CN110317767B - 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法 - Google Patents

一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110317767B
CN110317767B CN201910599466.0A CN201910599466A CN110317767B CN 110317767 B CN110317767 B CN 110317767B CN 201910599466 A CN201910599466 A CN 201910599466A CN 110317767 B CN110317767 B CN 110317767B
Authority
CN
China
Prior art keywords
threonine
pfw01
genetically engineered
phacab
twf001
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910599466.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110317767A (zh
Inventor
王小元
王建莉
马文渐
方宇
赵磊
董笑飞
詹依
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910599466.0A priority Critical patent/CN110317767B/zh
Publication of CN110317767A publication Critical patent/CN110317767A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110317767B publication Critical patent/CN110317767B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01036—Acetoacetyl-CoA reductase (1.1.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB，在三氯生表达质粒pFW01上过表达了phaCAB，可以在胞外合成苏氨酸，胞内合成PHB。本发明构建的菌株苏氨酸合成量大大提高，在摇瓶发酵水平产量为17.0g/L，在3‑L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为96.4g/L，在10L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为133.5g/L。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB生长状况良好，未引入外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。

Description

一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。
技术背景
作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。
苏氨酸的工业生产方法主要有蛋白水解、化学合成和微生物发酵。相对于前两种方法，发酵法优点是原料便宜、反应条件温和、环境污染小、效率高等。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，基因操作简单，发酵周期短等优点，在工业生产饲料添加级苏氨酸中占主要地位。
由于目前苏氨酸生产高产菌是大肠杆菌，大肠杆菌虽生长迅速发酵周期短，但是转化率也并不高。该工业化生产的出发菌株，目前利用葡萄糖生产苏氨酸经济效益最好，但是转化率低，摇瓶作为对照时，转化率为40％。
发明内容
本发明目的在于提高该菌株的产量和转化率，并建立一种在大肠杆菌里高产苏氨酸的方法，同时这种方法可以运用到不同的产品生产。
本发明第一个目的是提供一株高产苏氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有苏氨酸生产能力的菌株为出发菌株，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为出发菌株，以质粒pFW01为表达质粒；所述TWF001和pFW01公开于2018年的论文《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shuntand the l-threonine biosynthesis pathway》。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF001中，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，该基因簇如GenBank登录号MH558939.1所示核苷酸序列。
在本发明的一种实施方法中，基因phaA、phaB和phaC分别编码的β-酮硫解酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶，在大肠杆菌中可以以乙酰辅酶A为底物合成β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)。
本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将所述phaCAB基因簇与表达载体连接，在大肠杆菌宿主细胞中表达。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pFW01。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌TWF001。
本发明的第三个目的是提供一种联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯的方法，应用所述基因工程菌进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，35～37℃，180～220rpm发酵至少24h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程控制溶氧为30％，pH 6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌经过两级种子培养。
在本发明的一种实施方式中，第一级种子培养基为LB培养基，第二级种子培养基含有32.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)2SO4,15g/L酵母浸提物,9.5g/L KH2PO4,24.35g/L K2HPO4,1g/LMgSO4·7H2O,pH 7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程中还进行补料。
在本发明的一种实施方式中，所述补料是当发酵体系残糖低于5g/L时则补加葡萄糖溶液至残糖达10g/L。
本发明还要求保护所述基因工程菌在生产含L-苏氨酸和/或β-聚3-羟基丁酸酯及其衍生物方面的应用。
