CN104098666B - 一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小菜蛾抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用。所述小菜蛾抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明的小菜蛾抗菌肽，对多种细菌均具有抑杀作用，能用于制备抗感染药物；对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞具有极显著的生长抑制作用，具有明显的体外抗肿瘤活性，能用于制备抗肿瘤药物；能促使CD4T细胞的增殖、促进其分泌IFNγ，同时能抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，具备免疫促进活性，能用于制备免疫促进剂；用作饲料添加剂可显著提高仔猪的存活率，降低仔猪和育肥猪的腹泻率，提高仔猪和育肥猪的日增重，降低仔猪和育肥猪的料肉比。

Description

一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂 和饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptide)是一类在一定诱导条件下，由宿主细胞特定编码基因产生的、对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽类的总称，具有广谱的抗菌、抗病毒作用，是天然免疫系统的组成部分。

抗菌肽具有分子量小、稳定性高、无免疫原性等特点。部分抗菌肽具在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性；同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。

1975年瑞典科学家G.Boman等人(Steinerhd et al.Nature,1981,292:246-248.)从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)的蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。此后许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。其后的抗菌肽研究，早期主要集中在大型的经济昆虫来源的抗菌肽、其后又扩展到来源于一些小型昆虫、无脊椎动物及脊椎动物(特别是两栖动物)乃至哺乳动物的抗菌肽；另外，细菌和植物来源的抗菌肽也一直是研究的热点。

已报道的抗菌肽除了具有广谱的抗菌、抗病毒作用外，还对部分原虫具备杀灭作用；更为令人感兴趣的是，一些抗菌肽对癌细胞具有强有力的杀伤作用，有些抗菌肽还具有免疫刺激功能。广袤自然界中还有更多具备强大功能的抗菌肽有待挖掘。

抗菌肽中最大的一类阳离子抗菌肽，其作用机理是破坏细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡，而不是作用于某个靶点酶或者受体。所以在应用上，抗菌肽还具有传统抗生素无法比拟的优越性，即不会诱导抗药菌株的产生。

鉴于抗菌肽的这些特点和功能，长期以来，许多科学家和技术人员致力于抗菌肽应用于抗菌药物、抗肿瘤药物、动物保健品和饲料添加剂等方面的研究和开发。

但是，抗菌肽的天然产量低，天然提取步骤复杂、产率低；而化学合成则价格相当昂贵；所以利用基因工程技术生产抗菌肽，是抗菌肽开发利用产业化的必由之路，具有重要意义。而抗菌肽分子量小，重组表达时mRNA稳定性差，而且抗菌肽本身对某些工程菌就具有抑杀作用，所以，如何构建高表达工程菌也是个关键问题。

发明内容

本发明提供了一种抗菌肽基因，该基因表达的抗菌肽抗菌谱广，具有多种生物活性。

一种抗菌肽基因，碱基序列如SEQ ID.No.1所示。该抗菌肽基因pxCA1是通过以下方法分离获得的：

(1)将小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫饲养至4～7日龄，以针蘸取培养至对数期的大肠杆菌对小菜蛾腹部进行穿刺接种，继续饲养24h后提取幼虫总RNA；

(2)对总RNA进行逆转录，获得cDNA；

(3)以所述cDNA为模板，设计引物进行PCR，即获得所述小菜蛾抗菌肽基因；

所述引物的碱基序列为：

上游引物：5’-ATGAAACTGTCAAATATTTTCTTTTTC-3’；

下游引物：5’-CTATTTCCCGGCAGGTCTAGCG-3’。

所述抗菌肽基因经转录、翻译后得到的全长肽段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该全长肽段中，第1～22位氨基酸为信号肽，第23～24位氨基酸在翻译后被切除，第25～65位氨基酸为成熟肽，即为本发明所述抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

为实现所述抗菌肽的大量表达，本发明对所述抗菌肽基因编码序列进行了密码子优化，人工合成获得了编码所述抗菌肽的基因，以适应具有不同密码子偏好的工程菌。

本发明提供了两种编码抗菌肽的基因，其碱基序列分别如SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示；SEQ ID No.4所示的基因适合在大肠杆菌中表达，SEQ ID No.5所示的基因适合在酵母中表达。

本发明还提供了含有所述基因的重组表达载体，以及含有所述重组表达载体的重组工程菌。

本发明提供了两种重组工程菌，其中，重组工程菌A的出发菌株为大肠杆菌，所述基因的碱基序列如SEQ ID No.4所示；重组工程菌B的出发菌株为酵母菌，所述基因的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

