JP2012240974A - ダイデムニンｂの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ダイデムニンＢを効率よく製造する方法の提供。
【解決手段】ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物を培養し、培養物よりダイデムニンＢを採取するダイデムニンＢの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、微生物を利用したダイデムニンＢの製造方法に関する。

ダイデムニンＢ（Ｄｉｄｅｍｎｉｎ Ｂ）は、１９８１年にカリブ海産ホヤ（Ｔｒｉｄｉｄｅｍｎｕｍ ｓｏｌｉｄｕｍ）から単離された環状デプシペプチドである（非特許文献１及び２）。ダイデムニンＢは優れた抗腫瘍作用を有し、抗ガン剤としての利用が期待されたが、その強い毒性のために現在開発が中止されている（非特許文献３）。
ダイデムニンＢは、抗腫瘍作用の他にも、抗ウィルス作用、免疫抑制作用等の様々な生理活性を持つこと、パルミトイルチオエステラーゼやＦＫ−５０６結合蛋白質を分子標的としていること等が報告されている（非特許文献４）。また、別種のホヤ（Ａｐｌｉｄｉｕｍ ａｌｂｉｃａｎｓ）から、ダイデムニンＢの乳酸部分の水酸基をカルボニルに置き換えたアプリジン（Ａｐｌｉｄｉｎ）が単離され、その抗腫瘍作用により新たに医薬品としての開発が進行している（非特許文献５）。
したがって、ダイデムニンＢは、抗腫瘍薬のみならず様々な治療薬を開発する上でリード化合物となることが期待される。

ホヤから分離されるダイデムニンＢは極微量であることから、ダイデムニンＢを工業的に大量に生産し、安定的に供給することは難しい。
しかし一方で、ダイデムニンＢを始め海洋天然物には独特の化学構造を持つものが多く、それらの実用的な製造技術は確立されていない。また、ホヤから単離された生理活性物質の多くは共生藻が生産しているのではないかという仮説があるものの（非特許文献６）、真の生産者は未だ明らかにされていない。

Ｒｉｎｅｈａｒｔ Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，１８５７−１８５９ Ｅｌｉａｎｅ Ａｂｏｕ−Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，１２５９１−１２６００ Ｎｕｉｊｅｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ：Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２０００，１１，７９３−８１１ Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Tｈｅｒ ２００５，４，３３３−３４２ Ｕｒｄｉａｌｅｓ Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ：Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． １９９６，１０２，３１−３７ Ｓｉｎｇ Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｒｉｎｅｈａｒｔ Ｋ．Ｌ．：Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，１７，３８５−３９６

したがって、本発明の課題は、ダイデムニンＢを効率よく製造する方法を提供することにある。

本発明者は、海砂より単離した細菌の培養液が強い癌細胞増殖抑制活性を示したことからその活性成分の単離を試みたところ、ダイデムニンＢであることが判明した。そしてさらにその生産菌について検討したところ、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物であり、当該微生物がダイデムニンＢを効率よく生産することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリスに属する微生物を培養し、培養物よりダイデムニンＢを採取するダイデムニンＢの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物を提供するものである。
また、本発明は、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９と命名され、ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０８０として寄託された微生物を提供するものである。

本発明によれば、ダイデムニンＢの効率的な生産が可能である。また、本発明のダイデムニンＢ生産菌を用いたダイデムニンＢの生合成に関する研究から、海洋天然物の生産者や生合成に関する新たな知見を得ることが期待できる。

チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を示す図である。 Ａ３ＤＥ分画のＨＰＬＣチャートを示す図である。 Ａ３ＤＥ３分画のＨＰＬＣチャートを示す図である。 化合物１の化学構造を示す図である。 化合物１の¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。 化合物１の¹³Ｃ-ＮＭＲスペクトルを示す図である。

