CN108473542A

CN108473542A - 遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法

Info

Publication number: CN108473542A
Application number: CN201680073102.3A
Authority: CN
Inventors: 吉里什·萨尼; 基绍尔·库马·乔什
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: JP7171434B2; US11008370B2; EP3368549A1; JP2018531611A; CN108473542B; WO2017072791A1; EP3368549B1; US20180362596A1

Abstract

本文中公开了用于在甲基营养酵母中生产和分泌生物活性的凝块特异性链激酶(CSSK)蛋白的表达系统。酵母表达的CSSK蛋白表现出改善的纤溶酶原活化和纤维蛋白选择性。还公开了用功能性cDNA序列的至少一个拷贝转化的甲基营养酵母，所述功能性cDNA序列编码带有经修饰的信号序列的CSSK，所述信号序列导致成熟的和正确加工的CSSK的分泌。

Description

遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法

技术领域

本发明涉及用于表达凝块特异性(clot specific)链激酶(CSSK)蛋白的遗传修饰的酵母细胞，其用于改进的CSSK生产。本发明也涉及包含凝块特异性链激酶的表达序列的载体的制备。所述载体具有经修饰的α信号序列和用于在酵母细胞中表达CSSK的CSSK密码子序列。

背景技术

近年来，用纤维蛋白溶解药剂诸如链激酶(SK)、组织型纤溶酶原活化剂(TPA)或尿激酶(UK)的溶血栓疗法已经彻底改变了多种循环系统疾病(例如，深静脉血栓形成、肺栓塞和心肌梗塞)的临床处理。这些药剂通过切割纤溶酶原(PG)中的残基561和562之间的易切断肽键活化循环系统中的纤溶酶原而发挥其纤维蛋白溶解效应。所以，无活性的酶原被转化成其活性形式：丝氨酸蛋白酶纤溶酶(PN)，其然后作用于纤维蛋白以将后者降解成可溶性的降解产物。PG向PN的活化可以由TPA、SK-纤溶酶原复合物和UK催化，它们中的每一种可以切割PG中的易切断肽键。

不同于UK和TPA，SK不具有它自身的蛋白水解活性，并且它通过首先与PG形成高亲和力等摩尔复合物(被称作活化剂复合物)间接地将PG活化为PN(在Castellino,F.J.,1981,Chem.Rev.81:431中综述)。由于在SK中缺乏任何可察觉的纤维蛋白凝块特异性，SK的施用可以造成全身性PG活化，从而导致出血性并发症，其归因于在循环系统中产生的纤溶酶对血液因子的蛋白水解性降解。在过去，编码SK的基因已经从它的天然来源(链球菌属(Streptococcus))分离，并被克隆进几种异源微生物诸如酵母(Hagenson,M.J.,1989,Enzyme.Microb.Technol.11:650)、细菌诸如大肠杆菌(Malke,H,Ferretti,J.J.,1984,Proc.Nat'l.Acad.Sci.81:3557)、链球菌属的其它种(Malke,H.,1984,Mol.Gen.Genet.196:360)和芽孢杆菌属(Bacillus)(Wong,S.L.,1994,Applied andEnv.Microbiol.1:517)中。

美国专利号7,163,817和8,143,027公开了含有SK或其功能相关部分的新颖的凝块特异性链激酶蛋白的制备，所述SK或其功能相关部分与人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域连接，所述纤维蛋白结合结构域赋予纤维蛋白亲和力和改变的纤溶酶原活化特征。所述改变的纤溶酶原活化涉及PG活化速率中几分钟的持续时间的最初延迟阶段，其之后是与天然SK类似的高PG活化速率。

CSSK嵌合蛋白中的纤维蛋白亲和力和延迟的PG活化会在需要溶血栓疗法的受试者的治疗中赋予独特优点。具体地，在注射进体内以后，尽管嵌合的PG活化剂蛋白仍然处于无活性的或部分活性的状态，但是它们会结合血管系统中的病理性纤维蛋白凝块。但是，在最初延迟以后，这些将变成完全活化(同时结合所述凝块)，由此避免与天然SK施用一致的全身性PG活化。因而，CSSK的纤维蛋白亲和力会赋予将它自身靶向至病理性凝块的近场所的能力，并从而帮助在其中积累治疗上有效的活化剂浓度；最初减慢的PG活化的动力学导致总体上减少的游离纤溶酶在循环中的产生，然后它们定位至由病理性纤维蛋白凝块诱导的循环阻抗部位。净结果是在靶标处持续的且更有效的纤维蛋白溶解，其被降低的治疗上有效剂量的CSSK维持。