由于所述抗菌肽对大肠杆菌具有较强的抑杀作用，以大肠杆菌作出发菌株时，要选择适当的表达载体。试验发现，采用pET32a质粒构建重组表达载体时，抗菌肽能实现融合蛋白形式的可溶性表达；而采用pET22b质粒构建重组表达载体时，抗菌肽在大肠杆菌中单独表达，不仅会抑制大肠杆菌的生长甚至引发菌体自溶，导致实际表达量极低，实际应用价值不大。

当以酵母菌作出发菌株时，优选采用pGAPZαA质粒构建重组表达载体。pGAPZαA质粒含丙酮酸激酶强启动子，能够启动插入基因的组成型表达，不需要甲醇诱导，表达产物随菌体增殖而自然累积并分泌至胞外，发酵上清不含有毒物质甲醇，可直接作为饲料添加剂加以利用。

本发明所述抗菌肽可采用以下方法制备：

(i)将重组工程菌A活化后接种至大肠杆菌发酵培养液中，发酵至OD₆₀₀为0.5以上后加入IPTG诱导表达；

所述大肠杆菌发酵培养液可选用M9补料培养基，IPTG的终浓度为0.2～1mM，于37℃下诱导表达3～4h(OD₆₀₀达1.5以上)；

(ii)收集菌体并对其进行超声破碎，离心收集上清液，过镍柱亲和层析获得融合蛋白，融合蛋白经肠激酶剪切后再过镍柱，获得初步纯化的抗菌肽原液；进一步过阳离子交换柱，即可获得纯化的抗菌肽原液；

或者，采用以下方法制备：

将重组工程菌B活化后接种至酵母发酵培养液中，发酵后收集发酵上清液；所述酵母菌优选为毕赤酵母，所述酵母发酵培养液可选用YPD培养基或无机盐甘油培养基，发酵条件优选为在30℃下培养72～120h；

所述发酵上清液中杂蛋白含量极少，因此可直接视为抗菌肽原液。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用，以及利用所述抗菌肽原液制备的饲料添加剂。

本发明中，可将所述抗菌肽原液与淀粉混合，获得所述饲料添加剂。当利用重组工程菌B来制备时，可直接取发酵上清液与淀粉混匀，获得所述饲料添加剂。因抗菌肽在pGAPZαA质粒的丙酮酸激酶强启动子作用下，能够实现组成型表达，不需要甲醇诱导，表达产物随菌体增殖而自然累积并分泌至胞外，发酵上清液不含有毒物质甲醇，可直接用于制备饲料添加剂。并且酵母菌本身或其分泌物质中也含有丰富的营养物质，也可直接用于饲喂动物。

本发明还提供了含有所述饲料添加剂的猪饲料，所述猪饲料是在猪基础日粮中添加0.1～2.0％的饲料添加剂而获得的。

利用所述猪饲料对断奶仔猪和育肥猪分别进行饲喂试验，试验结果表明，本发明的抗菌肽能够显著提高仔猪的存活率，腹泻率与对照组相比降低了7倍以上，死亡率降低到0％，仔猪日增重的提高和料肉比的降低，均达到差异显著水平。本发明的抗菌肽能够显著降低各种致病菌引起的育肥猪腹泻，同时对其他疾病也有预防作用，酵母表达抗菌肽的组死淘率显著低于对照，对各种致病菌引起的腹泻的保护率达到95％-100％，达到0死亡；育肥猪日增重的提高和料肉比的降低也均达到差异显著水平。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备抗感染药物中的应用。

试验发现，本发明的抗菌肽抗菌谱广、活性高，对包括抗生素抗性菌在内的多种细菌均具有抑杀作用；抗菌肽为20μg/ml时，大肠杆菌和甲氧西林抗性菌的存活率均为零。由此可见，本发明抗菌肽具有明显的抗菌活性，能用于抗感染药物的制备。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

试验发现，本发明的抗菌肽还对四种癌细胞具有显著的生长抑制作用，并呈现出明显的剂量依赖性，IC₅₀在0.19至0.86μM之间，抑制效果远超过阳性对照药物顺铂；与文献报道的其它抗菌肽(IC₅₀为几至几十μM)比较(高洁等,抗菌肽的抗肿瘤作用研究新进展，世界临床药物,2012,33:620)，则呈一至两个数量级的提高。由此可见，本发明抗菌肽具有明显的体外抗肿瘤活性，能用于抗肿瘤药物的制备。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备免疫促进剂中的应用。

试验发现，本发明的抗菌肽能够激活小鼠机体免疫系统，促使CD4T细胞的增殖、促进其分泌IFNγ，同时能抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，进而显著改善小鼠的适应型细胞介导的免疫功能。提示本发明的抗菌肽具备免疫促进活性，可用于免疫促进剂的制备。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明从小菜蛾中扩增得到全新的抗菌肽基因，其合成并分泌的抗菌肽对包括抗生素抗性菌在内的多种细菌均具有抑杀作用，由于其为纯生物制剂，不易诱导产生抗药性，因此可用于开发多肽类抗菌药物；

