CN108048369B - 一种产星形孢菌素的海洋链霉菌及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从海洋沉积物中筛选得到的一种产生星形孢菌素的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3‑202以及利用其制备星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c等吲哚咔唑生物碱的方法。海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3‑202于2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC 15228。本发明为星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c的生产制备提供了一条新的途径。

Description

一种产星形孢菌素的海洋链霉菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物领域，涉及从海洋沉积物中筛选得到的一种产生星形孢菌素的海洋链霉菌IMB3-202以及从中制备星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、 holyrine A和K252c等吲哚咔唑生物碱的方法。
背景技术：
吲哚咔唑(indolocarbazole)生物碱是一类具有吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核结构的天然产物，具有良好的抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒和神经保护等生物活性。星形孢菌素(staurosporine，CAS No.62996-74-1)，结构如式I (1)所示，是从链霉菌Streptomyces staurosporeus AM-2282的中发现的第一个吲哚咔唑生物碱[Omura,S.等，J.Antibiot.1977,30,275-282.]。去甲基星形孢菌素 (3′-De-O-methylstaurosporine，CAS No.161743-35-7)，结构如式I(2)所示，发现于Streptomyceslongisporoflavus R19的突变株发酵产物中；holyrine A(CAS No.249512-77-4)，结构如式II所示，最初从一株海洋放线菌中分离得到； K252c(CAS No.85753-43-1)，结构如式III所示，发现于Nocardiopsissp.K-252 菌株的发酵产物中。以上化合物均为吲哚咔哚类生物碱。吲哚咔唑生物碱具有很好的药物开发前景。2017年4月，第一个吲哚咔唑类药物，米哚妥林(midostaurin, PKC412)在美国正式批准上市，用于FLT3突变阳性的急性骨髓性白血病患者的治疗【Kim ES,Drugs,2017,77:1251-1259】。米哚妥林是星形孢菌素的半合成衍生物，其合成路线是以星形孢菌素为原料，通过苯甲酰化反应化学合成获得【Caravatti,G.；Fredenhagen,A.US Patent5093330A,1992；Hoehn,P. WO2006048296A1】。
发明内容：
本发明目的之一，提供一种能够产生抗肿瘤化合物星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c等吲哚咔唑生物碱的产生菌：海洋链霉菌 (Streptomyces sp.)IMB3-202，生物保藏编号为CGMCC 15228。
产生的星形孢菌素可为米哚妥林等吲哚咔唑类药物的合成提供原料。
本发明的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202是从我国大连海域海底沉积物中分离得到。
该菌株的分类学特征是：菌株干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，基内菌丝和气生菌丝结合紧密且不易挑起，末期产生孢子后，孢子易刮取。在ISP4 培养基上菌落呈白色，后期菌落呈灰白色。ISP2培养基：菌株干燥，呈白色，单菌落一般呈圆形，较小，中心呈分散状向四周扩散，边缘菌落较厚，末期产生孢子后，孢子易刮取，后期菌落呈灰白色。ISP3培养基：菌落干燥，呈白色，向四周扩散，边缘菌落较厚，后期菌落呈灰白色。SFM培养基：菌落干燥，呈白色，生长紧密，较厚，后期菌落呈灰白色。
本发明所述的化合物星形孢菌素，如式I所示，其中，R＝CH3。
本发明所述的化合物去甲基星形孢菌素，如式I所示，其中，R＝H。
本发明所述的化合物holyrine A，如式II所示。
本发明所述的化合物K252c，如式III所示。
Figure RE-GDA0001587255420000021
本发明目的之二是，提供星形孢菌素及其衍生物去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c的制备方法。
优选的，本发明所述的星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c 的制备方法，其特征是，从海洋链霉菌IMB3-202的发酵产物中制备得到，所述方法包括以下步骤：
(1)制备海洋链霉菌IMB3-202的发酵培养物。发酵培养物经固液分离，获得上清液和菌丝体；
(2)上清液上大孔吸附树脂柱层析，依次用4倍柱体积水、50％-100％的丙酮、甲醇或乙醇洗脱；菌丝体用等2-3倍体积的丙酮、甲醇或乙醇超声提取2次。上清液大孔树脂丙酮、甲醇或乙醇洗脱液与菌丝体提取液合并，减压浓缩除去溶剂后得到浸膏；
