CN109985229B - 化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。本发明通过对化合物ilamycin C影响三阴乳腺癌MDA‑MB‑231,BT‑549细胞的实验发现，化合物ilamycin C具有通过抑制IL‑6/STAT3通路的激活从而显著抑制三阴乳腺癌增殖、侵袭转移，促进凋亡的能力，因此，化合物ilamycin C能应用于制备三阴乳腺癌IL‑6/STAT3通路抑制剂的药物中。本发明为研究与开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

Description

化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中 的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。
背景技术：
三阴乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌。相比较其他亚型的乳腺癌，三阴乳腺癌的治疗由于缺乏有效的靶向药物，其治疗方式仍为传统化疗。但由于三阴乳腺癌易产生化疗抵抗，其较高的侵袭转移率和复发率使患者5年生存率明显低于其他亚型乳腺癌患者。已有报道证明，IL-6/STAT3的激活与三阴乳腺癌的不良预后有关，且p-STAT3已被在约80％的三阴乳腺癌细胞中发现，因此寻找高效且毒副作用低的STAT3抑制剂可能会成为三阴乳腺癌治疗的新希望。
近年来人们随着对深海资源研究的深入，发现海洋衍生的天然产物对多种癌症具有较好的抗肿瘤活性，这为抗癌新药的开发提供了源源不断的资源。本发明化合物ilamycin C(结构如下式所示)是已知化合物，是从深海链霉菌属中发酵纯化而得到，其公开于文献“Ma J，Huang H，Xie Y，et al.Biosynthesis of ilamycins featuring unusualbuilding blocks and engineered production of enhanced anti-tuberculosisagents.Nat Commun 2017,8,(1),391.”中，但目前国内外ilamycin C的抗三阴乳腺癌的活性未有报道。
Figure BDA0002023490160000021
发明内容：
本发明的目的是提供化合物ilamycin C及其同系物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。
本发明通过对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231,BT-549，非三阴乳腺癌细胞MCF7和正常乳腺细胞MCF10A细胞毒活性测试发现，化合物ilamycin C对上述4株肿瘤细胞的IC50值分别为7.26、6.91、15.93、35.53μmol/L。实验结果表明：化合物ilamycin C具有显著的三阴乳腺癌细胞毒活性，但对非三阴乳腺癌和正常乳腺细胞的毒性明显低于三阴乳腺癌，因此，化合物ilamycin C及其同系物能应用于制备抗三阴乳腺癌药物中。特别是对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和/或BT-549的细胞毒活性。
因此，本发明提供了如式1所示的任一化合物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用；
Figure BDA0002023490160000031
其中ilamycin C为
Figure BDA0002023490160000032
ilamycin C同系物为
Figure BDA0002023490160000033
所述的治疗三阴乳腺癌药物是对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和/或BT-549具有毒活性的药物。
本发明的第二个目的是提供一种治疗三阴乳腺癌药物，其特征在于，含有有效量的化合物ilamycin C或其同系物作为活性成分。
本发明的第三个目的是提供化合物ilamycin C或其同系物在制备IL-6/STAT3通路抑制剂的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种IL-6/STAT3通路抑制剂的药物，其特征在于，含有有效量的化合物ilamycin C或其同系物作为活性成分。
本发明通过对化合物ilamycin C影响三阴乳腺癌MDA-MB-231,BT-549细胞的实验发现，化合物ilamycin C具有通过抑制IL-6/STAT3通路的激活从而显著抑制三阴乳腺癌增殖、侵袭转移，促进凋亡的能力，因此，化合物ilamycin C能应用于制备三阴乳腺癌IL-6/STAT3通路抑制剂的药物中。本发明为研究与开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
附图说明：
图1是化合物ilamycin C对乳腺癌和正常乳腺细胞活性的影响(A)和IC 50值(B)的比较；
图2是化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞增殖的影响；
图3是化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞凋亡的影响(A)以及凋亡蛋白的变化(B)；
图4是化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞侵袭转移的影响(A、B)以及蛋白的变化(C)；
图5是化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞本底p-STAT3表达的影响(A)以及对IL-6/STAT3通路的影响(B)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
采用CCK8法测定化合物ilamycin C的细胞毒活性。本实验所用的肿瘤细胞为三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，BT-549，非三阴乳腺癌细胞MCF7和正常乳腺细胞MCF10A。将本发明将化合物ilamycin C用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为10mmol/L的母液，再用细胞株对应的培养基稀释至所需浓度。取对数生长期的MDA-MB-231，BT-549，MCF7，MCF10A细胞，以3000个/孔，将细胞接种于96孔板中，每个浓度梯度做5个副空，另设3个空白孔调零，于37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs。待细胞贴壁后，每孔按所需浓度梯度加入提前配好的ilamycin C溶液，阴性对照加入等体积的培养基，每孔液体总体积100μl。置37℃、5％CO2培养箱中培养48hrs后，每孔加入10μL CCK8，置于培养箱3hrs后，用酶标仪测定450nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物作用后的细胞活性，细胞生长的抑制率，采用GraphPad Prism 5.0软件计算对肿瘤细胞半数致死浓度(IC50值)。
细胞活性(％)＝A样品组/A阴性对照组×100％
细胞生长抑制率(％)＝1-细胞活性(％)
实验结果如图1所示，化合物ilamycin C处理细胞48hrs后，发现其明显抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231，BT-549细胞的活性，而对非三阴乳腺癌MCF7细胞活性的抑制较三阴乳腺癌下降，对正常乳腺MCF10A细胞活性的影响较弱。说明化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞活性具有特异的抑制作用。
