CN109061188B - Erbb4在胃癌治疗方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ERBB4在胃癌治疗方面的应用。具体地涉及ERBB4在作为指导胃癌患者个性化用药的标志物以及作为治疗靶点方面的应用，以及小分子抑制剂在制备针对ERBB4过表达和/或ERBB4突变胃癌的治疗药物方面的应用。本发明研究表明，ERBB4过表达的胃癌细胞对小分子抑制剂的敏感性增加，使小分子抑制剂对ERBB4过表达的胃癌细胞产生明显抑制作用，从而达到显著抑制肿瘤生长的治疗效果；同时，ERBB4过表达及突变的胃癌细胞敏感性增加更为显著，起到明显抑制肿瘤生长的作用。因此可指导胃癌患者的个性化精准用药，利用小分子抑制剂针对性的治疗ERBB4突变及过表达的胃癌，为胃癌治疗提供了进一步的准确性。

Description

ERBB4在胃癌治疗方面的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及ERBB4在胃癌治疗方面的应用，具体是在指导胃癌患者个性化用药以及作为治疗靶点方面的应用。
背景技术
胃癌是世界范围内常见的胃肠道肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中居首位，是全球范围内致人死亡的主要病因之一，并且临床治疗存在很大的困难。
受体酪氨酸激酶(RTK)的家族主要包含：表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、HER3、HER4。拉帕替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，靶点为HER2和EGFR，已经被FDA批准与卡培他滨联用治疗曲妥珠单抗难治的HER2阳性转移性乳腺癌。由于拉帕替尼在HER2阳性的NCI-N87胃癌模型中显示出单药活性，并且在一项II期试验中治疗不可切除的HER2阳性胃食管癌(CEG)患者表现出9％的缓解率，因此研究人员开展了两项III期试验研究拉帕替尼治疗HER2阳性CEG患者的疗效。然而Satoh团队近期报告了紫杉醇+拉帕替尼二线治疗HER2扩增亚洲AGC患者的III期试验TyTAN研究的阴性结果。另一项在Hecht团队近期报告的III期试验LOGiC研究中，主要考察奥沙利铂±拉帕替尼一线治疗HER2阳性CEG的疗效。尽管该研究设计良好且拥有合适的终点、入组标准、化疗骨架及毒性管理方案，然而该试验的结果仍应被认为阴性。
HER2并不与任何已知配体结合，但是可与其他HER家族成员结合成异源二聚体，进而与配体结合激活下游多个肿瘤基因通路的活性。基于小分子抑制剂在HER2阳性的胃癌中治疗失败，为我们证实了从其他受体酪氨酸激酶家族成员进行胃癌研究的必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有胃癌个性化治疗技术的缺陷和不足，提供ERBB4在指导胃癌患者个性化用药方面的应用以及作为治疗靶点的应用。不仅提供了小分子抑制剂的一种新应用，拓展了其的临床应用领域，而且凸显了ERBB4过表达及突变在胃癌治疗中的地位，为胃癌的治疗提供进一步的参考。
本发明的目的是提供ERBB4在作为指导胃癌患者个性化用药的标志物方面的应用。
本发明另一目的是提供小分子抑制剂在制备针对ERBB4过表达和/或ERBB4突变胃癌的治疗药物方面的应用。
本发明的再一目的是提供ERBB4在作为胃癌治疗靶点方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究明确了ERBB4突变及过表达在胃癌治疗中的作用，小分子抑制剂能极大程度提高ERBB4突变或过表达胃癌细胞的药物敏感性，能够显著抑制具有突变或过表达表达ERBB4胃癌细胞的生长和增殖，使小分子抑制剂达到更明显的抑制胃癌生长的作用，对胃癌具有显著的疗效。因此以下应用均应在本发明的保护范围之内：
ERBB4在作为指导胃癌患者个性化用药的标志物方面的应用。具体是指胃癌细胞中ERBB4表达水平指标在作为指导胃癌患者个性化用药的标志物方面的应用。
小分子抑制剂在制备针对治疗ERBB4过表达胃癌的药物方面的应用。
小分子抑制剂在制备针对治疗ERBB4过表达和/或ERBB4突变胃癌的药物方面的应用。
ERBB4在作为胃癌治疗靶点方面的应用。
过表达ERBB4所需试剂在制备胃癌治疗药物方面的应用。
突变ERBB4所需试剂在制备胃癌治疗药物方面的应用。
一种治疗胃癌的药物，包括小分子抑制剂和过表达ERBB4所需试剂。
优选地，所述药物还包括突变ERBB4所需试剂。