(3)浸膏经正相硅胶柱层板，以用二氯甲烷-甲醇(100:1，50:1，20:1，9:1， 4:1,2:1,0:100，V/V)梯度洗脱。收集二氯甲烷-甲醇20:1的馏分，经Sephadex LH-20 柱色谱脱色，二氯甲烷-甲醇1:1洗脱，收集脱色后的组分经HPLC色谱制备纯化[C18 5μM，10mm×250mm,25－40％的乙腈水溶液(含01％甲酸)为流动相， 5mL·min-1]，得到式Ⅰ所示的化合物1(星形孢菌素)、式II所示化合物holyrine A和式III所示化合物K252c。收集二氯甲烷-甲醇9:1洗脱的镏分，经HPLC制备纯化[C18 5μM，10mm×250mm,乙腈-水-甲酸溶液23:77:0.1为流动相，5 mL·min-1]得到式I所示化合物2去甲基星形孢菌素。
其中，制备方法中使用的链霉菌，优选为海洋链霉菌(Streptomyces sp.) IMB3-202，分离自中国大连黄海黑石礁海湾深度为约40m的海洋沉积物，该菌株于2018年1月18日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC 15228，分类名：链霉菌Streptomyces sp。
本发明目的之三是，提供海洋链霉菌IMB3-202的发酵培养物。
本发明所述的制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵培养物优选通过以下方法制备：
将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202菌种接入发酵培养基中，于28℃振摇培养96～168小时，得到发酵培养物。
所述的发酵培养基为下述培养基中的任意一种：
M1培养基：淀粉10g，葡萄糖25g，棉籽饼粉10g，蛋白胨3g，螺旋藻3g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.1g，NaCl 5g，CaCO3 5g，海盐30g，去离子水至 1L，pH 7.0-7.2。
M2培养基：葡萄糖4g，酪蛋白5g，胰蛋白胨3g，海盐30g，去离子水至 1L,pH 7.0-7.2。
M3培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2。
M4培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，去离子水至1L,pH7.0-7.2。
M5培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4 mg，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2。
M6培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4 mg，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
M7培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，海盐30g，去离子水至1L,pH7.0-7.2。
M8培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
发明效果：
本发明从来源于海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵产物中，获得4个具有抗肿瘤活性的吲哚咔唑化合物星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、 holyrine A和K252c。其中，以M2培养基作为发酵培养基，发酵液中星形孢菌素效价达到38.5mg/L，高于原产菌株Streptomyces staurosporeus AM-2282中星形孢菌素的效价(23mg/L)；以M1培养基作为发酵培养基时，通过所述制备方法，星形孢菌素的得率达到4.0mg/L。为以上化合物的生产制备提供一条新的途径，也为米哚妥林等吲哚咔唑类药物的合成提供原料。
具体实施方式：
本发明实施方案适用于从任何微生物，而不限于从链霉菌发酵液制备星形孢菌素。以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>海洋链霉菌(Streptomycessp.)IMB3-202的鉴定
a)菌株来源：海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202由本实验室从中国大连黄海黑石礁海湾(38°49'N,121°34'E)深度约40m的海洋沉积物中分离获得。
b)菌株鉴定：根据16S rRNA基因序列在微生物种属中的保守性，对链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202进行鉴定。提取链霉菌(Streptomyces sp.) IMB3-202的基因组，PCR扩增其16S rRNA基因并进行测序，提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号为HM467146。其序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
Figure RE-GDA0001587255420000051
表明，该菌属于链霉菌科链霉菌属中的一种，据此将该菌命名为链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202并于2018年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 15228。
