CN102993275A

CN102993275A - 一种博来霉素族衍生物及其抗癌活性

Info

Publication number: CN102993275A
Application number: CN2011102763189A
Authority: CN
Inventors: 沈奔; 段燕文
Original assignee: CHANGSHA TIANCI BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd; CHANGSHA CIHANG MEDICAMENTS GRADUATE SCHOOL Co Ltd
Current assignee: Hayao Cihang Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2011-09-19
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-09-19
Also published as: CN102993275B

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用黄绿链霉菌SB9026(保藏号CCTCCM 2011292)制备的新型博来霉素族衍生物及其抗癌活性。本发明的博来霉素族衍生物其化学结构通式如式(I)所示，其中R₁选自H、烷基、氨基、烃基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基或-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，其中n＝1-6；R₂选自H或-OH。同时本发明还对两种具体的博莱霉素衍生物的生物活性进行了初步测试，发现衍生化合物BLM S(化合物1)的DNA裂解活性与已知的博莱霉素A2相当，而衍生化合物6’-脱羟基-BLM S(化合物2)的DNA裂解活性则至少是博莱霉素A2活性的10倍以上。

Description

一种博来霉素族衍生物及其抗癌活性

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型博来霉素族衍生物及其活性。

背景技术

博莱霉素(Bleomycin，英文简字BLM)是20世纪60年代从轮枝链霉菌(Streptomycesverticillus)的发酵产物中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素。目前已有十余种博莱霉素天然组分被发现，它们的结构仅在末端胺基上存在差异，其中主要成分为博莱霉素A2(55％～70％)和博莱霉素B2(25％～32％)。此外，包括泰莱霉素(Tallysomycin)，佐伯霉素(Zorbamycin)和腐草霉素(Phleomycin)在内的天然产物与博莱霉素的结构和活性都极为相似，因此统称为博莱霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。

博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博莱霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统，因此对人体白细胞，机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博莱霉素属于细胞周期非特异性药物，从上世纪80年代起被开发成为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上广泛应用。以BLMA2和B2为主要成分的商品药

就被用于治疗睾丸癌，同时还广泛应用于霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤的治疗。但是博莱霉素能增加活性氧分子从而导致细胞的氧化压力，并诱导肺中的上皮和非上皮细胞的衰老和凋亡最终导致肺纤维化。目前博来霉素一般与其他抗肿瘤药物或辅助药物联合应用，以降低其毒性和获得更好的抗肿瘤效果。

佐伯霉素(Zorbamycin，英文简字ZBM)是由黄绿链霉菌(Streptomyces flavoviridis)合成的博莱霉素族抗生素。佐伯霉素与博莱霉素在结构极为相似，主要差别在于佐伯霉素中的末端胺基支链不同，第一个噻唑啉/噻唑的氧化程度不同，多肽骨架中存在β-羟基化-L-缬氨酸和L-高丝氨酸结构部分，糖基部分为2-O-(3-O-氨基甲酰-甘露糖基)-6-脱氧-L-古洛糖(如式II所示)。相应的，在佐伯霉素生物合成基因簇(zbm)的40个开放阅读框(ORF)中，仅有22个显示出与对应的博莱霉素生物合成基因簇(blm)开放阅读框的同源性，其它开放阅读框的不同很可能导致了上述两种化合物的结构差异。

博莱霉素自被发现后便因其强效的抗肿瘤活性迅速成为治疗多种肿瘤的特效化疗药物，近年来博莱霉素族抗生素在抗病毒研究中的应用，更加拓宽了其应用范围。但是博莱霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大地限制了其临床应用和推广。因此合成新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物一直都是开发博莱霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。虽然博莱霉素的化学全合成已经完成，但是通过传统化学修饰获取的少量博莱霉素衍生物并未展示出更好的活性或更低的毒性，同时博莱霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用。随着生物化学和分子生物学的快速发展，新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。通过生物合成基因簇中蕴含的信息以及相关微生物的遗传操纵，组合生物合成技术可实现复杂结构的多功能团化合物的特定结构改变。另一方面，包括博莱霉素、泰莱霉素和佐伯霉素在内的几种博莱霉素族抗肿瘤抗生素的生物合成被大量研究，其相关生物合成基因簇已经被分别克隆、测序以及表征，这为我们通过组合生物合成技术来操纵这些生物合成器并获得具有更好抗肿瘤活性和更低毒性的新型博莱霉素衍生物提供了坚实的基础，也为最终的博莱霉素类新型抗肿瘤药物的开发提供了一条新颖高效的途径。