CSSK的开发已经成为医学界的福利。但是，生产CSSK的现有技术方法是费时的和艰苦的，从而导致低收率和高生产成本。

在本领域已知的方法中，在大肠杆菌细胞内生产凝块特异性链激酶，但是通过溶解在脲/氯化胍(强离液剂)中和随后重折叠而得到生物活性蛋白。所述体外重折叠步骤是费时的，并且可以在非常低的蛋白浓度以高效率进行。另外，大肠杆菌细胞壁含有热原性脂多糖，并且所有基于大肠杆菌的方法需要除去这些内毒素的步骤。

因而，本领域需要改进的制备凝块特异性链激酶的方法，特别是比细菌CSSK表达系统好的方法。

尽管在酵母细胞中的表达具有合乎需要的属性，酵母表达也并非没有缺点。例如，在某些酵母中，转化体可以表达广泛地不同量的蛋白，这可能由于质粒整合部位的差异或表达盒拷贝数的差异。这些缺点要求许多轮的诊断和筛选操作才能得到转化体以获得高产克隆。通过聚合酶链式反应(PCR)或通过DNA印迹分析可以表征阳性转化细胞以确证DNA片段的整合。为了分析目标蛋白在酵母表达系统中的表达，可以与PCR或RNA印迹技术一起使用反转录。但是，取决于多肽组成和要求的翻译后修饰，所述蛋白水平可能不总是与转录水平一致。另外，筛选酵母克隆的常规方法涉及直接的或浓缩的上清液的SDS-PAGE分析，对于筛选数千个克隆中的至少一个真实的且合乎需要的高产克隆而言，这是非常令人厌倦的(由于低收率，浓缩过多转化体的培养基，等)。

因而，本领域需要一种用于在非细菌物种(诸如酵母)中生产CSSK的方法，和不具有以上缺点的用于筛选表达生物活性CSSK的酵母转化体的方法。

发明目的

本发明的一个目的是，提供包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、编码凝块特异性链激酶的核酸序列和转录终止子序列。

本发明的另一个目的是，提供用于转化酵母细胞的表达载体，其中所述表达载体包含至少一个表达盒。

另一个目的是，提供含有表达盒的遗传修饰的酵母细胞，所述表达盒还包含杂合多核苷酸，所述杂合多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、与凝块特异性链激酶具有85％同源性的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

本发明的再另一个目的是，提供一种多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的核酸序列。

本发明的另一个目的是，提供表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，所述CSSK包含：(a)由似马链球菌(Streptococcus equisimilis)生产的链激酶(SK)，或SK的具有活化纤溶酶原的能力的衍生物；和(b)人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(FBD4,5)，或其FBD 4,5的具有纤维蛋白亲和力的衍生物。

本发明的再另一个目的是，提供由所述转化的酵母细胞生产的凝块特异性链激酶，其中所述凝块特异性链激酶被糖基化且具有80,515Da的分子量。

本发明的再另一个目的是，提供一种组合物，其包含所述凝块特异性链激酶和药学上可接受的载体。

本发明的另一个目的是，提供一种治疗或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括通过注射或输注给所述受试者施用治疗有效量的所述组合物。

本发明的再另一个目的是，提供一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及含有表达盒的遗传修饰的酵母细胞，所述表达盒还包含杂合多核苷酸，所述杂合多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、与凝块特异性链激酶具有85％同源性的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

在另一个实施方案中，本发明涉及遗传修饰的酵母细胞，其具有由所述表达盒构成的表达载体。

在一个方面，本发明涉及包含杂合多核苷酸的表达盒，所述杂合多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、与凝块特异性链激酶具有85％同源性的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

在另一个方面，本发明提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、编码凝块特异性链激酶的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的核酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

本发明的另一个方面提供了用于转化酵母细胞的表达载体，其中所述表达载体包含至少一个表达盒。

本发明的再另一个方面提供了一种表达载体，其包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列具有至少85％同一性的多核苷酸。

本发明的再另一个方面提供了一种编码多肽的表达载体，所述多肽与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的多肽序列具有至少85％同一性。

本发明的另一个方面提供了一种多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的核酸序列。本发明的再另一个方面提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，所述CSSK包含：(a)由似马链球菌生产的链激酶(SK)，或SK的具有活化纤溶酶原的能力的衍生物；和(b)人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(FBD 4,5)，或其FBD 4,5的具有纤维蛋白亲和力的衍生物。

本发明的再另一个方面提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述CSSK在所述链激酶序列的N-和C-端的每一个处包含：与SEQ ID NO:11所示的多肽序列具有至少85％同一性的链激酶序列；和与SEQ ID NO:22所示的多肽序列具有至少85％同一性的多肽序列。

再另一个方面涉及一种转化的酵母细胞，其表达在上文中描述的表达盒，其中所述核酸序列编码包含以下对象的凝块特异性链激酶(CSSK)：(a)由似马链球菌生产的链激酶(SK)，或SK的具有活化纤溶酶原的能力的衍生物；和(b)人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(FBD 4,5)，或其FBD4,5的具有纤维蛋白亲和力的衍生物。