(2)本发明的抗菌肽具有明显的体外抗肿瘤活性，对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞具有显著的生长抑制作用，抗肿瘤活性远高于其它的抗菌肽，能用于抗肿瘤药物的制备；

(3)本发明的抗菌肽能促使CD4T细胞的增殖、促进其分泌IFNγ，同时能抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，具备免疫促进活性，可用于免疫促进剂的制备；

(4)本发明的抗菌肽用作饲料添加剂可显著提高仔猪的存活率，降低仔猪和育肥猪的腹泻率，提高仔猪和育肥猪的日增重，降低仔猪和育肥猪的料肉比。

附图说明

图1为pxCA1基因PCR扩增电泳检测图；其中，M表示DNA分子量标准(100bp，Thermo，GeneRuler)，泳道1为pxCA1基因；

图2为本发明的抗菌肽全长序列与现有小菜蛾抗菌肽序列的比对图；其中，7-BAF36816.seq、2-ADD17414.seq、3-ADC54851.seq、4-ADA13281.seq、5-ACX31606.seq、6-BAF64473.seq表示六个现有小菜蛾抗菌肽的氨基酸序列，1-专利.seq表示本发明的抗菌肽全长序列，consensus表示本发明的抗菌肽全长序列与所列六个小菜蛾抗菌肽氨基酸序列的同源碱基；

图3为工程菌株pET32a-pxCA1/BL21(DE3)诱导表达的SDS-PAGE图；其中，M表示蛋白质分子量标准，泳道1为未加IPTG诱导获得的上清，泳道2为37℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的上清，泳道3为28℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的上清，泳道4为16℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的上清，泳道5为37℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的沉淀，泳道6为28℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的沉淀，泳道7为16℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的沉淀；

图4为Trx-His6-EK-pxCA1融合蛋白经Ni2-IDA纯化过程图；其中，M表示蛋白质分子量标准，泳道1为37℃、IPTG诱导并破碎菌体获得的上清，泳道2为过柱流穿液；泳道3为Binding Buffer淋洗液；泳道4为60mM咪唑漂洗液；泳道5～9为250mM咪唑洗脱液；

图5为利用肠激酶对Trx-His6-EK-pxCA1融合蛋白进行酶切、纯化的效果图；其中，泳道1、3为酶切0h；泳道2、4为酶切16h(温度分别为15℃和37℃)；泳道5为超低分子量蛋白Marker；泳道6为空泳道，未上样；泳道7为剪切物镍柱纯化后初步纯化抗菌肽原液；泳道8为镍柱纯化后继之以阳离子交换纯化的pxCA1抗菌肽原液。

图6为pxCA1抗菌肽的杀菌活性检测结果图；其中，E.coli K12D31表示大肠杆菌K12D31，MRSA5636表示甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌5636；

图7为pxCA1抗菌肽的透明圈法抑菌(金黄色葡萄球菌)效果图；其中，1为大肠杆菌表达提取的抗菌肽原液(5μg/ml)，2为毕赤酵母表达的抗菌肽原液(5μg/ml)，3为生理盐水，4为氨苄青霉素(1μg/ml)，5为氨苄青霉素(10μg/ml)，6为PBS。

图8为酵母工程菌株X33/pGAPZαA-pxCA1发酵液的Tricine-SDS-PAGE检测结果图；其中，泳道1为超低分子量蛋白Marker；泳道2～3分别为2个不同转化子发酵96h的发酵液；泳道4为出发菌株X33发酵96h的发酵液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1.小菜蛾抗菌肽pxCA1的基因克隆

1.1小菜蛾幼虫的感染免疫

分离小菜蛾幼虫并人工饲养至4～7日龄，以针蘸取培养至对数期的大肠杆菌JM109对小菜蛾腹部进行应激穿刺，继续饲养24h后，提取幼虫总RNA。

1.2总RNA的提取

①将组织标本在-80℃预冷的小研磨中碾碎，往研磨中加入Trizol试剂，每50～100mg组织加入1ml TRIzol试剂(组织块体积不要超过TRIzol体积的10％)，充分将组织研磨成匀浆；用移液枪将匀浆液吸入到1.5ml的EP管，冰上放置5min。

②待核酸和蛋白充分解离后，向每1ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震摇15s，然后室温静置2～3min，最后于4℃中12000rpm离心5min。

③取上层水相于新的1.5ml的EP管，按每1ml TRIZol液加1.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，轻轻振荡混匀，于4℃中12000rpm离心10min。