式II.、博莱霉素(BLM)和佐伯霉素(ZBM)的化学结构，红色虚线圈标示为两者结构差异之处。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种博来霉素族衍生物及其活性，具体是通过以佐伯霉素原始生产菌株黄绿链霉菌SB9001(Streptomyces flavoviridis SB9001)为母体，通过基因重组技术构建不合成佐伯霉素的SB9025基因工程菌，并以此为异源宿主，将含有完整博莱霉素生物合成基因簇blm的人造细菌染色体(BAC)质粒pBS54引入SB9025基因工程菌中进行表达，从而生产具有极强抗癌活性的新型博莱霉素衍生物，及其药学上可接受的盐。同时本发明还对两种新型博莱霉素类似物的生物活性进行了初步测试，发现BLM S(CH102，化合物1)的DNA裂解活性与已知的博莱霉素A₂相当，而6’-脱羟基-BLMS(CH103，化合物2)的DNA裂解活性则至少是博莱霉素A₂活性的10倍以上。这说明在更少用量的条件下，6’-脱羟基-BLM S比目前临床使用的任何一种博莱霉素类抗癌药物的毒性都要低，很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。

本发明的技术方案之一为：

一种博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其化学结构通式如式(I)所示：

其中，R₁选自H、烷基、氨基、烃基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基或-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，其中n＝1-6；

R₂选自H或-OH；

所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃；

所述杂烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被O、S或N取代；

所述卤代烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被F、Cl或Br取代。

其中R₁优选为-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，n＝1-4，优选n＝2。

当R₁为-(CH₂)₂-C(NH₂)＝NH，R₂为-OH时，对于本发明中的一种具体的化合物，化合物1，其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂+H]⁺，分子量为1382.5212，简称为BLM S(CH102)，具体结构鉴定和活性测试参见实施例。

当R₁为-(CH₂)₂-C(NH₂)＝NH，R₂为H时，对于本发明中的另一种具体的化合物，化合物2，其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂+H]⁺，分子量为1366.5263，简称为6’-脱羟基-BLM S(CH103)，具体结构鉴定和活性测试实施例。

所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在DNA裂解活性方面的应用。

所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗抗肿瘤药物和抗生素类药物方面的应用。

所述治疗抗肿瘤药物包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌等，以及恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤。

所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗白血病和银屑病药物方面的应用。

本发明的技术方案之二为：

一种用于制备博来霉素族衍生物的黄绿链霉菌SB9026，保藏号CCTCC M 2011292，菌种名称为：黄绿链霉菌SB9026.拉丁文学名为：streptomyces flavoviridis SB9026，保藏编号为：CCTCC NO：M 2011292，保藏日期为：2011年8月19日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。

所述黄绿链霉菌SB9026的制备方法是：从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌SB9025突变株；同时以博莱霉素原始生产菌轮枝链霉菌ATCC15003为母体构建博莱霉素生物基因簇blm的人造细菌染色体(BAC)质粒文库，从中筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54；最终以黄绿链霉菌SB9025突变株为异源宿主，将BAC质粒pBS54转入其中获得黄绿链霉菌SB9026。

用该黄绿链霉菌SB9026来制备博来霉素族衍生物的方法为现有方法。

下面对本发明做进一步的解释和说明：

由于博莱霉素族抗癌抗生素的临床重要性，为了开发高效低毒的新型抗癌药物，研究人员进行了大量的研究来确定其分子结构与生物活性之间的关联。一般认为博莱霉素分子骨架中的双噻唑和C-末端的胺基部分对博莱霉素化合物与DNA之间的亲和作用起了主导作用，而且有可能影响着对DNA的辨识和DNA裂解的选择性；而糖基团的功能尚未明确，很有可能参与了博莱霉素与细胞的辨识过程，尤其是细胞的摄取和金属离子的配位等。本发明涉及的BLM S是由博莱霉素的多肽分子骨架包括糖基团部分与佐伯霉素的C-末端胺基链结合而成，而6’-脱羟基-BLM S则是由博莱霉素的多肽分子骨架与佐伯霉素的C-末端胺基链和糖基团部分结合而成。根据BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂的DNA裂解活性测试比较，BLM S(EC₅₀＝320nM)与BLM A₂(EC₅₀＝300nM)的生物活性相当，因此博莱霉素与佐伯霉素的末端胺基基团互换以后并未明显影响其生物活性；对于6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂而言，6’-脱羟基-BLM S(EC₅₀＝30nM)强于10倍以上的DNA裂解活性则首次揭示了糖基团在决定博莱霉素族化合物的生物活性中扮演了重要的角色。