本发明的再另一个方面提供了包含表达盒的转化的酵母细胞，其中所述酵母是选自毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属(Candida)种的甲基营养酵母(methylotropic yeast)。本发明的再另一个方面提供了一种如此转化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明的一个方面提供了具有登记号MTCC 25071的转化的巴斯德毕赤酵母。

本发明的另一个方面提供了由所述转化的酵母细胞生产的凝块特异性链激酶，其中所述凝块特异性链激酶被糖基化且具有80,515Da的分子量。

本发明的再另一个方面提供了一种组合物，其包含所述凝块特异性链激酶和药学上可接受的载体。

本发明的再另一个方面提供了一种治疗或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，所述疾病选自心肌梗塞、血管血栓形成、肺栓塞、卒中、急性缺血性卒中、心绞痛(angina)、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠脉干预手术后的血栓性再闭塞、外周血管血栓形成、心力衰竭、X综合征(Syndrome X)和至少一条冠状动脉的变窄，所述方法包括通过注射或输注给所述受试者施用治疗有效量的所述组合物。

本发明的另一个方面提供了一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，所述方法包括：用载体转化至少一个酵母细胞以得到转化的酵母细胞；在含有甲醇的BMMY培养基中培养至少一个转化的酵母细胞以诱导CSSK蛋白的表达；将所述培养基与所述转化的酵母细胞分离以得到上清液；测试所述上清液的纤溶酶原活化；和通过检测所述细胞的上清液中的纤溶酶原活化，鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞。

本发明的一个方面提供了一种定点溶解血块的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用有效量的组合物，其包含所述凝块特异性链激酶和药学上可接受的载体。

附图说明

图1A:在凝块特异性链激酶杂合构建体中的基因块的示意图，FBD(4,5)融合在SK的N-和C-端。

图1B:CSSK基因的片段的示意图，显示了经由聚-甘氨酸接头和转谷氨酰胺酶区域与纤维蛋白结合结构域连接的SK。SEQ ID NO:12是氨基酸序列；SEQ ID NO:13是核酸序列。

图1C:显示CSSK的PCR扩增的琼脂糖凝胶(0.8％)。成功地扩增了1860bp的PCR产物。

图2:pPIC9K载体图谱。将CSSK与α交配因子信号序列(其在载体图谱中指示为“S”)一起在框架内克隆进多克隆位点。

图3:pPIC9K CSSK的部分核苷酸(SEQ ID NO:17)和氨基酸(SEQ ID NO:14)序列，显示了在重组载体中除去的STE13切割位点的序列和位置。加下划线的碱基在XhoI和NotI消化后被除去。

图4:从天然α交配因子信号序列除去STE13切割位点的策略。在用XhoI和NotI消化以后，从pPIC9K载体除去具有KEX2和STE13信号切割位点(核酸序列，SEQ ID NO:18；氨基酸序列，SEQ ID NO:19)的α交配因子信号序列段。使用于扩增CSSK的正向引物与邻近KEX2切割位点(AAAAGA)的XhoI位点(CTCGAG)成为一体从而得到pPIC9K-α修饰的没有STE13切割位点的CSSK表达载体，从而建立‘经修饰的’α交配因子信号序列。将NotI位点(GCGGCCGC)从信号序列的末端移动至CSSK的末端。

图5:具有‘经修饰的’α-因子信号序列的、重组pPIC9K-α修饰的CSSK质粒的构建的示意图。利用分别包含XhoI限制位点、在5’末端的KEX2切割位点和在3’末端的NotI限制位点的引物从pET23(d)-CSSK扩增CSSK序列，随后用Xho I和Not I酶对CSSK PCR产物进行双重消化。还用XhoI和NotI消化pPIC9K载体，这导致STE13位点的切割以及pPIC9K载体的两个片段的产生(由于两个XhoI位点在所述载体中的存在)。随后，XhoI和NotI消化的pPIC9K载体的片段(两个片段)和CSSK的三块连接导致具有‘经修饰的’α-因子信号序列的重组pPIC9K-CSSK质粒的形成，其缺乏STE13切割位点。

图6A:具有α修饰的信号序列前蛋白的重组表达质粒pPIC9K的图解表示。

图6B:线性化的重组质粒的描绘。将CSSK编码基因克隆在XhoI和NotI限制位点之间。在转化之前使用Bgl II位点将所述质粒线性化。

图7：具有α修饰的CSSK的重组表达质粒pPIC9K的载体图谱。5’AOX1启动子片段：碱基1-948；允许甲醇诱导的在毕赤酵母属中的高水平表达，并且也将质粒整合靶向AOX1基因座。α因子分泌信号：碱基949-1203；允许期望的蛋白分泌进培养基中。CSSK基因：碱基1204-3063。3’AOX1转录终止(TT)：碱基3083-3416；允许有效的转录终止和mRNA的多腺苷酸化。HIS4 ORF：碱基3810-6344；提供选择标记来分离毕赤酵母属重组菌株。卡那霉素抗性基因：碱基6758-7573；允许选择大肠杆菌中的卡那霉素抗性，并且也允许通过增加的对G418的抗性在体内筛选多拷贝插入物。3’AOX1片段：碱基7952-8709；靶向在AOX1基因处的质粒整合。pBR322起点:碱基9118-9791；允许在大肠杆菌中复制。氨苄西林抗性基因：碱基9936-10796；允许针对大肠杆菌中的氨苄西林抗性进行选择。

