CN110951660A - 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株固定CO2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵领域。所述工程菌是对大肠杆菌Escherichia coli MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为敲除富马酸还原酶基因、富马酸酶基因、乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因，并游离过表达甲酸脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、酰化乙醛脱氢酶、甲醛裂合酶、二羟基丙酮激酶、苹果酸酶和亚磷酸氧化还原酶，获得菌株GH0407。上述菌株用于发酵生产苹果酸，以CO2和葡萄糖作为共底物厌氧发酵72h，苹果酸产量达到39g/L，得率为1.53mol/mol，原始出发菌株不积累苹果酸。

Description

一株固定CO2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及一株固定CO2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵工程领域。
背景技术
大气CO2浓度的不断提升影响了全球气候变化，因此迫切需要发展有效的CO2封存技术，以增强CO2的捕获或者减少CO2的释放。传统的基于物理和化学方法的二氧化碳封存技术，包括二氧化碳捕获(如后燃烧和氧燃料燃烧)、二氧化碳分离(如吸附和膜分离)和二氧化碳储存(如盐碱含水层、近海地质构造)，对于减缓二氧化碳具有重要意义。然而，这些方法存在一些明显的不足，如能耗大，运行成本高，或产生对人体健康和环境都有害的降解产物。相比之下，微生物CO2封存是缓解温室效应的一种绿色环保途径，还可以同时生产高附加值化学品。
异养微生物固定CO2可分为三个层次：(i)直接增强异养微生物中的内源性羧化反应；(ii)在异养微生物中构建人工合成的CO2固定支路并连接到中心碳代谢；(iii)改造异养微生物使其能够以CO2作为唯一碳源生长。第一层次的显著缺陷是只能生产少数特殊的化合物，对于合成途径没有羧化反应的产物来说无法固定CO2，而第三层次目前还没有完全实现，目前最好的研究进展是获得了一株半自养型大肠杆菌。因此，为了更好的利用异养微生物固定CO2生产化学品，需要人工构建新的CO2固定途径，并且连接到糖酵解上游，从而达到CO2固定效率高，产物谱广的目的。
L-苹果酸是一种重要的四碳平台化合物，已被美国能源部列为基础化合物之一，其应用领域涉及食品、医药、化工等行业。在食品领域，L-苹果酸已成为继柠檬酸、乳酸之后，用量排第三位的食品酸味剂；在医药行业中，L-苹果酸直接参与人体新陈代谢，具有抗疲劳保护肝肾心脏的作用以及降低抗癌药物的毒副作用等；在化工领域，L-苹果酸被用于日用化妆品的生产，金属的清洗和修整，织物整理，化学镀层等。L-苹果酸是三羧酸循环中的重要中间代谢物，野生型大肠杆菌的发酵液中不能检测到苹果酸(低于HPLC检测限)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能够固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，所述大肠杆菌工程菌株被敲除富马酸还原酶基因(frdBC)、富马酸酶基因(fumB)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和乙醇脱氢酶基因(adhE)，并过量表达甲酸脱氢酶(FDH)、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、酰化乙醛脱氢酶(ACDH)、甲醛裂合酶(FLS)、二羟基丙酮激酶(DHAP)、苹果酸酶(ME)和亚磷酸氧化还原酶(PTXD)。
在本发明的一种实施方式中，所述富马酸还原酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418577.1或NP_418576.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述富马酸酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418546.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_415898.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_415757.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌是以Escherichia coliMG1655为宿主得到的；所述Escherichia coli MG1655(
Figure BDA0002326335550000021
700926TM)是ATCC上购买的野生型大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:CP001666.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418493.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述酰化乙醛脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，甲醛裂合酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，二羟基丙酮酸激酶的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418493.1的基因一致。
在本发明的一种实施方式中，所述亚磷酸氧化还原酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、酰化乙醛脱氢酶、甲醛裂合酶和二羟基丙酮激酶是由同尾酶组装的方式逐步连接到载体pER上进行过量表达，最终质粒命名为pER-CF5A。所述苹果酸酶基因和亚磷酸氧化还原酶基因是由同尾酶组装的方式连接到载体pCDR上进行过量表达，最终质粒命名为pCDR-ME-PTXD。
本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌工程菌在发酵生产苹果酸方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度30-37℃、转速700-800rpm、氧气通气量0.8-1.2vvm、pH＝6.5-7.0条件下进行好氧培养12-18h；然后，将氧气通气量调至0vvm，转速调整至180-200rpm，并通入氮气10-20min(1vvm)，厌氧条件下发酵时间60-80h，维持pH中性。可选地，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度37℃、转速800rpm、氧气通气量1vvm、pH＝6.5-7.0条件下进行好氧培养；其次，将氧气通气量调至0vvm，转速调整至200rpm，并通入氮气10-20min(1vvm)，厌氧条件下发酵时间72h，采用250g/L KHCO3作为酸碱中和剂以维持pH＝7。
所述发酵使用的发酵培养基含有葡萄糖40-50g/L，Na2HPO3·5H2O 20-50mM，KHCO330-50mM，Na2HPO4·12H2O 15.11g/L、KH2PO4 3g/L NH4Cl 1g/L、NaCl 0.5g/L，每L培养基含有1mL微量元素液；微量元素液：FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl2 0.15g/L、ZnCl2·4H2O 0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO3 0.075g/L、MnCl2·4H2O 0.495
