CN101088565A - miRNA－34a的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RNA小分子的用途，尤其是涉及miRNA－34a的用途，属于生物医学材料技术领域。本发明首先采用Northern等方法确认其是年龄相关性表达，并用不同年龄阶段的大鼠脑前额叶皮层组织miRNA作对照，结果发现miRNA－34a在恒河猴大脑皮层和大鼠前额叶皮层的表达呈年龄相关性变化。为了探究miRNA－34a的可能作用机制，本发明建立了大鼠神经元AD细胞模型。在此基础上，通过转染miRNA－34a前体，miRNA－34a反义RNA及其它对照物，发现miRNA－34a具有拮抗Aβ诱导的神经元凋亡作用。

Description

miRNA-34a的用途

技术领域

本发明涉及一种RNA小分子的用途，尤其是涉及miRNA-34a的用途，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

近几年来，从植物、线虫到人的细胞中广泛存在一种非编码的单链RNA小分子(microRNA，miRNA)，它们能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非翻译端特定区域相互作用，抑制蛋白质的合成。1993年Lee等采用经典克隆方法在线虫中首次克隆了lin-4基因，通过点突变的方法证实小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蝇中发现了let-7基因的存在，于是推测这类小分子可能是一类进化上保守，在生命过程中起重要作用的调节分子。随后人们在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA基因。小RNA的研究给我们带来重要的启迪是基因组非组蛋白编码区蕴含着重要的生命功能活动信息。现有研究表明生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非蛋白编码小RNA的调控；而除miRNA、siRNA以外的小RNA我们更是知之甚少。长期以来，有关基因的研究重点都在蛋白编码基因上，而小RNA的发现和研究对揭示基因的表达调控机制，让我们更为深入的了解生命之奥秘无疑具有重大的科学价值。

据统计，miRNA在人类基因组中约占1％的数量，在不同的时空发育阶段表达量存在显著差异。Bartel等(Ambros V，Bartel B，Bartel DP，Burge CB，Carrington JC，Chen X，Dreyfuss G，Eddy SR，Griffiths-Jones S，Marshall M，Matzke M，Ruvkun G，Tuschl T.)提出，由于miRNA与靶miRNA互补程度不同，起着切割或微弱抑制作用。由于其作用靶点的多寡，miRNA表达量亦不同，通过基因芯片技术，可以同时检测所有miRNA时空表达的状况。在此基础上，寻找miRNA靶基因，揭示其作用机制是目前研究的重点，也是后基因组时代需要解决的问题之一。全部miRNA基因功能的揭示可能会给人们对生命现象的理解带来一场深刻的革命。miRNA在生命过程基因表达调控中起着重要的作用，成为今年的研究热点。现有的研究表明miRNA在神经系统发育过程中起着极其重要的作用。新近发现miRNA-134可以调控大鼠神经元树突棘的大小。当神经细胞在miRNA-134的存在的情况下，树突数量会减少，从而减弱突出的形成；当miRNA-134被抑制后，树突数量就会增加，突触连接也因此增强。进一步的研究表明，miRNA-134对神经元树突形成影响的可能机制是其能抑制Limk1基因的表达。在神经细胞中加入脑原神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)时miRNA-134对Limk1的抑制作用就会被阻遏。研究者推测miRNA-134等一些miRNA有可能在大脑中起到一种对认知功能微调的作用——即在受到外部环境刺激后，选择性控制突出的生长。一个神经细胞可以形成上千个突触，如果选择型控制其中一类突触，这可以提高大脑信息存储量。此外，研究已表明，Limk1基因缺失与威廉综合征相关。因此推测miRNA-134可能与一些神经疾病如弱智和自闭症相关。Miska等(Miska EA，Alvarez-Saavedra E，Townsend M，Yoshii A，Sestan N，Rakic P，Constantine-Paton M，Horvitz HR.Microarray analysis of microRNA expression in the developing mammalian brain.Genome Biology 2004，5：R68.)利用Northern blot方法对30个在特定组织器官表达的miRNA进行了研究，结果发现有7个miRNA在人脑中特异表达。这些miRNA是miRNA-9，-124a，-124b，-135，-153，-183和-219。而miRNA-18，-19a，-24，-32，-130和-213在肺中特异表达；miRNA-189和-212在脾脏特异表达；miRNA122a在肝脏特异表达；miRNA208在人心脏特异表达。Krichevsky等(Krichevsky AM，KingKS，Donahue CP，Khrapko K，Kosik KS.A microRNA array reveals extensive regulationof microRNAs during brain development.RNA 2003，9：1274-1281.)的研究发现miRNA-9和miRNA-131在PS-1敲除小鼠E17.5显著下调。但是到目前为止还没有文献报导关于miRNA-34a在抗神经元凋亡方面的用途。