<实施例2>链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵
将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202菌种接种于500mL摇瓶中，每瓶含100mL的M1培养基，28℃，180rpm，振摇培养96～168小时，得到发酵培养物，共25L。
所述的M1培养基，每升中含有：淀粉10g，葡萄糖25g，棉籽饼粉10g，蛋白胨3g，螺旋藻3g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.1g，NaCl 5g，CaCO3 5g，海盐30g，去离子水至1L。
<实施例3>发酵液的提取与浸膏的获得
链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202发酵液(共25L)经离心后得到上清液和菌丝体；菌丝体用2～3倍丙酮超声提取，得到菌丝体丙酮提取物；上清液上XAD7HP大孔吸附树脂柱层板，依次用水、50％、100％丙酮洗脱，收集50％和 100％丙酮洗脱镏分；将50％、100％丙酮洗脱镏分和菌丝体丙酮提取物合并，减压浓缩除去丙酮后得到发酵产物浸膏。
<实施例4>星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c的分离制备
将实施例3中获得的链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202发酵产物浸膏，上硅胶柱层板，依次用二氯甲烷-甲醇(100:1，50:1，20:1，9:1，4:1,2:1,0:100，V/V) 梯度洗脱；收集二氯甲烷-甲醇20:1的洗脱馏分，经Sephadex LH-20柱色谱，二氯甲烷:甲醇(1:1，V/V)洗脱，得到3个混合组分(F3-1-F3-3)；组分F3-1经HPLC 制备(C18 5μM，10mm×250mm，乙腈-水-甲酸25:75:0.1，V/V为流动相，流速5mL·min-1)纯化得到式I所示化合物(R＝CH3)星形孢菌素(100mg)；组分 F3-2经HPLC制备纯化(C18 5μM，10mm×250mm，乙腈-水-甲酸30:70:0.1为流动相，流速5mL·min-1)得到式II所示化合物holyrine A(3mg)；组分F3-3经 HPLC制备纯化(C185μM，10mm×250mm,乙腈-水-甲酸40:60:0.1为流动相，流速5mL·min-1)纯化得到式III所示化合物K252c(2mg)。收集二氯甲烷-甲醇 9:1的洗脱馏分，经Sephadex LH-20柱层析脱色，二氯甲烷:甲醇(1:1，V/V) 洗脱，脱色后的组分经HPLC制备纯化(C18 5μM，10mm×250mm，乙腈-水- 甲酸23:77:0.1，V/V，流速5mL·min-1)纯化得到式I所示(R＝H)去甲基星形孢菌素(2mg)。
式I所示化合物、式II所示化合物、式III所示化合物，其结构分别鉴定为星形孢菌素，去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c，其波谱数据如下。
星形孢菌素：1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.19(d,J＝7.8Hz,H-1),7.40(t,J ＝7.8Hz,H-2),7.24(t,J＝7.8Hz,H-3),9.21(d,J＝7.8Hz,H-4),4.77(d,J＝17.4 Hz,H-7A),4.56(d,J＝17.4Hz,H-7B),7.82(d,J＝7.8Hz,H-8),7.33(t,J＝7.8Hz, H-9),7.48(t,J＝7.8Hz,H-10),7.94(d,J＝7.8Hz,H-11),4.14(s,H-3'),3.71(m, H-4'),2.99(m,H-5'A),2.19(m,H-5'B),6.45(dd,J＝2.4,8.4Hz,H-6'),2.45(s, CH3-2),2.46(s,OCH3-3),2.40(s,NCH3-4)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:109.2 (C-1),126.4(C-2),120.6(C-3),127.1(C-4),124.4(C-4a),116.6(C-4b),120.0 (C-4c),175.2(C-5),46.9(C-7),133.8(C-7a),115.6(C-7b),125.8(C-7c),122.5(C-8), 121.7(C-9),126.2(C-10),114.1(C-11),139.8(C-11a),127.8(C-12a),131.6(C-12b), 137.8(C-13a),93.9(C-2'),82.0(C-3,3'),60.0(C-4'),29.5(C-5'),82.4(C-6'),29.0 (CH3-2'),54.9(OCH3-3'),32.1(NCH3-4')；ESIMS m/z:467[M+H]+,933[2M+H]+。
