CN109731004B

CN109731004B - 西维斯多在治疗结直肠癌方面的应用

Info

Publication number: CN109731004B
Application number: CN201811571471.2A
Authority: CN
Inventors: 徐瑞华; 陈展洪; 齐晶晶; 吴其年; 陆佳欢; 胡佩珊
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CN109731004A

Abstract

本发明公开了西维斯多在治疗结直肠癌方面的应用，以及西维斯多联合奥沙利铂在治疗结直肠癌方面的应用。本发明研究发现西维斯多能够抑制结直肠癌细胞的增殖及转移，抑制结直肠癌细胞的成球能力、下降细胞的干性，抑制结直肠癌细胞的侵袭、迁移能力，促进结直肠癌细胞凋亡，抑制结直肠癌细胞在体内的成瘤能力。同时研究还发现，西维斯多和奥沙利铂联合使用能够发挥协同增效的作用，能够更加显著地促进结直肠癌细胞凋亡、抑制结直肠癌细胞在体内的增殖能力和成瘤能力，对结直肠癌具有更加显著的治疗效果。本发明不仅为西维斯多的应用提供了新的适应症，还为结直肠癌转移的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径，具有很好的推广应用前景。

Description

西维斯多在治疗结直肠癌方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及西维斯多在治疗结直肠癌方面的应用。

背景技术

结直肠癌是世界范围内常见的胃肠道肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中居首位，是全球范围内致人死亡的主要病因之一，并且临床治疗存在很大的困难。

结肠癌的发生率及死亡率较高，该领域的医生也同样为化疗中肿瘤耐药问题所困扰。据美国癌症协会估计，死于不同程度的耐药的肿瘤患者占90%以上，肿瘤的耐药问题已经成为肿瘤化疗成功与否的关键因素。指南推荐的一线化疗药物奥沙利铂，是最常用的化疗药物之一。然而其化学治疗效果仍然有待提高，很大部分原因也要归咎于因耐药而导致的复发和转移。

西维斯多（Silvestrol）是一种真核生物翻译起始因子4A（EIF4A）的抑制剂，具有抑制MYC的作用，西维斯多最初被研究做为治疗白血病的药物，目前正在进行白血病的I期临床试验。目前未见有西维斯多应用于结直肠癌防治方面的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有结直肠癌治疗药物的缺陷和不足以及西维斯多的应用局限，提供一种新的治疗结直肠癌的药物，即西维斯多，以及西维斯多和奥沙利铂联用的用药方案。

本发明的目的是提供西维斯多在治疗结直肠癌方面的应用。

本发明另一目的是提供西维斯多和奥沙利铂联用在治疗结直肠癌方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究显示，西维斯多能够显著抑制结直肠癌细胞生长、增殖及转移，抑制结直肠癌细胞的成球能力、下降细胞的干性，抑制结直肠癌细胞的侵袭、迁移能力，促进结直肠癌细胞凋亡，抑制结直肠癌细胞在体内的成瘤能力，对结直肠癌具有显著的治疗效果，尤其是在患者来源的移植瘤模型中西维斯多抑制结直肠癌增殖的效果显著。同时研究发现，西维斯多和奥沙利铂联合使用能发挥协同增效的作用，对结直肠癌的治疗效率得到显著提升。因此以下应用均应在本发明的保护范围之内：

西维斯多在制备肠癌防治药物方面的应用。

西维斯多在制备抑制肠癌增殖及转移的药物方面的应用。

西维斯多和奥沙利铂联用在制备肠癌防治药物方面的应用。

西维斯多和奥沙利铂联用在制备抑制肠癌增殖及转移的药物方面的应用。

具体优选地，所述肠癌为结直肠癌。

更优选地，所述结直肠癌为IV期结直肠癌。

更优选地，所述结直肠癌是指人结肠癌细胞DLD1或人结肠腺癌细胞HCT116。

另外，具体优选地，上述药物是指能够抑制结直肠癌细胞增殖、存活和/或生长的药物。

优选地，上述药物是指能够促进结直肠癌细胞凋亡的药物。

优选地，上述药物是指能够抑制结直肠癌细胞侵袭、迁移和/或转移的药物。

优选地，上述药物是指能够抑制结直肠癌细胞在体内的成球能力和/或成瘤能力的药物。

基于上述研究，本发明提供一种治疗结直肠癌的药物，以及一种抑制结直肠癌增殖及转移的药物，该药物包含有西维斯多。优选地药物还包括奥沙利铂。

进一步的，所述药物还可以包括其药学上可接受的载体等。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了西维斯多的一种新应用，即应用于治疗结直肠癌，尤其是抑制结直肠癌增殖及转移，西维斯多能够显著抑制结直肠癌细胞克隆形成，促进结直肠癌细胞凋亡，抑制结直肠癌细胞在体内的增殖能力和成瘤能力，可应用于结直肠癌增殖及转移的治疗方面。