实施例2：
利用Edu试剂盒检测化合物ilamycin C对三阴乳腺细胞增殖的影响。取对数生长期的MDA-MB-231，BT-549细胞，以8×104个/孔，接种于24孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs，每孔按所需浓度梯度加入提前配好的ilamycin C溶液，阴性对照孔加入等体积的培养基，每孔液体总体积500μL。置37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs后，按Edu试剂盒说明书进行避光染色，倒置荧光显微镜拍照，红色荧光细胞(Edu阳性)代表增殖细胞。蓝色荧光(DAPI阳性)代表活细胞，利用如下公式，以细胞红蓝荧光比值计算增殖细胞比率(％)。
增殖细胞比率(％)＝红色荧光细胞总数/蓝色荧光细胞总数×100％
实验结果如图2所示，从图2可以看出，化合物ilamycin C处理三阴乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞24h后，增殖细胞比率(％)于6μM浓度处明显下降。说明化合物ilamycin C可以有效抑制三阴乳腺癌细胞的增殖。
实施例3：
采用Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒染色，再用流式细胞仪分析化合物ilamycin C是否对三阴乳腺癌细胞有促凋亡作用。取对数生长期的MDA-MB-231，BT-549细胞，以2×105个/孔，接种于6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs，每孔按所需浓度梯度加入提前配好的ilamycin C溶液，阴性对照孔加入等体积的培养基，每孔液体总体积2mL。置37℃、5％CO2培养箱中分别培养12hrs、24hrs后，收集细胞并加入Annexin V-FITC和PI各5μL，室温染色15min，流式细胞仪检测细胞凋亡率，以右上和右下象限相加得到凋亡率(％)。
取对数生长期的MDA-MB-231,BT-549细胞，以2×105个/孔，接种于6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs，每孔按所需浓度梯度加入提前配好的ilamycin C溶液，阴性对照孔加入等体积的培养基，每孔液体总体积2mL。置37℃、5％CO2培养箱中分别培养24hrs后，收集细胞，利用RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，PMSF)提取24h后的MDA-MB-231和BT-549细胞总蛋白，利用Westernblot技术检测凋亡关键蛋白(Bcl-2,Bax,Bcl-xL,PARP1,caspase-3)表达量的变化情况。
实验结果如图3，从流式细胞术结果可以看出，6μM的化合物ilamycin C可以在处理三阴乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞12hrs后引起明显凋亡，3μM的化合物ilamycin C可以在处理三阴乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞24hrs后引起明显凋亡。Westernblot结果发现化合物ilamycin C通过Bax/Bcl-2相关的caspase-3依赖的凋亡通路诱导凋亡。说明化合物ilamycin C可以有效促进三阴乳腺癌细胞的凋亡。
实施例4
利用transwell实验分析化合物ilamycin C是否抑制三阴乳腺癌细胞侵袭转移。
取对数生长期的MDA-MB-231,BT-549细胞，将MDA-MB-231,BT-549细胞以无血清培养基重悬，分别以1×105个/孔或2×105个/孔加入未铺基质胶或铺10％基质胶的transwell小室上室中，下室加入750μL含10％血清的培养基，置37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs后，甲醇固定细胞，以1％结晶紫溶液染色，再用棉签擦去上室细胞，倒置显微镜拍照计数。利用RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，PMSF)提取MDA-MB-231和BT-549细胞总蛋白，利用Western blot技术检测侵袭转移关键蛋白(MMP2,MMP9,vimtein)的变化情况。
实验结果如图4所示，结合transwell实验和Westernblot结果，化合物ilamycin C处理细胞24h后可以明显抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549的侵袭转移并抑制侵袭转移关键蛋白MMP2，MMP9，vimtein的表达。说明化合物ilamycin C可以有效抑制三阴乳腺癌细胞的侵袭转移。
实施例5
利用RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，PMSF)提取MDA-MB-231和BT-549细胞总蛋白，利用Western blot技术检测不同浓度的ilamycin C对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549本底高表达的p-STAT3表达量的影响。为了研究是否ilamycin C可以抑制IL-6激活p-STAT3。取对数生长期的MDA-MB-231，BT-549细胞，以2×105个/孔，接种于6孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs，每孔按所需浓度梯度加入提前配好的ilamycin C溶液，阴性对照孔加入等体积的培养基，每孔液体总体积2mL。置37℃、5％CO2培养箱中培养24hrs后，再以50ng/mL IL-6处理细胞30min，利用RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，PMSF)提取24h后的MDA-MB-231和BT-549细胞总蛋白，利用Western blot技术检测不同浓度的ilamycin C是否抑制三阴乳腺癌细胞IL-6激活p-STAT3。
实验结果如图5所示，从图5可以看出，化合物ilamycin C可以抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞中IL-6激活p-STAT3。说明化合物ilamycin C可作为三阴乳腺癌细胞的IL-6/STAT3抑制剂应用。
综上所述，化合物ilamycin C对三阴乳腺癌细胞有较强的细胞毒性，但对非三阴乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的毒性下降。进一步研究发现，化合物ilamycin C通过抑制IL-6/STAT3通路的激活，从影响下游功能蛋白，从而发挥抑制三阴乳腺癌细胞增殖、侵袭转移，并促进其凋亡的作用，因此，其可应用于制备抗三阴乳腺癌药物。本发明为实现和开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物，为开发利用深海链霉菌属来源的天然活性物质提供了科学依据。

Claims (2)

1.如式1所示的任一化合物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗三阴乳腺癌药物是对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和/或BT-549具有毒活性的药物。
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