图8:琼脂糖凝胶(0.8％)电泳图谱，显示了用XhoI和NotI对重组pPIC9K-α修饰的CSSK质粒的限制性内切核酸酶消化。在重组pPIC9K-α修饰的CSSK质粒的双重消化以后的1860bp DNA片段指示CSSK在含有α修饰的信号序列的pPIC9K载体中的成功克隆。

图9:具有‘经修饰的’α-因子信号序列和‘经优化的’CSSK序列的重组pPIC9K-OptCSSK质粒的构建的示意图。使用引物从含有经优化的CSSK核苷酸序列的质粒扩增CSSK序列，所述引物具有分别在5’末端处的XhoI限制位点和KEX2切割位点以及在3’末端处的NotI限制位点，随后用Xho I和Not I酶对扩增的经优化的CSSK PCR产物进行双重消化。还用XhoI和NotI消化pPIC9K载体，这导致STE13位点的切割以及pPIC9K载体的两个片段的产生(由于两个XhoI位点在所述载体中的存在)。随后，XhoI和NotI消化的pPIC9K载体的片段(两个片段)和CSSK的三块连接导致具有‘经修饰的’α交配因子信号序列的重组pPIC9K-OptCSSK质粒的形成。

图10A：具有‘经修饰的’α-因子信号序列的嵌合重组pPIC9K-Native+Opt CSSK和pPIC9K-Opt+Native CSSK质粒的构建的示意图。用Sac I和Afl II限制性酶消化含有经修饰的α因子信号序列的pPIC9K-Opt CSK和pPIC9K-Native CSSK。AOX1启动子和CSSK分别具有Sac I和Afl II限制位点，将其用于制备嵌合重组质粒。

图10B：构建嵌合重组质粒pPIC9K-Native+Opt CSSK和pPIC9K-Opt+Native CSSK的策略。

图11：CSSK筛选的代表图。从各个转化体表达、分泌CSSK，并使用纤溶酶原活性测定针对最好生产转化体进行筛选。在该多孔板中，每个块对应于含有100μl反应混合物的孔。曲线代表由纤溶酶原活化引起的在405nm的吸收的增加，其中所述纤溶酶作用于酰胺分解底物。在行A中，大多数转化体表现出常规克隆操作的结果的典型微弱活性。

图12:α修饰的CSSK筛选的代表图。从各个转化体表达、分泌α修饰的CSSK，并使用纤溶酶原活性测定针对最好生产转化体进行筛选。在该多孔板中，每个块对应于含有100μl反应混合物的孔。通过使用具有经修饰的α交配信号的载体，观察到增加的表达。基于反应速率选择几个克隆，包括克隆编号B15、B23、B56和B63。

图13:大肠杆菌表达和纯化的CSSK的活化测定，其用于得到标准图来测量毕赤酵母属表达的CSSK的确切浓度。使用不同浓度的大肠杆菌表达和纯化的CSSK(在0.05nM、0.1nM、0.25nM、0.5nM、10nM和100nM的范围内)来测量活化曲线的斜率并从而产生活性(斜率)相对于反应混合物中的CSSK的浓度的标准图。0.1nM链激酶(SK)和纤溶酶原(PG)分别用作反应混合物中的阳性和阴性对照。

图14A：使用纤溶酶原活性测定的、选择的克隆的α修饰的CSSK培养物上清液和10倍稀释的上清液的活性测定。每个块对应于含有100μl反应混合物的多孔板的孔。与Sac I线性化的DNA相比，对于Bgl II线性化的载体(其具有来自CSSK转化体的经修饰的α交配信号)观察到增强的活性。从数百个克隆中选择最高产CSSK转化体S1、S13和S16，并进行Sac I的载体消化。使用纤溶酶原活性测定检查选择的克隆。基于反应速率，携带Bgl II线性化的载体(其具有经修饰的α交配信号和CSSK)的转化体表现出更好的活性，包括克隆编号B15、B23、B56和B63。

图14B:克隆B15、B16、B23、B56和B63的培养物上清液的SDS-PAGE分析(在每个泳道中加载等同体积)。

图15:来自苯基琼脂糖柱的CSSK的色谱洗脱曲线。将培养液应用于用0.25M NaCl(在25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中)预平衡过的苯基琼脂糖柱，并用相同缓冲液洗涤，随后用25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤。然后将CSSK在无菌水洗液中洗脱，由色谱图中的独特峰显示。