g/L，溶于0.1M HCl中配制。
本发明的有益效果：
本发明通过敲除富马酸还原酶基因和富马酸酶基因构建了一株可以少了积累苹果酸的工程菌株。以阻断丙酮酸为节点合成苹果酸是目前发现的最短路径之一，构建该路径时，需要将丙酮酸节点的主要副产物合成途径进行阻断。本发明通过敲除乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因，以达到增加前体丙酮酸积累的目的。
本发明以Escherichia coli MG1655为出发菌株，利用代谢工程手段，通过构建CO2固定途径、苹果酸合成途径、阻断苹果酸代谢去路以及和阻断丙酮酸谢支路，从而得到生产苹果酸的大肠杆菌基因工程菌。在发酵72h后苹果酸的产量达到39g/L，苹果酸对葡萄糖得率为1.53mol/mol。该发酵过程为厌氧发酵，产品得率高、产量大，目前未见本发明中CO2固定途径生产苹果酸的报道。
本发明将CO2固定与苹果酸生产相结合，不仅能够对有效缓解温室效应提供新的方案，而且可以同时为苹果酸的生产提供新的思路，将废弃物质变成有用物质。
附图说明
图1大肠杆菌工程菌中构建CO2合成苹果酸的路径。
图2frdBC基因敲除验证电泳图【1-18号泳道均表示成功敲除frdBC基因的转化子，19号泳道(标注“+”)表示野生型大肠杆菌的菌落PCR结果，19号泳道(标注“-”)为空白对照组】。
图3fumB基因敲除验证电泳图【1-11、13-14号泳道均表示成功敲除fumB基因的转化子，12、15-16号泳道是未成功敲除fumB基因的转化子，17号泳道(标注“+”)表示野生型大肠杆菌的菌落PCR结果，18号泳道(标注“-”)为空白对照组】。
图4ldhA基因敲除验证电泳图【3号泳道是未成功敲除fumB基因的转化子，8-10号泳道表示成功敲除ldhA基因的转化子】。
图5adhE基因敲除验证电泳图【1-4、6-14、16号泳道均表示成功敲除adhE基因的转化子，17号泳道(标注“+”)表示野生型大肠杆菌的菌落PCR结果，18号泳道(标注“-”)为空白对照组】。
图6重组质粒pER-CF5A的图谱。
图7重组质粒pCDR-ME-PTXD的图谱。
图8大肠杆菌发酵生产苹果酸产量-时间曲线。
图9大肠杆菌发酵生产苹果酸得率。
具体实施方式
苹果酸检测方法(高效液相色谱条件)：色谱柱：Aminex HPX-87H(7.8×300mm)，流动相：5mM H2SO4，柱温：35℃，检测波长：210nm，进样量：10μl，流速：0.6ml/min。
商业化质粒产品的购买来源：pKD4、pKD46以及pCP20质粒购自BioVector NTCC。pER质粒是pETM6(购自addgene，#49795)改造启动子区域后获得的质粒，pCDR质粒是pCDM4(购自addgene，#49796)改造启动子区域后获得的质粒。
CO2固定速率的检测及计算方法：(1)检测方法：首先，使用LB培养基将大肠杆菌培养至对数生长中期(OD600＝0.4-0.8)；其次，收集对数中期细胞，并使用20mL M9培养基(含5-10g/L葡萄糖和20-50mM NaHCO3)重悬至OD600＝3-5；再次，将20mL的细胞悬液转移至25mL的血清瓶中培养2h；最后，注入浓盐酸释放细胞悬液中的总无机碳，用气相色谱仪测定血清瓶顶空气体中CO2的浓度。气相色谱柱：RTX-QBOND(30m；0.32mm内径，膜厚度10mm(美国宾夕法尼亚州贝尔方特RESTEK公司)。载气为氦气，色谱柱恒温80℃,流速15mL/min，进样口压力68.8kPa。
(2)计算方法：CO2固定速率＝(B-A)mg/mL×5mL/(C mg×2h)
注：A和B分别为血清瓶中培养前后血清瓶顶空的CO2浓度，顶空体积为5mL，血清瓶中细胞干重为C mg，培养时间为2h。
实施例1：构建能够固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株
(1)E.coli MG1655富马酸还原酶基因frdBC的敲除
根据NCBI数据库中Escherichia coli MG1655的frdBC基因序列设计敲除引物QCfrdBC-S和QCfrdBC-A(表1)，以pKD4质粒为模板扩增frdBC的敲除框并进行胶回收。
备注：pKD4质粒包含两个FRT位点(在翻转酶作用下可以折叠从而消除FRT位点之间的DNA序列)，两个FRT位点之间是卡那霉素(kan，作为基因敲除的筛选压力)的编码基因，即FRT-kan-FRT。在敲除基因时，设计引物扩增出FRT-kan-FRT的DNA片段。需要指出的是，设计的两条扩增引物分别包含靶基因的上下游39-49bp，即我们最终获得的DNA片段是“靶基因上游39-49bp-FRT-kan-FRT-靶基因上游39-49bp”，这个DNA片段称为靶基因的敲除框。
将frdBC的敲除框通过电转化的形式导入含有pKD46质粒的E.coli MG1655感受态细胞中(电转化电压和时间分别为1800V和5ms)。将电转的感受态细胞涂布于含卡那霉素(50g/mL)的LB固体培养基平板上，倒置培养12-24h。待平板长出单菌落后，使用验证引物YZfrdBC-S和YZfrdBC-A(表1)筛选阳性转化子。
将pCP20质粒转化至阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，再使用YZfrdBC-S和YZfrdBC-A引物进行验证，成功敲除的转化子电泳条带大小为529bp，没有敲除的对照组电泳条带大小为1917bp(图2)。在MG1655体内成功敲除frdBC基因的菌株命名为GH0101。
(2)E.coli GH0101富马酸酶基因fumB的敲除
根据NCBI数据库中Escherichia coli MG1655的fumB基因序列设计敲除引物QCfumB-S和QCfumB-A(表1)，以pKD4质粒为模板扩增fumB的敲除框并进行胶回收。
将fumB的敲除框通过电转化的形式导入含有pKD46质粒的E.coli GH0101感受态细胞中(电转化电压和时间分别为1800V和5ms)。将电转的感受态细胞涂布于含卡那霉素(50g/mL)的LB固体培养基平板上，倒置培养12-24h。待平板长出单菌落后，使用验证引物YZfumB-S和YZfumB-A(表1)筛选阳性转化子。
将pCP20质粒转化至阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，再使用YZfumB-S和YZfumB-A引物进行验证，成功敲除的转化子电泳条带大小为506bp，没有敲除的对照组电泳条带大小为1940bp(图3)。在GH0101体内成功敲除fumB基因的菌株命名为GH0201。
(3)E.coli GH0201乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
根据NCBI数据库中Escherichia coli MG1655的ldhA基因序列设计敲除引物QCldhA-S和QCldhA-A(表1)，以pKD4质粒为模板扩增ldhA的敲除框并进行胶回收。
将ldhA的敲除框通过电转化的形式导入含有pKD46质粒的E.coli GH0201感受态细胞中(电转化电压和时间分别为1800V和5ms)。将电转的感受态细胞涂布于含卡那霉素(50g/mL)的LB固体培养基平板上，倒置培养12-24h。待平板长出单菌落后，使用验证引物YZldhA-S和YZldhA-A(表1)筛选阳性转化子。
将pCP20质粒转化至阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，再使用YZldhA-S和YZldhA-A引物进行验证，成功敲除的转化子电泳条带大小为744bp，没有敲除的对照组电泳条带大小为2132bp(图4)。在GH0201体内成功敲除ldhA基因的菌株命名为GH0301。
(4)E.coli GH0301乙醇脱氢酶基因adhE的敲除
根据NCBI数据库中Escherichia coli MG1655的adhE基因序列设计敲除引物QCadhE-S和QCadhE-A(表1)，以pKD4质粒为模板扩增adhE的敲除框并进行胶回收。
