CN110642863B - 5,5,6型ptm类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了5,5,6型PTM类化合物及其制备方法和用途。本发明从链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物中分离得到6个新的5,5,6型PTM类化合物，其结构式如式(II)所示。本发明通过实验发现，化合物1‑5对人乳腺癌细胞MCF‑7、人神经胶质瘤细胞SF‑268、人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌肿瘤细胞HepG‑2都具有中等细胞毒活性，化合物1和化合物3对人乳腺癌细胞MCF‑7细胞毒活性优于或与阳性对照顺铂相当，化合物5对人神经胶质瘤细胞SF‑268具有与阳性对照顺铂相当的细胞毒活性。说明化合物1‑5均具有细胞毒活性，可望开发成为抗肿瘤新药。
Figure DDA0002211868880000011

Description

5,5,6型PTM类化合物及其制备方法和用途
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及5,5,6型PTM类化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
Polycyclic tetramate macrolactams(PTMs)是一类分布广泛、生物活性丰富的天然产物。5,5,6型PTM是其家族成员之一，其结构中包含有5-5-6三环系统。目前，5,5,6型PTM主要从链霉菌属(Streptomyces)和溶杆菌属(Lysobacter)的菌株中分离得到，具有多种有价值的生物活性，如抗真菌和抗生素的特性，其代表化合物HSAF已被用作控制植物病害的抗真菌剂。
发明内容：
本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供5,5,6型PTM类化合物及其制备方法和用途。
本发明的第一个目的是提供5,5,6型PTM类化合物，其结构式如式(I)中的任一化合物：
Figure BDA0002211868860000011
其中，R1选自-OH、＝O；R2、R3选自-H、-OH。
优选，所述的5,5,6型PTM类化合物，其结构式如式(I′)中的任一化合物：
Figure BDA0002211868860000021
其中，R1选自-OH、＝O；R2、R3选自-H、-OH。
优选，所述的5,5,6型PTM类化合物，其结构式如式(II)中的任一化合物：
Figure BDA0002211868860000022
其中，1为化合物1；2为化合物2；3为化合物3；4为化合物4；5为化合物5；6为化合物6。
本发明的第二个目的是提供所述的5,5,6型PTM类化合物1-6的制备方法，所述的5,5,6型PTM类化合物1-6是从链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物中制备分离得到的。
具体步骤如下：
a)制备链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液经丁酮萃取，丁酮萃取液浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液经减压回收丙酮后剩余水混合液用丁酮萃取，丁酮萃取液浓缩后得到浸膏B；
b)将浸膏A和浸膏B合并的粗提物，经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，从体积比100/0,95/5,90/10,80/20,50/50和0/100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比为95:5梯度洗脱下来的馏分Fr.2，收集氯仿/甲醇体积比为90:10梯度洗脱下来的馏分Fr.3；
馏分Fr.2经C18反相中压液相层析，以甲醇/水为洗脱剂，从体积分数0-100％梯度洗脱，收集体积分数70-80％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分Fr.2.14-Fr.2.15，馏分Fr.2.14-Fr.2.15经半制备高效液相层析纯化后得到化合物2、化合物3和化合物4；
馏分Fr.3经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，洗脱的馏分经半制备高效液相层析纯化后得到化合物1、化合物5和化合物6。
步骤a)所述的制备链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物是通过以下方法制备的：将活化的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养72h制得种子液，将种子液以体积分数10％的接种量接入发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养7d，而制得发酵培养物；所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为：每升培养基中含有淀粉10g、酵母提取物4g、蛋白胨2g、CaCO3 2g和粗海盐30g，余量为水，pH7.2-7.4。
本发明的第三个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010在制备所述的5,5,6型PTM类化合物1-6中的应用。
本发明通过实验发现，化合物1-5对人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268、人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌肿瘤细胞HepG-2都具有中等细胞毒活性(IC50值介于2.47～17.68μM)；化合物1和化合物3对人乳腺癌细胞MCF-7细胞毒活性优于或与阳性对照顺铂相当，化合物5对人神经胶质瘤细胞SF-268具有与阳性对照顺铂相当的细胞毒活性。说明化合物1-5均具有细胞毒活性，可望开发成为抗肿瘤新药。
因此，本发明的第四个目的是提供所述的5,5,6型PTM类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物优选为抗人乳腺癌、人神经胶质瘤、人非小细胞肺癌或人肝癌的药物。
本发明的第五个目的是提供一种抗肿瘤药物，包含有效量的所述的5,5,6型PTM类化合物作为活性成份。
本发明从链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物中分离得到6个新的5,5,6型PTM类化合物1-6，本发明通过实验发现，化合物1-5对人乳腺癌细胞MCF7、人神经胶质瘤细胞SF-268、人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌肿瘤细胞HepG-2都具有中等细胞毒活性，可望开发成为抗肿瘤新药。因此本发明为制备具有抗肿瘤活性的PTM类化合物1-5的生产制备提供了一种新的方法，为开发高效、低毒的抗菌抗肿瘤药物提供了理想的侯选化合物。
