CN112300109B - 一种fluorene类抗生素及其制备方法和在制备抗肿瘤药物和酶抑制剂中的应用 - Google Patents

一种fluorene类抗生素及其制备方法和在制备抗肿瘤药物和酶抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种fluorene类抗生素及其制备方法和在制备抗肿瘤药物和酶抑制剂中的应用。fluostareneA或B，其结构如式1所示。本发明从天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154‑2(ΔflsO1i)分离得到1个新的具有抗肿瘤活性的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene B，其能用于制备抗肿瘤药物。同时分到一个已知bezo[b]fluorene类化合物PK1和另一个新的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene A，二者均可用于制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂药物，通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗肿瘤新药和用于治疗II型糖尿病的α‑葡萄糖苷酶抑制剂药物。
Figure DDA0002726383470000011

Description

一种fluorene类抗生素及其制备方法和在制备抗肿瘤药物和 酶抑制剂中的应用
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素fluostarene A、fluostareneB与已知的PK1，及其制备方法和在制备抗肿瘤药物和开发为α-葡萄糖苷酶(II型糖尿病药物的筛选靶点)抑制剂中的应用。
背景技术：
bezofluorene类化合物结构多样且具有多种生物、药理活性。一些化合物有很强的细胞毒或抑菌活性，有很好的应用前景。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤活性的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene B以及两种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物fluostarene A和PK1。
本发明的两种新的bezofluorene类化合物fluostarene A、B，其结构如式1所示：
Figure BDA0002726383450000011
本发明的第二个目的是提供一种化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1的制备方法，其是从天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)的发酵培养物中制备分离得到的；
所述的化合物fluostarene A、B和PK1的结构式如下所示：
Figure BDA0002726383450000021
具体步骤如下：
a、制备天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经大孔树脂吸附，后用丙酮洗脱大孔树脂，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
b、将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比95：5梯度洗脱下来的馏分Fr.2，后经ODS反相中压液相色谱，用水/乙腈作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集水/乙腈体积比30：70梯度洗脱下来的馏分Fr.2-8，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，洗脱馏分再经HPLC半制备液相分离纯化，得到化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1。
所述的a步骤的制备天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)接入种子培养基，28℃，200rpm，培养48h得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养168h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基的配方为每升培养基中含有：胰蛋白胨大豆肉汤培养基30g，余量为水，pH7.2，所述的发酵培养基的配方为每升培养基中含有淀粉10g，鱼蛋白胨4g，玉米粉6g，细菌蛋白胨2g，甘油5mL，CaCO3 2g，粗海盐30g，余量为水，pH7.0。
本发明的第三个目的是提供天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)在制备化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1中的应用。
本发明人通过实验发现，化合物fluostarene B对四株肿瘤细胞SF-268、MCF-7、HepG2和A549具有抑制活性，其半数抑制浓度IC50分别为9.74μM、9.41μM、7.17μM及10.38μM。同时发现PK1和fluostarene A对酵母来源的α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其半数抑制浓度分别为0.13μM和0.89μM。
因此，本发明的第四个目的是提供化合物fluostarene B在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物优选为抗人神经癌、乳腺癌、肝癌和肺腺癌的药物。
本发明的第五个目的是提供化合物fluostarene A或PK1在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
优选，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂是治疗II型糖尿病的药物。
本发明的第六个目的是提供一种抗肿瘤药物，其含有化合物fluostarene B作为活性成份。
本发明的第七个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其包含有效量的化合物fluostarene A或PK1作为活性成份。
本发明从天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)分离得到1个新的具有抗肿瘤活性的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene B，其能用于制备抗肿瘤药物。同时分到一个已知bezo[b]fluorene类化合物PK1和另一个新的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene A，二者均可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物，通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗肿瘤新药和用于治疗II型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物。
