CN108864221B - 阿克拉霉素类似物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阿克拉霉素类似物及其制法和用途，具体地，本发明提供了一种如下式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐、光学异构体、互变异构体、水合物、溶剂合物。本发明还提供了通过生物工程菌发酵方法制备该化合物的方法，以及该化合物用于制备抗肿瘤药物的用途。
Description
技术领域
本发明属于药物领域和生物技术工程领域，具体地，本发明涉及一类新型阿克拉霉素类似物及其制法和用途。
背景技术
蒽环类抗生素拥有一个蒽环骨架，还包括糖基修饰和其他一些特殊修饰。蒽环类抗生素临床上主要被用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌等。
研究表明，蒽环类药物抑制肿瘤生长的作用机理有三种：(1)通过嵌入DNA双链的碱基之间，形成稳定复合物，抑制DNA复制与RNA合成，从而阻碍快速生长的癌细胞的分裂；(2)抑制拓扑异构酶II，影响DNA超螺旋转化成为松弛状态，从而阻碍DNA复制与转录；(3)螯合铁离子后产生自由基从而破坏DNA、蛋白质及细胞膜结构。
阿克拉霉素A又名阿柔比星，是第二代葸环类抗肿瘤抗生素，为细胞周期非特异性药，能抑制DNA和RNA的合成。有较强的抗癌活性并可口服给药，对心脏的毒性远低于阿霉素，无明显的免疫抑制和骨髓抑制作用。临床使用中用其盐酸盐形式，对急性白血病有高度缓解作用，对子宫体癌、肝癌、胃肠道癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌和恶性淋巴瘤等均有效。早期在对阿克拉霉素A分离时，还得到了其余阿克拉霉素类天然产物，包括阿克拉霉素B、阿克拉霉素X和MA144-S1等。
大多数蒽环类抗生素的结构差异主要体现在糖基结构上的差别，而针对蒽环骨架的改造的研究则较少。为了提高阿克拉霉素的抗肿瘤活性以及其他特性，本领域一直在尝试针对蒽环骨架进行改造从而得到阿克拉霉素的各类衍生物或类似物，然而迄今为止尚未开发出具有更高活性等优点的阿克拉霉素类似物。因此，本领域迫切需要开发各类新型的阿克拉霉素类似物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的阿克拉霉素类似物及其制备。
本发明的第一方面，提供了一种如下式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐、光学异构体、互变异构体、水合物、溶剂合物：
其中，所述的R1和R2各自独立地选自下组：H、
或所述的R1和R2共同构成以下基团：
其中，
表示连接位点。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式I化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一种加利链霉菌(Streptomyces galilaeus MA144-M1)突变菌株，其特征在于，所述的菌种中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因(aknB)和链延伸因子基因(aknC)被失活敲除；
(2)培养所述的菌株，并对发酵产物进行分离，得到所述的式I化合物。
在另一优选例中，所述步骤(2)中还包括步骤(b)：
(b)用突变蒽环骨架饲喂所述的菌株，得到如式I所述的化合物；其中，所述的突变蒽环骨架如下式IIa所示：
在另一优选例中，所述步骤(b)前还包括步骤(a)：
(a)用加利链霉菌突变菌株进行发酵，并对发酵产物进行分离，得到所述的突变蒽环骨架；其中，所述的加利链霉菌突变菌株中，阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除，且所述的菌株中还包括异源表达的越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤细胞增殖相关的疾病的药物组合物。
在另一优选例中，所述的肿瘤为白血病。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：治疗有效量的如式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐、光学异构体、互变异构体、水合物、溶剂合物；和药学上可接受的载体。
本发明的第五方面，提供了一种用于生产阿克拉霉素类似物的加利链霉菌(Streptomyces galilaeus MA144-M1)突变菌株，所述的菌种中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因(aknB)和链延伸因子基因(aknC)被失活敲除。
本发明的第六方面，提供了一种用于生产阿克拉霉素类似物的加利链霉菌(Streptomyces galilaeus MA144-M1)突变菌株，所述的菌种中，阿克拉霉素生物合成基因簇中的负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除，且所述的菌种包括异源表达的越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11。
本发明的第七方面，提供了一种如下式IIa所示的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)用加利链霉菌突变菌株进行发酵，并对发酵产物进行分离，得到所述的突变蒽环骨架；其中，所述的加利链霉菌突变菌株中，阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除；且异源表达越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的1H NMR(500MHz，CDCl3)。
图2为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的13C NMR(125MHz，CDCl3)。
图3为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的COSY(500MHz，CDCl3)。
图4为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的HSQC(500MHz，CDCl3)。
图5为-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的HMBC(500MHz，CDCl3)。
图6为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的1H NMR(600MHz，CD3OD)。
图7为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的13C NMR(150MHz，CD3OD)。
图8为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的DEPT 135(150MHz，CD3OD)。
图9为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的COSY(600MHz，CD3OD)。
图10为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的HSQC(600MHz，CD3OD)。