将adhE的敲除框通过电转化的形式导入含有pKD46质粒的E.coli GH0301感受态细胞中(电转化电压和时间分别为1800V和5ms)。将电转的感受态细胞涂布于含卡那霉素(50g/mL)的LB固体培养基平板上，倒置培养12-24h。待平板长出单菌落后，使用验证引物YZadhE-S和YZadhE-A(表1)筛选阳性转化子。
将pCP20质粒转化至阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，再使用YZadhE-S和YZadhE-A引物进行验证，成功敲除的转化子电泳条带大小为352bp，没有敲除的对照组电泳条带大小为2676bp(图5)。在GH0301体内成功敲除adhE基因的菌株命名为GH0401。
(5)FDH、ACS、ACDH、FLS和DHAK蛋白的过表达
根据NCBI数据库中提供的永达尔梭菌甲酸脱氢酶基因序列设计扩增引物FDH-S与FDH-A(表1)，以永达尔梭菌基因组为模板，扩增出FDH蛋白的基因序列，胶回收后采用一步同源重组的方式连接到质粒pER(BglII和XhoI)上得到重组质粒pER-FDH；pER质粒的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
根据NCBI数据库中提供的大肠杆菌MG1655乙酰CoA合成酶基因序列设计扩增引物ACS-S与ACS-A(表1)，以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，扩增ACS蛋白的编码基因序列，胶回收后采用一步同源重组的方式连接到质粒pER(BglII和XhoI)上得到重组质粒pER-ACS；
根据文献提供的ACDH、FLS和DHAK基因序列，采用基因合成的方式，分别得到ACDH、FLS和DHAK编码基因的片段，然后以酶切连接的方式连接到质粒pER上(BglII和XhoI)，分别得到重组质粒pER-ACDH、pER-FLS和pER-DHAK；采用同尾酶组装技术【ACS Synth Biol1,256-266(2012)】，分别将上述五个质粒(pER-FDH、pER-ACS、pER-ACDH、pER-FLS和pER-DHAK)逐步组装成一个质粒pER-CF5A。采用的同尾酶为BlnI和SpeI，酶切位点的位置见图6。
(6)ME和PTXD蛋白的过表达
根据NCBI数据库中提供的丙酮丁醇梭菌苹果酸酶基因序列设计扩增引物ME-S与ME-A(表1)，以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，扩增出编码苹果酸酶的基因片段，并采用一步同源重组的方式连接到质粒pCDR(BglII和XhoI)上得到重组质粒pCDR-ME；pCDR质粒的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
采用基因合成的方式，得到PTXD编码基因的片段，然后以酶切连接的方式连接到质粒pCDR(BglII和XhoI)上，得到重组质粒pCDR-PTXD；
采用同尾酶组装技术，将上述两个质粒(pCDR-ME和pCDR-PTXD)组装成一个质粒pCDR-ME-PTXD。采用的同尾酶为BlnI和SpeI，酶切位点的位置见图7。
将上述得到的两个质粒pER-CF5A和pCDR-ME-PTXD转化至E.coli GH0401感受态细胞中，涂布于含有壮观霉素和氨苄青霉素的双抗性平板上，获得的转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌，命名为GH0407。此外，将pER空质粒与pCDR-ME-PTXD转化至E.coliGH0401感受态细胞获得工程菌株GH0402作为对照菌株，以验证异源CO2固定途径(HFLS，图1)对苹果酸合成的影响。
实施例2：利用工程大肠杆菌GH0402和GH0407发酵生产苹果酸
平板活化培养基及活化培养条件：平板活化培养基是LB培养基，活化条件：37℃培养箱倒置12h。
发酵使用的发酵培养基含有：葡萄糖50g/L、Na2HPO3·5H2O 20mM、KHCO3 50mM、Na2HPO4·12H2O 15.11g/L、KH2PO4 3g/L NH4Cl 1g/L、NaCl 0.5g/L、微量元素液1mL/L；微量元素液：FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl2 0.15g/L、ZnCl2·4H2O 0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO3 0.075g/L、MnCl2·4H2O 0.495g/L，以0.1M HCl为溶剂。
将工程大肠杆菌GH0402和GH0407于平板活化后，挑取单菌落于液体LB种子培养基中，37℃、200rpm培养12h(OD600＝3-4)。种子培养完成后，按2％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，于温度37℃、转速800rpm、氧气通气量1vvm、pH＝7.0条件下培养16h后关闭氧气通量，并通入氮气10-20min(氮气通量：1vvm)除去残留氧气，厌氧条件下继续发酵时间72h。整个过程采用250g/L KHCO3作为酸碱中和剂以维持pH＝7。
采用高效液相色谱(HPLC)测得GH0407发酵液上清中最终的苹果酸产量为39g/L(图8)，苹果酸对葡萄糖得率达到1.53mol/mol(为目前报道最高)(图9)，工程菌株GH0407的CO2固定速率为41mg gDCW-1h-1，比多数自养蓝藻的CO2固定速率(6-25mg gDCW-1h-1)更高(表2)。发酵液中的HCO3 -与CO2之间会发生快速的可逆反应，同时HCO3 -还可以作为酸碱中和剂控制发酵液的pH，因此，通过向培养基中添加KHCO3可以创造CO2环境。
我们设置了两个对照组：(i)发酵液中不添加KHCO3，采用NaOH作为酸碱中和剂；(ii)以不含CO2固定途径(即不含pER-CF5A质粒)的菌株GH0402作为对照组。结果表明，当使用NaOH替代KHCO3作为酸碱中和剂时(即不提供CO2环境时)，工程菌株GH0407苹果酸的产量仅为2.3g/L，对葡萄糖得率仅为0.14mol/mol；对照组GH0402发酵上清液中最终的苹果酸产量为22g/L，对葡萄糖得率为1.13mol/mol。从对照组的数据可以看出，CO2确实提高了苹果酸的产量和得率。
表1基因敲除引物与蛋白过量表达引物序列
引物名称 引物序列
QCfrdBC-S ATGGCTGAGATGAAAAACCTGAAAATTGAGGTGGTGCGCTATAACCCGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
QCfrdBC-A TTACCAGTACAGGGCAACAAACAGGATTACGATGGTGGCAACCACAGTTATGGGAATTAGCCATGGTCC
YZfrdBC-S TGGAGTACAGCGACGTGAAG
YZfrdBC-A GGAATACGCGACCAATGAAG
QCfumB-S ATGTCAAACAAACCCTTTATCTACCAGGCACCTTTCCCGATGGGGAAAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
QCfumB-A TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC
YZfumB-S TGTGAGCGTATCGTGCGTC
YZfumB-A CGTGAAATTACAATCGCAAAC
QCldhA-S ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
QCldhA-A TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC
YZldhA-S AACCCACAGCCCGAGCGT
YZldhA-A GGCTTACCGTTTACGCTTTCC
QCadhE-S ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
QCadhE-A TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCTTCTATGGGAATTAGCCATGGTCC
YZadhE-S TCATCACCGCACTGACTAT
YZadhE-A TCCTTAACTGATCGGCATT
FDH-S agatatacatatggcagatctGATGAAAAGTATACTAACTACTTGTCCTTATTGT
FDH-A ggtttctttaccagactcgagTTAAGCGTCTTTACGCATACTCTTTT
ACS-S agatatacatatggcagatctGATGAGCCAAATTCACAAACACACC
ACS-A ggtttctttaccagactcgagTTACGATGGCATCGCGATAGC
ME-S agatatacatatggcagatctGATGAATAATTTAAAAGGTTTAGAATTACTAAGAA
ME-A ggtttctttaccagactcgagTTATCTATAGTATGGTTCCCAAATTTCA
表2微生物CO2固定速率的比较
Figure BDA0002326335550000091
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株固定CO2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
<130> BAA191258A
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagcctgg aagataagga cctgcgtagc atccaagaag tgcgtaacct gatcgaatct 60
gcgaataagg cccaaaaaga actggcggcg atgtcacagc aacagattga taccatcgtg 120
aaagcgattg ccgacgcagg ctatggtgcg cgtgaaaaac tggctaagat ggcgcacgaa 180
gaaacgggct ttggtatttg gcaggataaa gttatcaaga acgtcttcgc ctcgaagcat 240
gtctacaact acatcaagga tatgaagacc atcggtatgc tgaaagaaga caacgaaaag 300
aaagttatgg aagtcgcagt gccgctgggc gtggttgctg gtctgattcc gtcaaccaat 360
ccgacctcga cggtgatcta caaaacgctg atttcaatca aggcgggcaa cagtatcgtg 420
tttagcccgc acccgaatgc cctgaaagca attctggaaa ccgtccgcat tatctcagaa 480
gcggccgaaa aagcaggctg cccgaagggt gctatttcgt gtatgaccgt tccgacgatc 540
caaggcaccg atcagctgat gaaacataag gacaccgctg tcattctggc aacgggcggt 600
tctgcgatgg tgaaagcagc ttatagctct ggcaccccgg caattggtgt gggtccgggc 660
aacggtccgg cctttattga acgtagtgcg aatatcccgc gtgcggttaa acacatcctg 720
gattccaaga ccttcgacaa cggtacgatt tgcgccagcg aacagtctgt cgtggttgaa 780
cgtgtcaata aagaagctgt gatcgcggaa tttcgcaagc aaggcgcaca cttcctgagt 840
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gatgcacgtg ttctgattgc ggaagaaacg aaagttggcg ccaagatccc gtatagtcgc 1020
gaaaaactgg ccccgattct ggcattttac accgctgaaa cgtggcagga agcatgcgaa 1080
ctgagcatgg atattctgta ccatgaaggc gctggtcaca ccctgattat ccatagcgaa 1140
gacaaagaaa ttatccgtga atttgcactg aaaaagccgg tttctcgcct gctggtcaac 1200
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atgctgccga aactggtgat cacgcatcgc gtgcacgacg aaattctcca gctcctcgcg 60
ccacattgcg aactgatgac gaaccagacc gatagcacgc tgacccgcga agaaattctg 120
cgtcgctgcc gtgatgcgca agcgatgatg gcctttatgc cggatcgcgt tgatgccgac 180
tttctgcaag cgtgcccaga actgcgtgtt gttggctgcg ccctcaaagg cttcgacaac 240
ttcgacgtgg atgcgtgcac ggcccgtggc gtttggctga cctttgtgcc ggatctgctg 300
accgttccga ccgcggaact ggcgattggt ctggccgtgg gtctcggtcg tcatctgcgt 360
gcggccgacg ccttcgttcg tagcggcgag ttccaaggct ggcagccgca gttctacggc 420
accggtctgg ataatgccac cgttggtatc ctcggcatgg gtgcgatcgg tctggcgatg 480
gcggatcgtc tgcaaggctg gggtgccacc ctccagtatc atgaagcgaa ggcgctggat 540
acgcaaaccg aacagcgcct cggtctgcgt caagttgcgt gcagcgagct gttcgccagt 600
agcgatttca ttctgctcgc gctgccgctc aacgcggata cccagcatct cgttaacgcc 660
gaactgctgg cgctggttcg tccgggcgcg ctgctggtga acccgtgccg tggtagtgtg 720
gttgatgaag ccgccgttct cgccgcgctg gaacgtggtc aactgggcgg ttacgccgcc 780
gacgtttttg agatggaaga ttgggcgcgt gcggaccgtc cacgtctgat cgatccggcg 840
ctgctggccc atccaaacac gctgttcacg ccgcatatcg gtagtgccgt tcgtgccgtg 900
cgtctggaaa tcgaacgctg cgcggcgcag aatatcatcc aagttctcgc cggtgcccgc 960
ccaattaatg ccgccaatcg tctgccaaaa gccgaaccag cggcgtgcta a 1011
<210> 5
<211> 5351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gcgccgctga gaaaaagcga agcggcactg ctctttaaca atttatcaga 120
caatctgtgt gggcactcga ccggaattat cgattaactt tattattaaa aattacctct 180
agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tggcagatct caattggata 240
tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt ctggtaaaga aaccgctgct 300
gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagtc gcagcttaat taacctaaac 360
tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 420
gggttttttg ctagcgaaag gaggagtcga ctatatccgg attggcgaat gggacgcgcc 480
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 540
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 600
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 660
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 720
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 780
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 840
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 900
ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc tggcggcacg atggcatgag attatcaaaa 960
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1020
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1080
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1140
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1200
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1260
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1320
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1380
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1440
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1500
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1560
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 1620
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 1680
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 1740
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 1800
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 1860
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 1920
tcatgattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 1980
ttagaaaaat aaacaaatag gtcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 2040
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 2100
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2160
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2220
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2280
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2340
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2400
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2460
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2520
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2580
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2640
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2700
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2760
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2820
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2880
tgtgcggtat ttcacaccgc atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 2940
atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 3000
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 3060
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 3120
aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg 3180
tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt 3240
ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg 3300
taagggggat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg 3360
atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg 3420
gcggtatgga tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt 3480
aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac 3540
ataatggtgc agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag 3600
accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc 3660
tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc 3720
ctcaacgaca ggagcacgat catgctagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 3780
gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt 3840
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 3900
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 3960
ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 4020
gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 4080
ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 4140
gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 4200
atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 4260
ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 4320
gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 4380
gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 4440
cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 4500
aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 4560
cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 4620
acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 4680
ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 4740
ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 4800
gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 4860
ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 4920
gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 4980
tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct 5040
tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg 5100
ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg 5160
ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc 5220
catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg 5280
ccacgatgcg tccggcgtag cctaggatcg agatcgatct cgatcccgcg aaattaatac 5340
gactcactat a 5351
<210> 6
<211> 3958
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta 60
ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat 120
aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga 180
tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag 240
gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg 300
cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca 360
acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa 420
ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc 480
tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat 540
aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc 600
ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg 660
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 720
aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 780
catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 840
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 900
gatgcgtccg gcgtagccta ggatcgagat cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact 960
cactatattg acaattaatc atccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 1020
atttcacaca ggaaacagcg ccgctgagaa aaagcgaagc ggcactgctc tttaacaatt 1080
tatcagacaa tctgtgtggg cactcgaccg gaattatcga ttaactttat tattaaaaat 1140
tacctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatgg cagatctcaa 1200
ttggatatcg gccggccacg cgatcgctga cgtcggtacc ctcgagtctg gtaaagaaac 1260
cgctgctgcg aaatttgaac gccagcacat ggactcgtct actagtcgca gcttaattaa 1320
cctaaactgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg 1380
tcttgagggg ttttttgcta gcgaaaggag gagtcgacac tgcttccggt agtcaataaa 1440
ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct atttaacgac cctgccctga accgacgacc 1500
gggtcatcgt ggccggatct tgcggcccct cggcttgaac gaattgttag acattatttg 1560