另外，上述小分子抑制剂为小分子酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼(Lapatinib)或马来酸吡咯替尼(Pyrotinib)等。
优选地，所述ERBB4突变为L39F、R50C、R106H、R393W、S774G、L798R、V840I、F1120C或K1223M。优选为突变R393W或L798R。
该突变的表达方式含义为：ERBB4上特定位点的突变，如L798R代表ERBB4上第798个氨基酸由亮氨酸L突变成精氨酸R。
优选地，所述胃癌是Ι到Ⅳ期胃癌。
更具体地，研究所用胃癌细胞是指人胃癌细胞MKN74、MKN45或AGS。
进一步地，所述药物还可以包括其药学上可接受的载体等。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究表明，过表达ERBB4的胃癌细胞对小分子抑制剂(如lapatinib、pyrotinib等)的敏感性增加，使小分子抑制剂对ERBB4过表达的胃癌细胞产生明显抑制作用，从而达到显著抑制肿瘤生长的治疗效果；同时，ERBB4过表达及突变的胃癌细胞敏感性增加更为显著，起到明显抑制肿瘤生长的作用。因此可指导胃癌患者的个性化精准用药，利用小分子抑制剂针对性的治疗ERBB4突变及过表达的胃癌。
本发明不仅为小分子抑制剂的使用提供了一种新的借鉴和治疗途径，还明确了ERBB4突变及过表达在胃癌治疗中的作用，可以ERBB4为靶点进行过表达和/或突变后再利用小分子抑制剂进行治疗，为胃癌治疗提供了进一步的准确性。
附图说明
图1为ERBB4过表达及突变促进胃癌细胞生长。
图2为ERBB4过表达及突变在体外使胃癌细胞对小分子抑制剂敏感性增加。
图3为ERBB4过表达及突变在体内影响肿瘤生长速度及对小分子抑制剂敏感性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 ERBB4突变对胃癌细胞生长的影响
1、实验材料
(1)癌细胞：人胃癌细胞AGS、MKN74、MKN45。
2、实验分组
(1)对照组：荧光空白对照(RFP)，即不影响癌细胞本身ERBB4表达。
(2)野生型实验组：WT，即过表达ERBB4的表达，未突变。
(3)突变型实验组：R50C，R393W，S774G，L798R，及ERBB4过表达及突变。
3、ERBB4突变对细胞生长及成瘤的影响
(1)在六孔板中铺胃癌细胞，待其贴壁后，转ERBB4-RFP，WT，R50C，R393W，S774G，L798R腺病毒，以72h荧光观察其转染效率，观察其对胃癌细胞的生长作用。
细胞生长曲线测定具体方法如下：
1)取对数生长期的AGS细胞，用胰酶将其消化并计数，取每孔1×103个细胞均匀铺到96孔板中。每组3个重复。
2)铺7块96孔板，每一天同一时间点用MTS测定。
克隆实验具体方法如下：
1)取对数生长期的AGS细胞，用胰酶将其消化并计数，取每孔500个细胞均匀铺到六孔板中。
2)孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，吸去培养基，用PBS小心清洗。
3)甲醇固定1小时后用结晶紫染色1小时，用PBS清洗，在空气中风干。
4)倒置显微镜中拍照。
(2)实验结果
结果如图1、2所示，ERBB4过表达及突变的胃癌细胞克隆形成数目明显增加，表明ERBB4的过表达可增加胃癌细胞的成瘤率。其ERBB4的突变极大程度增加了胃癌细胞的成瘤率。
实施例2 ERBB4过表达与突变胃癌细胞对小分子抑制剂(lapatinib、pyrotinib)敏感性的影响
1、实验材料
(1)药物：
1)Lapatinib(拉帕替尼)：购于Selleck，目录号S2111。
Lapatinib的化学结构式如下所示：
Figure BDA0001768084410000041
2)Pyrotinib(马来酸吡咯替尼)：由江苏省恒瑞公司提供。
Pyrotinib的化学结构式如下所示：
Figure BDA0001768084410000051
(2)癌细胞：同实施例1。
(3)市购的MTS试剂盒。
2、通过MTT方法检测lapatinib、pyrotinib处理后AGS细胞活性
(1)在96孔板中铺好胃癌AGS细胞，待其贴壁后，加入含有0μM、8μM、10μM、12μM、15μM、20μM、25μM laptinib的培养基处理细胞，pyrotinib的浓度分布为0μM、0.3625μM、0.7250μM、1.5μM、2.5μM、3.5μM，然后在72h通过MTT方法检测AGS细胞活性。
具体方法如下：
1)将对数生长期的AGS(RFP、WT、L39F、R50C、R106H、R393W、S774G、L798R、V840I、F1120C、K1223M)细胞用胰酶消化后，取3×103细胞均匀铺到96孔板中。