图16:在重组巴斯德毕赤酵母pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115/B15中表达的CSSK的10％SDS-PAGE分析。泳道1-7：峰级分；8，分子量标志物。

图17:在重组毕赤酵母属菌株中表达的CSSK和在大肠杆菌中表达的CSSK的对比性纤溶酶原活化剂活性测定。X-轴，时间(min)，和Y-轴，在405nm的吸光度。正方形，0.1nM浓度的通过疏水相互作用色谱法(HIC)纯化的巴斯德毕赤酵母表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。圆圈，0.5nM浓度的通过HIC纯化的巴斯德毕赤酵母表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。向上三角形，0.1nM浓度的通过HIC纯化的大肠杆菌表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。向下三角形，0.5nM浓度的通过HIC纯化的大肠杆菌表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。菱形，0.1nM浓度的先后通过HIC和二乙基氨基乙基树脂(DEAE)纯化的大肠杆菌表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。(+),0.5nM浓度的先后通过HIC和DEAE纯化的大肠杆菌表达的CSSK的纤溶酶原活化活性。(x),0.5nM浓度的通过HIC纯化的巴斯德毕赤酵母表达的CSSK+人纤溶酶的纤溶酶原活化活性。(*),0.5nM浓度的通过HIC纯化的大肠杆菌表达的CSSK+人纤溶酶的纤溶酶原活化活性。(-),0.5nM浓度的先后通过HIC和DEAE纯化的大肠杆菌表达的CSSK+人纤溶酶的纤溶酶原活化活性。

图18:由重组巴斯德毕赤酵母pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115/B15菌株表达的糖基化CSSK的10％SDS-PAGE银染色凝胶。使用疏水相互作用色谱法来纯化CSSK，其用和不用endoH酶处理来检查糖基化和去糖基化形式的差异。用endoH酶处理过的CSSK表现出从85kDa至70kDa的带转移，这与CSSK的计算分子量一致。泳道1含有标准分子量标志物(“M.wt.”)。

图19A:在重组巴斯德毕赤酵母pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115/B15中纯化和表达的CSSK的糖基化分析，作为考马斯亮蓝染色的凝胶。

图19B:在重组巴斯德毕赤酵母pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115/B15中纯化和表达的CSSK的糖基化分析，作为PAS染色的SDS-PAGE凝胶。将毕赤酵母属衍生出的CSSK用PAS试剂染色，从而指示糖基化的存在。将纤溶酶原的较低分子形式(例如，未糖基化的蛋白小纤溶酶原(miniPG)和微纤溶酶原(microPG)，也得自毕赤酵母属)用作用于PAS染色的阴性对照。

图20:显示了与标准(大肠杆菌表达的SK)对比的CSSK批次的蛋白质印迹。泳道1-5代表在5L规模的CSSK批次，而泳道6代表100L规模批次。

图21：通过静脉内推注在施用了CSSK的食蟹猴(Cynomolgus monkey)的股动脉中的各个血流量数据。

图22A:再灌注以后的即时血流量。

图22B:再灌注以后的平均血流量。

图23用图形描绘了在本文中制备的CSSK的施用对具有急性段升高心肌梗塞(AMI/STEMI)的患者中的纤溶酶纤维蛋白原水平的影响。

序列表的简要描述

SEQ ID NO:1.CSSK氨基酸序列

SEQ ID NO:2.CSSK核酸序列

SEQ ID NO:3.为毕赤酵母属修饰的CSSK序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:4.为毕赤酵母属修饰的CSSK序列(核酸序列)

SEQ ID NO:5.CSSK修饰的N-端原始C-端(氨基酸序列)

SEQ ID NO:6.CSSK修饰的5'原始3'(核酸序列)

SEQ ID NO:7.CSSK原始N-端经修饰的C-端(氨基酸序列)

SEQ ID NO:8.CSSK原始5'经修饰的3'(核酸序列)

SEQ ID NO:9.经修饰的α信号序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:10.经修饰的α信号序列(核酸序列)

SEQ ID NO:11.链激酶序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:12.具有聚-甘氨酸接头和转谷氨酰胺酶位点的SK C-端序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:13.具有聚-甘氨酸接头和转谷氨酰胺酶位点的SK 3'序列(核酸序列)

SEQ ID NO:14.天然α信号序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:15.天然α信号序列(核酸序列)

SEQ ID NO:16:信号肽序列段(氨基酸序列)

SEQ ID NO:17.具有AOX1 5’启动子和α序列的部分载体序列(核酸序列)

SEQ ID NO:18.部分载体序列(核酸序列)

SEQ ID NO:19:由部分载体序列编码的多肽(氨基酸序列)

SEQ ID NO:20.α信号序列+N-端CSSK(氨基酸序列)

SEQ ID NO:21.纤维蛋白结合结构域4,5(核酸序列)