发明内容

本发明的目的在于通过miRNA芯片技术提供miRNA-34a的用途。

本发明提供miRNA-34a作为制备治疗神经退行性疾病的药物的应用

本发明提供miRNA-34a作为制备治疗脑肿瘤的药物的应用

本发明发现miRNA-34a既在神经干细胞中表达，又随年龄增加而表达增加。为探索miRNA-34a在大脑皮层的分布及功能，本发明首先采用Northern等方法确认其是年龄相关性表达，并用不同年龄阶段的大鼠脑前额叶皮层组织miRNA作对照，结果发现miRNA-34a在恒河猴大脑皮层和大鼠前额叶皮层的表达呈年龄相关性变化。为了探究miRNA-34a的可能作用机制，本发明建立了大鼠神经元AD细胞模型。在此基础上，通过转染miRNA-34a前体，miRNA-34a反义RNA及其它对照物，发现miRNA-34a具有拮抗Aβ诱导的神经元凋亡作用。这一研究结果提示miRNA-34a基因的表达与维持神经元的稳态有关。为进一步探讨miRNA-34a基因在神经系统发育和衰老过程中的分子机制，本发明通过miRNA靶标预测软件对其可能的靶标进行验证，研究结果表明，miRNA-34a拮抗Aβ诱导的神经元凋亡作用的机制与其抑制CAPN6和CASP2的活性相关。

用于研究的样品除来自恒河猴外，本发明还从人胚胎脑提取培养神经干细胞(NSC)和从人血中提取培养间充质干细胞(MSC)用于miRNA芯片研究。芯片分析聚类与分析结果表明miRNA-34a随年龄增加而呈显著上调。

一般认为一个miRNA分子需要符合条件应包括：a)表达需要用Northern-blot来验证其存在；b)小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端；c)小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d)前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来。这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a(表达)和b(结构)两条标准；或者a(表达)和c(保守性)；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c(保守性)；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a(表达)和前体RNA分子结构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c(系统发育保守性)和d(累积性)标准也行；这样就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。

附图说明

图1是miRNA芯片杂交图

图2是芯片分析聚类结果。A显示猴脑前额叶皮层尼氏染色正常形态学组织图谱。B显示培养的人神经干细胞(B1)及免疫组化鉴定图谱(B2)。C显示miRNA分析聚类结果

图3是芯片分析聚类分析结果。A显示在老年猴脑中高表达的miRNAs。B显示在新生猴脑中高表达的miRNAs。

图4是miRNA-34a在恒河猴大脑皮层和大鼠前额叶皮层的表达呈年龄相关性变化。A显示恒河猴大脑皮层miRNA-34a Northern杂交结果。BA：Brodmann area，Hi：海马，AN：杏仁体，CD：尾壳核，BA23：扣带回。B显示Northern结果经灰度扫描标准化后的直方图。C为鼠脑前额叶皮层在四个年龄阶段(FC-1D：出生第一天，FC-3M：三月龄FC-14M：十四月龄，FC-22M：二十二月龄)miRNA-34a Northern杂交结果。D为C图Northern结果经灰度扫描标准化后的直方图。

