CN104312932B - 一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法 - Google Patents

一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，所述方法包括：首先进行酵母前培养，至发酵液中菌体的OD600达到80‑150时，添加混合诱导剂进行诱导培养；其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇5‑9份，酵母发酵培养基1‑5份。本发明所提供诱导的方法，能够促进酵母的生长，使得收获菌体密度升高，在原有基础上大大提高目的蛋白的产量。菌液密度和蛋白收获量均较传统工艺提高了10％以上；而且蛋白的活性与原有纯化工艺得到的蛋白无异，免疫原性较高。

Description

一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及发酵培养过程中甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法。
背景技术
甲醇营养型酵母(酿酒酵母、汉逊酵母)表达系统常用于蛋白药物及疫苗的研发和生产，其表达载体为整合型质粒，即含有外源基因的质粒可整合至酵母基因组中，在甲醇诱导启动子(pMOX)的作用下，外源基因得以表达。甲醇营养型酵母一般先在以甘油为碳源的培养基中生长，培养至较高浓度时，添加纯甲醇继续诱导生长，在此后续过程中，甲醇既作为碳源也作为诱导剂，促进目的蛋白的表达。该方法可大大提高表达产量，外源蛋白的表达量可达到克级。然而，在传统诱导工艺中，只是单纯的加入甲醇进行后期的培养和诱导，由于酵母长期(培养周期约为7天)的高密度培养，容易导致后期营养成分降低，营养成分缺乏制约了酵母的生长，导致收获菌体密度低，影响了目的蛋白的产量。因此，有必要提供一种新的蛋白诱导方法，提高菌体生长密度，增加目的蛋白产量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的能够提高菌体生长密度和蛋白产量的甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法。
为了达到这一目的，本发明提供了一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，该方法包括：首先进行酵母前培养，至发酵液中菌体的OD600达到80-150时，添加混合诱导剂进行诱导培养；
其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇5-9份，酵母发酵培养基1-5份。
可选的，相对于每升发酵液，所述混合诱导剂的添加剂量为每小时添加一次，每次添加1-5mL。
可选的，所述诱导培养的条件包括：温度为29-39℃、溶解氧浓度为5-50％、时间为60-100h。
可选的，所述方法包括在OD600达到160-250时停止诱导培养，收获发酵产物。
可选的，所述方法还包括诱导培养前的酵母前培养，所述酵母前培养包括以下步骤：
1)按照1％-15％的接种比例，将酵母种子接种至一级培养基中，在29℃-39℃下摇瓶震荡培养至OD600至5-20之间，获得一级培养液；
2)将一级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至二级培养基中，29℃-39℃摇瓶震荡培养至OD600至5-20之间，获得二级培养液；
3)将二级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至含有发酵培养基的发酵罐中发酵培养，发酵过程中根据溶氧的变化添加甘油，控制含氧量不低于20％，在29℃-39℃下培养，获得OD600为80-150的发酵液。
可选的，所述酵母为酿酒酵母、汉逊酵母或毕赤酵母。
可选的，按重量份计，所述酵母发酵培养基的组成成分包括：甘油8-11份，磷酸二氢钾4.5-5.5份，磷酸二氢铵9-11份，硫酸镁4.8-4.2份，氯化钾2.1-2.5份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸亚铵0.08-0.12份。
本发明所提供诱导的方法，能够促进酵母的生长，使得收获菌体密度升高，在原有基础上大大提高目的蛋白的产量。菌液密度和蛋白收获量均较传统工艺提高了10％以上；而且蛋白的活性与原有纯化工艺得到的蛋白无异，免疫原性较高。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
根据本发明的一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，所述方法包括：首先进行酵母前培养，至发酵液中菌体的OD600达到80-150时，添加混合诱导剂进行诱导培养；
其中所述甲醇营养型酵母指代一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源生产蛋白药物、疫苗等蛋白制品的酵母菌，在本发明所提供的方法中，所述甲醇营养型酵母的种类包括但不限于：酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母。
其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇5-9份，酵母发酵培养基1-5份。
在本发明所提供的方法中，所述酵母发酵培养基为本领域进行酵母发酵培养时发酵培养阶段所使用的培养基。具体的培养基种类根据培养菌株和生产的蛋白种类进行调整。