SEQ ID NO:22.纤维蛋白结合结构域4,5(氨基酸序列)

SEQ ID NO:23.CSSK序列经修饰的α序列+为毕赤酵母属修饰(核酸序列)

SEQ ID NO:24.CSSK序列经修饰的α序列+为毕赤酵母属修饰(氨基酸序列)

SEQ ID NO:25.具有经修饰的α信号序列的原始CSSK(氨基酸序列)

SEQ ID NO:26.具有经修饰的α信号序列的原始CSSK(核酸序列)

SEQ ID NO:27.CSSK修饰的N-端原始C-端，具有经修饰的α信号序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:28.CSSK原始5’经修饰的3’，具有经修饰的α信号序列(核酸序列)

SEQ ID NO:29.CSSK原始N-端经修饰的C-端，具有经修饰的α信号序列(氨基酸序列)

SEQ ID NO:30.5’AOX1正向引物

SEQ ID NO:31.3’AOX1反向引物

SEQ ID NO:32.正向引物

SEQ ID NO:33.引物序列

发明详述

现在将结合某些优选的和任选的实施方案详细描述本发明，使得可以更充分地理解和明白其各个方面。

本发明的一个实施方案提供了表达盒、载体、多核苷酸序列、转化的酵母细胞、凝块特异性链激酶、包含凝块特异性链激酶的组合物、使用凝块特异性链激酶治疗疾病的方法和筛选转化的酵母细胞的方法。经改良的微生物巴斯德毕赤酵母pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115/B15菌株(其通过引入编码CSSK的载体pPIC9K-α修饰的CSSK而转化)已经保藏于International Microorganism Depository Authority,Microbial Type CultureCollection&Genebank,Institute of Microbial Technology,Sector 39-A,Chandigarh,India。所述经改良的巴斯德毕赤酵母的登录号是MTCC25071，且保藏日期为2015年10月19日。

凝块特异性链激酶

本文中使用的“凝块特异性链激酶”或“CSSK”被定义为嵌合多肽，其组合了：(1)由似马链球菌生产的链激酶(SK)，或其SK的衍生物或变体形式，所述SK或SK的衍生物或变体具有活化纤溶酶原的能力；和(2)所述人纤连蛋白基因的具有纤维蛋白结合能力的片段(例如，人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5)，或其纤维蛋白结合结构域的具有纤维蛋白亲和力的衍生物或变体形式。公开的CSSK因而具有功能性SK活性且可以将纤溶酶原活化为纤溶酶，并且也经由人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4,5具有功能性纤维蛋白亲和力。与由似马链球菌表达的天然SK的立即(即，没有独特时间延迟)活化动力学相比，该CSSK也具有延迟的PG活化动力学。CSSK和它在细菌系统中的表达公开在美国专利号7,163,817和美国专利号8,143,027中，它们二者的内容通过引用并入本文。如在这些专利中公开的，与天然SK相比，CSSK具有活化动力学的独特初期延迟。该延迟的活化与痕量的纤溶酶在所述系统中的存在相关，从而指示CSSK需要纤溶酶才能活化，这不同于天然SK，其可以在没有任何纤溶酶存在下活化纤溶酶原，即经由独立于纤溶酶的机制。

根据本发明，“衍生物”包括来自天然、合成或重组来源(包括融合蛋白)的片段、部分、突变体、同系物和模拟物。衍生物可以源自氨基酸的插入、缺失或置换。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合物以及单个或多个氨基酸的序列内插入。插入氨基酸序列变体是这样的变体：其中将一个或多个氨基酸残基引入蛋白中的预定位点，尽管在得到的产物的合适筛选下随机插入也是可能的。缺失变体以从序列中除去一个或多个氨基酸为特征。置换氨基酸变体是这样的变体：其中已经除去序列中的至少一个残基，且在它的位置插入不同的残基。向氨基酸序列的添加包括与其它肽、多肽或蛋白的融合体。“变体”表示在结构和功能上与完整分子或其片段基本上类似的分子。术语“片段”表示所述分子的任何功能性子集，也就是说，保留期望的生物活性的较短肽。

在本申请的范围内预见到CSSK变体多肽，例如在美国专利号8,143,027中公开的与纤维蛋白结合结构域的不同组合缀合的SK。

本发明的一个实施方案提供了包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、编码凝块特异性链激酶的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的核酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达盒，其中所述经修饰的α信号基因序列如在SEQ ID NO:10中所示。

根据本发明，所述CSSK包括：(a)与似马链球菌链激酶的多肽序列(SEQ ID NO:11)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性的多肽序列；和(b)在所述链激酶多肽序列的N-端、C-端或N-和C-端处与人纤维蛋白原纤维蛋白结合结构域4,5(FBD 4,5)的多肽序列(SEQ ID NO:22)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性的多肽序列。根据本发明，CSSK的多肽序列与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、24、25、27和29的多肽序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、or 99％或更大同一性。根据本发明，CSSK由与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、23、26和28的多核苷酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性的多核苷酸序列编码。由所述多核苷酸中的任一种编码的CSSK具有纤维蛋白原活化活性和纤维蛋白亲和力。