2)待细胞贴壁后，分别更换含有不同浓度lapatinib和pyrotinib的培养基。
3)加入药物72h后，按1:10比例加入MTS试剂，37℃孵育2h后，用酶标仪检测490nm吸光值。
(2)实验结果
结果如图2所示，ERBB4过表达的胃癌细胞对小分子抑制剂(lapatinib、pyrotinib)的敏感性增加，表现为IC50下降，同时，ERBB4过表达及突变的胃癌细胞敏感性增加更为显著，IC50明显下调。以R393W和L798R两个突变最为显著。
实施例3小分子抑制剂(lapatinib、pyrotinib)在体内明显增加ERBB4过表达及突变的肿瘤抑制率
1、实验材料
(1)药物：根据Selleck药物推荐，lapatinib与pyrotinib均用2％DMSO+30％PEG300+5％Tween 80+ddH2O配制。
(2)胃癌细胞：人胃癌细胞MKN74、MKN45。
2、通过裸鼠体内实验，观察小分子抑制剂(lapatinib、pyrotinib)对于ERBB4过表达及突变的肿瘤抑制效应
(1)在体外用MKN74、MKN45构建ERBB4对照、过表达(WT)、突变(R393W、L798R)的细胞，待到一定数量之后，接种于小鼠皮下，待肿瘤长至月100mm3开始分组给lapatinib与pyrotinib。
具体方法如下：
1)将对数生长期的MKN74与MKN45均匀铺至75ml细胞培养瓶，分别转染ERBB4-RFP、ERBB4-WT、ERBB4-R393W、ERBB4-L798R腺病毒。
2)待每组细胞长至足够量，均需大于3.2×107个细胞。消化，计数。
3)每组分别取3.2×107个细胞，离心收集，配置成细胞悬液(基质胶：PBS＝1:1)2ml。每个接种100ul，即1×106个细胞。
4)将细胞分别注射于小鼠皮下，分组如下表。
Figure BDA0001768084410000061
Figure BDA0001768084410000071
5)待小鼠皮下细胞成瘤之后，约100m3，开始按步骤4分组灌胃给药，lapatinib灌胃剂量为100mg/kg，pyrotinib灌胃剂量为20mg/kg。
6)隔天灌胃给药一次，并记录肿瘤大小及小鼠体重。
7)待最大小鼠肿瘤超过接近1500mm3，终止实验，取出皮下肿瘤，称重拍照。
(2)实验结果
结果如图3所示，胃癌细胞(MKN74、、MKN45)过表达ERBB4(WT)后，增加了肿瘤大小，ERBB4的过表达及突变(R393W、L798R)明显增加肿瘤大小。
同时，ERBB4突变及过表达增加了对小分子抑制剂(lapatinib、pyrotinib)的敏感性，表现为ERBB4突变及过表达(R393W、L798R)的给药组相比未加药组肿瘤体积减小大约30～40％，ERBB4过表达组肿瘤体积减小大约20％。
综上结果表明，ERBB4的过表达及突变在体内能促进胃癌细胞的生长，ERBB4突变更表现为生长速度的增加。同时，过表达及突变增加体内小分子抑制剂的敏感性，同时ERBB4突变对小分子抑制剂更为敏感，起到明显抑制肿瘤生长的作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.检测ERBB4突变的试剂在制备用于指导胃癌患者个性化用药的产品方面的应用，其特征在于，所述个性化用药是指选择小分子抑制剂作为治疗药物；所述ERBB4突变为R393W或S774G，所述小分子抑制剂为拉帕替尼(Lapatinib)或马来酸吡咯替尼(Pyrotinib)。
2.小分子抑制剂在制备针对治疗ERBB4突变胃癌的药物方面的应用；所述ERBB4突变为R393W或S774G，所述小分子抑制剂为拉帕替尼(Lapatinib)或马来酸吡咯替尼(Pyrotinib)。
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ERBB4 promotes the proliferation of gastric cancer cells via the PI3K/Akt signaling pathway;Ji Xu et al;《ONCOLOGY REPORTS》;20180330;第39卷;第2892-2895页 *
Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: clinical implications;Rosalin Mishra et al;《Oncotarget》;20171130;第8卷(第69期);第114371-114392页 *

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