CN107698602A - 具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法与应用。通过链霉菌Steptomyces qinglanensis 1772205的enterocin基因簇缺失突变株发酵分离制备得到聚酮类化合物1‑4，其结构如式(I)所示。体外细胞毒活性测试结果表明本发明所涉及的化合物1‑4对肿瘤细胞HeLa和MCF‑7表现出不同程度的抑制活性，特别是化合物1对肿瘤细胞表现出显著的抑制作用。为开发高效的抗肿瘤药物提供了理想的候选化合物。

Description

具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物药物领域，特别涉及多种具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是全球发病和死亡的一个主要原因，仅2012年就有820万人死于癌症。而我国的发病率和死亡率仍在逐渐上升，且发病年轻化趋势明显。虽然目前已开发出一些抗肿瘤药物，但昂贵的抗肿瘤药物价格、临床出现的药物耐药性以及治疗药物的毒副作用等对人类发现新的高效低毒的抗癌药物提出了不断的需求。
微生物天然产物是重要的药物先导化合物来源，大量的抗肿瘤化合物在微生物发酵产物中被发现。陆地微生物的过度发掘，使得海洋环境来源的微生物资源更具有发现新型抗肿瘤药物的潜力，从海洋放线菌中寻找抗肿瘤活性的次级代谢产物也已成为国际海洋微生物研究的重要方向。海洋红树林环境来源的链霉菌Streptomyces qinglanensis172205为一株已鉴定的链霉菌新种，被证实能够大量产生化合物enterocin(Xu D.B.etal.,Genotype-driven isolation of enterocin with novel bioactivities frommangrove-derived Streptomyces qinglanensis 172205,Appl.Microbiol.Biotechnol.2015Jul；5825-32)。本发明从中分离获得的具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其抗肿瘤用途均未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于提供四个具有抗肿瘤活性的聚酮类结构化合物。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述抗肿瘤化合物的方法。
本发明的再一目的在于提供上述抗肿瘤化合物作为制备抗肿瘤药物的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
四个抗肿瘤的聚酮类结构化合物1-4，其结构如式(I)所示：
一种生产式(I)所示结构的化合物1-4的制备方法，具体包括：
1)链霉菌Streptomyces qinglanensis 172205的enterocin生物合成基因簇缺失突变株菌株172205Δenc的构建
本发明所用的菌种为链霉菌Streptomyces qinglanensis 172205，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(编号：CGMCC 4.6825；保藏日期：2011年2月16日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)；
以链霉菌Streptomyces qinglanensis 172205的基因组DNA为模板，设计引物enc-L1和enc-L2，其核苷酸序列分别如SEQ NO.1、2所示，用于扩增enterocin合成基因簇上游片段enc-L，设计引物enc-R1和enc-R2，其核苷酸序列分别如SEQ NO.3、4所示，用于扩增enterocin合成基因簇下游片段enc-R；
扩增片段经胶回收后，与pMD19-T simple载体进行连接并转化至E.coliTop10中，利用氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并进行测序验证，然后通过双酶切分别回收基因簇上下游同源片段enc-L和enc-R以及经Nde I和Hind III酶切的pYH7载体线性片段，采用三片段酶连技术通过T4DNA连接酶将三个片段进行连接并转化至E.coli Top10中，利用阿泊拉霉素作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并酶切验证，重组质粒命名为pWHU2343；