在本发明的一种实施方式中，按重量份计，所述酵母发酵培养基的组成成分包括：甘油8-11份，磷酸二氢钾4.5-5.5份，磷酸二氢铵9-11份，硫酸镁4.8-4.2份，氯化钾2.1-2.5份，氯化钠0.4-0.6份，硫酸亚铵0.08-0.12份。
在本发明中，相对于每升发酵液，所述混合诱导剂的添加剂量为每小时添加一次，每次添加1～5mL。优选的，所述混合诱导剂的添加剂量为每小时添加一次，每次添加2-4mL。
在本发明所提供的方法中，所述诱导培养的条件包括：温度为29-39℃、溶解氧浓度为5-50％、时间为60-100h；OD600达到160-250时停止诱导培养，收获发酵产物。
本发明中，对于发酵过程中温度、溶解氧浓度的控制方法没有特别的限制，可以按照本领域常规的发酵过程条件控制方法进行，为了使菌体对培养基进行充分的利用，可以在发酵过程中进行搅拌使发酵体系保持均一。
本发明所述的方法还包括诱导培养前的酵母前培养，所述酵母前培养是指将酵母菌种通过一级、二级培养获得OD600为80-150的发酵液的过程，具体的，该过程可以包括以下步骤：
1)按照1％-15％的接种比例，将酵母种子接种至一级培养基中，在29℃-39℃下摇瓶震荡培养至OD600至5-20之间，获得一级培养液；
2)将一级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至二级培养基中，29℃-39℃摇瓶震荡培养至OD600至5-20之间，获得二级培养液；
3)将二级培养液按照1％-15％的接种比例，转接至含有发酵培养基的发酵罐中发酵培养，发酵过程中根据溶氧的变化添加甘油，控制含氧量不低于20％，在29℃-39℃下培养，获得OD600为80-150的发酵液。
当进入诱导培养阶段后停止添加甘油，改为添加所述混合诱导剂至发酵液中进行诱导培养。
其中，所述一级培养基和二级培养基均可以为本领域扩大培养相应菌株时常规使用的培养基。
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。
以下实施例中：
菌密度用紫外分光光度计进行测量。
汉逊酵母一级培养基(L-1)：YNB(酵母氮源)1.34％，甘油1％。
汉逊酵母二级培养基(L-1)：甘油30g，磷酸二氢钾2.5g，磷酸二氢铵5.0g，硫酸镁2.5g，氯化钾1.15g氯化钠0.25g，硫酸亚铵0.05g，硫酸铜4mg，硫酸锌15mg，硫酸锰20mg，Na-EDTA 0.05g，硼酸0.25mg，硫酸镍0.5mg，氯化钴0.5mg，钼酸钠0.5mg，碘化钾0.5mg，维生素B1 0.05mg，维生素D 0.15mg，氯化钙0.375mg。
发酵培养基(L-1)：甘油10g，磷酸二氢钾5.0g，磷酸二氢铵10g，硫酸镁5g，氯化钾2.3g，氯化钠0.5g，硫酸亚铵0.1g，硫酸铜8mg，硫酸锌30mg，硫酸锰40mg，N-EDTA 0.1g，硼酸0.5mg，硫酸镍1mg，氯化钴1mg，钼酸钠1mg，碘化钾1mg，维生素B10.1mg，维生素D0.3mg，氯化钙0.65mg。
实施例1
汉逊酵母中诱导培养重组乙肝表面抗原
1)取一支液氮中冻存的汉逊酵母工作种子(血清型为adw，基因型为A2)1ml，该种子为已鉴定成功的重组乙肝表面抗原工程菌株，按照2％的接种比例，接种至一级培养基中，37℃摇瓶震荡培养至OD600至12；
2)将一级摇瓶中的培养菌液按照2％的接种比例，转接至二级培养基中，37℃摇瓶震荡培养至OD600至12；
3)将二级摇瓶中的培养菌液按照2％的接种比例，转接至含有培养基的发酵罐中发酵培养，发酵过程中根据溶氧添加甘油，控制含氧量不低于20％，37℃培养至OD600至130；
4)发酵前期培养菌液的OD600达到130时，停止添加甘油，改为添加混合诱导剂(将发酵培养基与甲醇按照体积比1:3混合)至发酵罐中，混合诱导剂的添加计量为相对于每升发酵液，每小时添加4mL，并控制溶氧至20～40％，进行诱导培养；
5)诱导培养90h，OD600达到200时停止培养，收获发酵液1。
对比例1
本对比例用于说明现有技术的蛋白诱导方法。
按照与实施例1相同的方法进行重组乙肝表面抗原诱导，不同的是，诱导培养阶段不添加混合诱导培养基而只添加甲醇，甲醇的添加剂量为相对于每升发酵液，每小时添加4mL甲醇进行乙肝抗原的诱导表达从而获得发酵液2。
测试例1
本测试例用于检测实施例1和对比例1制备获得的发酵液1和2中乙肝抗原的含量。
利用紫外分光光度仪，分别对发酵液1和2进行菌密度测定。发酵液1(混合诱导剂诱导)的OD600值为210，发酵液2(单独甲醇诱导)的OD600值为178。
以上结果可见，以本发明的诱导方式获得的发酵菌液的菌密度高于传统的甲醇单独诱导的菌密度，菌密度提高了17.9％。
利用酶联免疫法(ELISA)，分别测定发酵液1(混合诱导剂诱导)和发酵液2(甲醇诱导)中乙肝抗原含量，结果见表1：
表1
发酵液 抗原质量(mg)/发酵液(L) 发酵液体积(L) 抗原总量(mg)
1 440.3 1.1 484.3
2 374.8 1.1 412.8
以上结果可见，以本发明的诱导方式获得的发酵菌液中，抗原总质量高于传统的甲醇单独诱导产生的抗原质量，抗原量提高了17.3％。
测试例2
本测试例用于检测实施例1和对比例1制备获得的发酵液1和2中乙肝抗原的活性。
分别对不同诱导剂诱导产生的乙肝抗原蛋白进行层析纯化，获得的乙肝抗原原液，后将乙肝抗原原液进行佐剂吸附后免疫小鼠，测定阳转率，对抗原的免疫原性进行鉴定，结果如下：
分别将相同初始浓度的乙肝抗原按照1:4、1:16、1:64、1:256的比例进行稀释，然后分别免疫BALB/C小鼠各10只，测定其阳转效率，小鼠发生阳转的统计结果见表2：
表2
以上结果可知，两种诱导剂诱导的抗原，使小鼠发生阳转的比率相同，没有统计学差异，即与原有工艺相比，新型诱导剂诱导表达的抗原，免疫原性不变。