ccgactacct tggtgatctc gcctttcacg tagtggacaa attcttccaa ctgatctgcg 1620
cgcgaggcca agcgatcttc ttcttgtcca agataagcct gtctagcttc aagtatgacg 1680
ggctgatact gggccggcag gcgctccatt gcccagtcgg cagcgacatc cttcggcgcg 1740
attttgccgg ttactgcgct gtaccaaatg cgggacaacg taagcactac atttcgctca 1800
tcgccagccc agtcgggcgg cgagttccat agcgttaagg tttcatttag cgcctcaaat 1860
agatcctgtt caggaaccgg atcaaagagt tcctccgccg ctggacctac caaggcaacg 1920
ctatgttctc ttgcttttgt cagcaagata gccagatcaa tgtcgatcgt ggctggctcg 1980
aagatacctg caagaatgtc attgcgctgc cattctccaa attgcagttc gcgcttagct 2040
ggataacgcc acggaatgat gtcgtcgtgc acaacaatgg tgacttctac agcgcggaga 2100
atctcgctct ctccagggga agccgaagtt tccaaaaggt cgttgatcaa agctcgccgc 2160
gttgtttcat caagccttac ggtcaccgta accagcaaat caatatcact gtgtggcttc 2220
aggccgccat ccactgcgga gccgtacaaa tgtacggcca gcaacgtcgg ttcgagatgg 2280
cgctcgatga cgccaactac ctctgatagt tgagtcgata cttcggcgat caccgcttcc 2340
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 2400
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag ccagctcact cggtcgctac 2460
gctccgggcg tgagactgcg gcgggcgctg cggacacata caaagttacc cacagattcc 2520
gtggataagc aggggactaa catgtgaggc aaaacagcag ggccgcgccg gtggcgtttt 2580
tccataggct ccgccctcct gccagagttc acataaacag acgcttttcc ggtgcatctg 2640
tgggagccgt gaggctcaac catgaatctg acagtacggg cgaaacccga caggacttaa 2700
agatccccac cgtttccggc gggtcgctcc ctcttgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 2760
tttaccggat acctgttccg cctttctccc ttacgggaag tgtggcgctt tctcatagct 2820
cacacactgg tatctcggct cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtaagcaaga 2880
actccccgtt cagcccgact gctgcgcctt atccggtaac tgttcacttg agtccaaccc 2940
ggaaaagcac ggtaaaacgc cactggcagc agccattggt aactgggagt tcgcagagga 3000
tttgtttagc taaacacgcg gttgctcttg aagtgtgcgc caaagtccgg ctacactgga 3060
aggacagatt tggttgctgt gctctgcgaa agccagttac cacggttaag cagttcccca 3120
actgacttaa ccttcgatca aaccacctcc ccaggtggtt ttttcgttta cagggcaaaa 3180
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta ctgaaccgct 3240
ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata 3300
taagttgtaa ttctcatgtt agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg 3360
aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta 3420
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 3480
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct 3540
tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg 3600
cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa 3660
cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc 3720
accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt 3780
ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa 3840
accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt 3900
gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggccc 3958
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggctgaga tgaaaaacct gaaaattgag gtggtgcgct ataacccggg tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttaccagtac agggcaacaa acaggattac gatggtggca accacagtta tgggaattag 60
ccatggtcc 69
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tggagtacag cgacgtgaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaatacgcg accaatgaag 20
<210> 11
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgtcaaaca aaccctttat ctaccaggca cctttcccga tggggaaagg tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 12
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttacttagtg cagttcgcgc actgtttgtt gacgatttgc tggaagaaga tgggaattag 60
ccatggtcc 69