图11为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的HMBC(600MHz，CD3OD)。
图12为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1的NOESY(600MHz，CD3OD)。
图13为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的1H NMR(600MHz，CD3OD)。
图14为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的13C NMR(150MHz，CD3OD)。
图15为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的DEPT 135(150MHz，CD3OD)。
图16为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的COSY(600MHz，CD3OD)。
图17为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的HSQC(600MHz，CD3OD)。
图18为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的HMBC(600MHz，CD3OD)。
图19为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的NOESY(600MHz，CD3OD)。
图20为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的1H NMR(600MHz，CDCl3)。
图21为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的13C NMR(150MHz，CDCl3)。
图22为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的DEPT 135(150MHz，CDCl3)。
图23为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的COSY(600MHz，CDCl3)。
图24为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的HSQC(600MHz，CDCl3)。
图25为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的HMBC(600MHz，CDCl3)。
图26为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的NOESY(600MHz，CDCl3)。
图27为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的1H NMR(600MHz，CDCl3)。
图28为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的13C NMR(150MHz，CDCl3)。
图29为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的DEPT 135(150MHz，CDCl3)。
图30为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的COSY(600MHz，CDCl3)。
图31为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的HSQC(600MHz，CDCl3)。
图32为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的HMBC(600MHz，CDCl3)。
图33为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的NOESY(600MHz，CDCl3)。
图34表示通过喂养突变株sHY075001获新型得阿克拉霉素类似物的HPLC分析结果，其中，图34i为野生型Streptomyces galilaeus MA144-M1的发酵结果；图34ii为突变株sHY075001的负对照(无突变蒽环骨架)的发酵结果；图34iii为突变株sHY076701的发酵结果，sHY076701是产生突变蒽环骨架1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的菌株；图34iV为突变株sHY075001与1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮共同发酵产生新型阿克拉霉素类似物的发酵结果。
符号说明
图34中，Aclacinomycin X：阿克拉霉素X；Aclacinomycin A：阿克拉霉素A；Aclacinomycin B：阿克拉霉素B；1-hydroxy-4-dehydroxy-aklavinone：1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮；1-hydroxy-4-dehydroxy-MA144-S1：1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1；1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin X：1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X；1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin A：1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A；1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin B：1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对阿克拉霉素生物合成基因簇的克隆以及生物合成机制研究，利用突变生物合成方法，意外地发现，当用1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮(式IIa化合物)取代阿克拉霉素类天然产物中的蒽环骨架阿克拉菌酮时，制备的阿克拉霉素类似物的抗肿瘤活性大大提高。具体地，当用1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮(式IIa化合物)取代阿克拉霉素类天然产物中的蒽环骨架阿克拉菌酮时，抗肿瘤活性提高了2-5倍。在此基础上完成了本发明。
活性成分
如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”和“本发明的阿克拉霉素类似物”可以互换使用，都指1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素类似物，如式Ia所示的1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1、Ib所示的1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X、Ic所示的1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A和Id所示的1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B。