图5是(A)MTT实验发现，与正常对照比较(NC)，Aβ能诱导原代培养的大鼠前额叶皮层的神经元细胞凋亡。miRNA-34a前体(34a_PRE)能拮抗Aβ的这一作用，而miRNA-34a的反义RNA(34a_AS)则促进了神经元细胞的凋亡。采用miRNA-520f的前体(520f_PRE)和反义RNA(520f_AS)则对Aβ的这种作用没有明显的影响。(B)Northern结果显示，转染miRNA-34a前体后的神经元可见其显著的成熟体(M)的形成，miRNA-520f的前体则未发现明显的成熟体的形成。据报道，目前miRNA-520家族成员仅在灵长类中存在，miRNA-520f的前体至原代培养的大鼠前额叶皮层神经元未见其明显的成熟体形成的原因有待进一步探讨。

图6是为进一步验证图5-5所述结果，采用Fura-2荧光法测定了上述研究体系中各组神经元细胞内游离钙离子浓度，实验结果表明各组神经元细胞内钙离子浓度的变化与MTT所指示的细胞凋亡情况具有一致性(A)。采用蛋白质印迹技术检定该体系中各组的样品发现Caspase-3的活性体p20也与上述实验结果一致(B)。应用本室建立的检测miRNA定量PCR方法，我们发现转染miRNA-34a前体(34a_PRE)后，miRNA-34a成熟体的拷贝数较正常对照组(NC)增高1144.95±63.63倍。而较NC组，Aβ组和34a_AS组miRNA-34a成熟体的拷贝数则有一定程度的下降(C)。这可能与Aβ导致神经元细胞凋亡的毒性作用有关。

具体实施方式

1.RNA抽提：每100mg组织加入1ml Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定OD260和OD280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S∶18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

2.MicroRNA芯片的制备：首先从miRNA信息登录网站http://microrna.sanger.ac.uk(2005.09)上获取制备miRNA探针的序列，其中包括313条人的及34条小鼠的miRNA序列对应的探针序列。同时，我们也将XIE发表在2005年Nature(Xie X，LuJ，Kulbokas EJ，et al.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3UTRs by comparison of several mammals[J].Nature，2005，434(7031)：338)上的文章中所提及的122条预测中的miRNA对应的探针也整合到其中，最终在我们的miRNA芯片上集中了469种不同的miRNA对应的探针。为了实现对芯片实验过程的质量控制，我们在芯片上设置了阴性及阳性对照。阴性对照我们设计了两种，一种是空白点样液体；另外一种就是没有掺入Y2对应的RNA，因此Y2就是一个最合适的阴性对照。阴性对照预期的杂交信号是很弱的，它们的信号值不足以进入到后续的数据分析当中。阳性对照分为三种：

(1)固定化阳性对照：5’-GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATC-3’。在芯片实验最后检测杂交结果时，此序列应该在cy3的激发波长下有较强的荧光信号，扫描信号值在8000以上，表明芯片上的核酸固定是没有问题的。

(2)杂交的阳性对照：选择组织内源的，RNA碱基长度在100nt左右的U6和tRNA作为miRNA芯片的内源阳性对照；U6对应的探针序列是：

5’-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’；tRNA对应的探针序列是5’-GGGTTATGGGCCCAGCACGCTTCCGCTGCGCCACTCTGCT-3’；它们的杂交信号也应该是比较高的，一般都超过5000信号值。

(3)芯片系统的阳性对照：为了避免受到实验RNA样品的干扰，在芯片上还点有与实验样品没有关系的核酸序列，以检查芯片系统的有效性。我们把这种对照称为外标(exogenous controls)。在miRNA芯片上，我们设计了8条与所有的RNA序列不具同源性的寡核苷酸序列作为外标，名字和序列见下表。经过blast比较，这8个核酸序列和人的全部基因序列没有同源性。我们用Ambion公司的miRNA ProbeConstruction kit(Cat#.1550)合成了此8条探针对应的长度类似miRNA的RNA序列(20-30nt)，然后在反应的时候掺入到实际检测的RNA样品中去，一同进行芯片反应实验。根据掺入RNA量的不同，这些外标点可以呈现不同的杂交信号；除了Y2以外，一般信号值都在5000以上。芯片系统的阳性对照见表1。