本发明的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010，于2019年08月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCC No：60754。
附图说明：
图1是链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010基于16S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的分离和鉴定
本发明的海洋来源的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010是从马来西亚槟城红树林沉积物中分离获得的，常规方法提取其16S rDNA，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将16S rDNA进行BLAST比对，并进行系统发育树分析，系统发育树如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌与一组Streptomyces属物种的系统进化关系，表明该菌株属于Streptomyces属的一种，由此将该菌株命名为链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010，该菌株于2019年08月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为：GDMCC No：60754。
实施例2：活性代谢产物的分离和制备
1、种子培养基和发酵培养基的配方都为：每升培养基中含有淀粉10g、酵母提取物4g、蛋白胨2g、CaCO3 2g和粗海盐30g，余量为水，pH 7.2-7.4。按上述组份和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min。
2、发酵
2.1、种子培养：将活化的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010接入每瓶含有30mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28℃，200rpm，培养72h制得种子液。
2.2、发酵培养：将种子液以体积分数10％的接种量接入到20L发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养7d，而制得发酵培养物。
3、萃取：发酵培养物经离心(3900r·min-1，15min)将发酵液和菌丝体分离，发酵液用丁酮萃取4次，合并丁酮萃取液，减压蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮在室温下浸提4次，合并丙酮浸提液，减压回收丙酮后剩余水混合液用丁酮萃取，丁酮萃取液减压蒸馏浓缩后得到浸膏B，将浸膏A和浸膏B合并，得到粗提物(11.5g)。
4、活性化合物的提取分离和鉴定
将浸膏A和浸膏B合并的粗提物(11.5g)用20g硅胶(100-200目)进行拌样，经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，从体积比100/0,95/5,90/10,80/20,50/50和0/100梯度洗脱(每个梯度洗脱1000mL)，氯仿/甲醇体积比为100:0梯度洗脱下来的馏分Fr.1，氯仿/甲醇体积比为95:5梯度洗脱下来的馏分Fr.2，氯仿/甲醇体积比为90:10梯度洗脱下来的馏分Fr.3，氯仿/甲醇体积比为80:20梯度洗脱下来的馏分Fr.4，氯仿/甲醇体积比为50:50梯度洗脱下来的馏分Fr.5，氯仿/甲醇体积比为0:100梯度洗脱下来的馏分Fr.6。将馏分Fr.2(0.72g)进行C18反相中压液相层析(柱型14.5×2.5cm，流速15mL/min)，以甲醇/水为洗脱剂，从体积分数0-100％梯度洗脱300min，依次得到18个馏分(Fr.2.1-Fr.2.18)。将馏分Fr.2.14-Fr.2.15(170mg，体积分数70-80％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分)进行半制备高效液相层析(Hitachi HP LC station，反相柱Phenomenex Gemini C18,250mm×4.6mm,5μm；流动相为体积比65:35的乙腈/水，2.5mL min-1)纯化得到化合物2(3.4mg，保留时间为16.8min)，化合物3(10.8mg，保留时间为19.7min)，化合物4(3.6mg，保留时间为28.2min)。将馏分Fr.3(0.83g，氯仿/甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分)进行凝胶柱层析(Sephadex LH-20)，用体积比1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，每15mL收集合并为一份，顺序得到馏分Fr.3.1-Fr.3.25，然后对馏分Fr.3.5-Fr.3.9(300mg)进行半制备高效液相层析(Hitachi HPLC statio n，反相柱Phenomenex Gemini C18,250mm×4.6mm,5μm；流动相为体积比45:55的乙腈/水，2.5mL min-1)，得到化合物1(4.1mg，保留时间为11.5min)，化合物5(5.6mg，保留时间为14.5min)和化合物6(2.8mg，保留时间为20.7min)。
结构鉴定：
化合物1:白色粉末；
Figure BDA0002211868860000071
(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)322(3.92)nm,219(4.18)nm；ECD(c 4.3×10-4M,MeOH)λmax(Δε)215(+15.5),241(-18.1),326(+6.2)nm；IRνmax 3356,2951,2918,2369,2341,1653,1541,1471,1020,679cm-1；1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(+)-HR ESIMS m/z[M+H]+513.2960(calcdfor C29H41N2O6,513.2965).由此鉴定化合物1的结构式如式(II)的1所示。
化合物2:白色粉末；
Figure BDA0002211868860000072