将构建的重组质粒pWHU2343导入E.coli ET12567/pUZ8002中，以其作为接合转移的供体菌与野生型菌株进行接合转移；过程如下：刮取一块ISP2琼脂平板上生长2周后的链霉菌172205的孢子，加入0.5mL TES缓冲液(0.05M，pH＝8.0)并洗涤孢子两次，将孢子重新悬浮于500μL TES缓冲液(0.05M，pH＝8.0)，50℃水浴热休克10min；加入500μL 2×孢子预萌发培养基于37℃，220rpm预萌发4h；8000rpm转速4℃离心5min收集孢子，去除上清后用0.5mL LB培养液重悬，作为受体菌备用；另外，从含有质粒pWHU2343的E.coliET12567/pUZ8002平板上挑取单克隆接种至5mL含有卡那霉素、氯霉素和阿泊拉霉素的LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；然后吸取1mL的菌液转接至50mL含有相应抗生素的LB培养液中，置于37℃摇床中220rpm培养至OD值在0.4～0.6之间；4℃，4000rpm离心10min，大肠菌体用20mL LB洗涤两次后，重悬于0.5mL LB培养液，作为DNA供体；随后，将大肠杆菌和孢子等体积混合后取100μL均匀涂布于MS(含10mM MgCl2)平板上，吹干后倒置培养于28℃恒温培养箱中，覆盖时间为14h，定时取出后用1mL含抗生素的无菌水(终浓度为4μg/mL阿泊拉霉素及25μg/mL萘啶酮酸)均匀覆盖培养基表面，液体吹干后重新倒置于28℃恒温培养箱中，培养4～5d；
接合子在含4μg/mL阿泊拉霉素及25μg/mL萘啶酮酸的MS平板上多次传代后涂布，通过基于敲除基因簇的中间序列设计的验证引物enc-M1和enc-M2，其核苷酸序列分别如SEQ NO.5、6所示，对单克隆进行PCR筛选，筛选出无法扩增出1.9kb左右条带的候选菌株，再通过其他验证引物enc-U1和enc-U2，其核苷酸序列分别如SEQ NO.7、8所示，enc-UD1和enc-UD2，其核苷酸序列分别如SEQ NO.9、10所示，enc-D1和enc-D2，其核苷酸序列分别如SEQNO.11、12所示，分别对候选菌株进行PCR验证，从而获得引物enc-UD能扩增出约1.8kb左右单一条带而其他引物均无法扩增出目的条带的候选菌株，即为enterocin基因簇缺失突变株172205Δenc；
2)利用enterocin基因簇缺失突变株172205Δenc制备式(I)所示结构的化合物1-4
(1)将链霉菌172205Δenc先在ISP2液体培养基中培养，28℃、200r/min振荡培养3d，以5％接种量再转接到发酵培养基中进行发酵，28℃、200r/min振荡培养7d；发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，酵母提取物2g，CaCO3 3g，水1L，pH 7.2；
(2)将步骤(1)获得的发酵液上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层；菌丝体加入3倍体积的80％的丙酮溶液超声破碎后，离心取上清，去除丙酮后，水溶液采用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次；混合所有乙酸乙酯层，减压浓缩获得粗提物；
(3)将步骤(2)获得的粗提物采用硅胶100～200目进行拌样，200～300目硅胶装填硅胶柱。洗脱剂石油醚/二氯甲烷(v/v，1:0，1:1，0:1)和二氯甲烷/甲醇(v/v，100:1，50:1，5:1，2:1，0:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱体积均为3L，每升单独浓缩后共获得24个组分，经过HPLC液相检测后进行相同组分样品的混合，共分为7个大组分Fr1～Fr7；
(4)最后甲醇洗脱后，取保留在硅胶柱上的上样硅胶采用适量DMSO溶解，离心取上清，再将其与饱和NaCl盐水进行体积比为1:1混合，对混合液进行等体积的乙酸乙酯(EA)萃取，最终合并EA萃取液并进行旋干；样品回溶至2mLDMSO，对其进行C-18半制备液相分离，流动相为甲醇和水(均添加0.1％TFA-三氟乙酸)，流动相比例为甲醇:水＝75:25，最终获得化合物1；
(5)取Fr4进行加压正相硅胶色谱柱分离，采用环己烷和丙酮进行洗脱，对含有最大紫外吸收为320nm左右目标化合物的组分进行半制备HPLC分离，流动相比例为甲醇:水＝30:70，获得化合物2；对另一个含有类似紫外吸收光谱目标化合物的组分采用流动相比例为甲醇:水＝48:52，经半制备HPLC同时获得化合物3和4。
一种抗肿瘤组合物，包括抗肿瘤有效量的式(I)所示结构的化合物1-4中的至少一种。
式(I)所示结构的化合物1-4在制备抗肿瘤的药物中的作用。
本发明通过构建链霉菌Streptomyces qinglanensis 172205中enterocin生物合成基因簇的缺失突变株Δenc，避免了大量合成的enterocin干扰了其他次级代谢产物的分析判断和分离，从而能够更简易地分离纯化获得式(I)所示结构的化合物1-4，经数据库SCIfinder搜索确认为首次发现的新结构化合物，本发明通过MTT实验证明具有如式(I)所示结构的化合物1具有较强的抗肿瘤活性以及化合物2～4具有中等强度的肿瘤抑制活性。这些化合物由于其展现的抗肿瘤作用预示可用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1是enterocin生物合成基因簇缺失突变株构建示意图。
