CN109576297A - 一种含wsb1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。具体地，克隆WSB1基因启动子特异性序列，重组到含萤火虫荧光素酶报告基因载体序列中，构建含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒，再将构建的重组质粒与海肾荧光素酶报告基因质粒pRL‑TK共转染肿瘤细胞，使其稳定表达，最后通过检测双荧光素酶的活性来反映WSB1基因启动子启动转录的活性，从而应用于靶向筛选抗肿瘤药物。本发明构建的重组质粒采用的是WSB1基因启动子，并选取了特定的启动子序列，所构建的药物筛选模型具有高特异性、高灵敏度和高准确度，实现了以WSB1为靶点的抗肿瘤药物的高通量筛选。

Description

一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法 和应用

技术领域

本发明属于基因重组和分子克隆技术领域，涉及一种肿瘤血管新生、侵袭转移相关基因靶点的重组质粒，具体涉及一种含WSB1基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

WD重复和SOCS盒结合蛋白1(WD repeat and SOCS box-containing protein 1，WSB1)是ECs泛素连接酶复合物的底物，包含7个WD蛋白复合体和一个SOCS盒，在骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、肝癌和唾腺肿瘤等许多肿瘤细胞中过表达。WD-重复蛋白(WD repeatProtein)是具有高度保守WD基元和功能各异的蛋白质，参与多种肿瘤细胞的调控过程，如细胞信号转导、RNA剪接、转录和囊泡运输等(Cell Mol Life Sci，2001,58(14):2085-2097)。SOCS盒是调节机体诸多细胞因子信号的重要调控分子，是蛋白泛素化和蛋白酶体降解过程的重要调节因子(Growth Factors，2012,30(4):207-219)，参与生物发育、免疫、肿瘤发生、代谢等许多生理调节过程。因此，WSB1是肿瘤细胞内重要的信号调节分子，参与细胞内蛋白泛素化和蛋白酶体降解过程，在肿瘤发生发展过程中发挥重要的作用，从发育生物学、细胞免疫、糖酵解、缺氧调节到泛素化功能，WSB1对肿瘤细胞增殖，侵袭，转移方面起到促进效应。

WSB1基因定位于人类基因组的第17号染色体的长臂(17q.11.1)，目前被文章报导的主要有三种不同的转录亚型，WSB1在最开始是被认为是一种细胞因子信号转导抑制物(SOCS box)和WSB2一起被发现的，随后的研究证实WSB1作为Hedgehog信号(通路)的一部分，调节雏鸡胚胎枝芽的生长，这个新发现的基因被命名为SWiP-1(SOCS box and WDrepeats in Protein 1)，随后的研究证实，雏鸡与人的WSB1蛋白序列相似性高达88％，小鼠与人WSB1蛋白序列相似性为96.29％。

WSB1的基本结构可以分为，N端的数个WD重复序列和C端的SOCS盒。WD基序最早于G蛋白的β亚基中被发现，也称为Trp-ASP或WD40，在真核生物的多种蛋白质中均有表达，但是在原核生物中很少发现有WD基序，WD基序含有大约40个保守氨基酸，大部分以GH(glycine-histidine)为N端，以WD(tryptophan-aspartic acid)为C端，其中tryptophan-asparticacid为核心序列，维持WD蛋白家族的高度保守性和稳定的空间结构。重复的WD序列通过相互之间的作用，形成β-折叠，作为与其他蛋白的结合位点，增强WD重复蛋白与其它蛋白质的相互作用。关于WSB1中所含的WD序列数量并不统一，目前发现有6～8个WD序列存在于WSB1蛋白中。

WSB1中的socs-Box由大约50个氨基酸组成，包含由三个α螺旋组成的二级结构。目前发现包含socs-box的蛋白有80多种。广泛存在于细胞因子信号转导抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族的C端。通过与vonHippel Lindau(VHL)肿瘤抑制蛋白和E3泛素连接酶中的elongin B/C异源二聚体结合形成复合物后与Cullin5相互作用，发挥泛素连接酶E3的功能，与目标底物结合，促进底物降解。Socs-box由两个模序组成，分别为elongin B/C盒和Cullin5盒。Elongin B/C盒由SOCS盒N-末端的残基组成，形成两亲性α-螺旋结构，其可与elongin C的表面疏水性结构结合。Cullin5盒是SOCS盒C端的短模序，含有与Cullin5结合的Leu-Pro-Leu-Pro(LPLP)序列。WSB1中包含Elongin B/C盒，是维持WSB1基本功能的重要组成部分。到目前为止，关于WSB1的具体结构还没有非常精确的认识，相信随着其更多生物学功能的发现，WSB1的结构也会完全展现在我们面前。

