CN102716498A - 一种可高效高特异灭杀p53基因突变型乳腺癌细胞的药物脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体。可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的T-VISA-miR34a治疗载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-miR34a治疗载体，所述的T-VISA-miR34a治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的T-VISA-miR34a治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶点，与其3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，导致乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗P53突变型乳腺癌中具有广阔的前景。
Description
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞T-VISA-miR34a治疗载体及其药物T-VISA-miR34a脂质体。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，严重危害了人类的身体健康。乳腺癌疗效较好，但是仍有一部分患者综合治疗后会出现复发和转移，对现有药物疗效很差。microRNAs(miRNAs)是近年来发现的一类长度为18-24个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。miRNA在人类肿瘤的发生和发展中扮演重要角色，发挥着癌基因或抑癌基因的作用，有望成为癌症治疗的作用靶点。因此，迫切需要探索高效靶向杀灭乳腺癌的新药物。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶点，可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的T-VISA-miR34a治疗载体。
本发明的可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的T-VISA-miR34a治疗载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的1％，因此无法广泛应用，本发明首先将hTERT启动子控制Gal4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；再将Gal4-VP2 融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录；然后将WPRE位于目的基因的3-UTR，增强mRNA稳定性的作用，由此构建得到hTERT-VP16-GAL4-WPRE(VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier，VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA(整合性系统放大器)系统，最后，结合miR34a作为治疗基因，建立T-VISA-miR34a治疗载体，该T-VISA-miR34a治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-miR34a治疗载体，所述的T-VISA-miR34a治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的脂质体可以使用按照常规方法制备的脂质体，优选是通过以下方法制备的脂质体：按照1摩尔胆固醇对应1.7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5％的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5％的葡萄糖溶液的体积，在50℃的超声水浴箱中进行超声处理1min，再在50℃下收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。通过该方法制备的脂质体粒径为180nm左右，容许其穿透肿瘤细胞中极细的毛细血管并被细胞摄取。
所述的药物T-VISA-miR34a脂质体优选通过以下方法制备的，将上述脂质体加入到5％的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-miR34a治疗载体加入到5％的葡萄糖溶液中使T-VISA-miR34a治疗载体的浓度为1μg/ml，然后将脂质体溶液和T-VISA-miR34a治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-miR34a脂质体。利用该方法制备得到的药 物T-VISA-miR34a脂质体的粒径200～300nm，稳定性好，在4～8℃，1-2年无降解。
本发明还发现，药物T-VISA-miR34a脂质体与5-氟尿嘧啶脂质体存在协同作用，因此本发明的第三个目的是提供一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物，其特征在于，由药物T-VISA-miR34a脂质体和5-氟尿嘧啶脂质体组成。
本发明的药物T-VISA-miR34a脂质体在体外能高效杀灭P53基因突变的乳腺癌细胞系，而对正常细胞无杀灭作用。
由此可见，本发明的T-VISA-miR34a治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶点，与其3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，导致P53基因突变乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗P53突变型乳腺癌中具有广阔的前景。
附图说明：
图1是T-VISA-miR34a治疗载体的结构示意图，它是以pUK-21为基本骨架，卡那霉素抗性的可治疗性载体；
图2是动态光散射测量实施例2制得的脂质体(Liposome)和实施例3的T-VISA-miR34a脂质体(Liposome+T-VISA-miR34a)的粒径及其分布；
图3是药物T-VISA-miR34a脂质体在体外杀灭P53突变型乳腺癌细胞系的结果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照，T-VISA-miR34a表示药物T-VISA-miR34a脂质体，P53是指P53基因，M表示突变型，W表示野生型；
图4是药物T-VISA-miR34a脂质体抑制BCL2，E2F3的mRNA结果图，其中Ctrl表示没有 做任何处理的空白对照；
