CN103030683A - 棘孢肽类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及棘孢肽类化合物及其制备方法；本发明还涉及该化合物在抗肿瘤剂中的用途。所述化合物通过发酵培养棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。本发明的棘孢肽类化合物属于活性线性小肽，并且是罕见的C端与N端同时乙酰化。所述棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性。可作为制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。

Description

棘孢肽类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及棘孢肽类化合物及其制备方法；本发明还涉及该化合物在抗肿瘤剂中的用途。
背景技术
棘孢肽类化合物（peptaibol）主要是来源于木霉属的一类活性线性小肽，常被报道具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫等活性，并且C端与N端同时乙酰化的棘孢肽十分罕见。本发明人研究得知，棘孢木霉(Trichoderma asperellum) (2012年10月31日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCC M 2012438)液体发酵产物的粗提物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棘孢肽类化合物及其制备方法和用途，该化合物具有抑制肿瘤细胞增殖作用，具有抗肿瘤活性。其结构式为：
Figure 785774DEST_PATH_IMAGE002
    其结构特征是：含有六个甲基丙氨酸残基、一个缬氨酸残基、一个异亮氨酸残基、一个丝氨酸残基，并且C端与N端同时乙酰化。
本发明还提供了所述化合物的制备方法：发酵培养棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。 
所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) IBPT-2，已于2012年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC M 2012438。
本发明还保护了所述的化合物在制备细胞增殖抑制剂中的用途。及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的显著优点：研究所示棘孢肽类化合物属于活性线性小肽，并且是罕见的C端与N端同时乙酰化。所述棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取棘孢木霉(Trichoderma asperellum) IBPT-2 (2012年10月31日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCC M 2012438) 适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 适量，接种到装有400mL培养液 [ 培养基组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH2PO4 0.5 ，MgSO4 0.3，海水 ] 的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。
2 浸膏的获得
 用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液与乙酸乙酯1:2萃取两次，萃取液减压蒸馏至干，得到发酵液的乙酸乙酯浸膏。
3 化合物的分离精制 
浸膏用100-200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过300-400目硅胶进行减压硅胶色谱柱层析，得到5个组分（A-E）。收集组分B (二氯甲烷-甲醇20:1洗脱物)，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过加压硅胶柱层析，得4个组分（B1-B4）。收集组分B3（二氯甲烷-甲醇为20:1的洗脱物）通过氯仿-甲醇(1:2)为溶剂进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，再经过RP-18反相硅胶柱层析以甲醇-水(3:2)为溶剂洗脱，最后通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250 mm，5μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为50%乙腈水溶液，得到所示化合物。
化合物   无色晶体，正离子HR-ESI-MS m/z: 995.6172 [M + H] +，分子式C47H82N10O13； [α]25 D -22 (c=0.1, MeOH); 1H和13C-NMR等NMR数据见表1。负离子二级质谱碎片离子 (-)ESIMS/MS m/z 994, 964, 922, 837, 751, 652, 567；正离子二级质谱碎片离子(+) ESIMS/MS m/z 1018 [M + Na]+, 847, 762, 674, 589, 504, 391, 306。
表1化合物的1H和13C-NMR数据(500和125MHz，in DMSO-d 6 )a
Figure 85354DEST_PATH_IMAGE004
Figure 962043DEST_PATH_IMAGE005
Figure 2012105610620100002DEST_PATH_IMAGE006
a) 本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMQC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定。
b)  此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出耦合相关信号的1H核。
c)  此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出耦合相关信号的13C核。
d)  此栏中的A=Aib, V=Val, I=Ile, S=Ser。
实施例2 体外抗肿瘤活性的测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制  测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞系。细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37℃于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法 
丽丝胺罗丹明B（SRB）法  取对数生长期的人肺癌A549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，于37℃下培养24小时。取在药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清液。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4% SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris换成（100mmol/L，pH 10.5）溶解蛋白结合染料并利用酶标仪测定每孔在520nm处的光密度（OD）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR (%) = (OD空白对照-OD样品)/OD空白对照 × 100%式计算每个浓度下的样品对细胞增殖抑制率 (IR%)。根据不同浓度的抑制率计算，得出IC50值。
2. 实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在SRB法测试中，该化合物对人肺癌A549细胞的增殖抑制结果：IC50=0.48mg/mL。
3. 结论
化合物具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。

Claims (6)

  1. 化合物
    Figure 260662DEST_PATH_IMAGE001
    。
  2. 一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：发酵培养棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。
  3.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) IBPT-2已于2012年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCC M 2012438。
  4. 权利要求1所述的化合物在制备细胞增殖抑制剂中的用途。
  5. 根据权利要求4所述化合物的用途，其特征在于：细胞为人肺癌A549细胞。
  6. 权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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