根据本发明生产的CSSK通过翻译后修饰(诸如糖基化)而修饰，这使它更适合用于施用给人类。

生产CSSK的酵母细胞

本发明的另一个实施方案提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，所述CSSK包含：(a)由似马链球菌生产的链激酶(SK)，或SK的具有活化纤溶酶原的能力的衍生物；和(b)人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(FBD 4,5)，或其FBD 4,5的具有纤维蛋白亲和力的衍生物。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述CSSK在所述链激酶序列的N-和C-端的每一个处包含：与SEQ ID NO:11所示的多肽序列具有至少85％同一性的链激酶序列；和与SEQ ID NO:22所示的多肽序列具有至少85％同一性的多肽序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述CSSK由与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的多核苷酸序列具有至少85％同源性的多核苷酸序列编码。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述CSSK由选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的多核苷酸编码。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述酵母是选自毕赤酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属和假丝酵母属种的甲基营养酵母。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述酵母选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、异常毕赤酵母(Pichia anomola)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母。

在本发明的另一个实施方案中，提供了表达凝块特异性链激酶(CSSK)的转化的酵母细胞，其中所述酵母是具有登记号MTCC 25071的巴斯德毕赤酵母。

本发明的另一个实施方案提供了一种包含表达盒的转化的酵母细胞，其中所述酵母是选自毕赤酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属和假丝酵母属种的甲基营养酵母。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种转化的酵母细胞，其中所述酵母选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、异常毕赤酵母、多形汉逊酵母和博伊丁假丝酵母。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种转化的酵母细胞，其中所述酵母是具有登记号MTCC 25071的巴斯德毕赤酵母。所述转化的酵母细胞保藏于InternationalMicroorganism Depository Authority,Microbial Type Culture Collection&Genebank,Institute of Microbial Technology,Sector39-A,Chandigarh,India。保藏日期为2015年10月19日。

这些转化的酵母菌株表达大量的CSSK。在本发明中有用的酵母种是甲基营养种，其可以在含有甲醇或甲烷作为碳源的培养基中生长。根据本发明的示例性甲基营养酵母包括汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属或球拟酵母属的酵母。优选的种包括巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、异常毕赤酵母、多形汉逊酵母和博伊丁假丝酵母。最优选的是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母His4(GS115)的营养缺陷型突变株是特别优选的。

如下面进一步详述的，通过在酵母细胞中引入编码CSSK的载体，可以转化酵母种。

重组酵母向细胞外分泌CSSK，所以可以用本领域已知的温和回收方法(诸如离心和微滤等，其能够实现CSSK的更少降解和更高收率)得到CSSK。

用于在酵母中表达CSSK的核酸和载体

本发明的另一个实施方案提供了用于转化酵母细胞的表达载体，其中所述表达载体包含至少一个本发明的表达盒。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性的多核苷酸。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列具有至少85％同一性的多核苷酸。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体编码与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的多肽序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性的多肽。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体编码与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的多肽序列具有至少85％同一性的多肽。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种表达载体，其中所述表达载体编码具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的序列的多肽。

本发明的另一个实施方案提供了一种多核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大同一性。

本发明的另一个实施方案提供了一种多核苷酸，其具有选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的核酸序列。

由本文中公开的多核苷酸序列编码的CSSK具有纤维蛋白原活化活性和纤维蛋白亲和力。

本发明的另一个实施方案也提供了用于转化酵母细胞以表达CSSK的载体。许多可用于将外源基因转移进靶酵母细胞中的载体是可得到的。所述载体可以是附加型，例如质粒，或可以通过同源重组或随机整合而整合进靶细胞基因组中。在同源重组中，将目标基因(在本文中，编码CSSK的基因)靶向至宿主细胞基因组中的特定基因座。通过将携带目标基因的载体设计成具有与靶基因座序列同源的DNA区域，所述同源区域侧接载体上的目标基因的5’和3’末端，可以为与宿主细胞基因组内的靶基因座的同源重组设计任何序列(Rothstein,R.J.1983.Methods Enzymol 101:202-211；Cregg J.M.等人.1987,NatureBiotechnology 5:479-485)。为目标基因向靶基因座中的整合(通过与宿主细胞基因组的同源重组)设计的同源序列区域在本文中被称作“整合序列”。一旦将所述载体引入酵母细胞中，与靶基因座具有序列同源性的载体区域将与靶基因座对齐，且目标基因将整合进靶基因座中。