博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。因此博莱霉素族化合物的DNA裂解活性的强弱直接反映了其抗癌活性的高低。6’-脱羟基-BLM S极强的DNA裂解活性也预示其更好的抗癌活性，因此可以减少其临床用量并极大地降低其剂量依赖性肺毒性，从而克服了当前博莱霉素临床治疗应用的一大挑战，很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明提供了一种用博来霉素族衍生物的黄绿链霉菌SB9026。

2、本发明提供了一种新型的博来霉素族衍生物，其DNA裂解活性比现有的博来霉素BLM A₂强10倍左右。

3、本发明的博来霉素族衍生物有望成为一种新型的抗癌药物。

附图说明

图1是通过pBluescript II SK(+)质粒松弛活性分析来测试BLM S(化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(化合物2)的DNA裂解活性，并与BLM A₂进行比较；

其中，图1(a)是固定浓度下的终点分析比较化合物1、化合物2和博来霉素A₂的DNA裂解活性；图1(b)以6’-脱羟基-BLM S(化合物2)诱导的DNA裂解为例通过动力学分析确定EC₅₀值；其中A代表超螺旋质粒DNA；B代表开环质粒DNA；C代表线形质粒DNA。

另外，本发明的保藏号CCTCC M 2011292的菌种保藏信息如下：

菌种名称为：黄绿链霉菌SB9026.

拉丁文学名为：streptomyces flavoviridis SB9026，

保藏编号为：CCTCC NO：M 2011292，

保藏日期为：2011年8月19日，

保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例进一步解释和说明本发明，以下所有百分含量均指质量百分含量。

实施例1：

黄绿链霉菌SB9001和实验中得到的基因工程突变菌株均在30℃的ISP4琼脂固体培养基上培养以获取孢子。轮枝链霉菌ATCC15003在含有0.5％甘氨酸的TSBY液体培养基中，28℃和250rpm转速下生长以获取基因组DNA。大肠杆菌在LB液体培养基中，37℃和250rpm转速下生长用于日常的质粒克隆，BAC文库的建立。

1)黄绿链霉菌SB9025突变株的构建

从包含一部分佐伯霉素生物合成基因簇zbm的科斯质粒中分离得到了大小为10kb的含有完整的zbmVIII基因的DNA片段，并通过BamHI和BglII酶切位点将该10kb DNA片段克隆到Litmus 28质粒上。所得质粒经SbfI酶切后将约3.7kb大小的插入片段移除，然后质粒再进行自我连接，完成zbmVIII基因的敲除。将这一更改过的DNA插入片段经过BamHI和BglII酶切后释放，并转移连接至pOJ260质粒中，所得质粒转入大肠杆菌S17-1中作为配体菌株与黄绿链霉菌SB9001进行接合转移实验。通过PCR实验对接合体进行筛选后分离得到双交换重组的黄绿链霉菌SB9025突变株，并最终通过DNA印迹实验对zbmVIII基因的敲除进行验证。

2)轮枝链霉菌ATCC15003基因组BAC文库的建立和筛选

基因组BAC文库的构建按照标准试验操作进行。对插入DNA片段的平均大小进行检查后，从平板上挑选的BAC克隆被转入冷冻的96孔板上并在-80℃冷藏过夜。随后这些克隆被转移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia，美国)上通过杂交进行固定，并与BlmA探针进行杂交实验。BlmA探针由引物BlmAF(5′-CATATGGTGAAATTCTTGGGTGCCG-3′)和BlmAR(5′-AAGCCTCTCCCCCGCGGTGAAGTG-3′)扩增得到。最后通过ORF32引物C-PHNA-F1(5′-GCAGCGTCATGAACAGGGTG-3′)和C-PHNA-r1(5′-CCGGACCATCATGTAGCGAC-3′)对杂交所得的阳性克隆进行PCR筛选，PCR扩增程序为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟共35个循环；72℃7分钟。最终筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54。

上述基因序列号码均在美国的Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上公开发布，zbmVIII基因(Genbank accession number：EU670723)，blm基因簇，以及BlmA探针和ORF32(Genbank accession number：AF149091，AF210249)。

