CN104694405A - 一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株及其工业化发酵产酶方法 - Google Patents

一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株及其工业化发酵产酶方法 Download PDF

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Abstract

一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株及其工业化发酵产酶方法，该菌株为巴斯德毕赤酵母hgdsd-334菌株，2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2013520。所述工业化发酵产酶方法是根据本发明中酵母菌株营养特点及发酵生理特性，给其提供合适的营养需求及生长环境，使该菌株进行高密度发酵，通过调整产酶诱导因子，使菌体将酶蛋白高效分泌到胞外，获得最大发酵产率。酶液经提取、浓缩、干燥后获得低温酸性α-淀粉酶固体酶产品。

Description

一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株及其工业化发酵产酶方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株及其工业化发酵产酶方法。
背景技术
酸性α-淀粉酶具有在较低pH值条件下发生作用的特性，可在糖化酶最适pH值附近起作用，使淀粉质原料可以直接进行液化糖化过程，在食品工业生产过程中不需要再加入酸碱类物质调节pH值。这既降低了生产成本，节约工业用粮，同时也有效地减缓了废水排放对生态环境的破坏，具有很好的经济和社会效益。
在食品行业，低温α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂，多用于面制品的烘焙。在面粉中添加适量的低温酸性α-淀粉酶，可改良面包品质，缩短发酵时间，可降低其工业化生产成本，并能代替国内原有面包改良剂中的化学物质溴酸钾的使用，是小麦粉α-淀粉酶的增补剂。馒头生产中，将低温酸性α-淀粉酶添加面粉中，能明显提高酵母发酵活力，使面团发酵时间缩短，馒头蒸制后松软度好，色泽稳定，甜香味和口感较好。此外，酸性低温α-淀粉酶还可广泛应用于青贮饲料、发酵饮料、药物生产及工业副产品的加工、废料的处理等多种领域，具有非常广泛地应用开发前景。
尽管从70年代开始，国内外就有人开始对酸性α-淀粉酶进行了研究，也取得了一些成就，获得多株产酸性淀粉酶的芽孢杆菌和曲霉菌，但这些菌株产酸性淀粉酶的活力较低，还不能直接应用于工业化发酵生产。从已有研究报道看，部分菌株来源的淀粉酶虽具有良好的耐酸性，但也表现出不同程度的耐高温能力，不适合烘焙食品制作的要求。近年来，有研究者通过生物技术手段获得了具有生产价值的工程菌，但大都是从提高菌株发酵活力、提高对热、酸的稳定性方面入手，而低温酸性淀粉酶方面的相关资料较少，面制品行业对此类产品的市场需求越来越大。因此，低温酸性淀粉酶的工业化生产具有非常广阔的市场空间。
我国酶制剂生产相对滞后，部分酶品种的生产菌种和发酵活力都不及国外同行，国际市场竞争力不强。在低温酸性淀粉酶方面，我国生产菌株单一，其工业化生产还是空白。研究开发低温酸性淀粉酶，可弥补我国现有淀粉酶生产品种少、竞争力弱的局面。对酿造及烘焙工业来讲，节约了成本、降低劳动强度、提高生产效益，具有非常好的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明之目的是针对实际生产中存在的生产工艺陈旧，发酵产率低下等不足之处而提供一株低温酸性α-淀粉酶的高产菌株的工业化应用方法。本发明根据该酵母菌株营养特点及发酵生理特性来优化培养基配方和生产发酵工艺，有效解决了低温酸性α-淀粉酶发酵产率低、生产成本高的难题。
本发明的目的可以通过以下技术措施来实现：
一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株，该菌株为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）hgdsd-334菌株， 2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2013520。
该菌株hgdsd-334所产α-淀粉酶作用温度范围为30℃-55℃，最适作用温度45℃，对65℃以上高温的耐受性差，该酶最适作用pH5.0，在pH3.5～5.5下稳定。
一种利用菌株hgdsd-334进行工业化发酵产酶方法，先将菌株hgdsd-334在种子培养基中扩大培养，待菌体长势健壮无杂菌污染时接入无机盐发酵培养基，发酵温度升至70-80℃；在发酵前期，菌体利用乳清液和甘油，在短时间内快速增殖。当发酵液中菌体浓度达到80g/L湿重时，开始流加甘油，使发酵液中菌体浓度继续增加，当达到120g/L湿重时，停止甘油流加，并开始饥饿培养1-2小时，并促使菌体进行营养转型；饥饿培养结束后，开始流加甲醇，保持甲醇流加浓度在0.8-1.2%间；降低发酵温度至25℃，流加微量元素溶液，加大生物素投入量，诱导酶蛋白分泌胞外，当菌体浓度达到约420-450g/L湿重时，酶活性达2000U/mL并不再明显增长时结束发酵。
每隔4小时加入发酵液体积的0.1-0.2‰的微量元素溶液。微量元素溶液配方为：五水硫酸铜2.2g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4.5g/L，二水钼酸钠0.3g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.1g/L，氯化锌8g/L，七水合硫酸亚铁32g/L，98%浓硫酸3mL/L，生物素0.2-0.4g/L。
发酵液经板框过滤去除酵母菌体，上清液即酶液再经超滤膜浓缩获得酶浓缩液，向酶浓缩液中加入一定比例的玉米淀粉并搅拌均匀，用输送泵将混合液送入到喷雾干燥机进行喷雾干燥，收集干粉即为低温酸性α-淀粉酶固体产品。
本发明的原理及有益效果如下：
（1）酶的高密度发酵工艺：细胞在其生长周期中向外分泌酶蛋白的量往往有限，提高酶发酵产率的有效途径之一是进行高密度发酵，亦即使发酵液中菌体数量大幅增加。本发明根据菌株hgdsd-334的营养特点及生理特性，设计了不同于一般毕赤酵母的发酵培养基配方，加大了氮源在营养成分中的占比，使得菌体生长及酶基因表达时有充足的速效氮源。本发明还依据该酶的酶学性质，对调配了培养基微量元素的添加量，避免了使酶活钝化或丧失的金属离子的存在，确保分泌到发酵液中酶蛋白的活性稳定。
（2）酶的诱导产生：酵母细胞将酶在胞内合成完成后，应及时将酶蛋白分泌到胞外才能提高发酵产率。本发明采用25℃低温诱导，并加大了微量元素溶液中生物素的含量。生物素是细胞多种酶的辅因子，且具有使细胞膜孔隙增大的作用，有利于酶蛋白的及时外泌和活性维持。本发明在发酵后期，增加了生物素的流加量，有利于酶蛋白的及时外泌。25℃的低温环境调节菌体发酵生理，使菌体从以细胞增殖为主的营养生长阶段过渡到以次级代谢产物形成为主的产酶阶段，提高诱导产酶效率。同时，该温度下可减弱发酵液中部分蛋白酶对目标产物的降解作用，实现酶的诱导及活性维持。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例作进一步描述：
实施例1：菌株hgdsd-334种子的培养
一级摇瓶种子的培养：一级摇瓶种子培养基采用YPD培养基（酵母浸膏1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%），用500mL三角瓶分装，每瓶装液量为100mL，灭菌后备用。然后取一支试管斜面保藏的菌株hgdsd-334种子，用5mL无菌水冲洗斜面种子制成菌悬液，并将该菌悬液全部接种至含100mL种子培养基的三角瓶中，在28-32℃摇床，振荡培养26-30小时，摇床转速为200-300rpm，得一级摇瓶种子；
二级种子的培养：二级种子培养采用无机盐培养基，其配方为：磷酸氢二铵6.32 g/L、氯化钙0.12g/L、硝酸钾7.56g/L、硫酸亚铁0.93g/L，七水硫酸镁6.28g/L、氯化钾1.45g/L、甘油36g/L、乳清粉8.2g/L，用水定容并用氨水调pH值至5.0。待上述培养基灭菌冷却后，还需加入4mL经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液。微量元素溶液配方为：五水硫酸铜2.2g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4.5g/L，二水钼酸钠0.3g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.1g/L，氯化锌8g/L，七水合硫酸亚铁32g/L，98%浓硫酸3mL/L，生物素0.2g/L。
采用50L发酵罐培养二级种子，先在发酵罐中配制25L无机盐培养基，将培养好的2-3L一级摇瓶种子接入其中，培养条件为：培养温度30-32℃，pH4.5-5.0，通气量0.5-1.2v/v·m（每分钟气液比），搅拌转速400-650rpm，培养时间24-28h。
实施例2：菌株hgdsd-334在2m 3 发酵罐中发酵生产
（1）种子培养：按实施例1准备二级种子约40L。
（2）高密度发酵：菌株hgdsd-334在2m3发酵罐中采用无机盐培养基发酵产酸性α-淀粉酶时需高密度菌体培养。按实施例1中无机盐培养基配方预先在2m3发酵罐装约1000L的发酵培养基及200mL消泡剂。打开蒸汽阀门，使蒸汽进入发酵罐盘管并对发酵培养基加热，待温度升至约80℃时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐底部放料口、空气进口、取样口进入到罐内，使发酵培养基温度迅速上升至121- 123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌约30min。同时，用高温蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌。待发酵培养基冷却后，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素液40L，并用氨水调节培养基pH至5.0。
将准备好的二级种子40L全部接入到2m3发酵罐中进行培养，培养条件为：温度30-32℃，通气量1.0～1.5v/v·m，搅拌转速80-120rpm，pH5.0。16-20小时后，发酵培养乳清粉及甘油消耗完，溶氧开始上升。此时，开始以10-25Kg/h的速度流加甘油，当发酵液中菌体湿重达到120g/L时，开始停止碳源供给而代之以饥饿培养，促使菌体进行营养转型。饥饿培养1-2小时后，开始流加甲醇，发酵液中甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，同时加大发酵罐通气量，保证发酵液中溶氧达到30%以上（以搅拌转速为100rpm，进气量为2m3/min定义为溶氧100%）。甲醇流加20小时后，发酵液中菌体湿重达200g/L，开始进行诱导产酶发酵。
（3）诱导产酶：菌株hgdsd-334能以甲醇为主要碳源，以氨水为氮源进行发酵产酶，按高密度发酵条件继续流加甲醇。此时，降低发酵温度至25℃，降低发酵液pH至4.0-4.5，每隔4小时加1-2L微量元素溶液，该微量元素溶液中中生物素含量提高至0.4g/L。诱导产酶阶段约40小时，发酵液中菌体湿重达到420-450 g/L，酶活性达到约2000U/mL且不再明显增长，发酵时段结束。
（4）酶的提取：发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到另一个2m3的发酵液储罐中，经板框过滤后收集清液。该清液即酶液再经截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得酶浓缩液。将该酶浓缩液收集到1000L的酶液储存罐中，向罐中加入玉米淀粉并搅拌均匀，通过出料泵输送到喷雾干燥机中进行干燥。
（5）酶液喷雾干燥：通过输送泵将储存罐内酶液送入喷雾干燥机，调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为200L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后收集干粉即为低温酸性α-淀粉酶。将酶粉称重，分装，包装获得低温酸性α-淀粉酶固体酶产品。

Claims (5)

1.一株产低温酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于：该菌株为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）hgdsd-334菌株，2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2013520。
2.根据权利要求1所述的产低温酸性α-淀粉酶的菌株，其特征在于：该菌株hgdsd-334所产α-淀粉酶作用温度范围为30℃~55℃，最适作用温度45℃，对65℃以上高温的耐受性差，该酶最适作用pH5.0，在pH3.5～5.5下稳定。
3.一种利用权利要求1所述菌株进行工业化发酵产酶方法，其特征在于：先将菌株hgdsd-334在种子培养基中扩大培养，待菌体长势健壮无杂菌污染时接入无机盐发酵培养基，发酵温度升至70-80℃；在发酵前期，菌体利用乳清液和甘油，在短时间内快速增殖；当发酵液中菌体浓度达到80g/L湿重时，开始流加甘油，使发酵液中菌体浓度继续增加，当达到120g/L湿重时，停止甘油流加，并开始饥饿培养1-2小时，并促使菌体进行营养转型；饥饿培养结束后，开始流加甲醇，保持甲醇流加浓度在0.8-1.2%间；降低发酵温度至25℃，流加微量元素溶液，加大生物素投入量，诱导酶蛋白分泌胞外，当菌体浓度达到约420-450g/L湿重时，酶活性达2000U/mL并不再明显增长时结束发酵。
4.根据权利要求3所述的工业化发酵产酶方法，其特征在于：微量元素溶液每小时的加入量为发酵液体积的0.1-0.2‰，配方为：五水硫酸铜2.2g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4.5g/L，二水钼酸钠0.3g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.1g/L，氯化锌8g/L，七水合硫酸亚铁32g/L，98%浓硫酸3mL/L，生物素0.2-0.4g/L。
5.根据权利要求3所述的工业化发酵产酶方法，其特征在于：发酵液经板框过滤去除酵母菌体，上清液即酶液再经超滤膜浓缩获得酶浓缩液，向酶浓缩液中加入一定比例的玉米淀粉并搅拌均匀，用输送泵将混合液送入到喷雾干燥机进行喷雾干燥，收集干粉即为低温酸性α-淀粉酶固体产品。
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