④弃上清液，按每1ml TRIzol加至少1ml的比例加入70％乙醇(DEPC水配制)，用移液枪混匀，于4℃中12000rpm离心5min。

⑤弃去上清液，用移液枪小心吸去管壁上残液，室温或真空干燥10min，加入50μLRnase Free水充分溶解即得。

1.3逆转录合成cDNA

使用杭州宝赛公司的逆转录试剂盒，对实施例1获得的总RNA进行逆转录，获取cDNA。

逆转录反应体系见表1：

表1

组分	体积
		5×firt-stand Buffer	4μl

Oligo(dT)12-18Primer(50μM)	1μl
		10mM dNTP	1μl
RNase Inhibitor(40U/μl)	1μl
		M-MLV(200U/μl)	1μl
Total RNA	0.1-2μl
		DEPC H2O	Up to20μl

逆转录反应程序：42℃温浴55min；80℃加热10min终止反应，置冰上进行后续试验或冷冻保存。

1.4pxCA1基因的扩增、克隆和序列测定

根据NCBI上已登录的小菜蛾抗菌肽家族基因序列，综合分析后设计一对PCR引物：

P1：5’-ATGAAACTGTCAAATATTTTCTTTTTC-3’(SEQ ID No.6)；

P2：5’-CTATTTCCCGGCAGGTCTAGCG-3’(SEQ ID No.7)；

以上述cDNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系见表2：

表2

组分	体积
		10×PCR Buffer	2μl
MgCl2(25mM)	1.2μl
		10mM dNTP mix	0.4μl
10μM引物P1	0.4μl
		10μM引物P2	0.4μl
Tag DNA polymerase(5U/μl)	0.4μl
		cDNA	2μl
灭菌ddH2O	Up to20μl

PCR扩增程序：

95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，30cycles；72℃7min。

PCR完成后，对PCR产物进行凝胶电泳分析(图1)，并利用BioTECH公司的多功能DNA回收Kit回收PCR片段；将回收的PCR片段经TA克隆至PMD-18T Vector，CaCl₂法转化DH5α。转化子经PCR鉴定正确后送上海生工生物工程有限公司测序，获得抗菌肽基因(pxCA1基因)的碱基序列如SEQ ID No.1所示，其编码的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

用关键词Plutella xylostella cecropin检索Genebank protein序列库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/？term＝Plutella+xylostella+cecropin)，库中收载有6个小菜蛾抗菌肽全长序列(GenBank登录号分别为：BAF36816、ADD17414、ADC54851、ADA13281、ACX31606、BAF64473)，将这6个小菜蛾抗菌肽全长序列与SEQ ID No.2用DNAMAN分析软件进行比对(见图2)，发现SEQ ID No.2为全新的分子。

实施例2小菜蛾抗菌肽pxCA1在原核中的表达和提取

2.1基因工程融合抗菌肽原核表达工程菌的构建及诱导表达

根据在线信号肽预测server的分析并参考cecropin家族抗菌肽翻译后修饰的文献，去除pxCA1基因表达的全长肽段(SEQ ID No.2)中信号肽及N端非成熟肽部分的氨基酸，对成熟肽(25-65位氨基酸)(SEQ ID No.3)的编码序列进行密码子优化，合成如SEQ IDNo.4所示的适合在大肠杆菌中表达的编码基因。

将该编码基因构建至pET32a质粒中，上下游克隆位点为KpnI/XhoI，并在抗菌肽N端引入肠激酶切割位点(DDDDK▼)，形成Trx-His6-EK-pxCA1融合形式，测序鉴定后获得pET32a-pxCA1表达载体。

将上述表达质粒以Cacl₂法(参照《基因克隆》)转化大肠杆菌BL21(DE3)，经双酶切及PCR鉴定后筛选出阳性转化子，即为本发明设计的能够表达融合蛋白Trx-His6-EK-pxCA1的基因工程菌株。

从Amp抗性LB平板挑取阳性转化子的单克隆于4ml含Amp的LB液体培养基中过夜培养；过夜培养的菌液以1:100加入新鲜培养基后，37℃培养至OD₆₀₀≈0.5，加入IPTG至终浓度1mM，37℃诱导培养至OD₆₀₀≈1.5，离心收集菌体，以破菌Break buffer1(20mM Tris-Hcl，300mM Nacl，1mM EDTA，pH8.0)重悬，并用超声波破碎细胞，离心后分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测融合抗菌肽的表达情况(图3)。

2.2原核表达基因工程菌株的发酵及抗菌肽pxCA1的制备

2.2.1发酵

将上述OD600≈0.5的菌液接种至M9补料培养基，M9补料培养基的组分及配比见表3：

表3

M9(补料)培养基	1000mL
		Na2HPO4·12H2O	17.3g
KH2PO4	3g
		NaCl	0.5g
NH4Cl	1g
		酵母粉	4g
蛋白胨	6g
		葡萄糖	5g