表1.芯片系统的阳性对照

ID	sequence(5′-3′)
		Zip23	CAGCATCGGACCGGTAATCGGACC
Zip5	GACCACCTTGCGATCGGGTACAGC
		Zip15	GACCGGTATGCGACCTGGTATGCG
Zip13	CAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG
		Zip21	TGCGATCGCAGCGGTAACCTGACC
Zip25	GACCATAGTGCGGGTAGGTAGACC
		Y2	AGGTACGAAACGCTAAGAAT
Y3	CATTCCTAAACGGGCTGAT

3.miRNA芯片检测：用于miRNA芯片检测的RNA样品制备先使用Trizol抽提方法得到总RNA，再使用Ambion公司的mirVana miRNA isolation kit(catalog#1560)试剂盒对样品进行纯化，去除占总RNA主要成分的较大片段，留下包括miRNA在内的小片段部分。具体纯化步骤详见试剂盒使用手册。miRNA芯片检测按常规方法进行。

4.生物信息学分析：由于microRNA也是通过基因芯片的手段进行研究，所以将两者并列说明。首先，采用的芯片是Affymetrix U133 Plus 2.0array，这种芯片是目前同类产品中覆盖基因数目最多的一种：在一张芯片上，覆盖了47,000个转录本，代表38,500个明晰的人类基因，来自下列公共数据库GenBank，dbEST，and RefSeq.其中的6,500个更新的基因来自最新的数据库：Build 159 of the UniGene database(2003年1月25日)。U133主要适用于研究基因的表达情况并了解基因发挥功能的网络。包括：1)基因表达的组织特异性和细胞特异性；2)诱导基因表达谱研究；3)基因表达分化和4)肿瘤表达谱研究。在基因芯片的结果中，采用T-Test的方法来检验数据间的显著性差异以求得其可信度，而用不同年龄阶段的数据两两相比的方法来求得某些蛋白质的表达是否具有年龄特异性，使用cluster3.0程序来进行聚类分析。

5.Northern blotting分析：使用Trizol抽提培养细胞或组织的总RNA，定量并质检。取30-50ug总RNA进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为15％。电泳结束后进行电转膜，将样品转至带正电荷的尼龙膜上。将所要检测的miRNA对应的探针用同位素进行末端标记，并在适宜条件下与膜进行杂交。杂交完成后进行压片扫描。再以U6基因的探针与膜进行杂交，得到U6的杂交信号，并以此作为上样量的衡量标准。最后使用成像系统读出杂交信号的强度，比较各组不同的样品间的差异。

6.qPCR检测方法：miRNA的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取50-100ng总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。U6基因作为内照对miRNA qPCR检测结果进行标准化校正。对于预测中的目标基因的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取3ug总RNA为模板，以随机寡核苷酸为引物，使用invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以eDNA为模板，使用针对目标基因的特异引物及Takara的SYBR(R)Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系，在stratagenMX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。同时测定待测样品中的看家基因(如：B-actin、GAPDH)的Ct值，以此来校正各组样品之间上样量差别，将所得数据标准化后进行比较各组之间目的基因的变化(即相对定量法)。