本发明的天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)是通过以下方法制备的：
一、在包含完整fluostatins生物合成基因簇的异源表达粘粒pCSG5033(公开于中国专利ZL201510648554.7)上同框缺失编码黄素氧化酶的基因flsO1，获得异源粘粒pCSG5042，具体方法如下：
用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pIJ778后获得的1425bp片段(包含壮观霉素抗性和转录起始位点)为模板，利用表1引物FlsO1DF/FlsO1DR扩增用于敲除flsO1基因的抗性片段，然后将此抗性片段转化进感受态细胞E.coli BW25113/pIJ790/pCSG5033(将异源表达粘粒pCSG5033转化进入感受态细胞E.coli BW25113/pIJ790中)获得粘粒pCSG5033/ΔflsO1，随后将其转入E.coli BT340感受态细胞获得flsO1同框敲除的粘粒pCSG5042。
表1.编码氧化酶基因flsO1的敲除和验证引物
Figure BDA0002726383450000041
二、将pCSG5042转入E.coli ET12567/pUZ8002获得结合转移的供体菌，以模式链霉菌Streptomyces coelicolor M1154作为受体菌进行结合转移，通过表1所述的引物FlsO1DTF/FlsO1DTR进行验证，获得的阳性结合子即为天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)。
本发明的链霉菌Streptomyces coelicolor M1154公开于文献：Zhou,H.；Wang,Y.；Yu,Y.；Bai,T.；Chen,L.；Liu,P.；Guo,H.；Zhu,C.；Tao,M.；Deng,Z.Curr.Microbiol.2012,64,185-190.。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。
附图说明：
图1是活性化合物fluostarene A(1)、fluostarene B(2)和PK1(3)的生产菌株Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)小发酵的高效液相色谱图；
高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流动相包括A相和B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+90％(体积分数)的水+0.08％(体积分数)的甲酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈+10％(体积分数)的水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100；20-21min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100；21-24min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100；24-25min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100-95:5；25-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5，检测波长304nm，流速1ml/min。
图2是化合物fluostarene A(1)及fluostarene B(2)的关键HMBC，1H–1H COSY和NOE相关以及它们的晶体结构图。
图3是推导的化合物fluostarene A(1)、fluostarene B(2)和PK1(3)的生物合成途径。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：活性代谢产物fluostarene A、fluostarene B和PK1的分离和制备
1、培养基：(1)种子培养基：每升含有胰蛋白胨大豆肉汤培养基30g，余量为水，pH7.2。按上述组份及其含量混合均匀，121℃，灭菌30min，得到种子培养基；(2)发酵培养基：每升培养基中含有淀粉10g，鱼蛋白胨4g，玉米粉6g，细菌蛋白胨2g，甘油5mL，CaCO3 2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.0，按上述组份及其含量混合均匀，121℃，灭菌30min，得到发酵培养基。
2、发酵
2.1、种子培养：将培养皿上活化的天蓝链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)的单菌落分别接入36瓶，每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28℃，200rpm，培养48h，制得种子液1800mL。
2.2、发酵培养：将种子液以10％的接种量(体积百分比)接入到16L发酵培养基(置于1L的锥形培养瓶，每瓶含有200mL发酵培养基，共72瓶)中，28℃，200rpm，振荡培养168h，得到16L发酵培养物。
3、萃取：发酵培养物先进行离心分离(3900rpm，10min)，得到16L体积的上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD16固相萃取，后用丙酮洗脱大孔树脂3次，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取3次，丁酮层经蒸馏浓缩后得到上清液提取物-浸膏A(10.0g)；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，合并提取液，减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏得菌丝体提取物—浸膏B(1.0g)。
4、活性化合物的提取分离和鉴定
