JP2011527886A5

JP2011527886A5 -

Info

Publication number: JP2011527886A5
Application number: JP2010537955A
Authority: JP
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2012-02-02

Claims

非天然アミノ酸と；
メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてＯ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
を含むメタノール資化性酵母細胞。
非天然アミノ酸がｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
ｉ）Ｏ−ＲＳが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む;
ｉｉ）Ｏ−ＲＳが誘導的プロモーターから発現される；
ｉｉｉ）Ｏ−ＲＳが構成的プロモーターから発現される；
ｉｖ）ｉ）及びｉｉ）；又は
ｖ）ｉ）及びｉｉｉ）；
請求項１に記載の細胞。
ｉ）における核酸がＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項３に記載の細胞。
ｉｉ）における誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項３に記載の細胞。
ｉｉｉ）における構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項３に記載の細胞。
ｉ）Ｏ−ｔＲＮＡが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするか又は含むポリヌクレオチドを含む；
ｉｉ）Ｏ−ｔＲＮＡが高レベル構成的プロモーターから発現される；又は
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）；
請求項１に記載の細胞。
ｉ）における核酸がＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項７に記載の細胞。
ｉｉ）におけるプロモーターがＰＧＫ１プロモーターを含む請求項７に記載の細胞。
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡが非真核生物又は大腸菌に由来する請求項１に記載の細胞。
該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、
ｉ）前記ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む；
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドがシングルコピーとしてゲノムに組込まれている；
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドがマルチコピーとしてゲノムに組込まれている；
ｉｖ）ｉ）及びｉｉ）；又は
ｖ）ｉ）及びｉｉｉ）；
請求項１に記載の細胞。
該当ポリペプチドがＨＳＡ、ヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、発熱外毒素Ｂ、発熱外毒素Ｃ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ／ｃキット、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＥＦ）、ｈＶＥＧＦ１６５、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、ＣＤ４４、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ＢＰ３２０抗原、ヒトカスパーゼ３、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質（ｈＳＢＰ）、ヒトエンドスタチン、又はｇｐ１２０を含む請求項１１に記載の細胞。
組込みが非必須遺伝子をコードする遺伝子座で遺伝子置換により行われる請求項１１に記載の細胞。
非必須遺伝子がＡＯＸ１である請求項１３に記載の細胞。
細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がｍｕｔ^Ｓである請求項１４に記載の細胞。
細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がＭｕｔ^＋である請求項１１に記載の細胞。
該当ポリペプチドが誘導的プロモーター又は構成的プロモーターから発現される請求項１１に記載の細胞。
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項１７に記載の細胞。
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項１７に記載の細胞。
メタノール資化性酵母細胞がＣａｎｄｉｄａ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ細胞、又はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞である請求項１に記載の細胞。
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドをメタノール資化性酵母細胞で生産する方法であって、
ａ）ｉ）非天然アミノ酸と；
ｉｉ）メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｉｉｉ）Ｏ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
ｉｖ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む該当核酸
を含むメタノール資化性酵母細胞を準備する段階と；
ｂ）セレクターコドンに応答して該当ポリペプチドの翻訳中に該当核酸の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産する段階を含む前記方法。
非天然アミノ酸を準備する段階が、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を準備する段階を含む請求項２１に記載の方法。
Ｏ−ＲＳを準備する段階が
ｉ）プロモーターの下流でＯ−ＲＳをコードするＯ−ＲＳポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階と、コードされるＯ−ＲＳを発現させる段階；
ｉｉ）誘導的プロモーターからＯ−ＲＳを発現させる段階；
ｉｉｉ）構成的プロモーターからＯ−ＲＳを発現させる段階；
ｉｖ）ｉ）及びｉｉ）；又は
ｖ）ｉ）及びｉｉｉ）；
を含む請求項２１に記載の方法。
ｉ）におけるポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座にポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項２３に記載の方法。
ｉｉ）における誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項２３に記載の方法。
ｉｉｉ）における構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項２３に記載の方法。
細胞がアンバーサプレッサーｔＲＮＡ、オーカーサプレッサーｔＲＮＡ、オパールサプレッサーｔＲＮＡ、又は４塩基コドン、レアコドンもしくは非コーディングコドンを認識するｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡが高レベル構成的プロモーターの転写制御下のＯ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドによりコードされ、前記Ｏ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドがゲノムに組込まれている請求項２１に記載の方法。
Ｏ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座に前記ポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項２７に記載の方法。
高レベル構成的プロモーターがＰＧＫ１プロモーターを含む請求項２７に記載の方法。
ポリペプチドをコードする該当核酸を準備する段階が、ＨＳＡ、ヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、発熱外毒素Ｂ、発熱外毒素Ｃ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ／ｃキット、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＥＦ）、ｈＶＥＧＦ１６５、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、ＣＤ４４、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ＢＰ３２０抗原、ヒトカスパーゼ３、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質（ｈＳＢＰ）、ヒトエンドスタチン、又はｇｐ１２０をコードする核酸を準備する段階を含む請求項２１に記載の方法。
該当核酸を準備する段階が構成的プロモーター又は誘導的プロモーターの転写制御下の核酸を細胞のゲノムに組込む段階を含む請求項２１に記載の方法。
核酸をゲノムに組込む段階が、核酸をシングルコピー又はマルチコピーとしてゲノムに組込む段階を含む請求項３１に記載の方法。
核酸をゲノムに組込む段階が、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、ＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座に、又はＡＯＸ１の遺伝子座５’に核酸を組込む段階を含む請求項３２に記載の方法。
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項３１に記載の方法。
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項３１に記載の方法。
メタノール資化性酵母細胞を準備する段階がＣａｎｄｉｄａ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ細胞、又はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を準備する段階を含む請求項２１に記載の方法。
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）中で培養する段階と、培養液を振盪フラスコで増殖させ、ポリペプチドの発現を誘導する段階を含む請求項２１に記載の方法。
適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を培養する段階がＣａｎｄｉｄａ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ細胞、又はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を培養する段階を含む請求項３７に記載の方法。
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、ペーストのコンシステンシーに達するまで培養液を増殖させてポリペプチドを産生させる段階を含む請求項３８に記載の方法。
産生されるポリペプチドが
ｉ）硫酸化されている；
ｉｉ）グリコシル化されている；
ｉｉｉ）１個以上のジスルフィド結合を含む；
ｉｖ）１０ｍｇ／Ｌまでの濃度で前記細胞から発現される；
ｖ）ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）のいずれかの組合せである；
請求項２１に記載の方法。
産生されるポリペプチドが１０ｍｇ／Ｌまでの濃度で前記細胞から発現される請求項２１に記載の方法。
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、
ａ）ＹＰＤ培地に適切なＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株のコロニーを接種し、第１の培養液を作製する段階と；
ｂ）第１の培養液を振盪フラスコに入れ、振盪フラスコを２９℃〜３０℃の温度にて２８０ｒｐｍの速度で振盪し、飽和付近まで増殖させる段階と；
ａ）緩衝グリセロール酵母エキス培地（ＢＭＧＹ）１リットルに第１の培養液を接種し、第２の培養液を作製する段階と；
ｂ）ＯＤ６００が８．０になるまで第２の培養液を増殖させる段階と；
ｃ）第２の培養液を１５００×ｇで５分間遠心し、ペレットを形成する段階と；
ｄ）１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌにペレットを再懸濁し、第３の培養液を作製する段階と；
ｅ）その後、２４時間おきに第３の培養液にメタノールを終濃度０．５％まで１２０〜１４４時間添加し、ポリペプチドの発現誘導を維持する段階
を含む請求項２１に記載の方法。