同时，本发明研究还发现，西维斯多和奥沙利铂联合使用能够发挥协同增效的作用，能够更加显著地促进结直肠癌细胞凋亡，抑制结直肠癌细胞在体内的增殖能力和成瘤能力，对结直肠癌具有更加显著的治疗效果，尤其是在患者来源的移植瘤模型中西维斯多联合奥沙利铂抑制结直肠癌增殖的效果显著。

本发明不仅为西维斯多的应用提供了新的适应症，还为结直肠癌转移的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径。

附图说明

图1为西维斯多对结直肠癌细胞克隆形成的影响。

图2为西维斯多对结直肠癌细胞成球能力的影响。

图3为西维斯多对结直肠癌细胞侵袭、迁移能力的影响。

图4为西维斯多对结直肠癌细胞凋亡的影响。

图5为西维斯多对结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 西维斯多对结直肠癌细胞克隆形成的影响

1、实验材料

（1）药物：西维斯多。

（2）结直肠癌细胞：人结肠癌细胞DLD1和人结肠腺癌细胞HCT116。

2、实验分组

（1）对照组：空白对照，即癌细胞不经过任何药物处理。

（2）实验组：使用西维斯多处理癌细胞。

3、克隆形成实验检测西维斯多对结直肠癌细胞克隆形成的影响

（1）在六孔板中再加入结直肠癌细胞DLD1/HCT116，加入DMSO（即对照）及100nM/20nmol、200nM/40nmol的西维斯多处理细胞2周，然后通过结晶紫法染色观察细胞克隆形成情况。

具体方法如下：

1）将DLD1和HCT116细胞用胰消化后计数，与2×1640培养基混合，加入6孔板中，密度为3×10⁵/ml，每孔2mL。

2）分别在每个孔加入不同浓度的对照或西维斯多，DLD1分别为DMSO，西维斯多100nmol，200nmol。HCT116分别为DMSO，西维斯多20nmol，40nmol，每3天更换一次培养基。

3）2周后，显微镜下观察克隆形成情况，使用结晶紫染色。随后拍照统计克隆个数。

（2）实验结果

结果如图1所示，使用西维斯多处理后，结直肠癌细胞的克隆明显减少，表明西维斯多能够抑制结直肠癌细胞生长。

实施例2 西维斯多对结直肠癌细胞成球能力的影响

1、实验材料

（1）药物：西维斯多。

2、实验分组

（1）对照组：空白对照，即癌细胞不经过任何药物处理。

（2）实验组：使用西维斯多处理癌细胞。

（1）在96孔板中加入1×10³结直肠癌细胞DLD1/HCT116，使用干细胞培养培养，加入DMSO（即对照）及200nM/40nmol的西维斯多处理细胞1周，观察成球情况。

干性培养基由以下组分组成：无血清的DMEM/F12（含有20 ng/mL 成纤维细胞生长因子）1×青霉素-链霉素溶液，20 ng/mL表皮生长因子，10μg/mL肝素和1% B-27。

具体方法如下：

1）将DLD1和HCT116细胞用胰消化后计数，用干性培养基，加入96孔板中，密度为1×10³/ml。

2）分别在每个孔加入不同浓度的对照或西维斯多，DLD1分别为DMSO，西维斯多200nmol。HCT116分别为DMSO，西维斯多40nmol，每3天更换一次培养基，每组设3个复孔。

3）2周后，显微镜下观察克隆形成情况，随后拍照统计克隆个数。

（2）实验结果

结果如图2所示，使用西维斯多处理后，结直肠癌细胞的成球能力明显减少，表明西维斯多能够抑制结直肠癌细胞的成球能力，下降细胞的干性。

实施例3 西维斯多对结直肠癌细胞侵袭、迁移能力的影响

1、实验材料

（1）药物：西维斯多。

2、实验分组

（1）对照组：空白对照，即癌细胞不经过任何药物处理。

（2）实验组：使用西维斯多处理癌细胞。

（1）在6孔板中加入3×10⁵结直肠癌细胞DLD1/HCT116，加入完全培养基培养24小时，加入DMSO（即对照）及100nmol、200nM/20nmol、40nmol的西维斯多，处理细胞24小时。后胰酶消化细胞，每个transwell小室加入3×10⁵结直肠癌细胞。

具体方法如下：

1）将DLD1和HCT116细胞用胰消化后计数，用完全培养基，加入6孔板中，密度为3×10⁵/ml，培养24小时。

2）分别在每个孔加入不同浓度的对照或西维斯多，DLD1分别为DMSO，西维斯多100nmol、200nmol。HCT116分别为DMSO，西维斯多20nmol、40nmol，24小时使用胰酶消化细胞。使用无血清培养基重悬细胞，每个transwell小室加入3×10⁵结直肠癌细胞，分别使用不含基质胶的transwell小室做迁移实验，用含基质胶的transwell小室做侵袭实验。24孔板里面加入完全血清，放入小室。