加入终浓度为0.2～1mM的IPTG，37℃诱导表达3.5h。离心收获菌体以Breakbuffer1(20mM Tris-Hcl，300mM Nacl，1％TritonX100，1mM EDTA，pH8.0)重悬，并超声破碎菌体，离心获得发酵上清液。

2.2.2融合蛋白Ni²⁺柱亲和纯化

利用0.45μm滤膜对发酵上清液进行过滤，并调整样品中咪唑浓度至40mM，以0.5ml/min流速将发酵上清液缓慢通过亲和层析柱，以8倍柱体积的Bingding Buffer、3ml/min流速淋洗填料，以含60mM浓度咪唑的Bingding Buffer漂洗填料，以去除杂蛋白；以250mM咪唑洗脱目的蛋白，纯化过程中各洗脱液的电泳结果见图4。

2.2.3融合蛋白Trx-His6-EK-pxCA1肠激酶切割及再分离：

将经Ni²⁺柱纯化后的Trx-His6-EK-pxCA1融合蛋白液用肠激酶酶切缓冲液CB(20mMTris-Hcl，50mM Nacl，2mM Cacl₂，pH8.0)进行透析，调整蛋白浓度至1.0～1.5mg/ml，根据预实验确定的肠激酶酶切体系如表2所示、酶切条件为15℃反应16小时。

表4 融合抗菌肽肠激酶酶切体系

pH	8.0
		10×CB buffer	10μl
重组牛肠激酶(rEK)	0.1U
		融合抗菌肽(5μg/μl)	10μl
Add H2O up to	100μl

将酶切反应液再次过Ni²⁺柱，收集流穿液，即为初步纯化的抗菌肽原液；进一步再经阳离子柱(CM Sepharose)纯化，可获电泳纯及抗菌肽原液(图5)。

实施例3.pxCA1抗菌肽最小抗菌浓度的测定(MTT法)

将大肠杆菌(K12D31)、金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、铜绿单胞菌(CMCC10104)、枯草芽孢杆菌(CMCC63501)及甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA5636)用LB液体培养至OD₆₃₀＝0.6，并用LB分别稀释到10⁵-2×10⁵CFU/ml。

将纯化浓缩后的pxCA1抗菌肽溶液以LB倍比稀释，每个稀释度的抗菌肽溶液取10μl、与90μl稀释后的细菌悬液混合培养；37℃培养6h以后，从混合培养液中分别取20μl加到96孔板；再向每孔中加入10μl的MTT，37℃温育1小时后，每孔加入90μl DMSO溶解孔内形成的不溶物，并于酶标仪570nm处每孔吸光度。之后每隔2小时重复取样20μl混合培养液，MTT染色测定吸光度。

pxCA1抗菌肽对不同细菌的MIC值如表5所示。

表5 pxCA1抗菌肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

受试菌	MIC(μg/ml)
		大肠杆菌(K12D31)	5.0
铜绿假单胞菌(CMCC10104)	5.0

甲氧西林抗性菌(MRSA5636)	10.0
		金黄色葡萄球菌(CMCC26003)	10.0
枯草芽孢杆菌(CMCC63501)	15.0

由表5可见，pxCA1抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌以及耐药菌均具有显著的抑杀效果。

平板透明圈法试验，也可以直观地观察到本发明所提供的pxCA1抗菌肽具有明显的抑菌效果(图7)。

实施例4.pxCA1抗菌肽杀菌活性的测定

将大肠杆菌K12D31和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA5636在液体LB培养基中培养至对数期，用LB液体将菌液稀释1000倍，取200μl用LB倍比稀释的不同浓度pxCA1溶液分别与200μl上述两种稀释菌液混合，37℃孵育2h。

取100μl温育后的混合菌液涂布到LB平板，设置不含抗菌肽的菌液液为阳性对照，含抗菌肽不含菌液的为阴性对照，37℃过夜培养。次日，对不同抗菌肽浓度平板上的菌落进行计数，并绘制抗菌肽浓度与菌存活率关系图(图6)。

由图6可见，pxCA1抗菌肽为20μg/ml时，大肠杆菌K12D31和MRSA5636的存活率均为0。

实施例5pxCA1抗菌肽体外抗肿瘤活性

5.1细胞复苏和培养

选择宫颈癌癌细胞株(Hela)、肝癌细胞(BEL-7721)、结肠癌细胞株(HCT-116)、肺癌细胞(A549)为研究对象，从超低温冰箱中取冻存的肿瘤细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心3min，收集细胞。然后以含10％小牛血清的RPMI1640培养基重悬后转入培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。RPMI1640培养基和小牛血清均为Gibco公司产品。