图2是enterocin生物合成基因簇缺失突变株PCR验证结果图。其中，Maker是1kbladder plus；Water为空白对照，以无菌水代替模板；Wild为野生型172205基因组模板；Δenc则是突变株的基因组模板；共设计4对验证引物enc-U、enc-M、enc-D和enc-UD。
图3是本发明的化合物1～4的高分辨质谱图
图4是本发明的化合物1～4的红外谱图。
图5是本发明的化合物1～4的氢谱图。
图6是本发明的化合物1～4的碳谱图。
图7是本发明的化合物1～4的二维核磁图谱——COSY谱图。
图8是本发明的化合物1～4的二维核磁图谱——HSQC谱图。
图9是本发明的化合物1～4的二维核磁图谱——HMBC谱图。
图10是本发明的化合物3和4的ROSEY图谱。
图11是化合物1，3和4的实际测量CD谱与量子化学计算ECD的比较图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】enterocin生物合成基因簇缺失突变株Δenc的构建
以野生型172205的基因组DNA为模板，设计引物enc-L1(5’-CCTAGGCAGTTCCATCACCCCGTTCG-3’，SEQ NO.1)和enc-L2(5’-AAGCTTGTCGTCGCAGCAGCAGTTCG-3’，SEQ NO.2)用于扩增enterocin合成基因簇上游片段enc-L，设计引物enc-R1(5’-CATATGAGAGGGCGGACGGGAACTGC-3’，SEQ NO.3)和enc-R2(5’-CCTAGGGCGCCATCCCAACGGGCTAC-3’，SEQ NO.4)用于扩增enterocin合成基因簇下游片段enc-R。使用Taq Mix酶的20μL PCR反应体系：Mix酶8μL，引物各1μL，DNA模板1μL，DMSO 1μL，超纯水8μL。PCR扩增条件为：95℃，3min预变性；95℃，30s变性；60℃(根据引物自行设置退火温度)，30s退火；72℃，2min延伸，循环次数为32次；72℃，10min后延伸；12℃，终止反应。
扩增片段经胶回收后，与pMD19-T simple载体进行连接并转化至E.coli Top10中，利用氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并进行测序验证，然后通过双酶切分别回收基因簇上下游同源片段enc-L和enc-R以及经Nde I和Hind III酶切的pYH7载体线性片段，采用三片段酶连技术通过T4DNA连接酶将三个片段进行连接并转化至E.coli Top10中，利用阿泊拉霉素作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并酶切验证，重组质粒命名为pWHU2343。
将构建的重组质粒pWHU2343导入E.coli ET12567/pUZ8002中，以其作为接合转移的供体菌与野生型菌株进行接合转移。过程如下：刮取一块ISP2琼脂平板上生长2周后的链霉菌172205的孢子，加入0.5mL TES缓冲液(0.05M，pH＝8.0)并洗涤孢子两次，将孢子重新悬浮于500μL TES缓冲液(0.05M，pH＝8.0)，50℃水浴热休克10min。加入500μL 2×孢子预萌发培养基于37℃，220rpm预萌发4h。8000rpm转速4℃离心5min收集孢子，去除上清后用0.5mL LB培养液重悬，作为受体菌备用。另外，从含有质粒pWHU2343的E.coliET12567/pUZ8002平板上挑取单克隆接种至5mL含有卡那霉素、氯霉素和阿泊拉霉素的LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。然后吸取1mL的菌液转接至50mL含有相应抗生素的LB培养液中，置于37℃摇床中220rpm培养至OD值在0.4～0.6之间。4℃，4000rpm离心10min，大肠菌体用20mL LB洗涤两次后，重悬于0.5mL LB培养液，作为DNA供体。随后，将大肠杆菌和孢子等体积混合后取100μL均匀涂布于MS(含10mM MgCl2)平板上，吹干后倒置培养于28℃恒温培养箱中，覆盖时间为14h，定时取出后用1mL含抗生素的无菌水(终浓度为4μg/mL阿泊拉霉素及25μg/mL萘啶酮酸)均匀覆盖培养基表面，液体吹干后重新倒置于28℃恒温培养箱中，培养4～5d。