WSB1是肿瘤细胞泛素化和蛋白降解的重要调节因子，在缺氧、应激和肿瘤微环境等条件下，通过降解肿瘤细胞内抑癌蛋白，下调抑癌基因的水平，促进肿瘤的发生发展，研究发现，WSB1使RHO结合蛋白(RHOGDI2)泛素化，同时促进RHOGDI2的蛋白水解，从而增加Rac1的活性，使细胞形态进一步改变，刺激肿瘤的转移和侵袭。PVHL被WSB1泛素化降解，与早期肿瘤组织相比，转移组织中的WSB1含量更高，且WSB1通过泛素化抑制PVHL的水平，进而影响了PVHL抑制HIF的功能。并且发现在缺氧条件下，WSB1泛素化PVHL的功能显著增强，可能与缺氧条件下HIF-1本身的过表达有关。

多种细胞在缺氧状态下培养时会出现WSB1的mRNA与蛋白表达水平出现上调的情况，研究发现WSB1的这种过表达的情况与HIF-1有关，并伴随着HIF-1的活性升高而增长。WSB1与缺氧状态之间的关系是在研究WSB1调控同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)的活性时被首次发现的。WSB1通过WD重复序列与HIPK2结合，再通过泛素化使其降解，同时研究人员通过WSB1的小干扰RNA增加了HIPK2的活性与稳定性。所以在正常组织细胞中，WSB1是HIPK2的负性调节因子，维持HIPK2在细胞中的平衡及活性。WSB1同时还靶向识别于VHL(希佩尔林道抑癌基因)，并通过泛素化使其降解，VHL是一种靶向作用于HIF-1α的抑癌基因，正常生理状态下VHL通过识别HIF-1α亚基致其降解而活性减弱。在缺氧状态下WSB1通过其负性调控VHL的能力，促进了HIF-1的转录，并且刺激细胞对缺氧条件的应答。

与正常细胞相比，肿瘤细胞虽然在低氧环境下生长，但糖代谢率却往往较高，因为当肿瘤细胞在线粒体氧化磷酸化途径供给ATP不足时，将转而更多依赖糖酵解供能来满足其快速生长的需要。这种通过更换能量来源方式来达到自身生长需要的目的称为warburg效应，HIF-1α作为一种熟知的缺氧诱导因子，参与了多种肿瘤细胞的增殖和分化，并且通过缺氧条件的形成改变了细胞中葡萄糖的利用方式。Jia Y Y,[J].Oncotarget,2016.等发现，在大多数肝细胞肝癌中miR-592都处于低表达状态，并且与患者的预后不良有关，当上调miR-592的表达时，不仅降低了肝细胞肝癌的葡萄糖利用率，并且抑制了肝癌细胞移植瘤的生长，作者发现miR-592通过对WSB1mRNA的3’-UTR靶点直接调控，抑制WSB1的表达，从而降低HIF-1α的稳定性，抑制了肿瘤细胞的糖酵解能力，miR-592可能是肝细胞肝癌中Warburg效应的负性调节因子，HIF-1/WSB1/miR-592调节轴可能是肝细胞肝癌的新的治疗靶点。

WSB1主要通过与HIF-1相互作用来促进肿瘤血管的新生，实体肿瘤中，由于血供缺乏，细胞增殖速度过快，往往普遍处于缺氧状态，为此，肿瘤组织通过一系列的调控，促进血管的生成，改善缺氧的微环境，其中血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成调节因子，HIF-1α作为HIF-1的一个组成单位，通过调控VEGF靶基因的表达促进肿瘤血管的生成。

WSB1作为参与肿瘤细胞能量代谢与血管新生的重要调节因子，调控着众多靶基因，在肿瘤生长发展、侵袭转移和放化疗耐受性等方面起着重要的作用。虽然WSB1在肿瘤恶性进展中发挥重要作用，但是机遇与挑战并存，针对WSB1的靶向治疗则成为肿瘤治疗的一个重要手段。同时，WSB1的水平与肿瘤预后关系密切，高水平的WSB1往往预示着较差的预后。因此，随着对WSB1机制及肿瘤发生发展更深入的研究，研发靶向WSB1的肿瘤治疗新药和基于WSB1指标的预后评价有着广阔的前景。