图5是药物T-VISA-miR34a脂质体联合5-FU杀伤乳腺癌细胞的效果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、T-VISA-miR34a脂质体的制备
实施例1：T-VISA-miR34a治疗载体的构建
(一)pCRII-TOPO-hTERT质粒克隆
1、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。
2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)和下游(Reverse)引物：
Forward：5′-ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc-3′(XbaI)
Reverse：5′-ata gat ctt atg cgg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agc gc-3′。
3、以乳腺癌MCF-7细胞DNA为模板，hTERT PCR引物(Forward：5′-ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc-3′；Reverse：5′-ata gat ctt atg cgg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agc gc-3′)、Pfu DNA polymerase、dNTP和PCR反应液，扩增获得hTERT启动子(-416 to+1)产物，其序列如SEQ ID NO.2所示。其PCR反应体系：10×PCR buffer 5μl，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各1μl，MCF-7细胞DNA为模板100ng DN A，25mM MgCl2 3μl，10mM dNTPs 1μl，Pfu-Taq(1U/μl)，最后补水至50μl。PCR反应条件：94℃热变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行3 0次循环；最后72℃延伸10min。
4、PCR产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，回收约418bp大小片断。方法参考其说明书。
5、将回收的PCR产物2μl，pCRII-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)1μl，DNA ligase buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应10min。
6、将2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
7、取200μl LB培养基细菌液，涂布ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
8、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO.2所示)已经插入克隆载体pCRII-TOPO中，命名为pCRII-TOPO-hTERT。
(二)pGL3-hTERT-Luc质粒克隆
1、用KpnI/Xho l酶切pCRII-TOPO-hTERT质粒，用KpnI/Xho l酶切pGL-3-basic质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)，该质粒中含有荧光素酶Luciferase基因。酶切体系：10×Buffer A 2μl，KpnI/Xhol 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1×TAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT(418bp大小)片断和pGL-3-Basis(4792bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的hTERT产物6μl，回收的pGL-3-basic产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最 后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、将2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子已经插入载体pGL-3-basic中，命名为pGL3-hTERT-Luc质粒。
(三)pGL3-Luc-WPRE质粒克隆
1、用Asp718/SalI酶切pGEM-3Z-WPRE质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)，然后用DNA polymerase平端；用SmalI酶切pGL-3-basic质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)。酶切体系：10X Buffer A 2μl，Asp718 1μl/SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE(590bp大小)片断和pG-L3-Basic(约4800bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的WPRE产物6μl，回收的pGL-3-basic产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实WPRE插入了pGL-3-basic中，命名为pGL3-Luc-WPRE质粒。
(四)pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒克隆
1、用HindIII/NotI酶切pCRII-TOPO-hTERT质粒(见上)，然后用DNA polymerase平端；用MSCI/NheI酶切pGL3-TSTA-Luc质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后用DNA polymerase平端。酶切体系：10X Buffer A 2μl，HindIII/NotI or MSCI/NheI1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT(418bp大小)片断和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的hTERT产物6μl，回收的pGL3-TSTA-Luc产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子插入了载体pGL3-TSTA-Luc中， 命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒。