去甲基星形孢菌素：1H-NMR(CD3OD,600MHz)δ:7.47(d,J＝7.8Hz,H-1), 7.49(t,J＝7.8Hz,H-2),7.29(t,J＝7.8Hz,H-3),9.24(d,J＝8.4Hz,H-4),5.01(2H,s, H-7),7.97(d,J＝7.8Hz,H-8),7.35(t,J＝7.8Hz,H-9),7.51(t,J＝7.8Hz,H-10), 7.99(d,J＝7.8Hz,H-11),4.69(m,H-3'),3.60(brs,H-4'),2.80(m,H-5'a),2.25(m, H-5'b),6.80(brs,H-6'),2.45(s,CH3-2'),2.35(s,OCH3-3')；13C-NMR(CD3OD, 150MHz)δ:109.9(C-1),126.6(C-2),120.8(C-3),127.1(C-4),124.5(C-4a),117.1 (C-4b),119.9(C-4c),175.4(C-5),47.3(C-7),134.4(C-7a),115.9(C-7b),126.0 (C-7c),122.2(C-8),121.6(C-9a),125.9(C-10),115.6(C-11),141.0(C-11a),126.0 (C-12a),131.5(C-12b),138.2(C-13a),95.7(C-2'),71.8(C-3'),56.0(C-4'),28.6 (C-55'),82.3(C-6'),30.0(CH3-2'),32.0(NCH3-4')；ESIMS m/z:453[M+H]+。
Holyrine A:1H-NMR(CD3OD,600MHZ)δ:7.73(brd,J＝7.8Hz,H-1),7.50 (td,J＝7.8,1.2Hz,H-2),7.30(td,J＝7.8,1.2Hz,H-3),9.42(brd,J＝7.8Hz,H-4), 5.01(2H,s,H-7),8.01(brd,J＝7.8Hz,H-8),7.32(brt,J＝7.8Hz,H-9),7.48(brt,J＝ 7.8Hz,H-10),7.69(brd,J＝7.8Hz,H-11),4.10(brs,H-3'),4.05(brd,J＝8.0Hz, H-4'),2.69(ddd,J＝10.8,8.0,12.0Hz,H-5'A),2.06(brd,J＝12.0Hz,H-5'B),6.66 (dd,J＝10.8,1.2Hz,H-6'),4.70(q,J＝6.6Hz,H-2'),1.67(d,J＝6.6Hz,CH3-2')；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:109.7(C-1),126.8(C-2),121.2(C-3),127.2(C-4), 124.3(C-4a),119.6(C-4b),119.0(C-4c),175.6(C-5),47.7(C-7),136.1(C-7a),116.7 (C-7b),123.6(C-7c),122.0(C-8),121.2(C-9a),126.4(C-10),112.5(C-11),141.0 (C-11a),129.4(C-12a),125.9(C-12b),140.3(C-13a),14.4(C-1'),78.4(C-2'),69.0 (C-3'),47.7(C-4'),33.3(C-5'),76.9(C-6')；ESIMSm/z:441[M+H]+。
K242c:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.02(brd,J＝7.2Hz,H-1),7.43(brt,J ＝7.8,1.2Hz,H-2),7.24(td,J＝7.8,1.2Hz,H-3),9.19(d,J＝7.8Hz,H-4),5.01(2H, s,H-7),7.62(brd,J＝8.4Hz,H-8),7.32(td,J＝8.4,1.2Hz,H-9),7.48(td,J＝8.4,1.2Hz,H-10),7.68(brd,J＝8.4Hz,H-11)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz) δ:111.3(C-1),126.1(C-2),129.9(C-3),127.8(C-4),125.2(C-4a),115.6(C-4b),118.9 (C-4c),174.4(C-5),45.3(C-7),132.9(C-7a),114.1(C-7b),125.0(C-7c),122.8(C-8), 121.2(C-9),125.9(C-10),111.9(C-11),139.2(C-11a),127.9(C-12a),125.4 (C-12b),139.1(C-13a)；ESIMS m/z:312[M+H]+。
<实施例6>不同培养基发酵产物中星形孢菌素效价测定
将海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202采用8种不同的发酵培养基分别进行发酵，测定不同培养基中的星形孢菌素效价(含量)。将海洋链霉菌 (Streptomyces sp.)IMB3-202菌种接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶，于28℃振摇培养120小时，每种培养基得到100mL发酵培养物。
所述的发酵培养基包括：
M1培养基：淀粉10g，葡萄糖25g，棉籽饼粉10g，蛋白胨3g，螺旋藻 3g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.1g，NaCl 5g，CaCO3 5g，海盐30g，去离子水至 1L，pH 7.0-7.2。
M2培养基：葡萄糖4g，酪蛋白5g，胰蛋白胨3g，海盐30g，去离子水至 1L,pH 7.0-7.2。
M3培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2。
M4培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，去离子水至1L,pH7.0-7.2。