5.2细胞生长抑制试验

细胞贴壁增殖至80％以上，用胰酶消化液(含0.02％EDTA)消化，用培养基稀释至细胞密度为1×10⁵/ml，100ul/孔接种于96孔板中。待96孔板中的细胞贴壁后，阴性对照组加入100μl/孔的培养基，阳性对照组加入含有6μg/ml顺铂(齐鲁制药产品，10mg注射用冻干制剂)的培养基，实验组每孔分别加入100μl含不同浓度(μg/ml)的pxCA1抗菌肽原液的培养基，各设5个复孔；细胞在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；每孔加入50μl(5mg/ml)MTT(噻唑蓝)溶液于培养箱内避光继续培养4h；然后吸去培养液，加入150μl DMSO，轻微震荡30秒，用酶标仪于490nm测定OD值，计算细胞存活率：

细胞抑制率(％)＝[100-(实验组或阳性对照组A490/阴性对照A490)×100]；实验结果见表6。

表6 不同浓度pxCA1抗菌肽对肿瘤细胞的生长抑制率(n＝5,％)

实验组别	BEL-7721	HCT-116	Hela	A549
					阴性对照组	0	0	0	0
阳性对照组	53.57±4.74	35.32±1.98	39.85±2.89	55.50±2.95
					1.0μg/ml	-0.28±3.76	45.47±1.72	18.16±2.79	23.75±3.70
2.0μg/ml	82.71±4.01	79.10±1.50	65.91±4.34	36.11±2.24
					4.0μg/ml	94.59±4.52	94.75±2.40	92.66±4.54	94.38±3.31
8.0μg/ml	94.67±6.82	95.19±1.72	95.19±5.23	94.66±3.63
					16.0μg/ml	96.79±5.13	98.78±4.56	96.78±6.44	95.81±3.21
IC50(μM)	0.86	0.19	0.36	0.39

注：抗菌肽pxCA1分子量为4418Dalton.

由表6可见，抗菌肽pxCA1对几种肿瘤细胞均有显著的生长抑制作用，呈现出明显的剂量依赖性，且抑制效果远远强于等剂量的阳性对照药物顺铂，也远远超过文献报道的其它抗菌肽(IC₅₀为几至几十μM)(高洁等,抗菌肽的抗肿瘤作用研究新进展，世界临床药物,2012,33:620)。

试验结果揭示，本发明提供的pxCA1抗菌肽具有明显的体外抗肿瘤活性，能用于抗肿瘤药物的制备。

实施例6pxCA1抗菌肽体内免疫活性

取上述制备的pxCA1抗菌肽溶液，用注射用生理盐水稀释配制成20、50、100μg/ml的溶液。取体重18～20g的C57小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司)，雌雄各半，随机分组和对照组，每组10只。每只小鼠隔日大腿内侧肌肉注射20μg/ml(低剂量组)、50μg/ml(中剂量组)、100μg/ml(高剂量组)的pxCA1抗菌肽溶液0.5ml，对照组隔日注射生理盐水，共注射7次。注射完成后两周，逐组处死动物，摘取脾脏，取脾细胞，测定相关免疫学指标；具体步骤如下：

1)分离的小鼠脾脏，100目金属网研磨，得到单细胞悬液1500rmp离心去上清，红细胞裂解液(Yeasen，USA)裂解，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为10⁷/ml，培养于完全RPMI1640(Hyclone)培养基中。

2)加入刺激剂PMA(佛波酯)，离子霉素(Ionomycin)以及蛋白转运抑制剂莫能霉素(Monensin)至终浓度分别为30ng/ml、1μg/ml、1.7μg/ml。37℃CO₂刺激培养4小时。

3)收获细胞于EP管中，100μl/管，PBS缓冲液洗两遍，小鼠脾细胞重悬于100μl PBS缓冲液中并加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置30min以封闭细胞表面Fc段受体，然后加入抗-CD3，-CD4，-CD8，-NK1.1，-γδ的抗体，4℃避光染色30min，用PBA洗三次，加入100μl固定液，4℃避光固定30min。

4)用穿膜液洗一次，重悬于100μl穿膜液中，加入新鲜大鼠血清或者大鼠IgG放置封闭30min后，分别加入PE标记抗胞内因子抗体(抗-IL-4和-IFNγ)，染色1小时。穿膜液和PBS各洗一遍后重悬于PBA中，用流式细胞仪检测。

上述个步骤中所用的各种抗体和标记物等试剂，均为美国Santa Cruz公司产品。免疫学指标测定结果如表7所示。

表7 pxCA1抗菌肽对小鼠免疫学指标的影响(n＝10)

组别	对照组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
					CD3	35.60±2.33	36.82±3.74	38.35±2.87	40.96±1.89a