7.细胞培养：(1)原代神经元培养取孕18-19天的SD大鼠，引臼脱颈处死，碘酒、乙醇消毒腹部，逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜，取出子宫，仔细剥离胎膜羊膜，暴露胎鼠，体视显微镜下剥离脑膜，分离胎鼠大脑皮质，剪碎，经含0.125mg/L的胰酶消化15min，含10％胎牛血清的DMEM终止消化，过200目铜筛，900r/min离心7min，弃上清，以完全培养液(10％胎牛血清，青、链霉素100000U/L)稀释至5×105/ml密度并接种于经多聚赖氨酸包被过的12孔板，5％CO2，37℃下培养24h后，更换培养基为NeuroBasal+B27，每隔3天半量换液。培养8d后转染miRNA，24小时后加入Aβ25-35片断，于体外培养的第11d收细胞。(2)细胞株培养：恶性胶质瘤细胞TJ905(由天津医科大学总医院神经外科馈赠)培养在含10％FBS(兰州民海)的高糖DMEM培养基中，人胶质母细胞瘤U251MG(购自上海中科院细胞库)培养在含10％FBS(兰州民海)的RPMI1640培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，2天传代一次。人胶质母细胞瘤SHG-44(购自上海中科院细胞库)培养在含10％FBS(兰州民海)的RPMI1640培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，2天传代一次。人神经母细胞瘤SH-SY5Y(ATCC号：购自上海中科院细胞库)培养在含15％FBS(兰州民海)的MEM-F12培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，3-4天传代一次。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(ATCC号：HTB-26)，培养在含10％FBS(兰州民海)的高糖DMEM培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，每天传代一次。人乳腺癌细胞株MDA-MB-435(ATCC号：)，培养在含10％FBS(兰州民海)的高糖DMEM培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，隔天传代一次。人乳腺癌细胞株MDA-MB-453(ATCC号：)，培养在含10％FBS(兰州民海)的高糖DMEM培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，隔天传代一次。高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97-H(L)细胞(购自上海复旦大学医学院中山医院肝癌研究所)培养在含10％FBS(PAA)的高糖DMEM培养基中、肝癌细胞HepG2(ATCC号：HB-8065，购自上海中科院细胞库)培养在含10％FBS(PAA)的MEM培养基中，肝癌细胞SMMC-7721(购自上海中科院细胞库)培养在含10％FBS(兰州民海)的高糖DMEM培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，3-4天传代一次。

8.细胞转染：甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成，microRNA前体购自美国Ambion公司(Ambion Pre-mir^TM miRNAprecursor CaU No.17100)，转染共设正常对照组，miRNA前体组，miRNA反义链组(anti sense)，miRNA碱基错配序列组(scramble)和miRNA通用阴性对照组(EGFP)。细胞于铺板18-24h后至70％-80％融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen)。转染按本室常规方法并参照说明书进行。寡核苷酸的工作浓度均为50nmol/L。DDR1 siRNA组和siRNA通用阴性对照组(Negative)。细胞于铺板18-24h后至70％-80％融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen).具体转染方法参照说明书进行，寡核苷酸及siRNA的工作浓度均为50nmol/L。细胞转染所用的核苷酸序列见表2。

表2.细胞转染所用核苷酸序列表

miRNA	Sequence 5’-3’
		antisense mir34a	AACAACCAGCUAAGACACUGCCA
scrambled mir34a	UAAGAACGCCUGAACACACCAAC
		antisense mir146b	AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA
scrambled mir146b	CAUGUGUAAUCUAAGACCUUCG
		antisense hsa-mir331	UUCUAGGAUAGGCCCAGGGGC
scrambled hsa-mir331	GCCUGCGGUCCGAGAAUGUGA
		antisense hsa-mir191	AGCUGCUUUUGGGAUUCCGUUG
scrambled hsa-mir191	CCGUGUUCGGAUUGCUUUGGUA
		antisense hsa-mir210	UCAGCCGCUGUCACACGCACAG
scrambled hsa-mir210	AGAACGCGCUAUCUCGCACGCC
		antisense hsa-mir145	AAGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC
scrambled hsa-mir145	GUAGGAUAGCUAACGCAAGCGAUG
		EGFP antisense	ACGGCAAGCUGACCCUGAAGU

9.细胞迁移实验：取无菌12孔板，恶性胶质瘤细胞TJ905培养在含10％FBS的高糖DMEM培养基中，人胶质母细胞瘤U251MG培养在含10％FBS的RPMI1640培养基中，置37℃培养箱、5％CO2，2天传代一次。转染miRNA 24h后，用200ul吸头划出两条十字交叉细胞刮除带。转染miRNA 48h后开始观察记录实验结果。