应理解，所述术语还包括及本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。人工序列(human sapiens)
一类优选的阿克拉霉素类似物具有下式I所示的结构式：
如本文所用，术语“1-hydroxy-4-dehydroxy-MA144-S1”表示“1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1”，其结构式如式Ia所示。
如本文所用，术语“1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin X”表示“1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X”，其结构式如式Ib所示。
如本文所用，术语“1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin A”表示“1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A”，其结构式如式Ic所示。
如本文所用，术语“1-hydroxy-4-dehydroxy-Aclacinomycin B”表示“1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B”，其结构式如式Id所示。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。
本发明人不仅通过对新型阿克拉霉素类似物的大量发酵以及分离纯化，确证了化合物的结构。此外，通过抗肿瘤活性实验证实了，本发明的阿克拉霉素类似物比对应阿克拉霉素天然产物的抗肿瘤活性有显著提高。
突变蒽环骨架
如本文所用，术语“突变蒽环骨架”指参与本发明阿克拉霉素类似物制备的化合物，其中所述的化合物具有式IIa所述的结构。此化合物被用于合成或制备本发明的阿克拉霉素类似物，可以由突变菌株发酵得到。
菌株
如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指的是加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1。应理解，出发菌株不仅包括加利链霉菌Streptomycesgalilaeus MA144-M1的菌株，还包括其衍生菌株及其他产阿克拉霉素的菌株。
在本发明的一个优选例中，提供了一种生产本发明阿克拉霉素类似物的加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1的突变菌株，其中，所述的菌株中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因(aknB)和链延伸因子基因(aknC)被敲除。
本发明还提供了一种构建可产生阿克拉霉素类似物突变株的方法，它包括同框质粒的构建，将质粒导入野生型菌株，通过同源臂的与野生型菌株基因组的重组，从而从基因组中敲除相应基因，从而获得基因同框缺失或失活的突变株。缺失阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因(aknB)和链延伸因子基因(aknC)的突变株无法正常合成阿克拉霉素类天然产物。
在本发明的一个优选例中，提供了一种构建突变株，并发酵突变株制备阿克拉霉素类似物的方法，其中包括：
1.构建aknB和aknC同框缺失质粒
PCR扩增用于基因敲除aknB和aknC基因的左臂和右臂片段，将这两个片段连入pKC1139中(US5,955,319)，获得重组质粒。将重组质粒转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落扩增培养，并将扩增后并验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
2.制备重组菌株
收集野生型的Streptomyces galilaeus MA144-M1的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上，再于IWL-4平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选，选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknB和aknC同框缺失的重组菌株。
在本发明的一个优选例中，提供了一种生产突变蒽环骨架的加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1的突变菌株，其中，所述的菌株中阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因(aknS和aknT)被敲除，在敲除基因aknS和aknT的基础上异源表达了越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11。
本发明提供了一种构建可产生突变蒽环骨架突变株的方法，它包括同框质粒的构建，将质粒导入野生型菌株，通过同源臂的与野生型菌株基因组的重组，从而从基因组中敲除相应基因，从而获得基因同框缺失或失活的突变株。之后在缺失突变株基础上继续异源表达其余基因。缺失阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因(aknS和aknT)的突变株无法正常合成阿克拉霉素类天然产物，会积累阿克拉菌酮，在敲除基因aknS和aknT的基础上异源表达了越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11，会积累突变蒽环骨架(式IIa所示结构)。
在本发明的一个优选例中，提供了一种构建突变株，并发酵突变株制备突变蒽环骨架(式IIa所示结构)的方法，其中包括：
1.构建aknS和aknT同框缺失质粒
PCR扩增用于基因敲除aknS和aknT基因的左臂和右臂片段，将这两个片段连入pKC1139中(US5,955,319)，获得重组质粒。将重组质粒转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落扩增培养，并将扩增后并验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
2.制备aknS和aknT敲除突变株
收集野生型的Streptomyces galilaeus MA144-M1的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上，再于IWL-4平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选，选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknS和aknT同框缺失的重组菌株。
3.构建kstA10和kstA11的异源表达质粒
PCR扩增用于异源表达的kstA10和kstA11基因，将PCR片段连入pIB139中，获得重组质粒。将重组质粒转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落扩增培养，并将扩增后并验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