CD4	18.37±2.27	22.56±1.92a	25.79±1.87b	24.24±1.11b
					γδT	0.24±0.05	0.295±0.05b	0.316±0.04b	0.297±0.01b
NKT	0.89±0.23	0.91±0.43	0.78±0.32	0.87±0.54
					NK	4.67±1.16	3.93±1.52	4.84±1.21	4.74±1.40
CD4IFNγ	1.58±0.37	2.47±0.51a	3.24±0.43b	3.58±0.47b
					CD4IL-4	0.49±0.20	0.42±0.31	0.31±0.26a	0.34±0.51a

注：a、b分别表示与对照组相比各免疫学指标的差异显著性(P<0.05,P<0.01)。

由表7可见，连续7次隔日注射pxCA1抗菌肽后，高剂量组小鼠体内CD3细胞比例显著增加，而CD4细胞和γδT细胞的比例则在各个剂量组都显著增加，其中，CD4IFNγ细胞(IFN-γ阳性的CD4细胞，th1)的比例在各个剂量组中均显著升高，而CD4IL-4细胞(IL-4阳性的CD4细胞，th2)的比例则在中、高剂量组中显著降低；NK和NKT细胞略有升高但其变化无统计学差异。

结果表明，pxCA1抗菌肽能够激活机体免疫系统，促使CD4细胞的增殖，促进其分泌IFNγ同时能抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，进而显著改善小鼠的适应型细胞介导的免疫功能。提示本发明提供的pxCA1抗菌肽具备免疫促进活性，可用于药物或者保健食品的制备。

实施例7pxCA1抗菌肽毕赤酵母表达工程菌的构建

根据毕赤酵母密码子偏好性，对pxCA1成熟肽的编码序列进行密码子优化，合成如SEQ ID No.5所示的适合在毕赤酵母中表达的编码基因。

将该编码基因克隆至pGAPZαA表达载体，克隆位点为XhoI/XbaI，抗菌肽N端添加Kex2切割位点(AAAAGA，KR)，构建pGAPZαA-pxCA1酵母分泌表达载体。

将pGAPZαA-pxCA1使用AvrII线性化后，以1500V，200Ω，25μF参数电转化毕赤酵母X33，Zeocin抗性梯度进行高拷贝筛选并进行PCR鉴定，PCR鉴定所使用的引物为：

pGAP Forward：5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′(SEQ ID No.8)；

3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′(SEQ ID No.9)；

经鉴定，在2.0mg/ml Zeocin抗性平板共筛选获得2株高拷贝的X33/pGAPZαA-pxCA1重组工程菌。

将鉴定正确的X33/pGAPZαA-pxCA1菌株在YPD培养基中活化，再按1％(V/V)接种于新鲜的YPD培养基30℃表达96小时。

表达产物经超滤离心浓缩，经Tricine-SDS-PAGE检测，Bandscan软件分析表达量为每L酵母发酵上清液中含pxCA1抗菌肽约10mg左右(图8)。

在7.0L发酵规模下，可用基础盐培养基上罐发酵，连续补料，控制温度28℃、pH5.0、溶氧30％-50％，发酵72至120小时，表达量至少可提高10倍(100mg/L)。

实施例8毕赤酵母表达pxCA1抗菌肽-玉米淀粉饲料添加剂的制备

取实施例7获得的发酵上清液，按比例加入玉米淀粉充分混匀，40℃鼓风风干后粉碎，过40目筛，密封包装后低温(2-8℃)干燥处存放，可直接作为饲料添加剂使用，编号标注为P-CY1。每克玉米淀粉含抗菌肽约0.25mg。

所制备的P-CY1，2-8℃干燥处分别存放1、3、6、12个月时，随即从3个包装中取样进行稳定性试验，采用干燥失重法测定水分含量，约在15％左右，Bradford法检测其蛋白含量(碧云天公司试剂盒)，Tricine-SDS-PAGE法检测其纯度，结果如表8所示。

表8 P-CY1稳定性试验

由表8可见，所制备的P-CY1，存放于低温干燥处12个月，水分、蛋白含量均变化不大，性能稳定。

实施例9pxCA1抗菌肽-玉米淀粉添加饲料饲喂断奶仔猪

选取21日龄、体重相近的健康杜-长-大三元杂交仔猪120头，公母各半，按大小、性别相近原则随机分成6组，每组20头。

将实施例8制备的P-CY1分别按0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、和2％添加至基础日粮中，分别饲喂其中的5组仔猪，为试验组；直接以基础日粮饲喂其中的1组仔猪，为对照组；连续饲喂一个月，观察并记录试验组和对照组仔猪的生长性能和健康状况。注意饲喂食物的温度不超过40℃，添加剂和食物要充分混匀。试验结果分别见表9和表10。

表9 P-CY1饲料添加剂对仔猪存活率、腹泻的影响(n＝20)

由表9可见，本发明的饲料添加剂P-CY1可以改善断奶仔猪的健康状况，表现出了良好的抑菌防病效果，与对照组相比，试验组仔猪的死淘率和腹泻率均显著明显下降，且试验组仔猪皮肤红润，毛质柔顺有明显的光泽。