高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高。目前用于药物筛选的细胞模型可分为三大类：基于靶点的细胞模型、基于表型的细胞模型和抗病毒药物筛选的细胞模型等。专利文献CN103898158A，公开日2014.07.02，公开了一种含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途，具体地，将MALAT1的启动子序列(1100bp)插入pGL3-Basic载体，构建获得含MALAT1启动子和报告基因luc+的重组质粒pGL3-Basic-MALAT1-promoter，该重组质粒与海肾萤光素酶报告基因载体pRL-SV40共转染肿瘤细胞，添加候选抗肿瘤药物作用细胞，然后通过检测双荧光素酶活性可以反映各药物对MALAT1基因启动子转录活性的影响，从而应用于靶向MALAT1基因的抗肿瘤药物筛选。专利文献CN104232588A，公开日2014.12.24，基于Ⅰ型胶原α1在肝纤维化过程中高表达的特征，建立了以Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性为靶点的高通量筛选系统，具体地，构建了Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子片段与pGL4.17表达载体的重组质粒，转染人肝星状细胞系(LX2)，以载体pGL4.17荧光素酶表达强度检测COL1A1启动子活性为指标，筛选获得了稳定的单克隆细胞株LX2-COL，并进一步应用该细胞株对化合物S1-S7进行筛选，获得了对COL1A1启动子活性有明显抑制作用的化合物S7，mRNA实时RT-PCR及Western blotting分析均表明化合物S7能在转录及蛋白水平明显降低Ⅰ型胶原α1的表达，有望成为抗肝纤维化的候选药物。专利文献CN108570451A，公开日2018.09.25，公开了一种细胞模型及其构建方法和在筛选抗过敏和抗炎症药物以及抗肿瘤药物中的应用，该发明的细胞模型是携带并能表达HRH1基因的哺乳动物细胞，其构建方法是将HRH1基因与表达载体连接构建成重组质粒后导入哺乳动物细胞，经过筛选培养获得能稳定表达HRH1基因的细胞株，可用于筛选抗过敏和抗炎症药物以及抗肿瘤药物。然而，目前未见高特异性、高效快速、反应灵敏的针对WSB1靶点的药物筛选模型。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、高准确度、高效快速的针对WSB1靶点的药物筛选模型。

第一方面，本发明提供了一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒，所述的重组质粒构建方法为：在pGL3-Basic质粒的多克隆位点插入WSB1基因启动子序列。

在一个优选例中，所述的WSB1基因启动子序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的WSB1基因启动子序列插入在Kpn I和Xho I限制性酶切位点之间。

第二方面，本发明提供了如上所述的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：在pGL3-Basic质粒的多克隆位点插入WSB1基因启动子序列。

在一个优选例中，所述的WSB1基因启动子序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的WSB1基因启动子序列插入在Kpn I和Xho I限制性酶切位点之间。

第三方面，本发明提供了如上任一所述的重组质粒在筛选抗肿瘤药物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物的筛选方法，将如上任一所述的重组质粒与另一种荧光素酶报告基因载体共转染肿瘤细胞，然后检测双荧光素酶活性来反映候选物质对WSB1基因启动子转录活性的影响。

在一个优选例中，所述的另一种荧光素酶报告基因载体为海肾荧光素酶报告基因载体质粒pRL-TK。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为人结肠癌HCT-116细胞。

本发明优点在于：

1、本发明构建了针对WSB1靶点的含有报告基因的药物筛选模型，用于筛选以WSB1为靶点的抗肿瘤药物，具有检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。

2、本发明构建重组质粒采用的是WSB1基因启动子，并选取了特定的启动子序列，基于该重组质粒所构建的药物筛选模型具有高特异性、高灵敏度和高准确度，显著优于研究过程中构建的WSB1高表达模型和其他WSB1基因启动子的模型。

3、本发明使用pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒和海肾荧光素酶报告基因载体质粒pRL-TK共转染，通过检测双荧光素酶报告基因克服了转染效率对结果的影响。