4.制备可以产生突变蒽环骨架(式IIa所示结构)的突变株
收集aknS和aknT敲除突变株的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选接合子到阿伯拉抗性TSB中30℃培养2到3天，选取长势良好的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknS和aknT同框缺失而异源表达了kstA10和kstA11的重组菌株。
活性成分的制备
本发明还提供了一种制备式Ⅰ化合物的方法，包括步骤：
用式Ⅱ化合物对经改造的aknB和aknC敲除突变株进行饲喂；
从培养物中提取式Ⅰ化合物；
离心弃去上清，丙酮浸泡菌体和HP20吸附树脂，过滤除去不溶物，滤液经减压蒸馏抽干，获得的膏状物先用200-300目硅胶预装的正相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，收集式Ⅰ化合物的流出液，最终得到目标产物。
本发明人不仅通过对式Ⅰ化合物的大量发酵以及分离纯化确证了化合物的结构，而且通过抗肿瘤活性实验证实了本发明的活性产物比阿克拉霉素的抗肿瘤活性有显著的提高。
本发明还提供了一种制备式ⅠI化合物的方法，包括步骤：
对aknS和aknT敲除而同时异源表达基因kstA10和kstA11重组菌株进行发酵；
从培养物中提取式ⅠI化合物；
离心弃去上清，丙酮浸泡菌体和HP20吸附树脂，过滤除去不溶物，滤液经减压蒸馏抽干，获得的膏状物先用300-400目硅胶预装的正相柱进行分离纯化，收集式ⅠI化合物的流出液，最终得到目标产物。
本发明的主要优点包括：
(a)提供了一种具有式Ⅰ结构的新颖的、具有活性更高等优点的阿克拉霉素类似物。
(b)以本发明的阿克拉霉素类似物为基础，有助于制备其他类型蒽环类抗生素的衍生物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本发明的内容。
实施例1.突变蒽环骨架产生菌sHY076701的构建
1.构建aknS和aknT基因的缺失质粒
克隆aknS和aknT同框缺失左臂的引物序列如下：
aknS和aknT左臂正向引物(SEQ ID NO:1)
5’-ATATCTAGACATGCACCACGAATGGGTCAC-3’
aknS和aknT左臂反向引物(SEQ ID NO:2)
5’-ATACATATGCTCCTCGACGAGCCCTCGTT-3’
克隆aknS和aknT同框缺失右臂的引物序列如下：
aknS和aknT右臂正向引物(SEQ ID NO:3)
5’-ATACATATGGAGATGACGGCCCAGTTCGCT-3’
aknS和aknT右臂反向引物(SEQ ID NO:4)
5’-ATAAAGCTTGTGCGCTCCTCACTCGTCGA-3’
以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，以dNTP，DMSO，无酶水，高保真的Primestar DNA聚合酶及缓冲液组成PCR反应体系，扩增用于aknS和aknT基因敲除的左臂和右臂片段。将克隆后的两个片段凝胶电泳分离，切胶回收并纯化，分别加入限制性内切酶NdeI和XbaI以及HindIII和NdeI消化回收片段，将其连入用限制性内切酶XbaI和HindIII同样酶处理过的pKC1139中，将连接体系转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素)中培养过夜，至菌液较浓。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
2.重组菌株sHY075003的获得
收集野生型的Streptomyces galilaeus MA144-M1的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上，再于平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选，选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknS和aknT同框缺失的重组菌株sHY075003。
3.构建kstA10和kstA11异源表达的质粒
克隆kstA10和kstA11异源表达片段的引物序列如下：
kstA10和kstA11正向引物(SEQ ID NO:5)
5’-ATACATATGTCTAGAACCGGGACTGGCCGGACTAC-3’
kstA10和kstA11反向引物(SEQ ID NO:6)
5’-ATAGAATTCATAATAACTAGTCCTCGGCGCTGCCGTATGCC-3’
以Micromonospora sp.TP-A0468的总DNA为模板，以dNTP，DMSO，无酶水，高保真的Primestar DNA聚合酶及缓冲液组成PCR反应体系，扩增用于kstA10和kstA11异源表达的片段。将克隆后的片段凝胶电泳分离，切胶回收并纯化，加入限制性内切酶NdeI和EcoR消化回收片段，将其连入用限制性内切酶NdeI和EcoR同样酶处理过的pIB139中，将连接体系转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素)中培养过夜，至菌液较浓。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
4.重组菌株sHY076701的获得
收集重组菌株sHY075003的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，选取长势良好的接合子于阿伯拉抗性的TSB溶液中培养，之后对目标菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknS和aknT同框缺失同时kstA10和kstA11进行异源表达的重组菌株sHY076701。
实施例2.链霉菌重组菌株sHY075001的构建
1.构建aknB和aknC基因的缺失质粒
克隆aknB和aknC同框缺失左臂的引物序列如下：
aknB和aknC左臂正向引物(SEQ ID NO:7)
5’-ATAAAGCTTGAGCGCGTCCCGGATGAAG-3’
aknB和aknC左臂反向引物(SEQ ID NO:8)
5’-ATACATATGGGTGATCACCACCCGGCG-3’
克隆aknB和aknC同框缺失右臂的引物序列如下：
aknB和aknC右臂正向引物(SEQ ID NO:9)
5’-ATACATATGGGCTTCAACAGCGCCATGG-3’
aknB和aknC右臂反向引物(SEQ ID NO:10)
5’-ATATCTAGAGTATCCGGTCGAGCACCAGG-3’
以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，以dNTP，DMSO，无酶水，高保真的Primestar DNA聚合酶及缓冲液组成PCR反应体系，扩增用于aknB和aknC基因敲除的左臂和右臂片段。将克隆后的两个片段凝胶电泳分离，切胶回收并纯化，分别加入限制性内切酶HindIII和NdeI以及NdeI和XbaI消化回收片段，将其连入用限制性内切酶XbaI和HindIII同样酶处理过的pKC1139中，将连接体系转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素)中培养过夜，至菌液较浓。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化E.coli S17-1中。