4.1化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1的分离和鉴定：将上述发酵、萃取所获得的浸膏A和B合并的粗提物进行硅胶柱(300-400目)层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比95:5梯度洗脱下来的馏分Fr.2(5.6g)，蒸干，经ODS反相中压液相色谱(YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，240×4.0cmI.D.)，流速为25mL/min，用水/乙腈作为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，收集水/乙腈体积比30：70梯度洗脱下来的馏分Fr.2-8(1.0g)，再过LH-20凝胶柱(2.5*100cm)，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，每50ml收集合并为一份，将第9-12瓶样品合并后采用日立-L2130半制备高效液相(配备日立L-2455检测器)进行分离，连接美国Phenomenex公司生产的ODS半制备柱(250mm×10.0mm，5μm)，用水/乙腈(A/B)作为洗脱剂进行梯度洗脱，具体梯度洗脱流程如下：0–15min(70％B)，15–16min(70％-90％B)，16–25min(90％B)，25–26min(90％-100％B)，26–28min(100％B)，28–29min(100％-70％B)，29–32min(70％B)，流速为2.5mL/min，检测波长为304nm。制备化合物PK1的液相保留时间为25.1min，化合物fluostarene A的液相保留时间为20.4min，化合物fluostarene B的液相保留时间为22.3min)，获得已知化合物PK1(40mg)，新化合物fluostarene A(17.0mg)和fluostarene B(29.5mg)。通过结构分析，对本发明的从天蓝链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2(ΔflsO1i)的发酵培养物中制备得到1个已知化合物和2个新化合物。根据与已知化合物比较NMR谱确定了已知化合物结构为PK1(3)，其NMR谱数据归属如表2所示。
表2.化合物PK1(3)在DMSO-d6中1H(700MHz)和13C NMR(176MHz)的核磁数据归属
Figure BDA0002726383450000071
Figure BDA0002726383450000081
化合物PK1的结构式如下所示：
Figure BDA0002726383450000091
两个新化合物(分别对应化合物fluostarene A(1)和fluostarene B(2)的NMR谱数据归属如表3所示，其结构鉴定结果如下：
fluostarene A：红色粉沫，1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据，见表3；C26H16O6(m/z 423.0883[M-H]-,calcd 423.0874)。
fluostarene A的负源高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z[M-H]-423.0883-，推测其分子式为C26H16O6(不饱和度为19)。分析1H，13C和HSQC(表3)数据表明该化合物含有1个甲基[δH 2.12s,δC 21.8]，9个sp2杂化的次甲基，两个活泼氢，16个季碳。通过1H-1H COSY图谱(图2)分析显示化合物含有1个ABC偶合体系(δH 7.69/7.41/7.04)和1个AX体系(δH 6.93/7.35)。仔细地分析COSY，HMBC谱(图2)表明结构上包含benzofluorene结构单元和4-羟基苯基丙酮酸单元。通过化学位移，确定这两个单元通过δ-内酯环在C-5/C-7′和C-6/C-8′进行连接。最后fluostarene A的结构通过Cu Kα靶晶体衍射确定(CCDC2024422)。
fluostarene B：橙红色粉沫，1H NMR(700MHz,DMSO-d6)和13C NMR(176MHz,DMSO-d6)数据，见表3；C28H17NO5(m/z 446.1040[M-H]-,calcd 446.1034)。
fluostarene B的负源高分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z[M-H]-446.1040-，推测其分子式为C28H17NO5(不饱和度为21)。比较fluostarene A和fluostareneB的核磁数据，1H-1H COSY相关H-3′/H-4′/H-5′/H-6′(δH 7.56/7.19/7.01/7.19)，NH-1′/H-9′(δH 11.6/7.77)和HMBC相关从H-4′到C-2′/C-6′，从H-5′到C-3′/C-7′，从H-6′到C-8′，从NH-1′到C-2′/C-7′/C-8′/C-9′，从H-5′到C-8′，以及从H-9′到C-10′的分析，表明fluostarene B的结构上存在3-吲哚丙酮酸单元，最后通过CuKα靶晶体衍射确定了fluostarene B的结构(CCDC 2024423)。
根据以上信息，确定化合物fluostarene A和fluostarene B的结构如式(1)、式(2)所示：
Figure BDA0002726383450000101
表3.化合物fluostarene A-B在DMSO-d6中1H(700MHz)和13C NMR(176MHz)的核磁数据归属
Figure BDA0002726383450000102
Figure BDA0002726383450000111
化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1的生物合成途径如图3所示，推测FlsG作用后的产物bezofluorene极不稳定很容易自发聚合反应形成同源三聚体化合物PK1，或与酪氨酸来源的4-羟基苯基丙酮酸，及色氨酸来源的3-吲哚丙酮酸发生加成反应分别形成fluostarene A和fluostarene B。
实施例2：化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1的抗肿瘤细胞毒活性及a-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1针对四株肿瘤细胞：SF-268(神经癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)和A549(肺腺癌细胞)进行了活性测定，实验方法参考文献[Skehan,P.；Storeng,R.；Scudiero,D.；Monks,A.；McMahon,J.；Vistica,D.；Warren,J.T.；Bokesch,H.；Kenney,S.；Boyd,M.R.,Journal of the National CancerInstitute 1990,82,1107-12.]。以阿霉素作阳性对照，经试验测定表明，化合物fluostarene B对SF-268(神经癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)和A549(肺腺癌细胞)的IC50值分别是9.74μM、9.41μM、7.17μM及10.38μM(表4)；阳性对照的分别为1.13μM、1.42μM、1.29μM及1.35μM。结果表明化合物fluostarene B对所测的四株肿瘤细胞表现有生长抑制活性。