(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)322(4.03)n m,212(4.37)nm；ECD(c 2.2×10-4M,MeOH)λmax(Δε)214(+7.8),244(-9.9),326(+4.4)nm；IRνmax 3356,3334,2953,2868,2358,2341,1647,1541,1506,1203,1024,669cm-1；1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(+)-HRESIMS m/z[M+H]+497.3010(calcd for C29H41N2O5,497.3015).由此鉴定化合物2的结构式如式(II)的2所示。
化合物3:淡红色固体；
Figure BDA0002211868860000073
(c 0.06,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)322(4.06)nm,218(4.31)nm；ECD(c 4.9×10-4M,MeOH)λmax(Δε)214(+26.3),238(-23.1),332(+6.0)nm；IRνmax 3336,2953,2920,2358,2341,1647,1456,1022,679cm-1；1H N MR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(-)-HRES IMS m/z[M-H]-509.2642(calcdfor C29H37N2O6,509.2952).由此鉴定化合物3的结构式如式(II)的3所示。
化合物4:白色粉末；
Figure BDA0002211868860000074
(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)322(3.97)nm,219(4.27)nm；ECD(c 2.6×10-4M,MeOH)λmax(Δε)210(+15.3),247(-16.9),327(+5.0)nm；IRνmax 3335,2951,2920,2837,2358,2341,1653,1456,1018,758,669cm-1；1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(+)-HRESIMS m/z[M+H]+495.2846(calcd for C29H39N2O5,495.2859).由此鉴定化合物4的结构式如式(II)的4所示。
化合物5:淡红色粉末；
Figure BDA0002211868860000082
(c 0.06,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)321(4.02)nm,216(4.32)nm；ECD(c 4.0×10-4M,MeOH)λmax(Δε)214(+24.1),238(-18.4),326(+4.4)nm；IRνmax 3334,3327,2955,2927,2359,2342,1697,1653,1541,1471,1217,1024,754,678cm-1；1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(+)-HRESIMS m/z[M+H]+527.2757(calcd for C29H39N2O7,527.2757).由此鉴定化合物5的结构式如式(II)的5所示。
化合物6:淡黄色固体；
Figure BDA0002211868860000083
(c 0.06,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)322(3.96)nm,226(4.39)nm；ECD(c 2.9×10-4M,MeOH)λmax(Δε)209(+12.0),239(-7.4),332(+2.7)nm；IRνmax 3321,2957,2926,2359,2342,1684,1647,1541,1456,1238,669c m-1；1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据见表1和表2；(+)-HRESIMS m/z[M+H]+511.2800(calcd for C29H39N2O6,511.2808).由此鉴定化合物6的结构式如式(II)的6所示。
表1.化合物1-6的1H NMR数据
Figure BDA0002211868860000081
Figure BDA0002211868860000091
注：氢谱是在700MHz磁场频率下测试的，溶剂为氘代DMSO-d6
表2.化合物1-6的13C NMR数据
Figure BDA0002211868860000092
Figure BDA0002211868860000101
注：碳谱是在176MHz磁场频率下测试的，溶剂为氘代DMSO-d6
Figure BDA0002211868860000102
实施例3：化合物1-5的细胞毒活性测定
测定了化合物1-5对人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268、人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌肿瘤细胞HepG-2的抑制活性(IC50)，实验方法参考文献(Skehan,P.；Stor eng,R.；Scudiero,D.；Monks,A.；McMahon,J.；Vistic a,D.；Warren,J.T.；Bokesch,H.；Kenney,S.；Boyd,M.R.,New colorimetric cytotoxicity assay for anticancerdrug screening.J.Natl.Ca ncer Inst.1990,82,1107-1112.)，结果如表3所示：
表3.化合物1-5的细胞毒活性
Figure BDA0002211868860000111
注：a顺铂
由表3表明，化合物1-5对人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268、人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌肿瘤细胞HepG-2都具有中等细胞毒活性(IC50值介于2.47～17.68μM)；化合物1和化合物3对人乳腺癌细胞MCF-7细胞毒活性优于或与阳性对照顺铂相当。化合物5对人神经胶质瘤细胞SF-268具有与阳性对照顺铂相当的细胞毒活性。综合数据表明化合物1-5能够被用于制备抗肿瘤的药物。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 5,5,6型PTM类化合物及其制备方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1361
<212> DNA