本発明に用いられる微生物は、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属し、ダイデムニンＢを生産する能力を有するものであれば特に限定されない。好適には、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に２０１１年３月１１日付でＦＥＲＭ ＡＰ−２２０８０として寄託された微生物が挙げられる。
ＹＩＴ１２４０９株は、後記実施例に示すように、千葉県館山湾の海砂より本発明者らによって初めて分離されたものであり、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列により相同性検索を行った結果、チストレラ・モビリスに属する菌株と判定された。表２は相同性検索の結果である。
なお、ＹＩＴ１２４０９株を親株とする子孫株（人工・自然変異株、遺伝子操作による変異株等）、或いは１６ＳｒＲＮＡの配列が、図１に示される配列（ＹＩＴ１２４０９株の１６ＳｒＲＮＡ配列）と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつダイデムニンＢ生産能を有する微生物も本発明の微生物に含まれる。

上記微生物を培養する培地は、チストレラ・モビリスの培養に用いられるものであれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
栄養源としては、例えば、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等の炭素源；アンモニア、アンモニウム塩等の無機・有機アンモニウム塩、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、各種アミノ酸等の窒素源；リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺等の無機塩類、海水および人工海水等を用いることができる。
また、必要に応じて、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−７（以上、登録商標、オルガノ製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−３０、ＨＰ−４０、ＨＰ−５０（以上、登録商標、三菱化学（株）製）等の非イオン性吸着剤を培地に添加してもよい。

培養は、チストレラ・モビリスが増殖する条件であればよい。培養方法は、特に限定されず、通気培養、嫌気培養、攪拌培養、振盪培養、静置培養等が挙げられ、生産性を考慮して、好気的条件下で攪拌、振盪培養するのが好ましい。

また、培養温度は、通常、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃であり、培養期間は、通常２４時間〜１４日間、好ましくは６〜８日間である。

培地のｐＨ（２５℃）は、６〜８、好ましくは７．３〜７．７である。培地のｐＨを調整する緩衝剤としては、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は２種以上組み合わせて用いてもよい。

このような培養により、培地中及び／又は菌体中にダイデムニンＢが蓄積するので、培養終了後、通常の分離・精製手段により培養物からダイデムニンＢを採取することができる。
例えば、培養物を溶剤抽出し、次いで、分別沈殿、液液分配、カラムクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフ等を単独或いは組み合わせて用いることによりダイデムニンＢを取得することができる。

抽出に用いられる溶剤としては、特に限定されないが、例えば水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；又はこれらの混液等が挙げられる。このうち、メタノール等の低級アルコール類が好ましい。

抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、培養物１質量部に対して１〜３質量部の溶剤を用い、１５〜３５℃で１〜２４時間抽出するのが好ましい。
得られた抽出物は、そのまま用いてもよく、希釈、濃縮もしくは凍結乾燥し、必要に応じて粉末状、ペースト状に調製して用いてもよい。

かくして得られるダイデムニンＢは、抗腫瘍活性をはじめ、様々な優れた生理活性を有しており、新規医薬品又はそのリード化合物としての利用が期待される。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

参考例１ ダイデムニンＢ生産菌の取得
１）スクリーニング
千葉県館山湾の水深３ｍ地点より採取された海砂を２０質量％（以下「％」とする）グリセロールを含む人工海水に懸濁し、一部をＩＳＰ Ｎｏ．２寒天培地（１Ｌあたりイーストエキス ４ｇ、麦芽エキス １０ｇ、グルコース ４ｇ、寒天１５〜２０ｇ含有）に接種し、２５℃にて２週間培養した。培養後プレートよりコロニーを釣菌し、株番号０８０９１９−２−１とした。