4、本发明在研究以WSB1为靶基因抗肿瘤药物的作用机理方面有广泛的应用前景。

附图说明

图1.实施例1中，pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒构建概要图。

图2.实施例1中，pGL3-Basic载体双酶切结果。1：条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；2：pGL3-Basic载体酶切产物；3：pGL3-Basic未酶切载体。

图3.实施例1中，pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒的KpnI和XhoI双酶切鉴定结果。1：Marker：5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp；2：上条带：pGL3-Basic；下条带：WSB1-P。

图4.实施例1中，pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒PCR鉴定结果。1：阴性对照(ddH₂O)；2：阴性对照(空载自连对照组)；3：阳性对照(GAPDH)；4：Marker自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp；5-12：1-8号转化子PCR结果。

图5.实施例1中，pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒测序比对结果。

图6.实施例1中，WSB1-P重组质粒转染HCT-116细胞后的双荧光素酶表达。

图7.实施例1中，不同中药作用于WSB1-P质粒转染HCT-116细胞后双荧光素酶表达。

具体实施方式

本发明运用RT-PCR的方法，从人外周血白细胞或人其它细胞中扩增出WSB1-P序列，经大肠杆菌DH5α感受态细胞扩增出的pGL3-Basic载体质粒，经纯化、测序鉴定后，运用酶切、连接等基因重组手段，得到pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒。然后将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行扩增，制备出的有WSB1-P和Luc⁺报告基因的重组质粒。最后将构建好的重组质粒与海肾荧光素酶报告基因载体质粒pRL-TK共转染人结肠癌细胞，使其能在细胞中表达，通过检测双荧光素酶活性来反映抗肿瘤药物对WSB1-P转录活性的影响，从而应用于靶向筛选抗肿瘤药物。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1人基因组DNA的提取

含有WSB1-P基因组DNA提取自正常人外周血白细胞或人其它细胞，采用基因组DNA纯化试剂盒或组织、细胞基因组DNA纯化试剂盒的操作方法进行提取，具体步骤如下：

(1)贴壁培养的细胞，吸出培养基，用PBS清洗细胞1次，加入胰蛋白酶溶液(0.1-0.25％)消化处理。800rpm室温离心10min，收集10⁶－10⁷个细胞，尽量去除上清。

(2)用200μl溶液PL重悬细胞，加入20μl蛋白酶K和200μl溶液BL，充分混匀。

(3)70℃水浴10min，期间颠倒混匀2-3次。

(4)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇可能会产生白色纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将上一步所得溶液(包括白色纤维状悬浮物)全部加入吸附柱中，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液。

(6)向吸附柱中加入500μl溶液PP，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液。

(7)向吸附柱中加入500μl漂洗液GW，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液。

(8)将吸附柱于12000rpm室温离心2min，除去残留的漂洗液GW。将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的漂洗液。漂洗液GW的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验操作。

(9)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管，加入60-100μl预热(70℃)的洗脱液EB(10mM Tris-HCl pH 8.5)静置2min，12000rpm室温离心1min，收集DNA溶液。

(10)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的大小及粗略估计浓度。

(11)用10mM Tris-HCl pH 7.5稀释DNA，使用紫外分光光度计测定260nm处吸光值A₂₆₀，同时使用Tris-HCl pH 7.5作为空白对照，按如下公式计算计算双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)的浓度：

dsDNA浓度＝A₂₆₀×50×稀释倍数μg/ml

ssDNA浓度＝A₂₆₀×40×稀释倍数μg/ml

(12)用10mM Tris-HCl pH 7.5稀释DNA，使用紫外分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀，计算A₂₆₀/A₂₈₀比值。一般情况下使用本试剂盒纯化的DNA片段1.8<A₂₆₀/A₂₈₀<2.0，这表明DNA无蛋白污染，纯度较高，对下游分子实验不产生影响。

2PCR扩增WSB1-P

根据已知人的WSB1-P序列设计并合成两端引物：

上游(5’端)引物：包含WSB1-P互补碱基，一个Kpn I识别位点(加粗)，二个保护碱基(下划线)，

下游(3’端)引物：包含WSB1-P互补碱基，一个Xho I识别位点(加粗)，二个保护碱基(下划线)，

以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，体系如下：

反应条件如下：

扩增产物取5μl用1％琼脂糖凝胶电泳检测；剩余PCR产物用DNA片段中量纯化试剂盒回收纯化备用。

3WSB1-P PCR产物和pGL3-Basic载体质粒的双酶切

pGL3-Basic载体质粒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：E1751。根据如下列表，配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