3)黄绿链霉菌SB9026的构建和发酵培养

将BAC质粒pBS54转入黄绿链霉菌SB9025突变株中得到黄绿链霉菌SB9026，并通过PCR实验和DNA印迹实验对blm基因簇的转入进行验证。将黄绿链霉菌SB9026的孢子悬浮液接种至50ml种子培养基(15g/L甘油，15g/L药用培养基药媒，3g/L NaCl，2g/L天冬酰胺酸，pH值用1N盐酸调至7.0)中生长。在30℃和250rpm转速下培养2天后，50ml种子培养基被转接到500ml生产培养基(6.4g/L粟米果冻，5g/L葡萄糖，35g/L黄豆粉，7.5g/L玉米浆，2g/L NaNO₃，3g/L NaCl，1g/L K₂HPO₄，0.1g/L CuSO₄·5H₂O，0.5g/L ZnSO₄·7H₂O，pH值用1N盐酸调至7.0)中，在30℃和250rpm转速下发酵12天。

实施例2：

新型博莱霉素类似物BLM S(CH102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)的分离提纯和检测

将发酵液离心后所得的上清溶液进行高效液相(HPLC)检测分析，流动相A为99.9％去离子水和0.1％醋酸，流动相B为99.9％甲醇和0.1％醋酸，流速为0.8mL/min，紫外检测器波长为300nm。线性梯度分析程序为：0-30分钟，100％A/0％B至0％A/100％B。其余上清液用1N盐酸调至pH 7.0后载入Amberlite IRC50(NH₄ ⁺ type)树脂柱，经10倍柱体积去离子水冲洗后，用2升20％醋酸铵溶液进行洗提。得到的洗提液与Diaion HP-20树脂混合并在室温下温和震荡45分钟进行吸附，然后将HP-20树脂装填入柱用10倍柱体积去离子水冲洗并排干残余水，用5倍柱体积的甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液进行浓缩后得到粗提物。将粗提物再次载入Sephadex LH-20柱并用甲醇进行洗提，含有化合物1和2的组分被分别合并蒸干，最后通过半制备高效液相进行提纯。制备柱首先用100％A进行平衡，然后用线性梯度程序(0-20分钟，100％A/0％ B至36％A/64％B)进行洗脱，流量为3mL/min，紫外探测波长为300nm。化合物1在11.1分钟被洗脱，化合物2在11.4分钟被洗脱，所得的洗脱液冻干蒸发后得到纯的浅蓝色铜离子复合物1和2。将铜离子复合物用0.5M EDTA-Na(pH 7.0)溶液处理后得到不含铜离子的纯化产物，白色粉末状化合物1和化合物2。

BLM S(CH102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)的结构分析说明：两种新型博莱霉素类似物通过全面的光谱分析进行了完整的结构表征。紫外光谱分析(最大波长分别为200、248和294nm)证明了化合物1和2含有博莱霉素族化合物中特有的双噻唑发光基团。高分辨基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)分析得到化合物1的[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为1382.5274，与其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂+H]⁺，分子量为1382.5212)的数值一致。¹H与¹³C核磁共振谱(NMR)，以及二维NMR的联合分析表明化合物1中含有博莱霉素的特征结构部分，包括金属离子结合功能域(嘧啶并blamic酸(PBA)子单元以及临近的羟基化组氨酸)、(2S，3S，4R)-4-氨基-3-羟基-2-甲基戊酸(AHM)子单元、糖基团和双噻唑基团。此外，化合物1的核磁共振数据表明其结构中还含有佐伯霉素的末端胺基链3-氨基丙酰胺(APA)[δ_C 169.2(s)，33.0(t)，and 36.9(t)；δ_H 3.82(m)and 2.83(t，J＝6.8Hz)]。通过对HMBC和COSY的进一步详细分析，尤其是对HMBC中H₂-51(δ_H 3.82)与两个三级碳原子(C-53和C-49)的主要交联信号峰的分析，化合物1被推断为由BLM骨架和ZBM的末端胺基基团组成(表1和2)。

化合物2的高分辨基质辅助激光解吸电离质谱[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为1366.5198，与其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂+H]⁺，分子量为1366.5263)的数值一致。化合物2与化合物1的核磁共振数据对比表明(表1和2)两者结构十分相似，仅仅在二糖侧链的C-50位置上存在差异，化合物1在C-50位置连接了一个羟基，而在化合物2中则被甲基取代了。这说明化合物2的结构中含有与佐伯霉素相同的糖基团和末端胺基基团。

BLM S(CH102，化合物1)：[α]_D ²³+26.5(c 0.1，CH₃OH)；LC-MS(阳离子)m/z 722.3[M+Cu]²⁺；HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1382.52121(C₅₃H₈₀N₁₉O₂₁S₂[M+H]⁺，1382.52745)。¹H和¹³C NMR数据见表1和2。

6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)：[α]_D ²³+18.1(c0.10，CH₃OH)；LC-MS(阳离子)m/z714.4[M+Cu]²⁺；HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1366.51983(C₅₃H₈₀N₁₉O₂₀S₂[M+H]^+，1366.51983).¹H和¹³C NMR数据见表1和2。