本发明的效果：
(1)本发明构建的一株高产苏氨酸的菌株E.coli TWF001/pFW01-phaCAB，遗传性能非常稳定，应用时无需添加抗生素，只需要添加终浓度为1μM的三氯生即可保证质粒稳定遗传，适合工业化生产。
(2)在工业化生产苏氨酸的菌株里面，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，通过联产β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)的方法，能有效提高苏氨酸产量。应用本发明的方法构建的菌株TWF001/pFW01-phaCAB的苏氨酸产量在10-L发酵罐水平达到133.5g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了41.6％，转化率对应也提高了31.6％；在3-L发酵罐水平达到96.4g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了31.7％，转化率对应也提高了31.7％；在摇瓶发酵水平达到17.0g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了74.9％，转化率对应也提高了72.7％；该方法核心思想是通过联产PHB，拉动胞内碳源代谢，增加乙酰辅酶A合成量，减少副产物乙酸的合成，增强细胞的代谢平衡，并通过乙醛酸循环快速利用乙酰辅酶A。
(3)本发明的方法——通过偶联PHB和苏氨酸合成，能够有效提高苏氨酸产量，同时也适用于通过联产PHB的途径生产其他天冬氨酸族氨基酸，比如将苏氨酸合成基因改变为赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸等途径的基因生产相应氨基酸；
附图说明
图1：重组质粒pFW01-phaCAB示意图。
图2：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵情况；其中，A为菌株生长，B为菌株发酵的耗糖情况，C为苏氨酸产量，D为发酵36h后的乙酸合成量。
图3：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵合成PHB的情况；其中，A为TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB颗粒的激光共聚焦观察照片，B为对照菌TWF001/pFW01的激光共聚焦观察照片，C为PHB合成量。
图4：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵对数期合成乙酰辅酶A和苹果酸的情况。
图5：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株耗糖情况，C为菌株发酵的苏氨酸产量。
图6：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的10-L罐发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株发酵的苏氨酸产量。
具体实施方式
实施例1重组菌TWF001/pFW01-phaCAB的构建
(1)以罗氏真养菌基因组NC_008313.1为模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R扩增phaCAB基因簇，扩增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列为
phaCAB-F：5’-CTGCTCGAGAGAAGGAGAATCAAATCATGGCTACCGG-3’
phaCAB-R：5’-CCGGAATTCAGGTCAGCCCATATGCAGG-3’
(2)用限制性内切酶XhoI和EcoRI消化PCR产物，载体pFW01(载体pFW01的构建方法参见文章《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineeringthe glyoxylate shunt and the l-threonine biosynthesis pathway》)用EcoRI和XhoI消化处理，酶切产物纯化后，使用T4连接酶22℃过夜处理，转化至大肠杆菌DH5α，筛选正确转化子，对于得到的正确转化子，提取质粒后用1.8kV，5ms电转化入谷氨酸棒杆菌WM001感受态，再次筛选正确的基因工程重组菌TWF001/pFW01-phaCAB转化子。
(3)提取pFW01质粒后直接电转化入TWF001，获得正确转化子，命名为TWF001/pFW01，作为无异源表达phaCAB基因的空载质粒对照菌株。
实施例2应用大肠杆菌基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB摇瓶发酵生产PHB和L-苏氨酸(1)重组基因工程菌的摇瓶发酵
种子培养基I：LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；
摇瓶发酵培养基I：30g/L葡萄糖、25g/L(NH4)2SO4、7.5g/L KH2PO4、2g/L酵母提取物、2g/L柠檬酸、1g/L MgSO4·7H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、5mg/L MnSO4·4H2O、20g/L CaCO3，pH 6.8或pH 7.0；
培养方法：37℃，200rpm，培养36h。
发酵结束后，pH6.8条件下，苏氨酸合成量更多，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸17.0g/L，葡萄糖转化系数为0.57g/g，乙酸合成2.83g/L；而对照菌TWF001/pFW01合成9.72g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.33g/g，乙酸合呈7.65g/L。
(2)重组基因工程菌的3-L罐发酵
一级种子培养基I：LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；
二级种子培养基II：32.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)2SO4,15g/L酵母浸提物,9.5g/LKH2PO4,24.35g/L K2HPO4,1g/L MgSO4·7H2O,pH 7.0.
发酵培养基II：20g/L葡萄糖,3g/L酵母浸提物,2g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.5g/LMgSO4·7H2O,5mg/L FeSO4·7H2O,5mg/L MnSO4·4H2O；
补料分批发酵条件：将甘油管中的菌体在LB平板上活化，然后接种到含有25mL种子培养基的250mL摇瓶培养4h，接着按初始OD＝0.2接种到两瓶含有50mL种子培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm培养4h，接着把两瓶种子液转入含有1.1L的3-L罐中，溶氧控制在30％，pH控制在6.8，当体系残糖低于5g/L时则补加700g/L葡萄糖溶液至残糖约为10g/L，通气量为1.5L/min，发酵36h。