4WSB1-P PCR产物与pGL3-Basic载体质粒酶连

于冰水浴中配制如下反应体系：

用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于16℃酶连5-8h，也可酶连过夜。

最终连入pGL3-Basic的WSB1-P目的片段序列如SEQ ID NO:3所示，其中第1-6bp、1007-1012bp为限制性酶识别位点。

5pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增

将DNA连接酶酶连产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取单菌落，经过不含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，培养后用试剂盒抽提法提取质粒备用，具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取200μl DH5α大肠杆菌感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上。

(2)加入20μl连接产物溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。

(3)42℃水浴中热击90秒(或37℃水浴5min)，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。

(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp^r)。

(5)将上述菌液摇匀后取300μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。

(6)待培养皿长出单菌落后，挑取4个单菌落加入到4个装有10ml LB液体培养基(不含Amp)的三角瓶中，37℃、250rpm振荡摇菌过夜(约12-16h)，使含重组质粒的大肠杆菌在LB培养基中大量扩增。

(7)将上述4瓶菌液各取2μl做PCR克隆鉴定，方法及条件同步骤2，结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见4个克隆均出现1002bp的目的片段，显示结果均为阳性。

6pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒的提取

pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒的提取按照质粒小量提取试剂盒的操作提取，所得质粒不含内毒素，可用于转染细胞和其它分子生物学实验，具体步骤如下：

(1)收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；

(2)弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；

(3)加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；

(4)加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；

(5)10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；

(6)12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；

(7)加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；

(8)在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；

(9)往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。

7pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒和pRL-TK内参质粒共转染细胞

将培养于含有10％新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素RPMI-1640完全培养基(37℃5％CO₂、饱和湿度)中人结肠癌HCT-116细胞株(购自中科院上海细胞库)，按1-5×105个细胞/孔的量在96孔板中接种指数生长期的细胞，在37℃5％CO₂培养箱中过夜培养，直到细胞密度达到60％-80％。

将上述常规培养的人肠癌HCT-116细胞随机分为空白组、阴性对照组和重组质粒组，分别按如下剂量加入不同的质粒进行转染：

(1)空白组：等剂量培养液，n＝3

(2)阴性对照组：pGL3-Basic+pRL-TK，n＝3

(3)重组质粒组：pGL3-Basic-WSB1-P+pRL-TK，n＝3

在1.5ml的离心管中配制待转染质粒pGL3-Basic-WSB1-P和内参质粒pRL-TK、转染脂质体Liprofectamine^TM3000复合物如下：

将待转染质粒、pRL-TK内参质粒(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：E2241)各0.2μg/孔稀释至25μl/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，用100μl的枪混合均匀。然后将转染脂质体悬液(0.5μl/孔)加入25μl/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，在室温温育5min。最后将两者混合在一起，充分混匀静置20min，使质粒与脂质体结合。

分别吸去接种到96孔板中的完全培养基，用不含血清和抗菌素的RPMI-1640润洗一次，向每个孔中加入100μl无血清无抗菌素的RPMI-1640培养基，然后在每个孔中加入62.5μl对应的质粒/脂质体混合物。在37℃5％CO₂培养箱中培养3-5h后，吸弃孔中的培养液，加入100μl含血清含抗菌素的RPMI-1640完全培养液。继续培养44h后收集样品，进行双荧光素酶检测。

8质粒转染后肠癌细胞双荧光素酶表达的检测

(1)配置新鲜裂解液：临用前，取适量5×Passive Lysis Buffer(5×PLB)，用双蒸水稀释至1×PLB。

(2)PBS洗2遍。

(3)细胞裂解：每孔加入20μl的1×PLB，混匀，在摇床上250rpm震荡15min。

(4)取上清，每孔10μl移入96孔板内。

(5)配制发光反应液：

测定前，在室温待Luciferase Assay Buffer II和Stop&Glo Buffer溶化，混匀。将10mL Luciferase Assay Buffer II全部加入保存在棕色瓶中的Luciferase AssaySubstrate，涡旋振荡器上混匀，配制成Luciferase Assay Reagent II(LAR II)试剂；按200μL50×Stop&Glo Substrate加入10mL Stop&Glo Buffer的比例配制1×Stop&GloReagent。

(6)灌注清洗：将仪器上的灌注瓶里灌上足量的双蒸水，固定好，将灌注板放好。打开任务栏最后一个检测仪控件，灌注1号，1200μl灌注3次后，取出针，灌注，重复以上步骤，灌注2号。

(7)灌注LAR II，1×Stop&Glo Reagent试剂：检测仪控件，灌注1号，1100μl灌注，同样灌注2号。并将处理好的样本(96孔板每个样本10μl)放在载物台上。

(8)程序：

孔模式(选择96孔板)

加注1(选择板的加注范围，加注100μl)

振板(线性，3S)

检测(发光，检测10s)

孔模式(选择96孔板)

加注2(选择板的加注范围，加注100μl)

振板(线性，3S)

检测(发光，检测10s)。

(9)检测：

Read1：读值

Read2：读值。

(10)回流LAR II，1×Stop&Glo Reagent试剂。

(11)再次灌注清洗：将仪器上的灌注瓶里灌上足量的双蒸水，放置灌注板。灌注1号，1200μl灌注3次后，取出针，灌注，重复以上步骤，灌注2号。

实验结果显示，空白对照组、pGL3-Basic载体质粒组和pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒组萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值分别为0.985±0.096、0.036±0.002和3.093±0.233，与载体质粒组相比，重组质粒组可以明显上调HCT-116细胞WSB1-P的表达水平(p<0.01)，具有统计学意义。

表1.质粒转染48h后HCT-116细胞WSB1-P的表达水平

*p<0.01vs pGL3-Basic Vector。

9WSB1-P重组质粒筛选抗肿瘤复方中药注射液和中药单体

将上述pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒和pRL-TK内参质粒共转染人肠癌HCT-116细胞4h后，分别加入中药复方、单体等药物，并与疗效确切的抗化疗药物5-Fu对照，继续培养48h后，收集各组的细胞，按照步骤8的方法，进行双荧光素酶检测，通过检测WSB1-P重组质粒荧光素酶活性判断被检测药物的抗肿瘤作用。

结果：与对照组相比，黄芪注射液组、参麦注射液组WSB1-P重组质粒荧光素酶活性无明显变化(△p>0.05)，丹红注射液组、去甲斑蝥素组、丹参酮IIA磺酸钠组和5-Fu组荧光素酶活性与WSB1-P组比较有所下降(*p<0.05)，提示有较好的抗肿瘤活性；血必净注射液组、华蟾素组和马钱子碱组与WSB1-P组比较则显著降低(*p<0.01)。等剂量情况下，抗癌效应强度依次为：马钱子碱、血必净注射液、华蟾素、丹参酮IIA、丹红注射液和去甲斑蝥素。

表2.不同药物对重组质粒转染人肠癌细胞WSB1-P活性的影响

^△p>0.05vs WSB1-P，^*p<0.05vs WSB1-P，^**p<0.01vs WSB1-P。

实施例2

本发明人研究过程中同时构建了WSB1高表达质粒及其他的含有不同WSB1启动子序列的重组质粒，用于抗肿瘤药物的筛选。包括：

(1)WSB1高表达质粒：将序列如SEQ ID NO:4所示的WSB1编码序列插入pGL3-promoter载体质粒(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：E1761)的Kpn I和BglII位点之间，构建高表达WSB1蛋白的重组质粒。

(2)按照实施例1所述方法构建pGL3-Basic-WSB1-P(1)(WSB1-P(1)序列如SEQ IDNO:5所示)和pGL3-Basic-WSB1-P⁽²⁾(WSB1-P⁽¹⁾序列如SEQ ID NO:6所示)重组质粒。

以上重组质粒构建完成后，按照实施例1所述的方法将其与pRL-TK内参质粒共转染人结肠癌HCT-116细胞，4h后，加入抗化疗药物5-Fu，设置5-Fu浓度为5μM、10μM、20μM处理，继续培养48h后，收集各组的细胞，按照实施例1的方法进行双荧光素酶检测，判断被检测药物的抗肿瘤作用。各处理设置三个重复。

结果显示：pGL3-Basic-WSB1-P重组质粒转染HCT-116细胞，在5-Fu作用后，随体系中5-Fu浓度的升高双荧光素酶的表达量逐渐降低，在浓度为20μM时，仍能够高效地检测出5-Fu的抗肿瘤作用，而其他三个质粒灵敏度较低，与pGL3-Basic-WSB1-P质粒相比，在相同药物浓度时，其他各组的检出率大大下降。

表3.各浓度下5-Fu对重组质粒转染人肠癌细胞WSB1或WSB1-P活性的影响

^*p<0.05vs WSB1-P，^**p<0.01vs WSB1-P+5-Fu(20μM)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海中医药大学附属曙光医院

<120> 一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用

<130> /

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgtaccac gttgtgagat gagaca 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactcgagct gcctcgggaa agctcccg 28

<210> 3

<211> 1012

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtacctgca acactctact ctgtcccatg aatatctgcc acatatttga attcccagtc 60

ttatacgccc caggcctttg caatgtttag ggtccacacg agaagccatt aaaatgcaaa 120

tacgtcatct gtgaccggga accaagctgg catctagcag atactgacac atttatcagt 180

ctgatgtgtg gacaactagg tgcctcccag aggccttcag gtaaggtgga ggaagggcca 240

attctgagct gacacagtgg gatccatctt ggccaggaca gtgggatcca tcttggccag 300

gacaaaggca gtccagagag gccccgcggc gcggtgcggc gcgatcacgc ccgagtctcc 360

ttctcgttcc cctcggccct tcctaaaacc tgctggctca ggtctgaaca atcgcagctg 420

gacaggtggt gcacaacgat gttaattttc atcctgtctt tttcatcagt gcatccttca 480

gttccctatt acttgtgggc tggggagttg gccaaattga gtgaaaacct gaaatgtctt 540

tttgttcttt tggttcagcc agtttaagtt ccatgcaatc tttaagctag gaggctaata 600

ataatacaat tctctgcttg cccttttcaa agccacttca gcttataaac tccatattag 660

accatccagg cccagaagac gccaccggcc tacaggcaga gtcagcggaa ccagcctggg 720

ctggatctcc ccctgcgagg cccccaggca acgcccgcgc cgggccgggg agatcacgtc 780

ccgtgcgtcg ggaggcgggg gcctcgggct gtgacgtcac gtggccgcgc ccctgccgcc 840

cagatatctc cggcgccgcc cgccattttg actccagtgt ctcgtttgca gtcggcgctt 900

taggggaact gtcttcctcc gcaggcgcga ggctgggtac agggtctatt gtctgtggtt 960

gactccgtac tttggtctga ggccttcggg agctttcccg aggcagctcg ag 1012

<210> 4

<211> 1268

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtaccatgg ccagctttcc cccgagggtc aacgagaaag agatcgtgag attacgtact 60

ataggtgaac ttttagctcc tgcagctcct tttgacaaga aatgtggtcg tgaaaattgg 120

actgttgctt ttgctccaga tggttcatac tttgcttggt cacaaggaca tcgcacagta 180

aagcttgttc cgtggtccca gtgccttcag aactttctct tgcatggcac caagaatgtt 240

accaattcaa gcagtttaag attgccaaga caaaatagtg atggtggtca gaaaaataag 300

cctcgtgaac atattataga ctgtggagat atagtctgga gtcttgcttt tgggtcatca 360

gttccagaaa aacagagtcg ctgtgtaaat atagaatggc atcgcttcag atttggacaa 420

gatcagctac ttcttgctac agggttgaac aatgggcgta tcaaaatatg ggatgtatat 480

acaggaaaac tcctccttaa cttggtagat catactgaag tggtcagaga tttaactttt 540

gctccagatg gaagcttgat cctggtgtca gcttcaagag acaaaactct cagagtatgg 600

gacctgaaag atgatggaaa catgatgaaa gtattgaggg ggcatcagaa ttgggtgtac 660

agctgtgcat tctctcctga ctcttctatg ctgtgttcag tcggagccag taaagcagtt 720

ttcctttgga atatggataa atacaccatg atacggaaac tagaaggaca tcaccatgat 780

gtggtagctt gtgacttttc tcctgatgga gcattactgg ctactgcatc ttatgatact 840

cgagtatata tctgggatcc acataatgga gacattctga tggaatttgg gcacctgttt 900

cccccaccta ctccaatatt tgctggagga gcaaatgacc ggtgggtacg atctgtatct 960

tttagccatg atggactgca tgttgcaagc cttgctgatg ataaaatggt gaggttctgg 1020

agaattgatg aggattatcc agtgcaagtt gcacctttga gcaatggtct ttgctgtgcc 1080

ttctctactg atggcagtgt tttagctgct gggacacatg acggaagtgt gtatttttgg 1140

gccactccac ggcaggtccc tagcctgcaa catttatgtc gcatgtcaat ccgaagagtg 1200

atgcccaccc aagaagttca ggagctgccg attccttcca agcttttgga gtttctctcg 1260

taagatct 1268

<210> 5

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtacctgca acactctact ctgtcccatg aatatctgcc acatatttga attcccagtc 60

ttatacgccc caggcctttg caatgtttag ggtccacacg agaagccatt aaaatgcaaa 120

tacgtcatct gtgaccggga accaagctgg catctagcag atactgacac atttatcagt 180

ctgatgtgtg gacaactagg tgcctcccag aggccttcag gtaaggtgga ggaagggcca 240

attctgagct gacacagtgg gatccatctt ggccaggaca gtgggatcca tcttggccag 300

gacaaaggca gtccagagag gccccgcggc gcggtgcggc gcgatcacgc ccgagtctcc 360

ttctcgttcc cctcggccct tcctaaaacc tgctggctca ggtctgaaca atcgcagctg 420

gacaggtggt gcacaacgat gttaattttc atcctgtctt tttcatcagt gcatccttca 480

gttccctatt acttgtgggc tggggagttg gccaaattga gtgaaaacct gaaatgtctt 540

tttgttcttt tggttcagcc agtttaagtt ccatgcaatc tttaagctag gaggctaata 600

ataatacaat tctctgcttg cccttttcaa agccacttca gcttataaac tccatattag 660

ctcgag 666

<210> 6

<211> 725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtacctggc caggacaaag gcagtccaga gaggccccgc ggcgcggtgc ggcgcgatca 60

cgcccgagtc tccttctcgt tcccctcggc ccttcctaaa acctgctggc tcaggtctga 120

acaatcgcag ctggacaggt ggtgcacaac gatgttaatt ttcatcctgt ctttttcatc 180

agtgcatcct tcagttccct attacttgtg ggctggggag ttggccaaat tgagtgaaaa 240

cctgaaatgt ctttttgttc ttttggttca gccagtttaa gttccatgca atctttaagc 300

taggaggcta ataataatac aattctctgc ttgccctttt caaagccact tcagcttata 360

aactccatat tagaccatcc aggcccagaa gacgccaccg gcctacaggc agagtcagcg 420

gaaccagcct gggctggatc tccccctgcg aggcccccag gcaacgcccg cgccgggccg 480

gggagatcac gtcccgtgcg tcgggaggcg ggggcctcgg gctgtgacgt cacgtggccg 540

cgcccctgcc gcccagatat ctccggcgcc gcccgccatt ttgactccag tgtctcgttt 600

gcagtcggcg ctttagggga actgtcttcc tccgcaggcg cgaggctggg tacagggtct 660

attgtctgtg gttgactccg tactttggtc tgaggccttc gggagctttc ccgaggcagc 720

tcgag 725

Claims (10)

1.一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒构建方法为：在pGL3-Basic质粒的多克隆位点插入WSB1基因启动子序列。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的WSB1基因启动子序列如SEQ IDNO:3所示。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的WSB1基因启动子序列插入在Kpn I和Xho I限制性酶切位点之间。

4.如权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在pGL3-Basic质粒的多克隆位点插入WSB1基因启动子序列。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的WSB1基因启动子序列如SEQ IDNO:3所示。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的WSB1基因启动子序列插入在Kpn I和Xho I限制性酶切位点之间。

7.权利要求1-3任一所述的重组质粒在筛选抗肿瘤药物中的应用。

8.一种抗肿瘤药物的筛选方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的重组质粒与另一种荧光素酶报告基因载体共转染肿瘤细胞，然后检测双荧光素酶活性来反映候选物质对WSB1基因启动子转录活性的影响。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述的另一种荧光素酶报告基因载体为海肾荧光素酶报告基因载体质粒pRL-TK。

10.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人结肠癌HCT-116细胞。