3）48小时后，使用PBS洗涤小室，使用甲醇固定及使用结晶紫染色，随后拍照统计迁移与侵袭的细胞个数。

（2）实验结果

结果如图3所示，使用西维斯多处理后，结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力明显下降。

实施例4 西维斯多和奥沙利铂对结直肠癌细胞凋亡的影响

1、实验材料

（1）药物：西维斯多、奥沙利铂。

（2）癌细胞：同实施例1。

（3）市购的细胞凋亡试剂盒。

2、通过流式细胞术检测西维斯多处理后DLD1和HCT116细胞的凋亡情况

（1）在6孔板中铺好3×10⁵结直肠癌细胞DLD1，细胞贴壁后后加入含有DMSO（即对照组）、西维斯多100nmol、奥沙利铂25μM、奥沙利铂50μM 、西维斯多100nmol+奥沙利铂25μM的培养基处理细胞，然后在24h后通过细胞凋亡试剂盒检测凋亡的情况。

在6孔板中铺好3×10⁵结直肠癌细胞HCT116，细胞贴壁后后加入含有DMSO（即对照组）、西维斯多20nmol、奥沙利铂25μM、奥沙利铂50μM 、西维斯多20nmol+奥沙利铂25μM的培养基处理细胞，然后在24h后通过细胞凋亡试剂盒检测凋亡的情况。

具体方法如下：

1）将对数生长期的DLD1和HCT116细胞用胰酶消化后，取3×10⁵细胞铺到6孔板中。

2）DLD1:细胞:加入含有DMSO（即对照组）、西维斯多100nmol、奥沙利铂25μM、奥沙利铂50μM 、西维斯多100nmol+奥沙利铂25μM的培养基处理细胞。

HCT116：加入含有DMSO（即对照组）、西维斯多20nmol、奥沙利铂25μM、奥沙利铂50μM 、西维斯多20nmol+奥沙利铂25μM的培养基处理细胞。

3）24h后收集细胞，胰酶消化后根据凋亡检测试剂盒的方法处理细胞，Annexin V和PI染色完成之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

（2）实验结果

结果如图4所示，图4中显示的百分比为Annexin V阳性（即发生凋亡的细胞）比例。使用低剂量西维斯多、低剂量奥沙利铂单独处理肠癌细胞时，凋亡略有增加，高剂量奥沙利铂组凋亡明显增加，将低剂量西维斯多联合低剂量奥沙利铂处理结直肠癌细胞后凋亡明显增加，超过高剂量奥沙利铂组诱导的凋亡率。表明西维斯多联合奥沙利铂可以显著促进结直肠癌细胞凋亡。

实施例5 西维斯多对结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤的影响

1、实验材料

（1）药物：西维斯多、奥沙利铂。

（2）结直肠细胞：同实施例1。

2、通过CDX和PDX裸鼠模型检测西维斯多和奥沙利铂处理后，对CDX和PDX模型转移的影响

具体方法如下：

CDX模型

1）将对数生长期的DLD1和HCT 116细胞用胰酶消化后，取2×10⁶细胞用100微升PBS重悬。

2）将2×10⁶的DLD1和HCT116细胞注射至裸鼠的皮下，待皮下成瘤刚可扪及的时候开始给药，分为对照组、西维斯多、奥沙利铂、西维斯多+奥沙利铂4个组。

3）每3天给药一次，将奥沙利铂和西维斯多注射至裸鼠腹腔，同时测量裸鼠体重计皮下瘤大小。

4）3-4周后，对裸鼠实施安乐死，取出皮下瘤子，称重，多聚甲醛溶液固定，切片后HE染色。

PDX模型

1）将接受手术的结直肠癌的患者的新鲜标本浸泡在完全培养基中。将标本切成相同大小的组织块，将组织块置入BNDG小鼠的皮下，这些小鼠命名为P1。观察组织块生长速度，当肿瘤体积达到600mm³，将组织块取出，将标本切成相同大小的组织块，将组织块置入BNDG小鼠的皮下。待皮下成瘤刚可扪及的时候开始给药，分为对照组、西维斯多、奥沙利铂、西维斯多+奥沙利铂4个组。

2）每3天给药一次，将奥沙利铂和西维斯多注射至裸鼠腹腔，同时测量小鼠体重计皮下瘤大小。

3）3-4周后，对裸鼠实施安乐死，取出皮下瘤子，称重，多聚甲醛溶液固定，切片后HE染色。

（2）实验结果

结果图5所示，结直肠癌细胞CDX及PDX模型中，经过西维斯多处理后，皮下成瘤明显缩小，在奥沙利铂联合西维斯多组最为明显。表明西维斯多可以显著地抑制结直肠癌细胞在体内的成瘤能力，而且跟奥沙利铂有协同治疗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.西维斯多和奥沙利铂联用在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为西维斯多和奥沙利铂联用促进结直肠癌细胞调亡、抑制结直肠癌细胞在体内的成瘤能力。