同时参考文献[Ma,C.M.；Hattori,M.；Daneshtalab,M.；Wang,L.,Journal ofMedicinal Chemistry 2008,51,6188-94.]，我们还测定了化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1针对酵母来源的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以阿卡波糖作阳性对照，经试验测定表明PK1和fluostarene A对酵母来源的α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其半数抑制浓度分别为0.13μM和0.89μM(表4)，而阳性对照阿卡波糖的半数抑制浓度为0.015μM。因此，抗肿瘤活性的bezo[b]fluorene类化合物fluostarene B，其能用于制备抗肿瘤药物。同时已知bezo[b]fluorene类化合物PK1和另一个新的bezo[b]fluorene类化合物fluostareneA，二者均可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物，通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗肿瘤新药和用于治疗II型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物。
表4.Fluostarene A(1)、fluostarene B(2)和PK1(3)的抗肿瘤细胞毒活性及酶抑制剂活性
Figure BDA0002726383450000121
Figure BDA0002726383450000131
─表示未测试。

Claims (8)

1.fluostarene A或B，其结构如式1所示：
Figure QLYQS_1
式1。
2.一种化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1的制备方法，其特征在于，是从天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i) 的发酵培养物中制备分离得到的；
所述的化合物fluostarene A、B和PK1的结构式如下所示：
Figure QLYQS_2
具体步骤如下：
a、制备天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i)的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经大孔树脂吸附，后用丙酮洗脱大孔树脂，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
b、将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0~0：100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比95：5梯度洗脱下来的馏分Fr.2，后经ODS反相中压液相色谱，用水/乙腈作为洗脱剂，从体积比100：0~0：100进行梯度洗脱，收集水/乙腈体积比30：70梯度洗脱下来的馏分Fr.2-8，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，洗脱馏分再经HPLC半制备液相分离纯化，得到化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1；
所述的Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i)是通过以下方法制备的：
在包含完整fluostatins生物合成基因簇的异源表达粘粒pCSG5033同框缺失编码黄素氧化酶的基因flsO1，获得异源粘粒pCSG5042，具体方法如下：
用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pIJ778后获得的、包含壮观霉素抗性和转录起始位点的1425 bp片段为模板，利用引物FlsO1DF/FlsO1DR扩增用于敲除flsO1基因的抗性片段，然后将此抗性片段转化进感受态细胞E. coli BW25113/pIJ790/pCSG5033，将异源表达粘粒pCSG5033转化进入感受态细胞E. coli BW25113/pIJ790中，获得粘粒pCSG5033/∆flsO1，随后将其转入E. coli BT340感受态细胞获得flsO1同框敲除的粘粒pCSG5042；
编码氧化酶基因flsO1的敲除和验证引物
Figure QLYQS_3
将pCSG5042转入E. coli ET12567/pUZ8002获得结合转移的供体菌，以模式链霉菌Streptomyces coelicolor M1154作为受体菌进行结合转移，通过引物FlsO1DTF/FlsO1DTR进行验证，获得的阳性结合子即为天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的a步骤的制备天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i) 的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i) 接入种子培养基，28 °C，200 rpm，培养48 h得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28 °C，200 rpm，振荡培养168 h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基的配方为每升培养基中含有：胰蛋白胨大豆肉汤培养基30 g，余量为水，pH 7.2，所述的发酵培养基的配方为每升培养基中含有淀粉10 g，鱼蛋白胨4 g，玉米粉6 g，细菌蛋白胨2 g，甘油5 ml，CaCO3 2 g，粗海盐30 g，余量为水，pH 7.0。
4.天蓝色链霉菌Streptomyces.coelicolor M1154-2 (∆flsO1i) 在按照权利要求2所述的制备方法制备化合物fluostarene A、fluostarene B和PK1中的应用；
所述的化合物fluostarene A、B和PK1的结构式如下所示：
Figure QLYQS_4
。
5.化合物fluostarene B在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的化合物fluostarene B的结构式如下所示：
Figure QLYQS_5
；
所述的抗肿瘤药物为抗人神经癌、乳腺癌、肝癌或肺腺癌的药物。
6.化合物fluostarene A或PK1在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；
所述的fluostarene A和PK1的结构式如下所示：
Figure QLYQS_6
。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂是治疗II型糖尿病的药物。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有化合物fluostarene B作为活性成份；
所述的化合物fluostarene B的结构式如下所示：
Figure QLYQS_7
。
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