BLM S(CH102，化合物1)与6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)的结构式如下：

表1.BLM S(CH102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)在D₂O中的¹H核磁共振数据(500Hz，δ：ppm，J＝Hz)

表2.BLM S(CH102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)在D₂O中的¹³C核磁共振数据(125Hz，δ：ppm)及对应的结构

实施例3：

BLM S(CH102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(CH103，化合物2)DNA裂解活性测试

在Fe²⁺存在条件下，分别对BLM S、6’-脱羟基-BLM S和博莱霉素A₂(BLM A₂)的生物活性进行测试比较。以超螺旋质粒DNA pBluescript II SK(+)的质粒松弛活性分析为依据，博莱霉素族化合物介导的单链裂解首先将超螺旋质粒DNA(form A)转化为开环质粒DNA(form B)，随后的双链裂解再将其变为线形质粒DNA(form C)。DNA裂解活性测试实验的反应总体积为10μl，其中包含25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，约0.65μg的pBluescriptSK II(+)质粒DNA，5μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O(在1mM H₂SO₄溶液中新鲜配制)和一定浓度的待测活性化合物(BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂)。该体系在35℃下反应30min后加入5mM EDTA和5μl染液(30％甘油中含有0.25％(w/v)苯酚蓝)结束反应，待测样品进行电泳实验后于紫外灯下观察DNA条带分布。

观察结果发现在所有测试中，待测活性化合物对DNA裂解活性均与其浓度相关。BLMS与BLM A₂的活性相当，两者的EC₅₀值分别为300nM和320nM。而6’-脱羟基-BLM S的活性至少是BLM A₂的10倍以上，其EC₅₀值仅为30nm(图1)。

BLM S和6’-脱羟基-BLM S的结构差异与其抗癌活性之间的关系

因为博莱霉素族抗癌抗生素的临床重要性，为了开发高效低毒的新型抗癌药物进行了大量的研究来确定其分子结构与生物活性之间的关联。一般认为博莱霉素分子骨架中的双噻唑和C-末端的胺基部分对博莱霉素化合物与DNA之间的亲和作用起了主导作用，而且有可能影响着对DNA的辨识和DNA裂解的选择性；而糖基团的功能尚未明确，很有可能参与了博莱霉素与细胞的辨识过程，尤其是细胞的摄取和金属离子的配位等。本发明涉及的BLM S是由博莱霉素的多肽分子骨架包括糖基团部分与佐伯霉素的C-末端胺基链结合而成，而6’-脱羟基-BLM S则是由博莱霉素的多肽分子骨架与佐伯霉素的C-末端胺基链和糖基团部分结合而成。根据BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂的DNA裂解活性测试比较，BLM S(EC₅₀＝320nM)与BLM A₂(EC₅₀＝300nM)的生物活性相当，因此博莱霉素与佐伯霉素的末端胺基基团互换以后并未明显影响其生物活性；对于6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂而言，6’-脱羟基-BLM S(EC₅₀＝30nM)强于10倍以上的DNA裂解活性则首次揭示了糖基团在决定博莱霉素族化合物的生物活性中扮演了重要的角色。

Claims

1.一种博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其化学结构通式如式(I)所示：

R₂选自H或-OH；

所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃；

2.根据权利要求1所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其特征是，

R₁为-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，n＝1-4；

R₂选自H或-OH。

3.根据权利要求2所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其特征是，

R₁为-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，n＝2；

R₂选自H或-OH。

4.一种用于制备权利要求1-3之一所述博来霉素族衍生物的黄绿链霉菌SB9026，其特征是，保藏号为：CCTCC M 2011292。

5.权利要求4所述黄绿链霉菌SB9026的制备方法，其特征是，从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌SB9025突变株；同时以博莱霉素原始生产菌轮枝链霉菌ATCC15003为母体构建博莱霉素生物基因簇blm的人造细菌染色体BAC质粒文库，从中筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54；最终以黄绿链霉菌SB9025突变株为异源宿主，将BAC质粒pBS54转入其中获得黄绿链霉菌SB9026。

6.权利要求1-3之一所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在DNA裂解活性方面的应用。

7.权利要求1-3之一所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗抗肿瘤药物和抗生素类药物方面的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征是，所述治疗抗肿瘤药物包括治疗鳞状上皮细胞癌、皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌或消化道肿瘤。

9.权利要求1-3之一所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗白血病药物方面的应用。

10.权利要求1-3之一所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗银屑病药物方面的应用。