发酵结束后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸96.4g/L，葡萄糖转化系数为0.54g/g，而对照菌TWF001/pFW01合成73.2g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.41g/g。
(3)重组基因工程菌的10-L罐发酵
一级种子培养基III：1.2g/L蔗糖,10g/L胰蛋白胨,8g/L酵母浸提物,4g/L(NH4)2SO4,3g/L K2HPO4,0.4g/L MgSO4,0.01g/L FeSO4，0.01g/L MnSO4,5g/L谷氨酸钠,0.2g/L蛋氨酸,pH 7.0.；
二级种子培养基IV：30g/L葡萄糖,2.86g/L酵母浸提物,5.7g/L玉米糖浆,2.86g/LK2HPO4,0.57g/L MgSO4,4.29g/L氨基酸混合物(包括0.026g/g天冬氨酸,0.034g/g谷氨酸,0.025g/g丝氨酸,0.018g/g甘氨酸,0.014g/g苏氨酸,0.010g/g精氨酸,0.014g/g丙氨酸,0.0032色氨酸,0.0039g/g半胱氨酸,0.021g/g甲硫氨酸,0.011g/g苯丙氨酸,0.011g/g异亮氨酸,0.0088g/g亮氨酸,0.0041g/g赖氨酸),1mg/L维生素B1,0.1mg/L ATP,pH 7.0.
发酵培养基III：25g/L葡萄糖,3.2g/L玉米糖浆,0.63g/L盐酸甜菜碱,0.39g/LMgSO4,0.85g/L KCl,10mg/L FeSO4,10mg/L MnSO4,0.84g/L H3PO4,1.05g/L氨基酸混合物(包括0.026g/g天冬氨酸,0.034g/g谷氨酸,0.025g/g丝氨酸,0.018g/g甘氨酸,0.014g/g苏氨酸,0.010g/g精氨酸,0.014g/g丙氨酸,0.0032色氨酸,0.0039g/g半胱氨酸,0.021g/g甲硫氨酸,0.011g/g苯丙氨酸,0.011g/g异亮氨酸,0.0088g/g亮氨酸,0.0041g/g赖氨酸),24mg/L消泡油,pH 6.8；
补料分批发酵条件：将甘油管中的菌体在LB平板上活化16h，然后接种到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶培养4h，接着将种子液按照初始OD600＝0.1转接到两瓶含有500mL种子培养基的2L摇瓶，37℃、200rpm培养4h，接着把两瓶种子液转入含有4L的10-L罐中，溶氧控制在30％，pH控制在6.8-6.9，当溶氧过高和体系残糖低于5g/L时则补加700g/L葡萄糖溶液至残糖为10g/L以上，发酵36h。
发酵结束后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸133.5g/L，葡萄糖转化系数为0.50g/g，而对照菌TWF001/pFW01合成94.3g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.38g/g。
(4)实施例2中的基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01胞内PHB的酯化：将所得发酵液中的菌体离心后，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，在真空冷冻干燥机中过夜冻干，称取20mg左右(质量记为Wt)的干菌体，加入到酯化管中，再加入2mL氯仿和2mL甲醇溶液，其中甲醇溶液是在甲醇中加入了3％的浓硫酸，将酯化管置于100℃的水浴锅中，酯化6小时，置于室温下半个小时，加入1mL水，充分震荡后分层，吸取下相；
(3)标样PHB的酯化：称取约5mg的PHB标样(质量分别记为WtB)加入酯化管中进行酯化，之后步骤同上述(2)；
(4)胞内PHB产量计算
得出基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB的酯化产物有一个特征峰，记为A，其面积记为As，对应标样PHB也有同样出峰时间的特征峰，标样特征峰面积记为A0s；那么所合成的PHB占细胞干重比为Wt％＝(As/A0s*WtBV)/Wt。
摇瓶发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重12.2％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB；3-L罐发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重11.5％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB；10-L罐发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重13.0％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB。
实施例4
(1)重组菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01的胞内乙酰辅酶A的测定
收集2mL实施例2中步骤(1)制备的OD600＝9.0左右的发酵菌液，置于冰上，并采用试剂盒Acetyl-CoA Assay Kit(Solarbio,Beijing,China)进行乙酰辅酶A提取及测定，在340nm测定光吸收值,乙酰辅酶A的合成量通过公式Acetyl-CoA (nmol/g wetcell)＝(1640*ΔA+0.012)/(OD600*1.7*0.002)；ΔA＝A80s-A20s计算获得，其中A80s为加入工作液后的80s的OD340nm，其中A20s为加入工作液后的20s的OD340n。
基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB每克湿细胞合成乙酰辅酶A量为4.51μmol/g，而对照菌TWF001/pFW01每克湿细胞合成乙酰辅酶A量为1.43μmol/g；
(2)重组菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01的胞内苹果酸的测定
参照实施例4(1)中方法收集菌体，用冰水洗涤2次，采用1mL去离子水重悬并进行超声破碎10min，超声2s，停歇3s，工作效率为17％，然后离心10min，收集上清，进行高效液相测定，柱子采用Diamonsil C18column(5μm,250mm×4.6mm No.99603)(DiKMAtechnology,Beijing,China)。
基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB每克湿细胞合成苹果酸量为0.32μmol/g，而对照菌TWF001/pFW01每克湿细胞合成苹果酸量为0.22μmol/g。
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgctcgaga gaaggagaat caaatcatgg ctaccgg 37
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccggaattca ggtcagccca tatgcagg 28