<213> 链霉菌SCSIO 40010(Streptomyces sp. SCSIO 40010)
<400> 1
gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt cgtgacgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat ctgcgattac tagcaactcc gacttcatgg 120
ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt ttgagattcg ctccgcctca 180
cggcatcgca gctcattgta ccggccattg tagcacgtgt gcagcccaag acataagggg 240
catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt ctcctgtgag 300
tccccatcac cccgaaaggc atgctggcaa cacagaacaa gggttgcgct cgttgcggga 360
cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcaccacctg tataccgacc 420
acaagggggg caccatctct gatgctttcc ggtatatgtc aagccttggt aaggttcttc 480
gcgttgcgtc gaattaagcc acatgctccg ctgcttgtgc gggcccccgt caattccttt 540
gagttttagc cttgcggccg tactccccag gcggggaact taatgcgtta gctgcggcac 600
cgacgacgtg gaatgtcgcc aacacctagt tcccaacgtt tacggcgtgg actaccaggg 660
tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagtaatg gcccagagat 720
ccgccttcgc caccggtgtt cctcctgata tctgcgcatt tcaccgctac accaggaatt 780
ccgatctccc ctaccacact ctagctagcc cgtatcgaat gcagacccgg ggttaagccc 840
cgggctttca catccgacgt gacaagccgc ctacgagctc tttacgccca ataattccgg 900
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ggctcatcct tcaccgccgg agctttcaac ccccacccat gcaggcagga gtattatccg 1260
gtattagacc ccgtttccag ggcttgtccc agagtgaagg gcagattgcc cacgtgttac 1320
tcacccgttc gccactaatc caccaccgaa gcggcttcat c 1361

Claims (3)

1.5,5,6型PTM类化合物1-6的制备方法，其特征在于，所述的5,5,6型PTM类化合物1-6是从链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物中制备分离得到的；
所述的5,5,6型PTM类化合物1-6的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0002992760230000011
其中，1为化合物1；2为化合物2；3为化合物3；4为化合物4；5为化合物5；6为化合物6；
具体步骤如下：
a)制备链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液经丁酮萃取，丁酮萃取液浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液经减压回收丙酮后剩余水混合液用丁酮萃取，丁酮萃取液浓缩后得到浸膏B；
b)将浸膏A和浸膏B合并的粗提物，经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，从体积比100/0,95/5,90/10,80/20,50/50和0/100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比为95:5梯度洗脱下来的馏分Fr.2，收集氯仿/甲醇体积比为90:10梯度洗脱下来的馏分Fr.3；
馏分Fr.2经C18反相中压液相层析，以甲醇/水为洗脱剂，从体积分数0-100％梯度洗脱，收集体积分数70-80％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分Fr.2.14-Fr.2.15，馏分Fr.2.14-Fr.2.15经半制备高效液相层析纯化后得到化合物2、化合物3和化合物4；
馏分Fr.3经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以体积比1:1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱，洗脱的馏分经半制备高效液相层析纯化后得到化合物1、化合物5和化合物6。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述的制备链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010的发酵培养物是通过以下方法制备的：将活化的链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养72h制得种子液，将种子液以体积分数10％的接种量接入发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养7d，而制得发酵培养物；所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为：每升培养基中含有淀粉10g、酵母提取物4g、蛋白胨2g、CaCO3 2g和粗海盐30g，余量为水，pH 7.2-7.4。
3.链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 40010在制备5,5,6型PTM类化合物1-6中的应用；所述的5,5,6型PTM类化合物1-6的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0002992760230000021
其中，1为化合物1；2为化合物2；3为化合物3；4为化合物4；5为化合物5；6为化合物6。
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