利用回归法测定ED50，计算结果见表3：
表3
甲醇诱导 混合诱导剂诱导 空白对照
ED50(U) 0.12 0.11 /
以上结果可知，两种诱导剂诱导的抗原，ED50分别为0.12和0.11，没有统计学差异，因此，混合诱导剂诱导产生的抗原与甲醇单独诱导产生的抗原的免疫原性没有差异。
由此可见，本发明通过对蛋白诱导剂的改进，实现了在不影响抗原免疫原性的基础上，大大提高了每批发酵液中的抗原蛋白的表达总量，即提高了抗原蛋白的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法，其特征在于，所述方法包括：
1)取一支液氮中冻存的血清型为adw，基因型为A2的汉逊酵母工作种子1ml，该种子为已鉴定成功的重组乙肝表面抗原工程菌株，按照2％的接种比例，接种至一级培养基中，37℃摇瓶震荡培养至OD600至12；
其中，所述一级培养基组成：每升汉逊酵母一级培养基中包含酵母氮源YNB 1.34％，甘油1％；
将一级摇瓶中的培养菌液按照2％的接种比例，转接至二级培养基中，37℃摇瓶震荡培养至OD600至12；
其中，所述汉逊酵母二级培养基每升组成：甘油30g，磷酸二氢钾2.5g，磷酸二氢铵5.0g，硫酸镁2.5g，氯化钾1.15g氯化钠0.25g，硫酸亚铵0.05g，硫酸铜4mg，硫酸锌15mg，硫酸锰20mg，Na-EDTA 0.05g，硼酸0.25mg，硫酸镍0.5mg，氯化钴0.5mg，钼酸钠0.5mg，碘化钾0.5mg，维生素B1 0.05mg，维生素D 0.15mg，氯化钙0.375mg；
3)将二级摇瓶中的培养菌液按照2％的接种比例，转接至含有培养基的发酵罐中发酵培养，发酵过程中根据溶氧添加甘油，控制含氧量不低于20％，37℃培养至OD600至130；
4)至发酵液中菌体的OD600达到130时，停止添加甘油，改为添加混合诱导剂至发酵罐中，混合诱导剂的添加计量为相对于每升发酵液，每小时添加4mL，并控制溶氧至20～40％，进行诱导培养；
其中，以体积份计，所述混合诱导剂的组成成分包括：甲醇3份，酵母发酵培养基1份；
其中，所述发酵培养基每升组成：甘油10g，磷酸二氢钾5.0g，磷酸二氢铵10g，硫酸镁5g，氯化钾2.3g，氯化钠0.5g，硫酸亚铵 0.1g，硫酸铜8mg，硫酸锌30mg，硫酸锰40mg，N-EDTA0.1g，硼酸0.5mg，硫酸镍1mg，氯化钴1mg，钼酸钠1mg，碘化钾1mg，维生素B10.1mg，维生素D0.3mg，氯化钙0.65mg；
5)诱导培养90h，OD600达到200时停止培养，收获发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母或汉逊酵母。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104878022A (zh) * 2015-04-27 2015-09-02 段青姣 编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用
CN111011481A (zh) * 2019-12-16 2020-04-17 中山市领秀工坊食品有限公司 一种生鲜果蔬保鲜剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446906A (zh) * 2003-03-27 2003-10-08 华东理工大学 一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法
WO2009075847A2 (en) * 2007-12-11 2009-06-18 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
CN102443594A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 上海生物制品研究所有限责任公司 RANKL-HBsAg表达构建物、酵母、制法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1446906A (zh) * 2003-03-27 2003-10-08 华东理工大学 一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法
WO2009075847A2 (en) * 2007-12-11 2009-06-18 The Scripps Research Institute In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris
CN102443594A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 上海生物制品研究所有限责任公司 RANKL-HBsAg表达构建物、酵母、制法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PICHIA PASTORIS FERMENTATION WITH MIXED-FEEDS OF GLYCEROL AND METHANOL:GROWTH KINETICS AND PRODUCTION IMPROVEMENT;WENHUI ZHANG ET AL;《J IND MICROBIOL BIOTECHNOL》;20030402;第30卷(第4期);210-215 *
甲醇诱导条件和方式对乙肝表面抗原产率的影响;常景玲 等;《生物技术》;20051231;第15卷(第6期);66-68 *

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