Claims (7)

1.一株基因工程菌，其特征在于，是过表达了来自罗氏真养菌的phaCAB基因簇的大肠杆菌，可联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯；所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为宿主，以pFW01为表达载体，过表达了序列如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇。
2.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇与表达载体pFW01连接，转化至大肠杆菌TWF001中。
3.一种联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，应用权利要求2所述的基因工程菌进行发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，35～37℃，180～220rpm发酵至少24h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程控制溶氧为30％，pH 6.8。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中还进行补料；所述补料是当发酵体系残糖低于5g/L时则补加葡萄糖溶液至残糖达10g/L。
7.权利要求1所述基因工程菌在生产含L-苏氨酸和/或β-聚3-羟基丁酸酯及其衍生物方面的应用。
CN201910599466.0A 2019-07-04 2019-07-04 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法 Active CN110317767B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910599466.0A CN110317767B (zh) 2019-07-04 2019-07-04 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910599466.0A CN110317767B (zh) 2019-07-04 2019-07-04 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110317767A CN110317767A (zh) 2019-10-11
CN110317767B true CN110317767B (zh) 2021-01-29

Family

ID=68122654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910599466.0A Active CN110317767B (zh) 2019-07-04 2019-07-04 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110317767B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852572B (zh) * 2019-01-28 2021-05-28 江南大学 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法
CN111363757B (zh) * 2020-01-19 2022-08-09 江南大学 一种温度开关系统及其在提高氨基酸产量中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201231664A (en) * 2011-01-28 2012-08-01 Univ Yuan Ze A method for the polyhydroxybutyrate (PHB) production by using recombinant escherichia coli
CN104046577A (zh) * 2014-04-01 2014-09-17 南京工业大学 一株产苹果酸基因工程菌及其构建及应用
CN104946552A (zh) * 2015-02-03 2015-09-30 上海交通大学 安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201231664A (en) * 2011-01-28 2012-08-01 Univ Yuan Ze A method for the polyhydroxybutyrate (PHB) production by using recombinant escherichia coli
CN104046577A (zh) * 2014-04-01 2014-09-17 南京工业大学 一株产苹果酸基因工程菌及其构建及应用
CN104946552A (zh) * 2015-02-03 2015-09-30 上海交通大学 安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cupriavidus necator H16 PhaC1 (phaC1), PhaA (phaA), and PhaB1 (phaB1) genes, complete cds;Wu,Y.H.等;《genbank》;20190312;LOCUS，ACCESSION，AUTHORS，CDS，ORIGIN 部分 *
Increasing L-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the L-threonine biosynthesis pathway;Hui Zhao等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20180430;第102卷;摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110317767A (zh) 2019-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11198890B2 (en) Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation
JP6341936B2 (ja) ５−アミノレブリン酸の高生産株及びその製造方法と使用
ES2318016T3 (es) Metodo y materiales para la produccion de productos organicos en celulas de especies de candida.
CN109868254B (zh) 一种高产泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN109913398B (zh) 无需β-丙氨酸添加的高产泛酸的基因工程菌、构建及应用
CN112195143B (zh) 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法
CN109321590B (zh) 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
JP2001525682A (ja) 改良された性質を有する形質転換微生物
JP2016518145A (ja) コハク酸を生産するための組換え大腸菌、及び組み換え大腸菌の使用
CN105907732A (zh) 一种d-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用
CN110317767B (zh) 一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法
CN108359628B (zh) 利用乙酸和丙酸生产聚羟基脂肪酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用
CN113249238B (zh) 一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用
CN116970659B (zh) 一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法
CN106434772B (zh) 一株生产l-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用
EP2348101B1 (en) Corynebacterium genus microorganism having ability to produce n-acetyl glucosamine and method for producing n-acetyl glucosamine or glucosamine using same
CN113652383A (zh) 一种高产d-泛酸的基因工程菌及其应用
CN106190901B (zh) 一种菌及其获取方法和应用
CN111549027A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌高强度启动子Psod-sx及应用
Jantama Technology toward biochemicals precursors and bioplastic production
CN114958635A (zh) 一种基于脂肪酸和油脂促进柚皮素合成的方法及其应用
KR102177743B1 (ko) 4-하이드록시발레르산을 생산하는 형질전환된 슈도모나스 푸티다
KR101914180B1 (ko) 글리세롤 함유 바이오디젤 생성 부산물을 이용한 메발로네이트 생합성 방법
KR20070096347A (ko) ４―ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＨＢ）생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 ４ＨＢ의 제조방법
WO2023186037A1 (zh) 一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶a及乙酰辅酶a衍生物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant