CN114540376B - 一种抗肿瘤聚酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了化合物angumycinones C及其制备方法和应用。本发明构建了重组菌株A3(2)‑OE1(保藏编号:CCTCC M 20211134)生产包含聚酮类化合物的制备方法，同时涉及该类化合物在抗肿瘤领域的用途，angumycinones C结构式为：

Description

一种抗肿瘤聚酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域：
本发明涉及工业微生物领域，具体涉及Streptomyces coelicolor A3(2)-OE1(保藏编号：CCTCC M 20211134，保藏日期：2021年9月3日)生产聚酮类化合物angumycinones C的方法；本发明还涉及该类化合物在抗肿瘤中的用途。
背景技术：
癌症是威胁人类身体健康的恶性肿瘤，是影响人们生活质量的主要难题之一。研究数据表明，肺癌、前列腺癌以及乳腺癌等占据癌症死亡排行榜的首位。但是迄今为止仍没有一种治疗显著的药物可以对癌症细胞进行彻底消除，以更好地对抗癌症这一顽疾。活性天然产物因其结构多样和活性显著等特点，是当今发现药物靶点的一个主要来源，也是当今的一个研究热点。聚酮类化合物结构复杂、活性多样，特别因其在抗肿瘤领域表现出来的良好应用前景，颇受研究者们的青睐。
发明内容：
本发明旨在提供一种具有强烈的细胞毒抑制活性，同时对正常细胞无副作用的新化合物。
其结构式是
本发明的第一个目的是提供聚酮类化合物angumycinones C的生物合成基因簇spi，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含25个基因，具体为：
负责角蒽醌骨架合成及合成过程中进行修饰的基因，即spi A、spi B、spi C、spiD、spi E、spi F共6个基因；
spi A位于SEQ ID NO.1所示序列第23639-23944个碱基处，长度为306个碱基对，编码酰基载体蛋白，101个氨基酸；
spi B位于SEQ ID NO.1所示序列第24020-25237个碱基处，长度为1218个碱基对，编码聚酮链延长因子，405个氨基酸；
spi C位于SEQ ID NO.1所示序列第25234-26295个碱基处，长度为1062个碱基对，编码Beta-酮基合酶，353个氨基酸；
spi D位于SEQ ID NO.1所示序列第26540-26869个碱基处，长度为330个碱基对，编码环化酶，109个氨基酸；
spi E位于SEQ ID NO.1所示序列第21827-22762个碱基处，长度为936个碱基对，编码环化酶，311个氨基酸；
spi F位于SEQ ID NO.1所示序列第22783-23565碱基处，长度为783个碱基对，编码酮基还原酶，260个氨基酸；
编码与糖有关的基因，即spi P、spi Q、spi R、spi S、spi T、spi U、spi V、spi W共8个基因：
spi P位于SEQ ID NO.1所示序列第6481-7314碱基处，长度为834个碱基对，编码N,N-二甲基转移酶，277个氨基酸；
spi Q位于SEQ ID NO.1所示序列第7383-8540碱基处，长度为1158个碱基对，编码NDP-己糖转氨酶，385个氨基酸；
spi R位于SEQ ID NO.1所示序列第8544-9134碱基处，长度为591个碱基对，编码NDP-己糖-35-异构酶，196个氨基酸；
spi S位于SEQ ID NO.1所示序列第9147-10214碱基处，长度为1068个碱基对，编码葡萄糖-1-磷酸胸腺嘧啶转移酶，355个氨基酸；
spi T位于SEQ ID NO.1所示序列第10211-11227碱基处，长度为1017个碱基对，编码dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶，338个氨基酸；
spi U位于SEQ ID NO.1所示序列第11224-12528碱基处，长度为1305个碱基对，编码NDP-己糖-3,4-脱水酶，434个氨基酸；
spi V位于SEQ ID NO.1所示序列第12525-13907碱基处，长度为1383个碱基对，编码NDP-己糖-2,3-脱水酶，460个氨基酸；
spi W位于SEQ ID NO.1所示序列第13907-14866碱基处，长度为960个碱基对，编码NDP-己糖-3-酮基还原酶，319个氨基酸；
编码氧化还原酶的基因是spiH1，spiH2，spiH3：
spi H1位于SEQ ID NO.1所示序列第269-985碱基处，长度为717个碱基对，编码蒽酮单加氧酶，238个氨基酸；
spi H2位于SEQ ID NO.1所示序列第19497-21824碱基处，长度为2328个碱基对，编码FAD依赖的单加氧酶，775个氨基酸；
spi H3位于SEQ ID NO.1所示序列第27076-28551碱基处，长度为1476个碱基对，编码FAD依赖的单加氧酶，491个氨基酸；
编码糖基转移酶的基因是spi L，spi N：
spi L位于SEQ ID NO.1所示序列第1030-2346碱基处，长度为1317个碱基对，编码假定的糖基转移酶，438个氨基酸；
spi N位于SEQ ID NO.1所示序列第3212-4345碱基处，长度为1134个碱基对，编码糖基转移酶，377个氨基酸；
编码与初级代谢相关的基因是spi I，spi J，spi K：
spi I位于SEQ ID NO.1所示序列第14925-16148碱基处，长度为1224个碱基对，编码甲硫氨酸腺苷转移酶，407个氨基酸；
spi J位于SEQ ID NO.1所示序列第16150-17133碱基处，长度为984个碱基对，编码假定的腺苷酸激酶，327个氨基酸；
spi K位于SEQ ID NO.1所示序列第17130-17999碱基处，长度为870个碱基对，编码亚甲基四氢叶酸还原酶，289个氨基酸；
spi O位于SEQ ID NO.1所示序列第4421-6040碱基处，长度为1620个碱基对，编码自抗性基因，539个氨基酸；
spi M位于SEQ ID NO.1所示序列第2343-3116碱基处，长度为774个碱基对，编码甲基转移酶，257个氨基酸；
spi G位于SEQ ID NO.1所示序列第18378-19274碱基处，长度为897个碱基对，编码硫酯酶，298个氨基酸；
SEQ ID NO.1的第1位到28551位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO.1的第1位到28551位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过用合适的限制性内切酶酶切得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1的第1位到28551位中DNA序列的重组DNA载体的途径。
本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后对发酵粗提物采用Sephadex LH20凝胶柱层析、中压MPLC和半制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的第二个目的是提供新的聚酮类化合物angumycinones C，其结构式如式(I)所示：
本发明的三个目的是提供聚酮类化合物angumycinones C或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用
本发明的下述实施例中列举了利用S.coelicolor A3(2)-OE1制备本发明式Ⅰ化合物的实例。
附图说明：
图1是重组菌株A3(2)-OE1粗提物的分析信息；
分析条件：色谱柱为Capcell Park C18柱：5μ，20mm×250mm，流动相包括A相和B相，流动相A相：色谱甲醇+1‰(体积分数)的三氟乙酸；流动B相：水+1‰(体积分数)的三氟乙酸；进样程序：0-60min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100，5-45min，检测波长190-600nm，流速1mL/min，其中1代表化合物I。
图2是angumycinones C的关键的二维信号；
图3是angumycinones C的假定生合成路线；
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)是：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1聚酮类化合物angumycinones C的生物合成基因簇的异源表达
1.Streptomyces sp.HDN15129基因组序列扫描及angumycinones C的生物合成基因簇序列分析和功能分析：
通过对Streptomyces sp.HDN15129进行全基因组测序，并上传到antiSMASH上进行分析，同时结合基因注释，在其中找到了29kb的与该化合物生物合成有关的基因簇，包含了20个开放阅读框(open reading frames,ORFs)(表1)。根据生物信息学分析spi A、spiB、spi C、spi D、spi E、spi F共6个基因负责聚酮链骨架合成及合成过程中的修饰；spi P、spi Q、spi R、spi S、spi T、spi U、spi V、spi W共8个基因负责编码与糖有关的基因；spiH1，spi H2，spi H3负责编码氧化还原酶的基因。该化合物生物合成途径初步推测如图3所示。
表1.angumycinones C生物合成基因簇的基因及其功能分析
实施例2化合物Ⅰ的重组菌株构建、发酵生产及分离精制
1.重组菌株的构建
(1)采用放线菌基因组提取的方法来提取Streptomyces sp.HDN15129放线菌基因组；
(2)使用MfeI/MseI限制性内切酶酶切基因组，来释放目的基因簇spi；同时将之前构建好的引物来扩增克隆载体p15A-spi。
(3)使用Red/ET重组工程技术将胶回收后的克隆载体和酶切后的线性基因组构建目的质粒，并通过转化子筛选得到正确的质粒。而后将正确的质粒重转化至GB05大肠中，以消除背景的影响。
(4)将重转化的正确质粒通过线环重组(linear plus circular homologousrecombination,LCHR)的方法添加强启动子kasOp*，以启动目的基因簇的表达。并通过该方法添加位点特异性重组元件pR6K-oriT-phiC31-kasOp*，最后将该质粒电转化入ET12567/PUZ8002中。
(5)链霉菌(S.coelicolor)A3(2)在MS[培养基组成(克/升)：豆粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，pH调节至7.2]平板中划线培养5-7天，长出的孢子用无菌棉签刮下孢子置于50mL离心管中，50℃热激10min自然冷却的菌株作为接合转移的受体菌。供体菌E.coliET12567/pUZ8002/p15A-spi在100mL含50μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.6-0.8时，离心收集菌体(9500rpm，1min)，用无抗LB清洗菌体3遍，悬浮于1mLLB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌200μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的MS固体培养基上，吹干后，于30℃培养16-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酮酸，吹干后，于30℃培养箱中，培养10-20天后观察。
(6)当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有25μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL萘啶酮酸的MS平板上，30℃培养10-15天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用异源表达的检测引物spiF/R(引物序列见于表2)通过PCR检测获得阳性克隆，即获得angumycinones C生物合成基因簇异源表达菌株A3(2)-OE1。
表2.检测引物名称和序列
Primer Sequences(5’-3’)
spiF GCAGGCTGCTGACGTGCGTG
spiR GTGTCCGAGGTGACCGGGAG
2.发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取S.coelicolorA3(2)-OE1适量，接种到MS-Apra[添加阿泊拉霉素终浓度50μg/mL]的固体斜面培养基上，在30℃培养箱中培养10天。
取斜面培养10天的S.coelicolor A3(2)-OE1适量，接种到装有100mL培养基[培养基组成(克/升)：可溶性淀粉10g，蛋白胨2g，酵母提取物4g，pH调节至7.2]的500mL锥型瓶中，在30℃，200rpm条件下摇床培养8天，获得发酵产物。
3.浸膏的获得
发酵液用纱布过滤得到上清液。用等量乙酸乙酯萃取三次，合并所有乙酸乙酯相，减压浓缩得到粗浸膏，共12克。
4.化合物的分离精制
浸膏用甲醇溶解后，使用95％甲醇溶解，使用石油醚萃取，出去油脂成分，蒸干后以甲醇-水为洗脱体系进行反相层析柱层析，分为7个流份。组分5先以甲醇为流动相进行sephadexG-200分子筛洗脱，后再经反相半制备高效液相色谱(甲醇：水＝46:54)得化合物Ⅰ(4.6mg)。
化合物Ⅰ为亮黄色针状固体,分子式C19H16O7,HR-ESI-MS m/z：355.0824[M-H]-,计算值355.0823)；IR(KBr)νmax 3399,1699,1683,1653,1577,1541,1488,1207,1136,1027cm-1。1H and 13C NMR核磁数据归属见表2。
表2化合物Ⅰ的1H和13C NMR数据(600和150MHz，in DMSO-d6)a
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)、m(多重峰)表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2化合物的细胞毒活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品，用DMSO配置成30μM的母液，然后采用二倍稀释法稀释成15，7.5，3.75，1.875，0.9375μM的待测溶液，阳性药阿霉素(ADM)配置成1μM，供测活性。
供测细胞：L-02、H69AR(SRB法)。
测试方法：SRB实验方法如下检测及数据分析
(1)细胞处理：贴壁细胞，胰酶消化对数期细胞，制成细胞悬液。
(2)细胞计数：使用计数板和计数器，吸取10-20μL，计四个角上16个方格细胞的平均数x(x大致20-50比较好)，40÷x＝y，y为一个板需要加的细胞的毫升数，每个板一共需要6mL，6－y＝z，z为需要加的培养基的体积(计数原则，计上不计下，计左不计右)。(每个96孔板的细胞数量在38-41万)
(3)细胞铺板：96孔板中每孔加入90μL细胞悬液
(4)加样品：细胞贴壁生长24h后，每孔加入10μL不同浓度的化合物溶液。
(5)细胞放入37℃培养箱培养
(6)72h后，去掉培养基，每孔加入100μL TCA溶液，4℃固定1h以上，自来水冲洗5-6遍，自然晾干，每孔加入100μL SRB溶液进行染色，染色5-10min后，去除SRB，1％的冰醋酸溶液冲洗5-6遍，自然晾干，干燥之后加入150μLTris溶液，震荡摇匀，用酶标仪在515nm测吸光度。
2实验结果
在细胞毒活性测试中，不同浓度的化合物I对所测试的肿瘤细胞的实验结果见表3。
表3不同浓度的化合物I对H69AR细胞的抑制率
3结论
化合物Ⅰ具有强烈的肿瘤细胞增殖抑制活性，作为新型抗肿瘤化合物结构在癌症治疗领域具有良好的应用前景。
中国海洋大学
一种抗肿瘤聚酮类化合物及其制备方法和用途
28768 bp
DNA
Streptomyces coelicolor A3(2)-OE1
CAATTGCAGATCATCGCCGAGGAGACGGGCCAGGAACTGCGGTGGGAGGACGTCCCGCACAAGGCCGCACGCGGCGCGATGGTCGACGCCGGCTGGCCTCCCTCGTACGCCGATGGCGCACTGGAGTACTTCGCGATGCTCGTGGATCGCCCCGAAACCGTCACCAACACGGTGGCGGAGGTGCTCGGCAGGCCGCCCCGTACGTTCCGCCGGTGGGTTGCGGAGCACGCGGACGACTTCCGCTGACAGCCAGGTTCTGGAGCAAGCCATGCCACCAACGAATGACCCCAATCCGGCAGCGGGCTACGTCACCTTCCACGAGATCGGGGCCCGGACGCCGGGCGACGCCCACCGGATCGCCGAGGCCAGCACGCGGCTGCTGCGGCGATACACCCGGCACTCCCCCGGGTTCCGTTCGGCGAGAGTCCATCTGAGCCTCGACGGCACCGCGGTGGTGGTGCGCGGCGAGTGGGACGGGGCGCAGCGGCCCGACACGGCCCTCGGCGGTCCGGCCGGCCGGATGCTGCGGCATGCCGAGCGTCTTGGCCCGGTGCCGGTGTCGAGCTTCCGGGGTATCCCCGCACCGGGTATCGAGGGCCCGGCGAAGGGGCGCCGCCCGGGGCTGGTCGTCGTCGCGACGCGGCAGGTGGGGAACGCGGACAACGCTCACAAGCTGTCCGGACTGCTGCTGCGCAGCGGCGAGTGGAAGGGCGACTTCTCGGGGTTCGTCGCGGCGGACCCGTGCGTCAGCGAGGACGGCGGTACCTACGTCAACTATCCGCAGTGGGTGGACGAGGACGCCTACGACGCGTACATGAACGACCCCCGCAACGCCGAAGGGCGCAAGGCCATCGCCGACCTGGAGGTGGCGCCGCCGCGATTCGTGATGTGCACGATGCTCGCGCAGATCGACGCCGAGCCGTCCCGCCCCGGCCTGCGGGCCCCTGCGGCAGAGAATCCCACCGGGCCGCGTTCGGGGCAGTGATCCGAGGCAACGCACCGGCCCGGAAGACTTCAGAGGAAGCCAGCATGAAAATCCTGTTCTCGGTGCCGCCGGCGCTGGCACACATCTATCCCATCGTGCCTCTGGCCGGCGCCCTGCAAGGAGCGGGGCACGAGGTCCGCGTCGCGACCCATCCCGAAATGGTCGACGCCGTGAGTCAGTTGGGGCTGTTCGCCGTGCCGGTGGGCGGAGAGGGTTTCGTCGAATCCTCGAAAGGCAGCTGCGACGAACTCTACGAGCGCATGGAGACCGTACTGGCCCCGGAGTTGGCGGAGGGCGGGACGAAGCGGCTGCCGTCGAAACCGTTCCTGGAGGCCTTCGCACGCTACTTCAGCCTGGAACCCACAGGTTCGGCCACGACCACTGCCGTGGAGGACCTCGTCGCGTTCGCGCGTGGCTGGCGGCCGGATCTGGTGCTGTGGGACATGGTGTCGTTCCCCGGGGCGGTGGCCGCGCATGCGTCGGGGGCCGCCCACGCCCGTGTCGTGCTGTCGGTCGACGACTTCGCCTGGGCGCGGCTGACGCTCGTCGACCGGTTACGCCTTGCCGGTGAGGACGACCCCATGGCCGCCGTGATGGAGCCCGTACTGCGGCGCTTCGGCATCGAGTTCGACGAGGATCTGCTGCTGGGGCAGTGGACCGTGGACCACTCGCCGGCGATCAGGGCGCGGCTGCAGCTCGACCTTCGGTACGTCCACTCACGGCCGCTTCCCTTCAACGGCTCGGCCGTCGTGCCGCCCTGGCTGTATGAGGGCGGGGGGCGGCCGAGGGTGGCGCTGTCCCTGGGGGCGGGAATGCGTAGCTTCTACCCCGACGACAGCACGATCGATCTGGACACGCTCTTCGACGCCGCGGAGAAGCTCGGCCTCGAAGTGGTGGCCACGCTCAACGACTCCCAGCTGCGCCAGGTGCGCCGTGTCCCGGACAACGTACGGTTGATCGACTACCTGCCGCTCAACCTGCTGCTGCCCACCTGCCGTGCCATCATCCACCACGGTGGCGGGGGCACCATGGCTGCGGCCGTTCCGCATGAACTGCCGCAGCTGATCTGGCCGGAGGACAGCCACTACTACCAGGACTTCGCCCGGTACGTCGAGCGAGCCGGCGCCGGCCTGGTGGTCGACCCCGGCAGGACGTCGGCCTCGACGATCGTCGAGTACCTCGACCGCCTGGTGAACGACCCCTCCCTCAAGGAAGGCGCGGCCGGGCTGCATCGGGACCTGTTGTCCGTTCCCAGCCCGGCGGAGGTCGTTCCCACGCTCCAGGCGCTCACCCAGGAGTACCGCGGGCGTGGCGTCGGCCCGTCCGCAGCCATAGCAGGGACCGAGGGGGCACAGGCATGACAGTCGAGGAGGAGAACATGACGCAGCGTGGCGACGAGGTCCTGGCGAAACTGTGGGAGCGCAACTACGACCCTCACACGTCGTCCATCATCAGCGGACTGTCGCCTGCGGACACCTGGCGGTGTCTGGATGTGGGGGCGGGCAGCGGTTCGATGTCCCGCTGGCTGGCCGAGCGTGTCCCCCGGGGCGAGGTCCTGGCGGTCGACGTCGACGACACCGGTTTCGGCGCTTCCTGCGCACCGAACCTGACCTTCCGGCAACTCGACGTGGCAGAGGCCGAGTTCGACTCGGGTTCGTTCGACCTCGTGCTGGCGCGGGCCGTGGTCTCCCATCTTCCGCAGGCCGAGCAGCAGCTCGCCCGGATGGTCGACTGGGTGGCGCCCGGAGGCTGGCTGCTGGTGGAGGACTTCTACTTCCTGCCGAGCGAGGACGCCCCCCAGGACGCCGGGCGCTCCGTCGTCGCCGCCTACACCGGGACCTTCCGCGCAGGCGGGGCCGACATGCGCATCGCACGGCGGCTGCCGGCGCGGCTGGCGCAGCACGGGCTGACCTCCGTCGACGTGAGCGTGCGGCCGCTGGGTCCCGGGCAGGGCGCGGACGAGAACGAGCTGATGCGGACCCGGATGGAACTGCACGGGCAGGCCCTGGTCGATCAGGGGCTGGTGAGCAGCGACCACCTGTCGGAGTTCGTCGCGACGCTGGACCGTCCGCAGGCGCGCGACGTCACCGTCCTGCAGTTCTCCGTGTGGGGGCAGCGCGCGGAGCTCTGATCGCCCCGGCAGACAGGGCGGTACGGCTGCCGTTCCGCAACCCTGGCGAAGGCTGCTACGCCTGTCCACAGAGTGACACAGTCAGGAGAGCACTGATGAAGGTCCTGTTCATCGCCTCGGGCAGCCCGGCCACCGTCTTCGGAATCGTGCCGCTCGCCACTGCCATGCGTGGCGCCGGTCACGAGGTCTTCATGGCCGGCAACGAGGCCATGGTGCCGTACATCGCGAGCGCGGGTCTGCCTGCGCTGGCGGCGGCCGAGCATGAGATAGCCCACTACATGGACCTCGCGCGGGCCGGCAGCGGTCCGCTCGATCTCGACAATCACCGCCAGGTGATGGAGTACGTCGGCAGCTGGTTCGCGTTGCTCGGTGCCGACAGCTTCGTCCGGCTGCGGGAGTCGCTGCGCGGCTGGCGCCCTGATCTTCTGGTGGGCGGCACGATGAGCTATGCGGCGCCGCTGCTCGCGGCAGCGCTCGACGTGCCGTACGTGGTGCAGGAGTGGACGCTGGACGACTGGTCGGGCACGGACGCGGGGGCGCTGCGCGTCCTGGAGCCGCAGCTGGCCGAGCTGGGCCTGAAGGGGCTGCCGGAGCCGGAGTTGAGGATCGGGATCTGTCCGCCGGCCATCGCGCATCCCGACGCCCCCGACGTCCAGCCGATGCGCTGGCGGCCTGGTAACAAGCAGGGCCGCGTCGAGCCGTGGATGTATGCGCTGCCCGACCGTCCGCGGGTGTGCCTGACCGCGGGGAGCCGGGCCAGCCACGAACGGGGCTTCGCCTTTCTGCGCGCGCTCCACGACCGGATCGCGCCGCTGGGTGTCGAGGTGGTCATCCCCGCGCCCGATCCGGTCGCCGCCGAGTTGCGTGCGGCCATGCCCGGAGTGCTCACGGGATGGATCCCCCTCGACACGGTCATGCCGACCTGTGACCTGGTCGTGCACCACTCGGGCGGCGCCACGACGATGACGGCCGCCGACGCGGGGGTGCCGCAGCTGATCATCCCTGAGACGCCGGTGTTCGCTCCGCCCGCCCAGCGGCTCGCCGATCACGGCGCGGGCATCATGATCGCCGAGGCCGAAGCGACGGACGAGGCGGTGGAGCGCGCCTGCCGGGAGATCCTCGGCGACTCCCGATTCAAGCAGCGGGCCGGTGAGATCGCTGCGGAGATCGCTGAGATGCCTCCGCCGCCGACGCTCGTGCCCCAGCTGGAAAAGGTCGCGCTCGGCTGAACTTCTCCGCCCGCGGGGCCCTTCTCGGTGTTCCGCGCTGTCCACCACCGCACCACAGTTTGAAGGAGAACGATCATGGCTCAGCAAGCGCCCCCTCTCGCCGGTCGGCGGGAATGGATCGGCCTTGCCGTCCTGGCCTTGCCCACCCTGCTCCTGGCGCTGAGCATGACCTCGCTCAACCTGGCGATCCCCTACCTGAGTGCGGACCTCAACCCCAGTGGCGCCCAGCTGCTGTGGATCACTGACATCTACGGGTTCCTCATAGCCGGGACCCTGATCACCATGGGCACCCTCGGCGACAGGTTCGGCCGCCGGCGGCTGCTGTTGATCGGTGCGGCGGTCTTCGGCGTGGCGTCGGCGGTCGGAGCGTACTCGAACAGCCCCGAGATGCTGATCGTGATGCGGGCCCTGCTCGGCCTGTCGGGCGCAACCCTGATGCCGTCGACGCTGTCCCTGCTGTCCAACATGTTCCGGGATCCGGCGCAGCGGACGTTCGCGTTCTCCACCTGGATGGCCACGTTCATGGGCGGCACCGCGGTGGGACCGCTGGTCGGCGGGGTGTTCCTGGAGCACTTCTGGTGGGGGTCGGTGCTGCTGCTCGGTGTTCCCGTGATGCTGGTGCTGCTCGTGCTCGGACCGGTCCTGCTGCCGGAGA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CGTGCGCTCGCGCAGGCCGTTCTCCAGGCCCAGGAAGAGCTCGTGGACATCGCCGGCCGGGCCGAGTTCCGCCCGTACGGTGAAGCCGCGGCCACCGTCCTTCTCGATCAGTTCGAGGACGTCCGTGGCCGCCTCCTCGCTCGACGCGTAGTGCACCGCGACGAGTGCTCCTTCCTGAGCCAGCCGGAGTGCCGTTGCCCGGCCCATCCCTCGGCTGGCGCCGGTGACGAGCGCGGTCTTTCCGCTGAGCCTGCCCATGTCTGTACTCCGCTTCTTCCGTGGTGGCTTTGCTGGGGACTTCACCGGTGTCATGGGCCCCGGTGCCGAGGCCTGCACGGTGGGTGGGGCGGCGGGTGAGGTGGCTGTTCCGAACCAGCGGTGCAGGGCAGTTGTGAGGTGGGTGGGGTCGCTTCCCGCCCAGGCGACGTGTCCGTCGGGCCGCACCAGCAGGGCCGGGGCGCCGGGGTCGGCGGGCGGGGAGGCGGCGGCCGTGTGCACCAGGCCGGTCCAGGGGAGGGCGGCGGTGCGCAGCGTCTTCTGGCGTGCTGCGTCGCCGGGTGGTACGAGCAGGACGCCGCGGCCGTCGTGCATCAGTTCGGCTGCGGTGGTGGGTCCCGGGGTGTTCGTGGTCAGCTCCCAGTGCGGCAGCCGGGCGCCGAGCAGGGGATGTGTGCCGGGCCCGACGTCGTAGCGGGTGTCCAGGCCGGAGATCATTCCTGCCAGGTGGCGGCGTACGCCTTCGTGCCGTAGCAGTTCGGCGAGAACCTGGCGTGCGGCGTCGACTTCAGCGGTTCCCAGCAGCAGGAGTGCCTGGGCCCGGATGTTGTCGAGGACTCTGCGGCCGACCGCGTGCCGTTCGCTGTGGTAGCTGTCCAGCAGCCCGTCGGGGCCACGCTCCAGGAGTTGCGCGGCGAGCTTCCATCCGAGGTTGGCGGCATCCTGCAGGCCCAGGTTGAGGGCCTGTCCTCCGATGGGCATCTGCTGGTGCGCGGCGTCCCCGGCGAGGAACAGGCGGTGGTCGCGGTAGCGCGAGGCGTGCCGGGAGGCGTCACCGAACGTGTTGACCCAGAGGGGACGGCCGCCGCTGATGTCCTCTCCGGTCACGCGCTTCCACGCATCGACGACATCGGTGAACTCGGCCGGTGCGGTGCGCGGCCGGGTTCCGTATTGGTGGACCATCACCCGGGTGACGCCGTCTCCGCGGCGTGCGGCGATGGCCAGGCCGTGCGGCAGCCTCTCGAAGCGCCGGTTGGGGATGTCGATGCCGTCGATGTCCGCGCGCAGCAGGTGGCGCTGTGCGTCGGTACCGGGGAAGTCGAAGCCGCCCAGCCGTCGCACGGTGCTGTTCTCGCCGTCGCAGCCGACGATGCACTTGGCCCGCAGGCGGGTGGTCCGCCCGTCGCCGAGGCGTACCTGTGCCTCGGCGCCGTCCGTGGTCATGGTCAGGCCGGTGAGCTCGTGGCCGCGCCGGATGTCCGCGCCGAGGCCTGTTGCCCATTGTCCGAGAAGCTCCTCGACGCGGGTCTGGGGGACTTTCCACTGCCCCGGATAGCGGCTGGGCAGGGACAGGTCGAGGGGGATGCCCCCGAAGTGGCCCGTCGGCTCGTTCGGCAGGTCACCGAGCGGAGCGAGCAGGCCGCGGGTTTCGAGGATCTCCATGGTGCGGGCGTGCAGCGTCGAGGCCCTCGACTCCGTCGTGGGGCTCCGGCGCCTCTCCAGCACGAGGGTGTCAGCCCCGCCGAGGCGCAGTTCACCGGCGAGCAGCAGCCCGACGGGGCCTGCGCCCACGACGATGACCTGTGTGTCCAGTCGGTCGGCCGTCATCGTCAGCGCTTCTCGGCGTAGTCCTTGGCGTGGCCCAGGGTGATGCGGCTGTTGGCCGACAGTGCGCCCTGTACGTACTCGCGGGCGTCCGTGACGGTGGCGTCGGCGCCCAGGATCCGTGCGATGTTCGCTGCGTTGATGACCACGGTGTGCTGCGAGGAGGCGGTGGTGACGCCGTTGTTGTCCTCCACGAAGGTCCAGTAGCCGGTGTGCAGGGTCATCAGGGCGGGCAGTGTCACTTGTTTGTAGGCGATCTTCTCGTGCGGGAGACACACGCGGTACGACTTGGTGGTGTGCACGGAGCCGTCCTTGGCGCGGGTGTCCATCTCCAGGGTCTGCAGGCCCGGTTCGTCCTCGGTCAGGCGCACGGTCGCCACGTGGGGGAGCCGTTGGGACCACAGGCCGGCTTCGTTGATGAAGTCGTAGACGTCCTTGGCGCTGCCGTGGACCTGGACACTGTCCTCGAAGGAGAAGGTCAGTGCCTCTGCGGCGTGGGCCAGTTCCACGTTCTGTTTGAGGGCGGCGAGTTCGGAGCGTGAATTGCGGTCGACGGCCTCGTCGATCCACTGCAGACCGGCCGGGTCGTCGTCGATCGCCCGGTAGTCGTGCAGCAGCCGCACCCGGCAGCCGGCCTCGGGCAGCGGTTCGATCACCCAGGCGCCTCCCATCGAGGCGACCGGCGGCGTGGAGACCTCCTGCCGGAAGTCGATGCGCAGGCCCTCGGGGTCGAGAGTGCGGTGCGAGGTCCAGTTCTTGGCGGCGCCGTTGGCGGTCGCCCAGATGCGGATGCGCTCGTCGTCGCCGTTGCGCTCGACCTGGTCGACGTGGATGGTCGGCGGGAAGATGCGGGGCCAGTTCTGCACGTCGGCGAGGAGCCGGTAGACGGTGGGGGGCGGGGCCGCCACCGTGATCTCGTGCTCGACCTCGTGAGTCGTCATGGTGAACCTCCTTGGGGTCATCAGAAGTTGCCCAGGCCGCCGCAGACGTTCAGGGCCTGTGCGGTGATGGACGCGGCGGTGTCCGAGACGAGGTAGCCGACCAGTCCTGCGACCTCCTGCGGGGTGGAGTAGCGGCCGAGCGGGATCTTCGCCTGGAACTTCTCCAGGATCGCGGCCTCCGAGGTCTGGTACGCCGTCGCGTACCCTTCGCGTACGCGCTGCGCCATGGGCGTTTCCACGTAGCCGGGGCAGACGGCGTTCACCGTGACCCCGGTCGGCGCCAGCTCGTTGCCCAGGGCTTTGGTGAACCCGACGACACCGTGTTTGGAGGCGGAGTAGGGGGCGCCGAGGATCACGCCCTGCTTGCCTGCGGTCGAGGCTATGTTGATGATCCGGCCGCGGTCCTTGGCCCGCATTCCGCCGGTGTTGAGCACGGCCCGGGTCACCCTGAAGACGCTGTTGAGGTTGGTGTCGATGACGTCGTCCCACAGTTCGTCGGTGAGGTCCGCGGTCACCCCGCCACCGCTGCGGCCCGCGTTGTTGACCAGTACGTCGATCGTCCCGAAGCGGTCCACGGCGGCACGGACGAACGCTTCCACCGCTTCGCCGGACCGTACGTCCACGGCCGTTCCGTCCACCTCCAGCCCTTCTTCCCGCAGCTGCTTGACGGTGGCGGCCACGTTCTCCTGGGTGCGGGCGCCGAGGAAGACCCGGTGGCCCTGCTCGGCAAGCAGTCGGGCGACTGCCAGACCGATTCCGCTGGTCGCGCCGGTGACGACCGCGACAGGCTGGTCCTGCTGCATGATGGTTACTCCAAACAGGGCGGTGGGGTGGGCGGCCGCTGCGCTCGGCGCAGCGGCCGCGGTGGTGCACGGATCAGGCGCTGATGAGCTTTGCCAGCGCGGTGTTGATGGTCTCGATCAACGCGCGCGGTGTCGGGTGTTCCGTGAAGATGTCGTCGTCGAGCGATATGCCGTATTCGCGCTCGATTCGGCTCGCTGTCTCCAGCAGGGCCAGTGACTCGTAGCCGAGGTCCCCGAACTGCTTGTCGAGGATGTCTTCGTCGAGGACGACGTCTTCGTCGGCGCCCGCTCCCTCCAGCAAGATCCGTGTGAGGTCGTCGAGGGTGAATTCCTTCTTGGGCATGACGTGCCTTTCGTAGGTCTGCCGCACGCGGTGCACCGTGCGGGAGGGGTGGGGCTGGGCGCCCGCCGGCGAGCGCCGGGGGGAGAAGCGGTGGGAGCGGCTTCTGGGGGGTCAGTACGGGGCCCGGAGCACCATCGCGGAGTTGAAGCCGCCGTAGCCGCGGGCAAGGACGAGTGCGGTGTTCACCGGCGTGACGCGCGCCTGGCCGGTGACCAGGTCAAGGTCGTAGTCGGGCGAGGGCAGTACGTTGATGGTGGGCGGGATCAGGCCTTCGCGGATGGTGAGCAGGGCGGTGACCACATCCACCGGTGCGGCTCCGGAGTAGAGGCGGCCGGTCGATGCCTTGGGTACGGTGACCGGCACGCCGGCGGGCCCGAAGACCGCGGTGATCGCCTCGGCTTCCTCACGGTCGAGGCGCGGTGTACCCGCGCCGTCCGCGAAGACCACGTCGATCTCGGCGGCCGGGACGTGCGCGTCGGTGAGTGCGGTCTCGATGGCCCGGCGCAGGCCGGGTTCGCGGCCGCTGTCCGGCCGGGGGTCGAACGTGGAGCCGTAGCCTGCGATCTCGCCGTAGATCCGGCGTGCGCCGCGGGCACGGGCCGACTCTGCGCTTTCCAGGGTCAGCAGTGCGCCTCCTTCGCCGGGCACGTAGCCGTCGGCCGCTTCGTCGAAGGGGAGGTAGGCCCGTTCGGGGTCGGTGCTGGTGGACAGCCGGTCGCTGGCCAGCTGCGCCACCCATCCCCAGGTGCAGATGGAGGCGTCGAAGCCGCCCGAGAGGATCAGCCGGCTGCCCTTGCGGATCAGCCGCCGGGCCTGGGCGATCGCGTCCAGGCCGCCGGCGTGGTCGCTGACGACCACGCTGCTGGGGCCGCGCATGCCGTTGCGTATCGAGATCTGTCCGCTGTTGACGGCGTAGAACCAGGCGAACGACTGGTAGGCGCTGACGTAGTGGCTGCCTTGGCTCCACAGCTTCTGCAGCTCGTTCTGTCCGAACTCGAAGCCGCCGGAGGTGGAGGCGGTGACCACACCCATGTCGTACTCGGCGAACTCGCCGGGCTGGACGTCCGCGTCCCCGAAGGCGCAGTCCGCCGCGACCAGGGCCATCCGGGTCATCCGGTCGGTCTGCGGGATGAGTCTGCTGGGGAGGTGTTGTGCGGCTGCGAAGCTGCGGATCTCGCCGGCGAGCTGGGCGGGGTAGGGGGTCGCGTCGAAGCGGGTGACTTGGCCGATCGCGTTCTTTCCGATATGGGTCGCGCTCCAGAAGTCGTCCACCCCCAGTCCGTGCGGGGTGAAGATTCCTATGCCGGTGACGACCGCCTTGGCGCTCATGCCGCCTTCCTTTCGGGCCGTGCAAGGACCATCGCGCTCTGGAACCCGCCGAATCCACTGCCGACCGTGAGTACGGTGTCGGTTCGCTGCTCGCGGGCGGTGAGCGGCACGTAGTCCAGGTCGCACTCGGGGTCAGGGGTGCGCAGGTTGGCGGTGGGGGGCACCACGTTGTGCTCCATGGCCAGGACGGACGCGGCGATCTCGATGGAACCGATGGCGCCGAGTGAGTGCCCGACCATCGACTTGATGGAGCTGACCGGGGTCCGGTAGGCGTGTTCGCCCAGGCTCAGTTTGAATGCGGCGGTCTCGTGGCGGTCGTTCTGCTTGGTGCCGGAGCCGTGTGCGTTGATGTAGTCGATGTCTTCGGGGTTCATCCGCGCCTCTGTCATGGCGACGCGGATCGCCTCCGCCATCTCGCGCCCGTCGGGGCGCAGGCCGGTCATGTGGAAGGCGTTGCACCGGGAGGCGTATCCGGCGATCTCCGCGTATATGTGGGCGCCGCGGCGCTGCGCGCTCTCCAGTTCCTCCAGGACGAAGACGGCGCTGCCTTCTCCGAGCACGAACCCGTTACGGGTGCCGTCGAAGGGGCGGGAGGCGTGCTCAGGGTCGTCGTTGCGGGCCGTGGTGGCCTTGATCGCGTCGAAGCAGGCCAGAGTGATCGGGGAGATCGGGGCGTCGGTGGCGCCGGCGATCATCACGTCGGCGGTGCCCTCGCGGATCAGCTCGACGGCGTGGCCGACCGAGTCGATGCCCGAGGTGCAGCCGGTGGAGATCACGGTGGCGGGTCCTTCGGCGCCGACGGCCCACGCCACTTCGGCCGAGAAGGAGCTCGGTACGAAGTAGTTGTACAGGTGCCGCGGTGCGTAGGTGTGGTCGACGAGATCGAGGCGGCCGTCGTCGCTCACCACGCGGTACTCGTCGTCGAGTCCGGTGGTGGCGCCGACGGCGCTGCCGATGGTGACGCCGGTGCGGTGCGGGTCGAAGTCGGCGACGGCGAGTTGGCTGTCGGCGAGTGCCTCGCGTGCGGTGACCACGGCGAACTGGGCGGCGCGGTCCATGCGGCGGAGTTCCTGGGGGCGCAGCCCGTGCTGTGCCGCATCGAAGTCGATCTCTGCGGCGACCCTGGAGCGGAAGGGCGCGGGGTCGAAGAAGGTGATGCCCCGGGTCGCTGTGCGTCCTTCGCTCAGCAGACTCCAGAAGTTTTTGACGCCTATCCCGCCCGGCGCCAGGACTCCGACTCCTGTGATTGCTACGCGGCGGCCCACTAGTGGCCGCCTCCCCTCGTGTCTGTGTGGCGGAGTTTCACCGGGTCGCCGTCCAGTCGTAGAAGCGCTTGGCCATCGCGTCGGCGGGTGAGCGCCAGGTCGCCGGGTCGTAGGCTTCGATGTGTGGCTTGAGGTCGTCGCTGATCTGGAGGAACCGGGGGTCCGACTTGGCCTCCTCGATGAGTTCGCCGCCGTTGTCTGCGTCGAAGTCCTGCAGGTGGAAGTACAAGCCCCGGTACTGGAACAGCTGGCGCCGCCGTGTGCCCATCCGGTGCGGCATGTCGGTGTTGTCGAATGCTTCGAACAGGCGCGCCACTTGGGTGCCGGAGGCGGCATCCATTCGGGCCACGATCAGGTTGCTGTGCATGTCTTCTCTCTTCCGTGGGTCAGCGTTCGGCGGCGAGTCCGAAGGGCGGTGGGGGGCGGACTGTTCGCGGGTGGATCGCGGTCGGCAGCCTCGGCCGGAGTGGACACGGCATGGTGTCCGGGGTCTTGCGTGCACGGGCCGGGGCCGGGCGGTGCAACGTTCCTCGATGTGCCGGTCGGTGTCCGGGAGAAGGGCGTGGCGCCGGTTCAGCCCGCCGCCGGCTGTCCGAACCATCGTTCCAGCGCCATCTGCAGGTCGTGGTGGCTGCCGGGTGCCGCCCATACGACGTGTCCGTCGGGTCGGACCAGCACGGCGGATGTGTCGGCGAGTTGGCTGTCGGGCGAGAAGGAGGGTGGTGCGGTGGTGACGATGTCGACGCGGTCGGCCCATCCGTAGGCCCGCTTCCGCAGCCGCTCGTTGGCCTCGAAGTCGAGGAGCACGCCGCGGGCGGAGTGCAGCAGTTCGGTGGTCGAGGTCCGGCGCCGTGCGCTGTCCAGTACCAGGTGCGGCATGCGTTTGCCGAGAAGCGGGTGCGTGCCGGTGCCGACGTCATAGGTGATCTCGAGGCCGCTCACCATGCCGGCGAGATGGCGCGCGACGTCCTTGTAGGTGATGAGCTCGCCCAGTACGTCACGCAACGGCTGTACTTCGGGTCCGCTGAGGAAGAGCAGGCCCTGGGCCCGGGTGTTCATCAACAGGCGCTTGCCGACCGCGTGTCGCTCGCTGTGGTACGAATCCAGCAGGCCCGCAGGGGCCGATCCCTTGACCTCGGCAGCGAGTTTCCAGCCCAGGTTCACCGAGTCCTGGATGCTGGTGTTCATGCCCTGCCCGCCGGCGGGCAGGTGAATGTGCGCGGAGTCCCCGGCCAGGAGGACCCGGCCGCGCCGGTACTCGGTGACCTGACGGCTCGCGTCGCCGAATGCGCTGACCCACACCGGTTCTGCGTGTGATATGTCGTCTCCGGTCAGGCGCTTCCAGGCGTCGGCGACTTCATCGAAGGAGGGGGGTGCGGTACGCCGCTGGGGCGGGGTGCCGCGCTCGCAGACGATCAGGCGTGTGATGCCACCGGGCAGCGGACCGACCATGACCATTCCGCCGGGCAGTGTCTCGCCGATCATGCGCGGTTCGAGTTCGATGCCCTTCACATCGGCGAGGAACATCTCCAAAGTCGCCGCGGTGCCCGGGAAGTCGAAGCCCGTGGCCTTCCGTACGGCGCTCCGCCCTCCGTCACAGCCCACCAGGTAGTCCGCGCGCAGTGTGTGGGTTCCGTCGGGGCCGCGGACATCGACCTCGACCTGCGTACCGAGGTCCCGCAGATCGAGGAACTCGTGGCTGCGCCGGATGTCGACGCCGAGGCTGCTGGCCCATTCCTCCAGGTGCGTCTCGGTGACGGATTGCGGCACGCTCTTCGCCGCCTGCAATGCGCCTTCGAGCACCCCGAAATCAATGGGTAAACCGCCGAAGTGACCGACGTTACTGGTCTCCACTTCGCCGAACCGCGGCAGGATTCCACGCTGATCGAAGACTTCCATGGTGCGCGCGGTGAATCCGAGACCGCGTGATTCGCCGGAGCGCTTCGCGAGGCGCTCCAGAACGATGACGTCAACTCCTGCGAGCCTGAGTTCGCCGGCCAGCATCATTCCCGCCGGACCTGCGCCCACGACAATCACTGCAGCGTCCATGTACCTCTCCTCGATCAGCGCAAGGGCTTCTTCAGGGTGATCCGGCACGTCGCCCATGAGCGAAGAATGCGCACCTCAGGTCCGAGCAACGACAACTACTAGTGAGATTCCCAGCCCGGGGCGGCAACTTCAAGACGATCCTTCTCAGATCTCCGTGATGTTTCTTCAGAGATCGACACGTTCGGAACGGGGAGGTCAAGCAAGCGTCAAGGAAACT

Claims (4)

1.如下式结构所示的化合物
2.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤细胞药物中的用途,其特征在于，所述肿瘤细胞为H69AR细胞。
3.一种生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种重组菌株A3(2)-OE1，保藏编号:CCTCC M 20211134，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学生命科学学院，430072。
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