接合子在含4μg/mL阿泊拉霉素及25μg/mL萘啶酮酸的MS平板上多次传代后涂布，通过基于敲除基因簇的中间序列设计的验证引物enc-M1(5’-CTCAGCAGGCGCTGGAGGGT-3’，SEQ NO.5)和enc-M2(5’-GGGCTGGGTCTCGCATCTGG-3’，SEQ NO.6)对单克隆进行PCR筛选，筛选出无法扩增出1.9kb左右条带的候选菌株，再通过其他验证引物enc-U1(5’-GGTCGAGCGTGCGCTGTCCA-3’，SEQ NO.7)、enc-U2(5’-CGAGACCGTGGTGCGGGAGA-3’，SEQNO.8)、enc-UD1(5’-CTGCTGCGCTTCGTGTTCGA-3’，SEQ NO.9)、enc-UD2(5’-GGGAGCACAGCGGCTACTGG-3’，SEQ NO.10)、enc-D1(5’-GGCCGGTCAGGGTCTTCAGT-3’，SEQNO.11)和enc-D2(5’-CACGGTCTGCGGAGGTCTCA-3’，SEQ NO.12)分别对候选菌株进行PCR验证(引物设计区域见图1)，从而获得引物enc-UD能扩增出约1.8kb左右单一条带而其他引物均无法扩增出目的条带的候选菌株(空白对照用于排除其他污染的可能性，而野生型模板对照只有在使用引物enc-UD进行扩增时才无法扩增出约1.8kb左右的条带)，即为enterocin基因簇缺失突变株172205Δenc。构建示意图见图1，突变株PCR验证结果见图2。
【实施例2】突变株172205Δenc大量发酵及其发酵物样品前处理方法
将实施例1中获得的突变株172205Δenc接种于ISP2液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养3d，以5％接种量转接至60L发酵培养基的摇瓶中，28℃、200r/min振荡培养7d，获得发酵液。发酵液上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层；菌丝体加入3倍体积的80％的丙酮水溶液超声破碎1h，重复3次，离心取上清，去除丙酮后，水溶液采用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次；混合所有乙酸乙酯层，减压浓缩获得粗提物。所述的ISP2液体培养基由以下组分组成：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，pH值为7.2。所述的发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，酵母提取物2g，CaCO3 3g，水1L，pH 7.2。
【实施例3】化合物的分离及结构确认
(1)化合物分离
将实施例2中获得的约80g的粗提取物采用硅胶100～200目进行拌样，200～300目硅胶装填硅胶柱。洗脱剂石油醚/二氯甲烷(v/v，1:0，1:1，0:1)和二氯甲烷/甲醇(v/v，100:1，50:1，5:1，2:1，0:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱体积均为3L，每升单独浓缩后共获得24个组分，经过HPLC液相检测后进行相同组分样品的混合，共分为7个大组分Fr1～Fr7。
甲醇最后洗脱后，取保留在硅胶柱上的上样硅胶采用适量DMSO溶解，离心取上清，再加入等体积的饱和NaCl盐水，对混合液进行等体积的乙酸乙酯(EA)萃取，合并EA萃取液并旋干。样品回溶至2mL DMSO，对其进行C-18半制备液相分离，流动相为甲醇和水(均添加0.1％TFA-三氟乙酸)，流动相比例为甲醇:水＝75:25，纯化获得化合物1。
取Fr4进行加压正相硅胶色谱柱分离，采用环己烷和丙酮进行洗脱，对含有最大紫外吸收为320nm左右目标化合物的组分进行半制备HPLC分离，流动相比例为甲醇:水＝30:70，获得化合物2；对另一个含有类似紫外吸收光谱目标化合物的组分采用流动相比例为甲醇:水＝48:52，经半制备HPLC同时获得化合物3和4。
(2)平面结构确认
通过MS(图3)、IR(图4)、一维(图5和6)和二维NMR(图7-10)多种波谱学手段，确定了上述化合物的结构，其理化性质与波谱数据如下：
化合物1：暗红色粉末；＝-168.85°(c 0.046,MeOH/CHCl3＝5:1)；UVλmax(logε)MeOH：247(4.34)，279(4.23)，316(4.08)，478(3.80)nm；CD(c 0.010,MeOH)λmax(Δε)：224(-4.00)，252(+0.42)，285(-2.17)，310(-0.61)，347(-2.62)，493(+0.85)nm；IRυmax(KBr)：3428，2925，1633，1028cm-1；HRESIMS(m/z)：534.0587[M+H]+(calcd for C27H17ClNO9，534.0586)；根据化合物核磁共振数据(表1)确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物。
化合物2：黄色粉末；UVλmax(logε)MeOH：225(3.80)，324(4.96)nm；IRυmax(KBr)：3430，2955，2930，1709，1664，1361，1253，998，604cm-1；HRESIMS(m/z)：179.1064[M+H]+(calcd for C11H15O2，179.1067)；根据化合物核磁共振数据(表2)确认了其化学结构，经SCIfinder搜索确认该化合物为新结构的化合物。