(五)T-VISA-Luc质粒克隆
1、用NotI/BglII酶切pGL3-Luc-WPRE质粒(见上)；用NotI/BglII酶切pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒(见上)。酶切体系：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，BglII 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE(590bp大小)片断和pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的WPRE产物6μl，回收的pGL3-hTERT-TSTA-Luc产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒，简称pGL3-hTERT-VISA-Luc质粒，即T-VISA-Luc质粒。
(六)pGL3-T-VISA-miR34a质粒
1、以miRBase数据库公布的人has-miR-34a(MI0000268)序列：uggcagugucuuagcugguugu，对应的DNA序列为：TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT，另合成随机序列(在人缘内无靶点)： 5′-GACUAACGCAAGUCCACUGAU-3′，依据以上序列设计合成茎环结构的寡核苷酸单链，在两条配对单链的5′端分别加入BglII、NheI酶切位点，loop环序列为CTCGAG。寡核苷酸单链(英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)体外复性成双链(复性缓冲液：100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；10mmol/LEDTA，pH 8.0；1mol/LNaCl。复性程序：95℃孵育10min，关闭电源缓慢冷却至室温)，取5μL 500nmol/L的复性产物经5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
2、用BglII/NheI酶切pGL3-hTERT-VISA-Luc质粒粘性末端，酶切体系：10X Buffer A2μl，BglII 1μl，NheI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
3、pGL3-hTERT-VISA-Luc质粒酶切产物与复性has-miR-34a发夹结构在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收miR-34a shRNA片段(493bp)和pGL3-hTERT-VISA片断(1650bp)(酶切去除了荧光素酶基因)。
4、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
5、回收的miR-34a shRNA产物6μl，回收的pGL3-hTERT-VISA产物2μl，DNAligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，室温连接反应过夜。
6、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
7、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
8、酶切质粒鉴定，进行测序证实，miR-34a shRNA插入到pGL3-hTERT-VISA中，命名为pGL3-T-VISA-miR34a质粒。
(七)pUK21-T-VISA-miR34a治疗载体
1、用NotI/SalI酶切pGL3-T-VISA-miR34a质粒，酶切体系：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。用NotI/SalI酶切pUK21质粒，酶切体系为：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收T-VISA-miR34a片段(1049bp)和pUK21片段(816bp)。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的T-VISA-miR34a产物6μl，回收的pUK21产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Kanamycin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，T-VISA-miR34a片段插入到pUK21质粒的NotI/SalI位点，命名为pUK21-T-VISA-miR34a治疗载体，简称T-VISA-miR34a治疗载体，经测序其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
pUK21-T-VISA-miR34a治疗载体是合成的miR-34a shRNA双链经复性后，miR-34ashRNA片段插入到pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒的BglII/NheI/平端位点，产生pGL3-T-VISA-miR34a质粒。pGL3-T-VISA-miR34a质粒NotI/SalI酶切后，T-VISA-miR34a片 段插入到pUK21质粒的NotI/SalI位点，产生pUK21-T-VISA-miR34a治疗载体，简称为T-VISA-miR34a治疗载体，其结构如图1所示。
pUK21-T-VISA-miR34a治疗载体主要包括hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO.2所示)、WPRE(其序列如SEQ ID NO.3所示)、G5E4T(其序列如SEQ ID NO.4所示)和Gal4-VP2基因(其序列如SEQ ID NO.5所示)和miR-34a shRNA序列(其序列如SEQ ID NO.6所示)。hTERT启动子控制Gal4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动micro RNA34a的大量转录，micro RNA34a与Bcl-2，CD44等靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而导致细胞凋亡。
实施例2：脂质体的制备：
将脂质从冰箱中取出(DOTAP储存于-20℃、胆固醇储存于-4℃)，恢复至室温。水浴加热2个旋转蒸发仪分别至30℃，50℃。称取68.75mg胆固醇，放入1000ml圆底烧瓶。向圆底烧瓶中加入100mg DOTAP和25mg Chloroform。转动烧瓶，使其充分混合。在30℃的水浴箱中旋转圆底烧瓶2min，使其混合均匀，在烧瓶壁上形成一层薄膜。打开真空抽吸器，30℃下30min。加入8.9ml预热的5％葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜，50℃下以105转/min快速旋转45min。然后降低温度至35℃旋转10min。用保鲜膜(或石蜡)封口烧瓶，室温下过夜，避光。测量体积，加双蒸水至8.9ml。在50℃的超声水浴箱中(200W)对烧瓶进行超声处理1分钟。在50℃下依次通过1.0μm，0.45μm，0.22μm，0.1μm的滤膜(1.0μm，0.45μm为Whatman的polysufone滤膜，货号分别为#6780-1310和#6780-1304；0.22μm，0.1μm为Whatman的 Anotop滤膜，货号分别为#6808-1122和#6809-1112)，最后通过0.1μm的脂质体放入洁净的玻璃瓶中。用氮气填充试管10秒，将脂质体保存于试管中置于4℃避光保存备用(同时防止空气进入)。
实施例3：T-VISA-miR34a脂质体的制备
T-VISA-miR34a治疗载体溶于5％葡萄糖溶液，使其终浓度为1ug/ul，同时将存储浓度(20mM)的实施例2的脂质体用5％葡萄糖溶液稀释为工作浓度(8mM)。1μg DNA/ul的T-VISA-miR34a治疗载体缓慢加入8mM的脂质体中(治疗载体∶脂质体＝20ug∶50ul)，在室温中静置20分钟，反应，形成药物T-VISA-miR34a脂质体。
然后再检定、生物特性检测和内毒素等质控，无菌分装。成品检定，包装，4-8℃保存；使用前先放室温20分钟，可直接用于体外研究，也可用于体内研究，也可用5％葡萄糖溶液稀释后使用。
二、效果实验：
1、T-VISA-miR34a脂质体的生物特性：
对实施例3获得的T-VISA-miR34a脂质体进行生物特性测定，其生物特性如下：
脂质体大小：经动态光散射所测的脂质体粒径在180nm左右，包裹质粒后粒径约为200nm-300nm(见图2)。
脂质体稳定性：在4-8度1-2年无降解。
浓度：4mM。
2、T-VISA-miR34a脂质体的抗乳腺癌活性：
2.1体外实验：
将T-VISA-miR34a脂质体共转染乳腺癌细胞和正常细胞系，48小时后，收集细胞、裂解，计算细胞存活率，以未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，结果如图3所示，由图3中可以看出，T-VISA-miR34a脂质体可高效杀灭P53基因突变型乳腺癌细胞，对P53基因野生型乳腺癌细胞和正常细胞没有明显杀伤作用。
2.2 机制实验：
将T-VISA-miR34a脂质体共转染乳腺癌细胞，48小时后，用Trizol(购自Invitrogen公司)收集细胞，按照Trizol标准操作步骤提取RNA后，Nanodrop(Thermo)定量RNA，后用MMLV(Invitrogen公司)逆转录酶以OligdT逆转录成cDNA，按照以下反应体系定量PCR检测BCL2，E2F3，CD44基因表达(反应体系：模版cdna 1uL，10uM引物F/R各0.5uL，SYBRmix 10uL，ddH2O 8uL)(检测引物为：BCL2：F：5′-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3′，R：5′-ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3′；E2F3：F：5′-TGCTTTCGGAAATGCCCTTACA-3′，R：5′-GATGACCGCTTTCTCCTAGCT-3′；CD44：F：5′-TCAGAGGAGTAGGAGAGAGGAAAC-3′，R：5′-GAAAAGTCAAAGTAACAATAACAGTGG-3′)，以上反应体系混匀，置于ABI7900HT仪器中，95℃ 5min预变性后，95℃ 15s→65℃ 35s(荧光检测)，40cycles。以未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，计算结果如图4所示，由图4中可以看出，T-VISA-miR34a脂质体可高效抑制乳腺癌BCL2和E2F3基因的表达，对CD44mRNA的影响不明显。
2.3 T-VISA-miR34a脂质体联合5-FU(5-氟尿嘧啶)用药效果实验
将T-VISA-miR34a脂质体与5-FU混合，终浓度分别为T-VISA-miR34a：0.56nM；5-FU：1.25ug/mL，然后共转染乳腺癌细胞，以二者单独用药作对照，48小时后，收集细胞、裂解，计算细胞存活率，以二者单独用药作阳性对照，未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，结果如图5所示，由图5中可以看出，T-VISA-miR34a可与5-FU协同杀伤乳腺癌细胞。
Claims (5)
1.一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的T-VISA-miR34a治疗载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-miR34a治疗载体，所述的T-VISA-miR34a治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体，其特征在于，所述的脂质体是通过以下方法制备的：按照1摩尔胆固醇对应1.7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5％的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5％的葡萄糖溶液的体积，在50℃的超声水浴箱中进行超声处理1min，再在50℃下收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。
4.根据权利要求3所述的可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物T-VISA-miR34a脂质体，其特征在于，所述的药物T-VISA-miR34a脂质体是通过以下方法制备的：将脂质体加入到5％的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-miR34a治疗载体加入到5％的葡萄糖溶液中使T-VISA-miR34a治疗载体的浓度为1μg/μl，然后将脂质体溶液和T-VISA-miR34a治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-miR34a脂质体。
5.一种可高效高特异灭杀P53基因突变型乳腺癌细胞的药物，其特征在于，由权利要求2所述的药物T-VISA-miR34a脂质体和5-氟尿嘧啶脂质体组成。
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