2.重组菌株sHY075001的获得
收集野生型的Streptomyces galilaeus MA144-M1的新鲜孢子，并用TES缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uL TES缓冲液中，放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在37℃萌发3小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养14小时后用萘啶酮酸和阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上，再于平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选，选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得aknB和aknC同框缺失的重组菌株sHY075001。
实施例3.突变蒽环骨架和阿克拉霉素类似物的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定
1.突变蒽环骨架的发酵、分离和鉴定
将突变株sHY076701接种于100mL预发酵培养基中(含TSB 30g/L及阿伯拉抗性抗生素)，30℃培养48小时。将8mL预发酵菌液接种于80mL发酵培养基中(含葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，棉籽粉5g/L，酵母提取物2.5g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4.7H2O 1g/L,NaCl 3g/L,CaCO3 3g/L,pH＝7.5),30℃，220rpm下培养。培养4-5天后加入已灭菌的HP20树脂(40g/L),继续培养至接种后第八天然后处理发酵液。
离心收集沉淀，用丙酮分三次浸泡沉淀，旋转蒸发仪旋去丙酮，用乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯经减压蒸馏抽干得到深褐色膏状物。对膏状物进行分离，用300-400目硅胶预装的正相柱，梯度洗脱条件见表1。
表1
突变蒽环骨架(式IIa所示结构)出现在5：1(乙酸乙酯：石油醚)的洗脱部分中，收集含有纯突变蒽环骨架的洗脱液并进行减压抽干，得到目标产物。对目标产物进行鉴定，核磁归属结果见表2(CDCl3,500MHz)。
表2
HR-ESI-MS(m/z)：[M-H]+测量值为411.1086(C22H19O8计算值为411.1085)。
图1、图2、图3、图4和图5分别为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮(式IIa所示结构)的1H NMR(CDCl3,500MHz)、13C NMR(CDCl3,125MHz)、COSY(CDCl3,125MHz)、HSQC(CDCl3,500MHz)和HMBC(CDCl3,500MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮(如IIa所示结构)。
2.阿克拉霉素类似物的发酵、分离和鉴定
将突变株sHY075001接种于100mL预发酵培养基中(含TSB 30g/L)，30℃培养48小时。将6mL预发酵菌液接种于60mL发酵培养基中(含葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，棉籽粉5g/L，酵母提取物2.5g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4.7H2O1g/L,NaCl 3g/L,CaCO3 3g/L,pH＝7.5),30℃，220rpm培养，接种第四天后加入突变蒽环合成元1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮的DMSO溶液,喂养终浓度是1mg/60mL,接种第七天后加入HP20树脂(3g/60mL)，继续培养至接种后第八天然后处理发酵液。
离心收集沉淀，用丙酮分三次浸泡沉淀，旋转蒸发仪旋去丙酮，用乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯经减压蒸馏抽干得到深褐色膏状物。对膏状物进行分离，用200-300目硅胶预装的正相柱进行粗分，梯度洗脱条件见表3。
表3
阿克拉霉素类似物1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1(式Ia所示结构)和1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X(式Ib所示结构)出现在5：1和3：1(氯仿：甲醇)的洗脱部分中，收集含有1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1和1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的洗脱液并进行减压抽干，溶于5ml甲醇，然后进行HPLC半制备。
HPLC的半制备条件为：
仪器：岛津LC-20-AT(日本岛津公司)
柱子：YMC-Pack ODS-AQ，5μM，C18column,10×250mm(日本YMC公司)
检测波长：UV＝432nm
流动相：A＝H2O(含10mM NH4Ac)；B＝CH3CN
流速：3mL/min
流动相梯度配比见表4。
表4
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 65 | 35 |
| 20 | 45 | 55 |
| 25 | 10 | 90 |
| 28 | 10 | 90 |
| 32 | 65 | 35 |
| 35 | 65 | 35 |
按上述的HPLC的洗脱条件，分别收集1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1和1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X的流出液，最终得到目标产物1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1和1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X。对目标产物1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1进行鉴定，核磁归属结果见表5(CD3OD,600MHz)；对目标产物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X进行鉴定，核磁归属结果见表6(CD3OD,600MHz)。
表5
HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为700.2967(C36H46NO13计算值为700.2964)。
图6、图7、图8、图9、图10、图11和图12分别为1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1(式Ia所示结构)的1H NMR(CD3OD,600MHz)、13C NMR(CD3OD,150MHz)、DEPT135(CD3OD,150MHz)、COSY(CD3OD,600MHz)、HSQC(CD3OD,600MHz)、HMBC(CD3OD,600MHz)和NOESY(CD3OD,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1(如Ia所示结构)。