表10 P-CY1饲料添加剂对仔猪生长性能的影响

项目	期初重(kg)	期末重(kg)	日增重(g)	日采食量(g)	料肉比
						对照组	6.22±0.52	16.28±1.08	241±54	355±26	1.47±0.07
0.1％组	6.24±0.47	16.42±1.04	245±48a	355±20	1.45±0.02
						0.2％组	6.21±0.49	16.55±1.05a	251±44a	357±25	1.42±0.03a
0.5％组	6.27±0.44	16.67±1.03a	257±41b	356±25	1.38±0.07b

1.0％组	6.25±0.46	16.92±1.02a	266±42b	356±22	1.33±0.05b
						2.0％组	6.26±0.48	16.94±1.02a	269±43b	355±26	1.32±0.06b

注：a、b分别表示相同日龄内5个添加组与对照组之间生产性能指标对比的差异显著性(P<0.05,P<0.01)。

此外，由表10可以看出，试验期(21-50日龄)内，添加0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％的饲料添加剂使仔猪日增重分别提高了1.66％、4.1％、6.6％、10.4％和11.6％，料肉比分别降低了1.36％、3.40％、6.12％、9.52％和10.20％。日增重的提高和料肉比的降低，均达到差异显著水平；其中，0.5％组、1.0％组和2.0％组的日增重达到极显著水平。

本发明所制备的抗菌肽为纯化生物制剂，主要成分为氨基酸，其直接作为饲料添加剂既能发挥抗菌效果，也能作为营养物质被吸收利用及减少动物体内生物氮的流失，上述试验结果提示，本制剂能显著提高断奶仔猪的生产率，且优选添加量为0.5％。

实施例10pxCA1抗菌肽-玉米淀粉添加饲料饲喂育肥猪

本发明同时也测试了pxCA1抗菌肽作为添加剂对育肥猪的饲喂效果。按照0.5％添加至基础日粮中进行饲喂。

选取70日龄、体重相近的健康杜-长-大三元杂交仔猪60头，公母各半，按大小、性别相近原则随机分成4组，每组20头。

将实施例8所制备的含pxCA1抗菌肽的P-CY1，按0.5％比例添加至基础日粮中，分别饲喂其中的1个试验组(抗菌肽组)；直接以基础日粮饲喂其中的1组，为阴性对照组；以基础饲粮添加1.0g/kg阿普拉霉素作为阳性对照组(抗生素组)；连续饲喂一个月，观察并记录试验组和对照组仔猪的生长性能结果如表11和12所示。注意饲喂食物的温度不超过40℃，添加剂和食物要充分混匀。

表11 P-CY1饲料添加剂对育肥猪健康状况的影响(n＝20)

组别	死淘头数	死淘率	腹泻头数	腹泻率
					阴性对照组	1	5％	5(重度腹泻2头)	25.00％

抗生素组	0	0％	2(轻微腹泻)	10.00％
					0.5％组	0	0％	1(轻微腹泻)	5.00％

由表11可见，抗菌肽组和抗生素组均能显著降低各种致病菌引起的腹泻，同时对其他疾病也有预防和作用，两组死淘率显著低于对照，达到0死亡率。

表12 P-CY1饲料添加剂对育肥猪生长性能的影响

组别	期初重(kg)	期末重(kg)	日增重(kg)	日采食量(kg)	料肉比
						阴性对照组	29.45±3.12	35.18±4.11	0.20±0.04	1.28±0.14	6.40±0.16
抗生素组	29.40±3.26	36.38±1.99a	0.23±0.06a	1.35±0.18	5.86±0.22a
						抗菌肽组	29.45±3.35	36.76±2.08b	0.24±0.05a	1.38±0.20a	5.75±0.20b

注：a、b分别表示相同日龄内2个添加组与对照组之间生产性能指标对比的差异显著性(P<0.05,P<0.01)。

表12结果显示，与阴性对照相比较，抗生素组和抗菌肽组的日增重和料肉比指标均得到显著改善；日增重分别增加15％和20％，均达显著水平；料肉比分别下降8.4％和10.1％，差异显著，但抗生素组和抗菌肽组差异不显著。

综上所述，pxCA1作为一种抗菌饲料添加剂有明显的使用效果，在饲料行业中是抗生素的理想替代产品。

Claims (1)

1.一种抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，编码所述抗菌肽的碱基序列如SEQ ID No.5所示；所述抗菌肽通过酵母表达系统表达获得；

所述饲料添加剂用于提高仔猪的存活率，降低仔猪和育肥猪的腹泻率，提高仔猪和育肥猪的日增重，降低仔猪和育肥猪的料肉比。