２）０８０９１９−２−１菌株の同定
０８０９１９−２−１菌株はＩＳＰ Ｎｏ．２培地（１Ｌあたりイーストエキス ４ｇ、麦芽エキス １０ｇ、グルコース ４ｇ含有）を用いて、２６℃、７日間、ロータリーシェーカーを用いて回転させながら培養した。
得られた菌液を遠心（２０，０００×ｇ，４分）して、菌体ペレットを得た。菌体ペレットからフェノール‐ガラスビーズ法でＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、表１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列増幅用プライマー（８Ｆ；配列番号１、１５Ｒ；配列番号８）で増幅後、精製を行った。精製した増幅産物を鋳型として、表１に示すプライマー（配列番号１〜８）を用いて、それぞれダイターミネーター反応を行い、ＤＮＡシークエンサー（３１３０ＸＬ，ＡＢ社）を用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を決定した。得られた遺伝子配列をデータベース内の配列に対して相同性検索（ＦＡＳＴＡ）し、近縁菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を含めて系統解析し、菌種を推定した。

０８０９１９−２−１菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号９）を図１に示した。また、相同性検索の結果を表２に示した。この結果、０８０９１９−２−１菌株はチストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）と同定された。
０８０９１９−２−１菌株は、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２２０８０として寄託された。

実施例１ ダイデムニンＢの製造
１）抽出物の調製
ＹＩＴ１２４０９株を５０ｍＬのISP No.2培地にて２５℃で１週間前培養し、これを約１００ｇのアンバーライトＸＡＤ−７樹脂（オルガノ社製）を含む４ＬのＩＳＰ Ｎｏ．２培地に加え、２５℃、１４０ｒ／ｍｉｎで１週間本培養を行った。培養後、樹脂を回収し水で洗浄した後、室温で１時間メタノール３００ｍＬにて３回抽出を行い、次いで減圧濃縮して抽出物を得た。

２）一次分画
上記１）で得た抽出物を酢酸エチル２０ｍＬと水２０ｍＬで二相分配した。水画分は更に２回酢酸エチル２０ｍＬで二相分配を繰り返した。酢酸エチル画分を合一し、減圧濃縮して画分Ａを８３．８ｍｇ得た。水画分は一部を減圧濃縮して画分Ｂとした。
画分ＡとＢの抗腫瘍活性を表３に示す。なお、本発明において抗腫瘍活性は次のとおり測定した。

＜抗腫瘍活性の測定＞
ヒト肺癌由来Ａ５４９細胞及び結腸直腸癌由来ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ，Ｌｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％ＦＢＳ、５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ-ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）及びＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ）にそれぞれ浮遊させ、５％ＣＯ₂、３７℃にて培養した。
対数増殖期の細胞（密度１×１０⁴細胞／１．９ｍＬ、体積１０９μＬ）を９６ウェルマイクロプレートに播種し、２４時間後、目的の濃度に調製した被験物質を１０μＬずつ添加した。３７℃で９６時間培養後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ ＯＮＥ（生化学工業）を１０μＬずつ各ウェルに添加し、さらに３７℃で１時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果は、細胞増殖を５０％抑制する被験物質の濃度（ＩＣ₅₀）で表した。

３）二次分画
φ３０×１３０ｍｍのシリカゲルカラムを用いて、画分Ａを順相クロマトグラフィーに供した。表４に示したとおりの溶媒で順次溶出し、Ａ１〜７の７画分を得た。各画分の抗腫瘍活性を表４に示す。

４）三次分画
上記で得られた７画分のうち、非常に強い活性を示した画分Ａ３について精製を進めた。Ｓｅｐ−ｐａｋ ２ｇ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて画分Ａ３を逆相クロマトグラフィーに供した。表５に示したとおりの溶媒で順次溶出し、Ａ３Ａ〜Ｆの６画分を得た。各画分の抗腫瘍活性を表５に示す。

５）四次分画
上記で得られた６画分のうち、非常に強い活性を示した画分Ａ３ＤとＡ３Ｅを合わせて（以下、Ａ３ＤＥ）、これについて精製を進めた。ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-ＡＭＣ₁₈φ１０×２５０ｍｍを用いて、下記条件で逆相高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行い、図２に示すＡ３ＤＥ１〜５の５画分を得た。各画分の抗腫瘍活性を表６に示す。なお、ＨＰＬＣ装置はＷａｔｅｒｓ社製 Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、検出器にＰｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ９９６を使用し、データ処理にはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ３２を使用した。
＜ＲＰ-ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-ＡＭＣ₁₈φ１０×２５０ｍｍ
溶離液：５０％ＭｅＣＮ−１００％ＭｅＣＮ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ５０ｍｉｎ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃

６）五次分画
上記で得られた画分のうち、非常に強い活性を示した画分Ａ３ＤＥ３について精製を進めた。ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-ＡＭＣ₁₈φ１０×２５０ｍｍを用いて、下記条件でＲＰ−ＨＰＬＣを行い、図３に示すＡ３ＤＥ３Ａ〜Ｇの７画分を得た。
＜ＲＰ-ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-ＡＭＣ₁₈φ１０×２５０ｍｍ
溶離液：６０％ＭｅＣＮ ６０ｍｉｎ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃

７）Ａ３ＤＥ３Ｅの同定
上記で得られた画分Ａ３ＤＥ３Ｅの主成分を化合物１とし、その構造解析を行った。
質量分析（ＭＳ）により、化合物１の（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン１１１２．６及び（Ｍ＋Ｃｌ）^-イオン１１４６．６が観察されたことから、分子量１１１１と決定した。また、ＭＳスペクトル及び各種ＮＭＲスペクトル解析より化合物１の分子式はＣ₅₇Ｈ₈₉Ｎ₇Ｏ₁₅と決定された。図４に化合物１の構造、図５に化合物１の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル、図６に化合物１の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル、表７−１〜表７−３に¹Ｈ及び¹³Ｃ−ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ及び１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）を示す。ＮＭＲスペクトルは日本電子ＪＮＭ−ＧＸ４００型スペクトロメータ及び、ＪＮＭ−ＥＣＡ５００型スペクトロメータを用いた。ＭＳスペクトルはＷａｔｅｒｓ社製ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（ＥＳＩ）を使用し、Ｗモード測定を行い、データ処理にはＭａｓｓＬｙｎｘを使用した。カラムはＡｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μｍ）φ２．１ｘ５０ｍｍ、溶媒は水：アセトニトリル（４０：６０−２０：８０−７．０分）、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで行った。

化合物１の分子式及び¹Ｈ−ＮＭＲの特徴的なピークの情報をもとに各種化合物ライブラリの検索を行った。微生物を由来とした化合物では化合物１に該当する化合物の報告はなかった。そこで、微生物に限らず検索を行ったところ、ダイデムニンＢと判明した。

既報のダイデムニンＢと化合物１の¹Ｈ−ＮＭＲ及び¹³Ｃ−ＮＭＲの化学シフトの比較を行った結果が表８−１、表８−２である。特徴的なシグナルとして¹Ｈ−ＮＭＲにおけるｉｓｏ−Ｓｔａ（δ７．５８ｐｐｍ）、Ｔｈｒ（δ８．２５ｐｐｍ）、Ｌｅｕ（δ８．４７ｐｐｍ）のアミドプロトンや、Ｎ，Ｏ−ｄｉＭｅＴｙｒのＮ−Ｍｅ（δ２．６３ｐｐｍ）、Ｏ−Ｍｅ（δ３．７３ｐｐｍ）、Ｎ−ＭｅＬｅｕのＮ−Ｍｅ（δ３．２４ｐｐｍ）があり、その他１１本のメチルシグナルも文献値と良い一致を示した。このことから、化合物１をダイデムニンＢと同定した。

以上より、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物は、培養物中にダイデムニンＢを生産することが確認された。

Claims (4)

1. ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物を培養し、培養物よりダイデムニンＢを採取するダイデムニンＢの製造方法。
2. ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリスに属する微生物が、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０８０）である請求項１記載のダイデムニンＢの製造方法。
3. ダイデムニンＢを生産する能力を有するチストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）に属する微生物。
4. チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＹＩＴ１２４０９と命名され、ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０８０として寄託された請求項３記載の微生物。

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