表6
HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为825.3446(C42H53N2O15计算值为825.3440)。
图13、图14、图15、图16、图17、图18和图19分别为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X(式Ib所示结构)的1H NMR(CD3OD,600MHz)、13C NMR(CD3OD,150MHz)、DEPT 135(CD3OD,150MHz)、COSY(CD3OD,600MHz)、HSQC(CD3OD,600MHz)、HMBC(CD3OD,600MHz)和NOESY(CD3OD,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X(如Ib所示结构)。
阿克拉霉素类似物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A(式Ic所示结构)出现在20：1和10：1(氯仿：甲醇)的洗脱部分中，收集含有1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的洗脱液并进行减压抽干，溶于5ml甲醇，然后进行HPLC半制备。
HPLC的半制备条件为：
仪器：岛津LC-20-AT(日本岛津公司)
柱子：YMC-Pack ODS-AQ，5μM，C18column,10×250mm(日本YMC公司)
检测波长：UV＝432nm
流动相：A＝H2O(含1‰HCOOH)；B＝CH3CN(1‰HCOOH)
流速：3mL/min
流动相梯度配比见表7。
表7
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 70 | 30 |
| 25 | 55 | 45 |
| 28 | 5 | 95 |
| 30 | 5 | 95 |
| 33 | 70 | 30 |
| 35 | 70 | 30 |
按上述的HPLC的洗脱条件，收集1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A的流出液，最终得到目标产物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A。对目标产物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A进行鉴定，核磁归属结果见表8(CDCl3,600MHz)。
表8
HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为812.3489(C42H54NO15计算值为812.3488)。
图20、图21、图22、图23、图24、图25和图26分别为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A(式Ic所示结构)的1H NMR(CDCl3,600MHz)、13C NMR(CDCl3,150MHz)、DEPT 135(CDCl3,150MHz)、COSY(CDCl3,600MHz)、HSQC(CDCl3,600MHz)、HMBC(CDCl3,600MHz)和NOESY(CDCl3,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A(如Ic所示结构)。
阿克拉霉素类似物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B(式Id所示结构)出现在40：1(氯仿：甲醇)的洗脱部分中，收集含有1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的洗脱液并进行减压抽干，溶于5ml甲醇，然后进行HPLC半制备。
HPLC的半制备条件为：
仪器：岛津LC-20-AT(日本岛津公司)
柱子：YMC-Pack ODS-AQ，5μM，C18column,10×250mm(日本YMC公司)
检测波长：UV＝432nm
流动相：A＝H2O(含1‰HCOOH)；B＝CH3CN
流速：3mL/min
流动相梯度配比见表9。
表9
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 20 | 80 |
| 22 | 5 | 95 |
| 25 | 5 | 95 |
| 28 | 50 | 50 |
| 30 | 50 | 50 |
按上述的HPLC的洗脱条件，收集1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B的流出液，最终得到目标产物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B。对目标产物1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B进行鉴定，核磁归属结果见表10(CDCl3,600MHz)。
表10
HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为810.3335(C42H52NO15计算值为810.3331)。
图27、图28、图29、图30、图31、图32和图33分别为1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B(式Id所示结构)的1H NMR(CDCl3,600MHz)、13C NMR(CDCl3,150MHz)、DEPT 135(CDCl3,150MHz)、COSY(CDCl3,600MHz)、HSQC(CDCl3,600MHz)、HMBC(CDCl3,600MHz)和NOESY(CDCl3,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B(如Id所示结构)。
实施例4.出发菌株和改造菌株的发酵产物HPLC分析
HPLC(图34)的检测条件为：
仪器：Dionex Ultimate 3000系统
柱子：Acclaim PolarAdvantage II,C18,5μm,
4.6×250mm(ThermoScientific公司)；
检测波长：UV＝432nm
流动相：A＝H2O(含1‰HCOOH)；B＝CH3CN
流速：1mL/min
流动相梯度配比见表11。
表11
发酵产物分别用HPLC进行分析，结果如下：
图34表示通过喂养突变株sHY075001获得羟基区域异构化阿克拉霉素类似物的HPLC分析。其中ⅰ为野生型Streptomyces galilaeus MA144-M1的发酵结果；ⅱ为突变株sHY076701的HPLC分析，发酵结果表明该突变株可以产生突变蒽环骨架1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮(式IIa所示)；ⅲ为突变株sHY075001的负对照(无1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮)的发酵结果；iV为突变株sHY075001与1-羟基-4-脱羟基-阿克拉菌酮共同发酵产生一系列羟基区域异构化阿克拉霉素类似物的发酵结果。结果表明，野生型菌株能够正常产生阿克拉霉素类天然产物，不加突变蒽环骨架的突变株既不产阿克拉霉素类天然产物，也不产羟基区域异构化阿克拉霉素类似物；而用突变蒽环骨架饲喂的突变株具有合成一系列羟基区域异构化阿克拉霉素类似物的能力。
实施例5.羟基区域异构化阿克拉霉素类似物的抗肿瘤活性
对羟基区域异构化阿克拉霉素类似物和对应阿克拉霉素天然产物进行抗肿瘤活性的测定，方法如下：将细胞用0.05％Trypsin和0.53mM EDTA消化，用培养基稀释成单细胞悬液，调整浓度至5×104个/mL，100μL/well接种于96孔平底透明细胞培养板中，24小时后分别加入含有不同浓度的药物作用一段适当的时间(例如：6、12、24或48小时)。向每孔加入10μl的CCK溶液作用1-4小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度OD(Optical Density)值。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与药物同体积的DMSO，计算细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。之后理算出半抑制浓度IC50。
选取Jurkat细胞进行抗肿瘤活性实验，半抑制浓度(IC50)测试结果显示，羟基区域异构化阿克拉霉素类似物的IC50值比对应的原阿克拉霉素类天然产物降低了2-4倍(表12)，这表明，羟基区域异构化阿克拉霉素类似物具有更高的抗肿瘤活性，其抑制Jurkat细胞的活性比对应的原阿克拉霉素类天然产物的活性提高2-4倍。
表12
| 化合物 | IC50(Jurkat,μM) |
| MA144-S1 | 0.134±0.017 |
| 1-羟基-4-脱羟基-MA144-S1 | 0.052±0.007 |
| 阿克拉霉素X | 0.101±0.010 |
| 1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素X | 0.024±0.004 |
| 阿克拉霉素A | 0.137±0.019 |
| 1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素A | 0.086±0.075 |
| 阿克拉霉素B | 0.110±0.007 |
| 1-羟基-4-脱羟基-阿克拉霉素B | 0.073±0.008 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院上海有机化学研究所
<120> 阿克拉霉素类似物及其制法和用途
<130> P2018-0969
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 1
atatctagac atgcaccacg aatgggtcac 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 2
atacatatgc tcctcgacga gccctcgtt 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 3
atacatatgg agatgacggc ccagttcgct 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 4
ataaagcttg tgcgctcctc actcgtcga 29
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 5
atacatatgt ctagaaccgg gactggccgg actac 35
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 6
atagaattca taataactag tcctcggcgc tgccgtatgc c 41
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 7
ataaagcttg agcgcgtccc ggatgaag 28
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 8
atacatatgg gtgatcacca cccggcg 27
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 9
atacatatgg gcttcaacag cgccatgg 28
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(human sapiens)
<400> 10
atatctagag tatccggtcg agcaccagg 29
Claims (6)
1.一种式I化合物的制备方法，
其中，所述的R1和R2各自独立地选自下组：H、
其中，
表示连接位点；
所述方法包括步骤：
(1)提供一种加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1突变菌株，其特征在于，所述的菌种中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因aknB和链延伸因子基因aknC被失活敲除，具体如下：由aknB和aknC左臂正向引物SEQ ID NO:7和左臂反向引物SEQ IDNO:8以及aknB和aknC右臂正向引物SEQ ID NO:9和右臂反向引物SEQ ID NO:10克隆得到用于aknB和aknC基因敲除的左臂和右臂片段，连接入载体得到缺失质粒，然后导入Streptomyces galilaeus MA144-M1中进行同源重组后得到重组菌株sHY075001；
(2)用式Ⅱa化合物对经改造的aknB和aknC敲除突变株进行饲喂，然后从培养物中提取式Ⅰ化合物，离心弃去上清，丙酮浸泡菌体和HP20吸附树脂，过滤除去不溶物，滤液经减压蒸馏抽干，获得的膏状物先用200-300目硅胶预装的正相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，得到所述的式I化合物；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的化合物选自下组：
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤(a)：
(a)用加利链霉菌突变菌株进行发酵，并对发酵产物进行分离，得到所述的突变蒽环骨架IIa；其中，所述的加利链霉菌突变菌株中，阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除，且所述的菌株中还包括异源表达的越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11；
所述的aknS和aknT采用左臂和右臂片段进行基因敲除，且所述的左臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATATCTAGACATGCACCACGAATGGGTCAC-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATACATATGCTCCTCGACGAGCCCTCGTT-3’
进行扩增得到；
所述的右臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATACATATGGAGATGACGGCCCAGTTCGCT-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATAAAGCTTGTGCGCTCCTCACTCGTCGA-3’