10.细胞内游离钙离子浓度检测：原代神经元培养如前述。11d收细胞时，PBS洗细胞后0.125％胰酶消化，终止消化后离心(2000rpm，4分钟)，重复离心洗1次，将细胞悬浮于1ml Hepes缓冲的HANKS+BSA液中，使细胞数为0.5～1×106-107/ml。加入0.5mmol/L Fura-2/AM 10μl(使Fura-2/AM浓度为5μmmol/L)，37℃振荡温育45分钟。离心，Hepes缓冲的HANKS buffer(含0.2％BSA)洗两次。样品上机检测，分别检测340、380两个波长处的值。加入10％Tritonx-100使终浓度是0.1％，充分破坏细胞后再次检测340、380两个波长处的值。加入EGTA，使终浓度是5mmol/L，与钙充分结合后检测340、380两个波长处的值。通过公式：[钙离子]i＝kd(FD/FS)*(R-Rmin/amax-R)计算得细胞内游离钙离子浓度。(注：R是实验观察到的荧光比值(F340/F380)，KD是fura-2与钙反应的解离常数，生理条件下KD为224hmol/L，Rmax是fura-2全部为钙饱和时的荧光比值，Rmin是fura-2完全未结合钙时的荧光比值，FD和FS分别代表无钙和钙饱和状态下380nm处的荧光强度。

11.MTT细胞活性检测实验：将细胞以密度接种于96孔细胞培养板中，培养12小时后转染miRNA寡核苷酸，miRNA转染终浓度为50nm/L。转染48小时后在每孔的培养基中加入10ul浓度为5mg/ml的MTT储存液，使终浓度达到0.5mg/ml。37℃孵育4小时，吸去上清，每孔加入100ul DMSO，摇床上摇8分钟，直到所有结晶彻底溶于DMSO中。570nm波长读OD值。

12.Caspase-3/7酶活性检测：将细胞接种于96孔板中，培养，进行转染实验，培养48小时。采用Apo-ONE^TM Homogeneous Caspase-3/7 kit(Promega Cat No.G7790)试剂盒，按说明书操作。将caspase底物和Apo-ONE^TM caspase3/7 buffer混合，配成Apo-ONE^TM试剂。按Apo-ONE^TM试剂和培养基体积比为1∶1的比例加入Apo-ONE^TM试剂，300rpm-500rpm摇至少30秒，使Apo-ONE^TM试剂和培养基充分混匀。使用荧光分光光度计在激发波长485±20nm和发射波长530±25nm条件下读取OD值。Caspase3酶活性检测也可利用化学发光法(Calbiochem，Cat No.235400)的活性。细胞计数，收集培养细胞，PBS洗两遍。加适量裂解缓冲液，液氮/37℃反复冻融三次，每次5分钟。10,000xg，4℃离心10分钟。吸取上清备用。准备caspase3底物溶液(2mM，Calbiochem，Cat No.235400))，caspase3抑制剂溶液(500nM)，按照如下表格的量向96孔板中加入样品，按说明书操作。、37℃预热酶标板，加入细胞裂解液和caspase3抑制剂，置于37℃孵育10分钟。加入10ul caspase3底物开始反应，0.5-2小时后在405nm下测OD值。

13.蛋白质印迹分析：在样品中加入裂解液，置于液氮中反复冻融数次后，再超声彻底破碎样品，离心分离出蛋白质，对取得的蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，煮沸3-5分钟后，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流20mA。待前沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行转膜。将样品转至膜上后，再与所要研究的蛋白的单抗共同孵育，最终进行显色，得到印迹信号。同时以beta-actin为参照，对信号进行标准化校正，之后在成像系统中读出信号密度，进行进一步的分析。

研究结果发现miRNA-34a具有拮抗Aβ诱导的神经元凋亡作用，作用的机制与其抑制CAPN6和CASP2的活性相关。

Claims (2)

 1.miRNA-34a作为制备治疗神经退行性疾病的药物的应用。

2.miRNA-34a作为制备治疗脑肿瘤的药物的应用。

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