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtgagcgta tcgtgcgtc 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgtgaaatta caatcgcaaa c 21
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgcg tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaaga tgggaattag 60
ccatggtcc 69
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aacccacagc ccgagcgt 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggcttaccgt ttacgctttc c 21
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaag tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagcttcta tgggaattag 60
ccatggtcc 69
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcatcaccgc actgactat 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tccttaactg atcggcatt 19
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
agatatacat atggcagatc tgatgaaaag tatactaact acttgtcctt attgt 55
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggtttcttta ccagactcga gttaagcgtc tttacgcata ctctttt 47
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agatatacat atggcagatc tgatgagcca aattcacaaa cacacc 46
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggtttcttta ccagactcga gttacgatgg catcgcgata gc 42
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agatatacat atggcagatc tgatgaataa tttaaaaggt ttagaattac taagaa 56
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggtttcttta ccagactcga gttatctata gtatggttcc caaatttca 49

Claims (10)

1.一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株被敲除富马酸还原酶基因(frdBC)、富马酸酶基因(fumB)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和乙醇脱氢酶基因(adhE)，并过量表达甲酸脱氢酶(FDH)、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、酰化乙醛脱氢酶(ACDH)、甲醛裂合酶(FLS)、二羟基丙酮激酶(DHAP)、苹果酸酶(ME)和亚磷酸氧化还原酶(PTXD)。
2.根据权利要求1所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌是以Escherichia coli MG1655为宿主。
3.根据权利要求1或2所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述甲酸脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、酰化乙醛脱氢酶、甲醛裂合酶和二羟基丙酮激酶是由同尾酶组装的方式逐步连接到载体上进行过量表达。
4.根据权利要求3所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述苹果酸酶基因和亚磷酸氧化还原酶基因是由同尾酶组装的方式连接到载体上进行过量表达。
6.根据权利要求5所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述富马酸还原酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418577.1或NP_418576.1的基因一致，所述富马酸酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418546.1的基因一致，所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_415898.1的基因一致，所述乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_415757.1的基因一致，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:CP001666.1的基因一致，所述乙酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列与NCBI上accessionnumber:NP_418493.1的基因一致，所述酰化乙醛脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示，甲醛裂合酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示，二羟基丙酮酸激酶的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述苹果酸酶基因的核苷酸序列与NCBI上accession number:NP_418493.1的基因一致，所述亚磷酸氧化还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.权利要求1-7任一所述的一种固定CO2生产苹果酸的大肠杆菌工程菌株在发酵生产苹果酸方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将大肠杆菌工程菌活化后，于温度30-37℃、转速700-800rpm、氧气通气量0.8-1.2vvm、pH＝6.5-7.0条件下进行好氧培养12-18h；然后，将氧气通气量调至0vvm，转速调整至180-200rpm，并以1vvm的速度通入氮气10-20min，厌氧条件下发酵时间60-80h，维持pH中性。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵使用的发酵培养基含有葡萄糖40-50g/L，Na2HPO3·5H2O 20-50mM，KHCO3 30-50mM，Na2HPO4·12H2O 15.11g/L、KH2PO4 3g/LNH4Cl 1g/L、NaCl 0.5g/L，每L培养基含有1mL微量元素液；微量元素液：FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl2 0.15g/L、ZnCl2·4H2O 0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO30.075g/L、MnCl2·4H2O 0.495g/L，溶于0.1M HCl中配制。
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