CN106434772A - 一株生产l‑苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效利用木糖发酵生产苹果酸的基因工程菌及其构建方法与应用。该重组菌中过表达了磷酸戊糖异构酶、墨角藻糖激酶、墨角藻糖‑1‑磷酸醛缩酶、醛脱氢酶、乙醇酸氧化酶、苹果酸合酶，同时敲除了木酮糖激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸水合酶，从而获得了苹果酸合成途径。本发明的重组菌在摇瓶和发酵罐培养中的苹果酸的产量和木糖转化率能达到较理想的水平，具有较好的工业化应用前景。

Description

一株生产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和发酵工程领域，涉及一株生产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用，具体涉及一株高效利用木糖发酵生产苹果酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其生产L-苹果酸的方法。
背景技术
苹果酸(malic acid)，又名2-羟基丁二酸，是一种重要的四碳化合物。苹果酸分子中含有一个不对称碳原子，因而可以有三种存在形式，即D-苹果酸、L-苹果酸和混合物DL-苹果酸。L-苹果酸作为三羧酸循环的中间体在生物体内普遍存在，具有略微刺激性的愉快酸味，能够被人体直接吸收利用。D-苹果酸需要经过体内的消旋酶和氧化还原酶作用转变为L-苹果酸之后才能被利用，因此制备具有单一旋光性的L-苹果酸具有重要的意义。
苹果酸主要应用于药品、食品和化妆品等领域，具有不可代替性。L-苹果酸的口感接近天然苹果的酸味，与柠檬酸相比酸度大、味道柔和、不损害口腔与牙齿，生理代谢上有利于氨基酸吸收、不积累脂肪，属于新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”，是继柠檬酸和乳酸之后用量排第3位的食品添加剂，已广泛用于高档饮料、调味品和糖果等食品中。作为苹果酸天冬氨酸穿梭的重要组成部分，L-苹果酸对细胞质和线粒体之间的还原力转移起重要作用，具有重要的生理功能，例如抗疲劳、保护心脏、促进羧酸盐代谢、促进线粒体呼吸、改善记忆能力、增强钙的活性、降低抗癌药物毒副作用等，在医药行业中有许多应用。例如，L-苹果酸可以治疗肝功能障碍导致的高血氨症；L-苹果酸钾是良好的钾补充药，可以维持体内水分平衡，治疗水肿和高血压等；L-苹果酸钠具有食盐的咸味，可以用作肾脏病人的代食盐。化工工业中，苹果酸主要作为络合剂和酯剂，用于牙膏配方、净牙片配合和合成香料配方等，还可以用于防臭剂和洗涤剂等。
苹果酸的获得方法主要有直接提取法、化学合成法、酶转化法和发酵法等。直接提取法的产量有限，仅在早期使用，不适宜工业化生产。化学合成法一般是以石油为原料，主要有反丁烯二酸或顺丁烯二酸经高温高压催化加水等几种方法，工艺较为成熟，成本相对较低，但环境污染大、设备要求高，所获得的是混合物DL-苹果酸，不适于在食品与医药工业中应用。酶转化法主要以富马酸为底物，经过富马酸酶的催化作用生成苹果酸，该方法原料依然依赖于高纯度化学合成的富马酸，存在原料价格昂贵、生产污染大和副产物含量高等缺点。发酵法以可再生生物质为底物，通过微生物(霉菌、酵母和大肠杆菌等)转化的方法获得L-苹果酸，具有原料来源丰富，产品成本低廉、杂酸含量低、食用安全性高等特点，克服了对石油资源的依赖，具有较好的发展前景。
目前，苹果酸发酵的菌种主要是霉菌，以黄曲霉Aspergillus flavus为主。霉菌发酵具有产量高、生产强度大等优点，但存在副产物多、菌丝易结球、条件控制复杂等缺点。大肠杆菌Escherichia coli作为遗传背景清楚的模式菌株，具有底物范围广、生长迅速、培养条件简单、基因改造容易等优点，已经在琥珀酸和乳酸等有机酸产品的发酵中有广泛应用，将其改造用于苹果酸发酵，具有较好的可行性。
发明内容
本发明一个目的是提供一种构建重组菌的方法。
本发明提供的方法，为提高大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因fucK、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因fucA、醛脱氢酶基因aldA、乙醇酸氧化酶基因簇(glcD、glcE和glcF)、苹果酸合酶基因簇(aceB和glcB)的表达或活性，且使所述大肠杆菌表达磷酸戊糖异构酶基因BurMR1_0153，且抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因xylB、苹果酸脱氢酶基因簇(mdh、maeA和maeB)和延胡索酸水合酶基因簇(fumA、fumB和fumC)的表达或活性，得到重组菌。
上述方法中，所述提高大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的表达或活性为增加大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的拷贝数；
所述抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因、苹果酸脱氢酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇表达或活性为敲除所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因、苹果酸脱氢酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇。
上述方法中，所述增加大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的拷贝数为将含有墨角藻糖激酶基因及其启动子的DNA分子、含有墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因及其启动子的DNA分子、含有醛脱氢酶基因及其启动子的DNA分子、含有乙醇酸氧化酶基因簇及其启动子的DNA分子、含有苹果酸合酶基因簇中各基因及其各自启动子的DNA分子导入所述大肠杆菌中；
所述使所述大肠杆菌表达磷酸戊糖异构酶基因为将含有磷酸戊糖异构酶基因及其启动子的DNA分子导入所述大肠杆菌中。
上述方法中，所述导入是通过重组载体的方式进行；
或所述敲除是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；
或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；
或所述同源重组具体为λ-red同源重组。
上述方法中，所述乙醇酸氧化酶基因簇由glcD、glcE和glcF组成。
所述苹果酸合酶基因簇由aceB和glcB组成；
所述苹果酸脱氢酶基因簇由mdh、maeA和maeB组成；
所述延胡索酸水合酶基因簇由fumA、fumB和fumC组成。
上述方法中，所述磷酸戊糖异构酶基因来自于伯克霍尔德氏菌属Burkholderia。
上述方法中，所述含有磷酸戊糖异构酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列1；
所述含有墨角藻糖激酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列2；
所述含有墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列3；
所述含有醛脱氢酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列4；
所述含有乙醇酸氧化酶基因簇及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列5；
所述含有苹果酸合酶基因aceB及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列6；
所述含有苹果酸合酶基因glcB及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列7；
所述敲除大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因xylB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列8；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因maeA基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列9；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因maeB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列10；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因mdh基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列11；
所述敲除大肠杆菌基因组中的延胡索酸水合酶基因fumAC基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列12；
所述敲除大肠杆菌基因组中的延胡索酸水合酶基因fumB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列13。
上述方法中，所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组菌在生产苹果酸中的应用也是本发明保护的范围；
或本发明还提供了一种生产苹果酸的方法，包括如下步骤：发酵所述重组菌，得到苹果酸。
上述发酵的条件为：
摇瓶：37℃、转速200rpm条件下培养72h，MMX1液体培养基。
发酵罐：37℃、转速600rpm、通气量1vvm、6M KOH调节pH至7.0条件下发酵72h，MMX2液体培养基。
上述MMX1液体培养基的配制方法：每升培养基含6g木糖、2g NH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0g KH2PO4、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素和0.05g卡那霉素，其余为水。
上述微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.0311g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1.01g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
上述发酵培养用的培养基为MMX2液体培养基。
上述MMX2液体培养基的配制方法：每升培养基含60g木糖、2g NH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0g KH2PO4、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素和0.05g卡那霉素，其余为水。
本发明的有益效果：本发明通过在大肠杆菌中表达9个代谢途径相关的基因和敲除7个内源基因，获得了能够以木糖等简单的碳水化合物为单一碳源，发酵获得苹果酸的工程菌株，并且重组菌在摇瓶和发酵罐培养中的苹果酸的产量也能达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。
附图说明
图1为pMCS-GA1载体图谱。
图2为pMCS-GA2载体图谱。
图3为pMCS-GA3载体图谱。
图4为pMCS-GA4载体图谱。
图5为pUC-MA1载体图谱。
图6为pUC-MA2载体图谱。
图7为pUC-MA3载体图谱。
图8为苹果酸标准曲线。
图9为木糖标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于NEB(New England Biolabs)公司；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒购自北京博迈德生物技术公司；实施例中涉及的DNA合成和测序工作由北京博迈德生物技术公司完成。
E.coli MG1655：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，TheColi Genetic Stock Center获得，编号CGSC#6300。
质粒pKD13：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7633。
质粒pKD46：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7739。
质粒pCP20：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7637。
质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交DNA合成公司进行质粒合成；公众也可从北京化工大学获得，该质粒记载在如下文献中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes,1995,Gene,166:175-176。
质粒pUC19：公众可以从NEB(New England Biolabs)公司购买，货号N3041S。
实施例1、重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)的构建
一、重组表达载体pMCS-GA4的构建
1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有BurMR1_0153表达盒，上游为SacI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-942位核苷酸为BurMR1_0153基因序列。
2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有fucK表达盒，上游为XbaI位点，下游为HindIII位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1518位核苷酸为fucK基因序列。
3、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有fucA表达盒，上游为HindIII位点，下游为XhoI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-717位核苷酸为fucA基因序列。
4、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有aldA表达盒，上游为XhoI位点，下游为KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1509位核苷酸为aldA基因序列。
5、用SacI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为936bp的DNA片段；用SacI和XbaI双酶切载体pBBR1MCS-2，回收大小约为5124bp的DNA片段；将上述936bp和5124bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小约为936bp和5124bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GA1。将得到的重组质粒pMCS-GA1进行测序验证，结果表明：在质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI酶切位点间插入了如序列表中序列1所示的DNA序列，表明质粒正确。
6、用XbaI和HindIII双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小约为1516bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切步骤5中得到的质粒pMCS-GA1，回收大小约为6018bp的DNA片段；将上述1516bp和6018bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和HindIII进行酶切验证，酶切产物大小约为1516bp和6018bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GA2。将得到的重组质粒pMCS-GA2进行测序验证，结果表明：在质粒pMCS-GA1的XbaI和HindIII酶切位点间插入了如序列表中序列2所示的DNA序列，表明质粒正确。
7、用HindIII和XhoI双酶切步骤3中合成的DNA序列，回收大小约为715bp的DNA片段；用HindIII和XhoI双酶切步骤6中得到的质粒pMCS-GA2，回收大小约为7513bp的DNA片段；将上述715bp和7513bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用HindIII和XhoI进行酶切验证，酶切产物大小约为715bp和7513bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GA3。将得到的重组质粒pMCS-GA3进行测序验证，结果表明：在质粒pMCS-GA2的HindIII和XhoI酶切位点间插入了如序列表中序列3所示的DNA序列，表明质粒正确。
8、用XhoI和KpnI双酶切步骤4中合成的DNA序列，回收大小约为1511bp的DNA片段；用XhoI和KpnI双酶切步骤7中得到的质粒pMCS-GA3，回收大小约为8209bp的DNA片段；将上述1511bp和8209bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliMG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XhoI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为1511bp和8209bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GA4。将得到的重组质粒pMCS-GA4进行测序验证，结果表明：在质粒pMCS-GA3的XhoI和KpnI酶切位点间插入了如序列表中序列4所示的DNA序列，表明质粒正确。
二、重组表达载体pUC-MA3的构建
1、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有glcD-glcE-glcF表达盒，上游为SphI位点，下游为PstI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1569位核苷酸为glcD基因序列，第1569-2621位核苷酸为glcE基因序列，第2632-3855位核苷酸为glcF基因序列。
2、人工合成序列表中序列6所示的DNA，含有aceB表达盒，上游为PstI位点，下游为SacI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1671位核苷酸为aceB基因序列。
3、人工合成序列表中序列7所示的DNA，含有glcB表达盒，上游为SacI位点，下游为EcoRI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-2241位核苷酸为glcB基因序列。
4、用SphI和PstI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为3853bp的DNA片段；用SphI和PstI双酶切载体pUC19，回收大小约为2680bp的DNA片段；将上述3853bp和2680bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SphI和PstI进行酶切验证，酶切产物大小约为3853bp和2680bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC-MA1。将得到的重组质粒pUC-MA1进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19的SphI和PstI酶切位点间插入了如序列表中序列5所示的DNA序列，表明质粒正确。
5、用PstI和SacI双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小约为1669bp的DNA片段；用PstI和SacI双酶切步骤4中得到的质粒pUC-MA1，回收大小约为6500bp的DNA片段；将上述1669bp和6500bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coliMG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用PstI和SacI进行酶切验证，酶切产物大小约为1669bp和6500bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC-MA2。将得到的重组质粒pUC-MA2进行测序验证，结果表明：在质粒pUC-MA1的PstI和SacI酶切位点间插入了如序列表中序列6所示的DNA序列，表明质粒正确。
6、用SacI和EcoRI双酶切步骤3中合成的DNA序列，回收大小约为2235bp的DNA片段；用SacI和EcoRI双酶切步骤5中得到的质粒pUC-MA2，回收大小约为8167bp的DNA片段；将上述2235bp和8167bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和EcoRI进行酶切验证，酶切产物大小约为2235bp和8167bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC-MA3。将得到的重组质粒pUC-MA3进行测序验证，结果表明：在质粒pUC-MA2的SacI和EcoRI酶切位点间插入了如序列表中序列7所示的DNA序列，表明质粒正确。
三、大肠杆菌E.coli MG1655ΔMA6的构建
1、敲除xylB基因
1)合成xylB基因敲除所用的引物xylBF和xylBR，序列如下：
xylBF：
5’-ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
xylBR：
5’-TTACGCCATTAATGGCAGAAGTTGCTGATAGAGGCGACGGAACGTTTCTCGTCGTGGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
2)以质粒pKD13为模板，采用引物xylBF和xylBR，PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为xylB同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。
经过测序，xylB同源重组片段的核苷酸序列为序列8，其中，第1-60位为xylB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为xylB基因下游同源臂。
3)利用电转化的方法将pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得E.coli MG1655(pKD46)。
4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养4h，加入阿拉伯糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。
5)利用菌落PCR的方法，以xylBF和xylBR为引物，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的xylB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，得到E.coli MG1655xylB-K(pKD46)。
6)将E.coli MG1655xylB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去pKD46质粒，得到E.coli MG1655xylB-K；E.coli MG1655xylB-K是xylB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。
7)将E.coli MG1655xylB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli MG1655xylB-K感受态细胞。
8)利用电转化的方法将pCP20转化到E.coli MG1655xylB-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以xylBF和xylBR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli MG1655基因组上的xylB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA1。
2、敲除maeA基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
maeA敲除引物序列如下：
maeAF：
5’-ATGGAACCAAAAACAAAAAAACAGCGTTCGCTTTATATCCCTTACGCTGGCCCTGTACTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
maeAR：
5’-TTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTCGCGGTATTCGGCTTGCCAGAAATTATCGTCAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
maeA同源重组片段的核苷酸序列为序列9，其中，第1-60位为maeA基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为maeA基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述1得到的突变体E.coliΔMA1。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以maeAF和maeAR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔMA1基因组上的maeA基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA2。
3、敲除maeB基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
maeB敲除引物序列如下：
maeBF：
5’-ATGGATGACCAGTTAAAACAAAGTGCACTTGATTTCCATGAATTTCCAGTTCCAGGGAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
maeBR：
5’-TTACAGCGGTTGGGTTTGCGCTTCTACCACGGCCAGCGCCACCATGTTGACGATACGACGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
maeB同源重组片段的核苷酸序列为序列10，其中，第1-60位为maeB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为maeB基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述2得到的突变体E.coliΔMA2。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以maeBF和maeBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔMA2基因组上的maeB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA3。
4、敲除mdh基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
mdh敲除引物序列如下：
mdhF：
5’-ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGGTATTGGCCAGGCGCTTGCACTACTGTTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
mdhR：
5’-TTACTTATTAACGAACTCTTCGCCCAGGGCGATATCTTTCTTCAGCGTATCCAGCATACCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
mdh同源重组片段的核苷酸序列为序列11，其中，第1-60位为mdh基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为mdh基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述3得到的突变体E.coliΔMA3。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以mdhF和mdhR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔMA3基因组上的mdh基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA4。
5、敲除fumAC基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
fumAC敲除引物序列如下：
fumAC-F：
5’-ATGTCAAACAAACCCTTTCATTATCAGGCTCCTTTTCCACTCAAAAAAGATGATACTGAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
fumACR：
5’-TTAACGCCCGGCTTTCATACTGCCGACCATCTGTTCTGGCCGTACCCAGCTGTCAAACTCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
fumAC同源重组片段的核苷酸序列为序列12，其中，第1-60位为fumAC基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为fumAC基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述4得到的突变体E.coliΔMA4。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以fumACF和fumACR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔMA4基因组上的fumAC基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA5。
6、敲除fumB基因
与上述1的方法基本相同，不同的是如下：
fumB敲除引物序列如下：
fumBF：
5’-ATGTCAAACAAACCCTTTATCTACCAGGCACCTTTCCCGATGGGGAAAGACAATACCGAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
fumB-R：
5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAAGTCGTTACCTTTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
fumB同源重组片段的核苷酸序列为序列13，其中，第1-60位为fumB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为fumB基因下游同源臂。
转化受体菌株为上述5得到的突变体E.coliΔMA5。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以fumBF和fumBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。
将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔMA5基因组上的fumB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20,命名为突变体E.coliΔMA6。
突变体E.coliΔMA6为敲除E.coli MG1655基因组上的xylB、maeA、maeB、mdh、fumA、fumB和fumC得到的重组菌。
四、重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-GA4和上述二得到的重组质粒pUC-MA3通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)。
E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)为将BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB转入大肠杆菌E.coli MG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的木酮糖激酶基因xylB、苹果酸脱氢酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重组菌。
五、对照重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-GA4通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)。
E.coliΔMA6(pMCS-GA4)为将BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA转入大肠杆菌E.coliMG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的木酮糖激酶基因xylB、苹果酸脱氢酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重组菌。
六、对照重组菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)的构建
1、将上述二得到的重组质粒pUC-MA3通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)。
E.coliΔMA6(pUC-MA3)为将glcD、glcE、glcF、aceB、glcB转入大肠杆菌E.coliMG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的木酮糖激酶基因xylB、苹果酸脱氢酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重组菌。
七、对照重组菌E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)的构建
1、将上述一得到的重组质粒pMCS-GA4和上述二得到的重组质粒pUC-MA3通过电转化的方法转化到大肠杆菌E.coli MG1655，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliMG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)。
E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)为将BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB转入大肠杆菌E.coli MG1655中。
实施例2、E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在生产苹果酸中的应用
一、摇瓶培养重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)生产苹果酸
1、将实施例1制备的重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMX1液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养72h，期间收集发酵液。
MMX1液体培养基的配制方法：每升培养基含6g木糖、2g NH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0g KH2PO4、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素和0.05g卡那霉素，其余为水。
微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.0311g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1.01g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的苹果酸和消耗的木糖进行定量检测。具体条件如下：
仪器：美国tsp公司Spectra系列HPLC仪，配有SCM1000型脱气泵，P2000型两台泵，AS3000型自动进样器，RI-150检测器。
色谱条件：Bio-RadHPX-87H(7.8×300mm)；流速0.50mL/min；柱温37度；流动相为7mM硫酸水溶液。
检测方法：
取0、2、4、6、8、10g/L的苹果酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号02288)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的苹果酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度浓度为横坐标，绘制标准曲线(图8)。苹果酸的出峰时间为9.040min。取0、4、8、12、16、20g/L的木糖标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号X1500)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的苹果酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度浓度为横坐标，绘制标准曲线(图9)。木糖的出峰时间为9.687min。
取2mL的发酵液，于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新Eppendorf管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。
将待测样品发酵上清液的苹果酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的苹果酸含量。将待测样品发酵上清液的木糖色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的残留木糖含量，将接种后初始的木糖含量减去发酵上清液中的残留木糖含量得到重组菌消耗的木糖量。
E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在摇瓶培养中获得的苹果酸产量和消耗的木糖的结果如表1所示：
表1、重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在摇瓶中的苹果酸的产量和木糖消耗情况
木糖转化率＝苹果酸产量/木糖消耗量(g/g)
由表1中的结果可以看出，本发明构建的重组菌株能够在添加木糖为碳源的简单矿物盐培养基中，发酵获得苹果酸，最终72h的苹果酸产量为3.26g/L，木糖转化率为0.54g/g。
二、对照菌株E.coliΔMA6(pMCS-GA4)的培养实验
1、将实施例1制备的重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)在含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMX1液体培养基(含卡那霉素，不含氨苄青霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养72h，期间收集发酵液。
3、经过HPLC检测，具体条件上述一的3所述，没有发现苹果酸的积累，表明仅将BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA转入大肠杆菌中，同时敲除xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC，所得到的重组菌以木糖为底物，不能合成苹果酸。
三、对照菌株E.coliΔMA6(pUC-MA3)的培养实验
1、将实施例1制备的重组菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMX1液体培养基(含氨苄青霉素，不含卡那霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养72h，期间收集发酵液。
3、经过HPLC检测，具体条件上述一的3所述，没有发现苹果酸的积累，表明仅将glcD、glcE、glcF、aceB、glcB转入大肠杆菌中，同时敲除xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC，所得的重组菌以木糖为底物，不能合成苹果酸。
四、对照菌株E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)的培养实验
1、将实施例1制备的重组菌E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MMX1液体培养基(含氨苄青霉素和卡那霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养72h，期间收集发酵液。
3、经过HPLC检测，具体条件上述一的3所述，没有发现苹果酸的积累，表明将BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB转入大肠杆菌中，如果不对内源的xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC等基因进行敲除，以木糖为底物，不能合成苹果酸。
五、发酵罐培养重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)生产苹果酸
1、将实施例1制备的重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为一级种子液。
2、按体积比4％的接种量，将一级种子液接种到MMX1液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养24h，作为二级种子液。
3、按体积比8％的接种量，将二级种子液接种到MMX2液体培养基中，在3L的发酵罐中，于37℃、转速600rpm、通气量1vvm、6M KOH调节pH至7.0条件下进行发酵，发酵时间为72h，期间收集发酵液上清。
MMX2液体培养基的配制方法：每升培养基含60g木糖、2g NH4Cl、5.0g(NH4)2SO4、6.0g KH2PO4、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素和0.05g卡那霉素，其余为水。
微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.0311g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1.01g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
4、通过高效液相色谱的对基因工程菌产生的苹果酸和消耗的木糖进行定量检测。具体条件上述一的3所述。
E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在发酵罐培养中获得的苹果酸产量和消耗的木糖的结果如表2所示：
表2、重组菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在发酵罐中的苹果酸的产量和木糖消耗情况
由表2中的结果可以看出，本发明构建的重组菌株能够在添加木糖为碳源的简单矿物盐培养基中，发酵获得苹果酸，最终72h的苹果酸产量为25.17g/L，木糖转化率为0.42g/g。
本发明以木糖为底物，通过代谢途径的理性设计，获得新的发酵生产苹果酸的工程菌株，为苹果酸的生物法合成提供了新的思路。

Claims (10)

1.一种构建重组菌的方法，为提高大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的表达或活性，且使所述大肠杆菌表达磷酸戊糖异构酶基因，且抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因、苹果酸脱氢酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇的表达或活性，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述提高大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的表达或活性为增加大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的拷贝数；
所述使所述大肠杆菌表达磷酸戊糖异构酶基因为将含有磷酸戊糖异构酶基因及其启动子的DNA分子导入所述大肠杆菌中；
所述抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因、苹果酸脱氢酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇表达或活性为敲除所述大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因、苹果酸脱氢酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述增加大肠杆菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因、醛脱氢酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、苹果酸合酶基因簇的拷贝数为将含有墨角藻糖激酶基因及其启动子的DNA分子、含有墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因及其启动子的DNA分子、含有醛脱氢酶基因及其启动子的DNA分子、含有乙醇酸氧化酶基因簇及其启动子的DNA分子、含有苹果酸合酶基因簇中各基因及其各自启动子的DNA分子导入所述大肠杆菌中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述导入是通过重组载体的方式进行；
或所述敲除是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；
或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；
或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述乙醇酸氧化酶基因簇由glcD、glcE和glcF组成。
所述苹果酸合酶基因簇由aceB和glcB组成；
所述苹果酸脱氢酶基因簇由mdh、maeA和maeB组成；
所述延胡索酸水合酶基因簇由fumA、fumB和fumC组成。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述磷酸戊糖异构酶基因来自于伯克霍尔德氏菌属Burkholderia
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述含有磷酸戊糖异构酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列1；
所述含有墨角藻糖激酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列2；
所述含有墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列3；
所述含有醛脱氢酶基因及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列4；
所述含有乙醇酸氧化酶基因簇及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列5；
所述含有苹果酸合酶基因aceB及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列6；
所述含有苹果酸合酶基因glcB及其启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列7；
所述敲除大肠杆菌基因组中的木酮糖激酶基因xylB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列8；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因maeA基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列9；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因maeB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列10；
所述敲除大肠杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶基因mdh基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列11；
所述敲除大肠杆菌基因组中的延胡索酸水合酶基因fumAC基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列12；
所述敲除大肠杆菌基因组中的延胡索酸水合酶基因fumB基因采用λ-red同源重组方式，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列13。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli MG1655。
9.由权利要求1-8中任一所述的方法制备的重组菌。
10.权利要求9所述重组菌在生产苹果酸中的应用；
或一种生产苹果酸的方法，发酵所述重组菌，得到苹果酸。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753802A (zh) * 2018-05-22 2018-11-06 昆明理工大学 一个苹果酸脱氢酶基因cimdh1及其重组表达载体
CN110951660A (zh) * 2019-12-19 2020-04-03 江南大学 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
CN112458032A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 南京盛德生物科技研究院有限公司 用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101255405A (zh) * 2008-04-11 2008-09-03 南京工业大学 新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法
CN101649300A (zh) * 2009-09-07 2010-02-17 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种产l-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104046577A (zh) * 2014-04-01 2014-09-17 南京工业大学 一株产苹果酸基因工程菌及其构建及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101255405A (zh) * 2008-04-11 2008-09-03 南京工业大学 新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法
CN101649300A (zh) * 2009-09-07 2010-02-17 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种产l-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104046577A (zh) * 2014-04-01 2014-09-17 南京工业大学 一株产苹果酸基因工程菌及其构建及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
X.ZHANG ET AL.: "L-Malate Production by Metabolically Engineered Escherichia coli", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
ZHENG-JUN LI ET AL.: "Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-malate from xylose", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
吴亚斌等: "产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建", 《生物加工过程》 *
洪鹏辉: "木糖生物合成L-苹果酸的代谢工程研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753802A (zh) * 2018-05-22 2018-11-06 昆明理工大学 一个苹果酸脱氢酶基因cimdh1及其重组表达载体
CN112458032A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 南京盛德生物科技研究院有限公司 用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用
CN110951660A (zh) * 2019-12-19 2020-04-03 江南大学 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
WO2021120237A1 (zh) * 2019-12-19 2021-06-24 江南大学 一株固定co 2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
CN110951660B (zh) * 2019-12-19 2021-12-03 江南大学 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

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