化合物3：无色油状物；＝+31.55°(c 0.727,MeOH)；UVλmax(logε)MeOH：223(4.07),311(4.40)nm；CD(c 0.013,MeOH)λmax(Δε)：200(-0.6)，224(+1.3)，316(+0.4)nm；IRυmax(KBr)：3437，2983，2936，1756，1640，1386，1273，1224，1056，995cm-1；HRESIMS(m/z)：279.1587[M+H]+(calcd forC16H23O4，279.1591)；根据化合物核磁共振数据(表3)确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物。
化合物4：无色油状物；＝-93.91°(c 0.553,MeOH)；UVλmax(logε)MeOH：221(4.11),313(4.46)nm；CD(c 0.011,MeOH)λmax(Δε)：201(+1.2)，225(-2.9)，310(-3.8)nm；IRυmax(KBr)：3432，2980，2934，1774，1758，1716，1640，1386，1274，1225，1113，1065，996，954cm-1；HRESIMS(m/z)：279.1587[M+H]+(calcd for C16H23O4，279.1591)；根据化合物核磁共振数据(表4)确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物。
(3)绝对构型确认
获得化合物平面结构后，采用量子化学计算化合物的电子圆二色谱ECD确定了化合物1，3和4的绝对构型。该方法采用软件Gaussian 03运用含时密度泛函理论TDDFT(Time-Dependent-Density Functional Theory)方法在B3LYP/6-31G(d)条件下进行计算。首先利用软件HyperChem 7.5进行化合物低能量态构像搜索；然后进行低能量态构像结构优化获得稳定构型，结构优化计算方法为B3LYP/6-31G(d)；最后采用B3LYP/6-311++G(2d,p)条件计算其在甲醇中的圆二色光谱，并与实际测量值比较(图11)。最终确认化合物1为15S-17,18-dehydroxantholipin，化合物3的绝对构型为3R,4S，命名为qinlactoneA，以及化合物4的绝对构型为3R,4R，该化合物命名为qinlactone B。
表1、化合物1的1H和13C NMR数据(800and 200MHz,DMSO-d6)
*,**,***通过相似化合物文献报道核磁数据归属。
表2、化合物2的1H和13C NMR数据(500and 125MHz,CD3OD-d4,δin ppm)
表3、化合物3的1H和13C NMR数据(500and 125MHz,CD3OD-d4,δin ppm)
表4、化合物4的1H和13C NMR数据(500and 125MHz,CD3OD-d4,δin ppm)
最终确定聚酮类化合物的结构如式(I)所示：
【实施例4】细胞毒活性检测化合物1～4的抗肿瘤活性
细胞毒实验采用MTT法检测，样品配置方法如下：取各化合物原液10μL，加入190μL无菌RPMI1640培养基稀释成样品测试母液(0.5mg/mL)。进一步利用无菌RPMI1640培养基进行梯度稀释，分别稀释成浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.13mg/mL、60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、8μg/mL和4μg/mL的样品液备用。检测方法如下：取对数生长的肿瘤细胞，胰酶消化后加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养液。以5000～6000个/孔的细胞密度接种于无菌96孔培养板中，每孔90μL，置于37℃过夜培养。各孔中分别加入10μL样品液，每个样品重复3孔，继续放置于37℃培养48h，每孔加入12μL MTT溶液(终浓度为0.5mg/mL)继续培养4h，小心吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡10min后使用酶标仪在570nm处检测每孔吸光度，参比波长为690nm。以空白对照孔调零，根据吸光值结果计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％，再根据不同浓度的抑制率利用SPSS软件计算IC50。
结果如表5所示化合物1具有较强的抑制MCF-7和Hela细胞增殖的作用(IC50分别为3.28和3.65μg/mL)，而化合物2、3和4具有中等强度的MCF-7和Hela细胞毒性(IC50均在40μg/mL左右)。
表5、活性化合物的细胞毒性(IC50,μg/mL)
序列表
<110> 武汉大学
<120> 具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cctaggcagt tccatcaccc cgttcg 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aagcttgtcg tcgcagcagc agttcg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