进行扩增得到；
所述kstA10和kstA11异源表达片段以Micromonospora sp.TP-A0468的总DNA为模板，用如下的正向引物：
5’-ATACATATGTCTAGAACCGGGACTGGCCGGACTAC-3’；和如下的反向引物：
5’-ATAGAATTCATAATAACTAGTCCTCGGCGCTGCCGTATGCC-3’
进行扩增得到。
4.一种用于生产阿克拉霉素类似物的加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1突变菌株，其特征在于，所述的菌种中阿克拉霉素生物合成基因簇中的酮基合酶基因aknB和链延伸因子基因aknC被失活敲除；且所述的阿克拉霉素类似物具有如下式I所示的结构：
其中，所述的R1和R2各自独立地选自下组：H、
其中，
表示连接位点；
所述的aknB和aknC采用左臂和右臂片段进行基因敲除，且所述的左臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATAAAGCTTGAGCGCGTCCCGGATGAAG-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATACATATGGGTGATCACCACCCGGCG-3’
进行扩增得到；
所述的右臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATACATATGGGCTTCAACAGCGCCATGG-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATATCTAGAGTATCCGGTCGAGCACCAGG-3’
进行扩增得到。
5.一种用于生产阿克拉霉素类似物的加利链霉菌Streptomyces galilaeus MA144-M1突变菌株，其特征在于，所述的菌种中，阿克拉霉素生物合成基因簇中的负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除，且所述的菌种包括异源表达的越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11；且所述的阿克拉霉素类似物具有如下式I所示的结构：
其中，所述的R1和R2各自独立地选自下组：H、
其中，
表示连接位点；
所述的aknS和aknT采用左臂和右臂片段进行基因敲除，且所述的左臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATATCTAGACATGCACCACGAATGGGTCAC-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATACATATGCTCCTCGACGAGCCCTCGTT-3’
进行扩增得到；
所述的右臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATACATATGGAGATGACGGCCCAGTTCGCT-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATAAAGCTTGTGCGCTCCTCACTCGTCGA-3’
进行扩增得到；
所述kstA10和kstA11异源表达片段以Micromonospora sp.TP-A0468的总DNA为模板，用如下的正向引物：
5’-ATACATATGTCTAGAACCGGGACTGGCCGGACTAC-3’；和如下的反向引物：
5’-ATAGAATTCATAATAACTAGTCCTCGGCGCTGCCGTATGCC-3’
进行扩增得到。
6.一种如下式IIa所示的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)用加利链霉菌突变菌株进行发酵，并对发酵产物进行分离，得到所述的突变蒽环骨架；其中，所述的加利链霉菌突变菌株中，阿克拉霉素生物合成基因簇中负责第一个糖基上载的糖基转移酶基因aknS和aknT被失活或敲除；且异源表达越野他汀生物合成基因簇中的基因kstA10和kstA11；
所述的aknS和aknT采用左臂和右臂片段进行基因敲除，且所述的左臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATATCTAGACATGCACCACGAATGGGTCAC-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATACATATGCTCCTCGACGAGCCCTCGTT-3’
进行扩增得到；
所述的右臂片段以Streptomyces galilaeus MA144-M1的总DNA为模板，采用如下所示的正向引物：
5’-ATACATATGGAGATGACGGCCCAGTTCGCT-3’；和如下所示的反向引物：
5’-ATAAAGCTTGTGCGCTCCTCACTCGTCGA-3’
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| US4405713A (en) * | 1981-12-28 | 1983-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for the preparation of optically active anthracycline glycosides A and B |
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|---|---|---|---|---|
| EP0072974A1 (en) * | 1981-08-11 | 1983-03-02 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Anthracycline antibiotics and their preparation method |
| US4405713A (en) * | 1981-12-28 | 1983-09-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for the preparation of optically active anthracycline glycosides A and B |
| CN105164138A (zh) * | 2013-04-29 | 2015-12-16 | 内尔维阿诺医学科学有限公司 | 新吗啉基蒽环类抗生素衍生物 |
| CN104151376A (zh) * | 2014-06-23 | 2014-11-19 | 天津市新药安全评价研究中心 | 一种抗肿瘤药物及其合成方法和用途 |
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| "Extensive Intracellular Accumulation of ID-6105, a Novel Anthracycline,in SK-OV-3 Ovarian Cancer Cells";Dae Hwan Shin et al.;《Arch Pharm Res》;20081231;第31卷(第10期);第1355-1361页 * |
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