt 540 ggagggttcg attctggctc aggatgaacg ctggcggcgt aaggaggtgg atcc 594

Claims

서열번호 1에 개시된 염기서열로 표시되는 비피도박테리움에서 유래한 베타-갈락토시다제의 프로모터 유전자.
제 1항의 비피도박테리움에서 유래한 베타-갈락토시다제의 프로모터 유전자 및 리보좀 결합부위 유전자가 pBES2 셔틀벡터로 클로닝된 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBESBR1.
서열번호 2에 개시된 염기서열로 표시되는 비피도박테리움에서 유래한 16S rRNA의 프로모터 유전자.
제 3 항의 비피도박테리움에서 유래한 16S rRNA 프로모터 유전자 및 리보좀 결합부위 유전자가 pBES2 셔틀벡터로 클로닝된 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBES16PR (KCCM-10451)
제 2항 또는 제 4 항의 발현벡터에 외래 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 5항에 있어서, 외래 유전자는 항암 활성을 갖는 인간 유래의엔도스타틴(endostatin) 및 콜레스테롤의 저하기능을 갖는 스트렙토마이세스(Streptomyces)유래의 코레스테롤 옥시다제 (cholesterol oxidase) 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나의 유전자인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 발현벡터 pBESBR1에 인간유래 엔도스타틴 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBESBR1-ENDO.
제 6 항에 있어서, 발현벡터 pBESBR1에 콜레스테롤의 저하기능을 갖는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)유래의 코레스테롤 옥시다제 (cholesterol oxidase) 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBESBR1-CHOL.
제 6 항에 있어서, 발현벡터 pBES16PR(KCCM-10451)에 콜레스테롤의 저하기능을 갖는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)유래의 코레스테롤 옥시다제 (cholesterol oxidase) 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBES16PR-CHOL.
제 5 항의 발현벡터로 형질 전환된 외래 유전자 발현 형질전환체.
제 10 항에 있어서, 발현벡터는 pBESBR1-ENDO, pBESBR1-CHOL 및 pBES16PR-CHOL로 구성된 군에서 선택되는 하나의 벡터인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 형질전환체는 대장균 또는 비피더스인 것을 특징으로 하는 외래 유전자 발현 형질전환체.
제 10항 또는 11항의 형질전환체를 배양하여 외래 유전자를 생산하는 방법.