catatgagag ggcggacggg aactgc 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cctagggcgc catcccaacg ggctac 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ctcagcaggc gctggagggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gggctgggtc tcgcatctgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggtcgagcgt gcgctgtcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cgagaccgtg gtgcgggaga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ctgctgcgct tcgtgttcga 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gggagcacag cggctactgg 20
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
ggccggtcag ggtcttcagt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
cacggtctgc ggaggtctca 20

Claims (4)

1.四个抗肿瘤的聚酮类结构化合物1-4，其特征在于，其结构如式(I)所示：
2.一种生产如权利要求1所述的式(I)所示结构的化合物1-4的制备方法，其特征在于，具体包括：
1)以保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 4.6825的链霉菌Streptomyces qinglanensis 172205的基因组DNA为模板，构建enterocin生物合成基因簇缺失突变株菌株172205Δenc；
2)利用enterocin基因簇缺失突变株172205Δenc制备式(I)所示结构的化合物1-4
(1)将链霉菌172205Δenc先在ISP2液体培养基中培养，28℃、200r/min振荡培养3d，以5％接种量再转接到发酵培养基中进行发酵，28℃、200r/min振荡培养7d；发酵培养基由以下组分组成：葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，酵母提取物2g，CaCO33g，水1L，pH 7.2；
(2)将步骤(1)获得的发酵液上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层；菌丝体加入3倍体积的80％的丙酮溶液超声破碎后，离心取上清，去除丙酮后，水溶液采用2倍体积的乙酸乙酯萃取3次；混合所有乙酸乙酯层，减压浓缩获得粗提物；
(3)将步骤(2)获得的粗提物采用硅胶100～200目进行拌样，200～300目硅胶装填硅胶柱。洗脱剂石油醚/二氯甲烷(v/v，1:0，1:1，0:1)和二氯甲烷/甲醇(v/v，100:1，50:1，5:1，2:1，0:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱体积均为3L，每升单独浓缩后共获得24个组分，经过HPLC液相检测后进行相同组分样品的混合，共分为7个大组分Fr1～Fr7；
(4)最后甲醇洗脱后，取保留在硅胶柱上的上样硅胶采用适量DMSO溶解，离心取上清，再将其与饱和NaCl盐水进行体积比为1:1混合，对混合液进行等体积的乙酸乙酯(EA)萃取，最终合并EA萃取液并进行旋干；样品回溶至2mLDMSO，对其进行C-18半制备液相分离，流动相为均添加0.1％TFA-三氟乙酸的甲醇和水，流动相比例为甲醇:水＝75:25，最终获得化合物1；
(5)取Fr4进行加压正相硅胶色谱柱分离，采用环己烷和丙酮进行洗脱，对含有最大紫外吸收为320nm左右目标化合物的组分进行半制备HPLC分离，流动相比例为甲醇:水＝30:70，获得化合物2；对另一个含有类似紫外吸收光谱目标化合物的组分采用流动相比例为甲醇:水＝48:52，经半制备HPLC同时获得化合物3和4。
3.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括抗肿瘤有效量的权利要求1所述的式(I)所示结构的化合物1-4中的至少一种。
4.权利要求1所述的式(I)所示结构的化合物1-4在制备抗肿瘤的药物中的作用。
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