M5培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4 mg，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2。
M6培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4 mg，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
M7培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，海盐30g，去离子水至1L,pH7.0-7.2。
M8培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
将发酵培养物离心获得上清液，上清液上XAD7HP大孔树脂，依次用水、丙酮洗脱，收集丙酮洗脱镏分，减压浓缩得到提取物浸膏。将提取物浸膏用5mL 甲醇溶解，10000rpm离心10min，取上清液5uL，进行HPLC-MS分析。色谱条件：色谱柱：C18,3μM,3.0mm×150mm；柱温30℃；流动相：A相为5mM醋酸铵水溶液，B相为乙腈；梯度：0-30min，10-90％B。流速：0.5mL·min-1；检测波长：280nm。HPLC-MS色谱图，其中峰1代表星形孢菌素，m/z 467[M+H]+；峰2代表去甲基星形孢菌素，m/z 453[M+H]+；峰3代表holyrine A，m/z 441[M+H]+；峰4代表K252c，m/z 312[M+H]+。
将星孢菌素标准品溶于甲醇，用上述相同色谱条件下进行HPLC-MS分析，以280nm波长下色谱峰面积进行回归分析，星形孢菌素在1002.6～10026.0ng/μL 的浓度范围与峰面积呈线性关系，线性方程为Y＝4.148X-244.67205，相关系数r ＝0.99961，计算星形孢菌素在发酵液中的效价(含量)，结果见表1。
表1不同培养基发酵产物中星孢菌素的含量(mg/L)
Figure RE-GDA0001587255420000091
序 列 表
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 一种产星形孢菌素的海洋链霉菌及其制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> Streptomyces sp. IMB3-202
<220>
<223> 16SrDNA
<400>
1 catgcttacc atgcagtcga cgatgaaccc gcttcggtgg gggattagtg gcgaacgggt
61 gagtaacacg tgggcaatct gccctgcact ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat
121 accggatacg accacttcag gcatctgatg gtggtggaaa gctccggcgg tgcaggatga
181 gcccgcggcc tatcagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg acgggtagcc
241 ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg
301 cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga
361 tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg acggtacctg
421 cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt
481 tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggcct gtcacgtcgg atgtgaaagc
541 ccggggctta accccgggtc tgcattcgat acgggcaggc tagagttcgg taggggagat
601 cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg
661 cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag
721 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgttg ggaactaggt gtgggcgaca ttccacgtcg
781 tccgtgccgc agctaacgca ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa
841 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa
901 cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac accggaaaca cccagagatg ggtgccccct
961 tgtggtcggt gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt
1021 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtccc gtgttgccag caggcccttg tggtgctggg
1081 gactcacggg agaccgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca
1141 tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaaaga gctgcgatac
1201 cgcaaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga
1261 ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc
1321 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc
1381 ccaacccctt gtgggaggga gctgtcgaag gtggtcgtcc

Claims (4)

1.一种制备去甲基星形孢菌素的方法，其特征在于，去甲基星形孢菌素是从生物保藏编号为CGMCC 15228的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵培养物中制备得到的。
2.一种星形孢菌素、去甲基星形孢菌素、hylorine A和K252c的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备生物保藏编号为CGMCC 15228的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵产物；
(2)发酵产物离心，获得上清液和菌丝体；上清液上大孔吸附树脂柱层析，依次用4倍柱体积的水、4倍柱体积的50％的丙酮和4倍柱体积的100％的丙酮洗脱；菌丝体用2-3倍体积的丙酮超声提取2次，上清液丙酮洗脱液与菌丝体提取物合并，减压浓缩除去溶剂后得到浸膏；
(3)浸膏经正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，洗脱过程按照二氯甲烷:甲醇V/V以如下比例依次进行洗脱：100:1，50:1，20:1，9:1，4:1，2:1，0:100，收集到的二氯甲烷-甲醇20:1洗脱馏分，经Sephadex LH-20柱色谱层析，二氯甲烷-甲醇1:1洗脱，脱色后的组分经HPLC色谱制备纯化，色谱柱的型号为C18 5μM，10mm×250mm,以25-40％的乙腈水溶液为流动相，其中乙腈水溶液中含0.1％甲酸，得到式Ⅰ所示的化合物1星形孢菌素、式II所示化合物holyrine A和式III所示化合物K252c；收集到的二氯甲烷-甲醇9：1洗脱镏分，经HPLC制备纯化得到式I所示化合物2去甲基星形孢菌素，色谱柱的型号为C18 5μM，10mm×250mm，用乙腈-水-甲酸溶液23:77:0.1为流动相，
Figure FDA0002445765150000021
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵产物通过以下方法制备：
将生物保藏编号为CGMCC 15228的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的菌种接种到发酵培养基中，于28℃振摇培养96～168h，制备发酵培养物；
所述的发酵培养基，选自以下所述M1～M8八种培养基中的任何一种：
M1培养基：淀粉10g，葡萄糖25g，棉籽饼粉10g，蛋白胨3g，螺旋藻3g，KH2PO4 0.1g，MgSO40.1g，NaCl 5g，CaCO3 5g，海盐30g，去离子水至1L，pH 7.0-7.2；
M2培养基：葡萄糖4g，酪蛋白5g，胰蛋白胨3g，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2；
M3培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2；
M4培养基：淀粉25g，葡萄糖5g，蛋白胨3g，牛肉膏3g，CaCO3 0.25g，微量元素FeSO40.01g，MnCl2 0.01g，ZnSO4 0.01g，CuSO4 0.01g，CoCl2 0.01g,自然pH，去离子水至1L,pH7.0-7.2；
M5培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4mg，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2；
M6培养基：淀粉10g，酵母浸膏4g，蛋白胨2g，KBr 10mg，FeSO4·7H2O 4mg，去离子水至1L，pH 7.0-7.2；
M7培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，海盐30g，去离子水至1L,pH 7.0-7.2；
M8培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，甘氨酸0.5g，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202的发酵产物，通过以下方法制备：
将生物保藏编号为CGMCC 15228的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)IMB3-202菌种接种于500mL摇瓶中，每瓶含100mL的M1培养基，28℃，180rpm，振摇培养96～168小时，得到发酵培养物，
所述的M1培养基，每升中含有：淀粉10g，葡萄糖25g，棉籽饼粉10g，蛋白胨3g，螺旋藻3g，KH2PO4 0.1g，MgSO4 0.1g，NaCl 5g，CaCO3 5g，海盐30g，去离子水至1L，pH 7.0-7.2。
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