根据本发明的公开的载体与用于在酵母中表达的合适启动子可操作地连接地编码CSSK。本文中使用的短语“可操作地连接”或“在转录控制下”是指，所述启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向以控制RNA聚合酶的转录起始和所述多核苷酸的表达。酵母启动子包括诱导型启动子，诸如甲醇诱导型启动子，和组成型启动子，诸如一般的氨基酸通透酶-1(GAP-1)启动子。甲醇诱导型启动子的例子包括醇氧化酶I(AOX1)和醇氧化酶II(AOX2)基因启动子。

在本发明的一个实施方案中，已经构建了一种表达盒，其在转录读码框的5’-3’方向含有以下DNA序列：(a)酵母甲醇诱导型启动子序列；(b)用于从细胞分泌CSSK的酿酒酵母(S.cerevisiae)信号序列；(c)与凝块特异性链激酶对应的多肽；和(d)在甲基营养酵母中有功能的转录终止序列。所述DNA序列在功能上彼此相关以便实现编码(c)的多肽的序列的转录。

在本发明中有用的载体可以包括用于选择酵母转化体的选择标记基因。为此目的，可以使用来自甲基营养酵母的任何功能性选择标记基因，其给甲基营养酵母细胞赋予不同的表型，且因此允许它以不同于大多数非转化细胞的选择性方式鉴别和生长。适当的选择标记基因包括，例如，由巴斯德毕赤酵母菌株的营养缺陷型突变体和补充宿主细胞中的缺陷的野生型生物合成基因组成的选择标记系统。例如，为了转化巴斯德毕赤酵母His4-菌株，可以使用酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的HIS基因。

载体还可以包括一个或多个在细菌中有功能的选择标记基因。为了鉴别和选择性培养的目的在细菌中赋予表型的任何基因是合适的。该另外的选择标记允许将本申请的载体引入细菌(诸如大肠杆菌)中进行扩增。适当的选择标记基因包括：氨苄西林(Amp^r)抗性基因、四环素(Tc^r)、卡那霉素(Kan^r)抗性基因等。

在本发明的一个实施方案中，用于表达CSSK cDNA的异源蛋白表达系统使用源自巴斯德毕赤酵母AOX1甲醇诱导基因的启动子，其被非常有效地表达和准确地调节。在一个具体实施例中，所述载体具有：巴斯德毕赤酵母AOX1启动子；编码α交配因子信号序列的DNA序列；编码CSSK的序列；和源自巴斯德毕赤酵母AOX1基因的转录终止子。

所述载体可以具有用于从细胞分泌CSSK的信号序列。本文中公开的“信号序列”是将表达的蛋白引导至细胞表面用于将所述蛋白释放/分泌至细胞外环境的序列(也被称作“标签”)。信号序列的例子包括来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α交配因子信号序列、α淀粉酶信号序列、菊粉酶信号序列、杀手蛋白信号序列、溶菌酶信号序列、白蛋白信号序列和葡萄糖淀粉酶信号序列。根据本发明，酿酒酵母的天然α因子信号序列的核酸序列如在SEQ ID NO:15中所示。酿酒酵母的天然α因子信号序列的氨基酸序列如在SEQ IDNO:14中所示。

在本发明的另一个实施方案中，所述载体可以编码“经修饰的”α信号序列。所述修饰包括从重组载体中的‘天然’α交配因子信号序列除去STE13蛋白酶切割位点。在‘天然’α交配因子信号序列中，KEX2和STE13切割位点位于信号肽序列的C-端末端附近。KEX2切割位点存在于Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala(SEQ ID NO:16)的信号肽序列段中的精氨酸和谷氨酰胺之间。Glu-Ala重复被STE13基因产物进一步切割。但是，Glu-Ala重复对于KEX2的切割而言不是必需的，取决于在Glu-Lys-Arg肽序列后面的氨基酸。在某些情况下，在STE13切割不是有效的情况下，Glu-Ala重复被保留在表达的目标蛋白的NH₂-端。因此，α因子信号序列的STE13切割位点的除去可以提供改进的信号序列的蛋白水解加工，这又产生没有不希望的N-端氨基酸残基的CSSK。根据本发明，编码经修饰的α信号序列的多核苷酸是与SEQ IDNO:9具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、or 99％或更大同一性的多核苷酸序列。根据本发明，编码经修饰的α信号序列的多核苷酸如在SEQ ID NO:9中所示。根据本发明，在本发明中公开的载体具有甲基营养酵母基因启动子、经修饰的α信号序列、编码CSSK的多核苷酸序列和在甲基营养酵母中有功能的转录终止子。

根据本发明，所述载体可以具有编码CSSK的多核苷酸序列，其对于表达CSSK的酵母种而言具有大于0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95的密码子适应指数。

本发明的一个实施方案提供了由转化的酵母细胞产生的凝块特异性链激酶，其中所述凝块特异性链激酶被糖基化且具有80,515Da的分子量。

转化酵母以产生表达CSSK的菌株

使用本文中公开的载体转化用于表达和分泌CSSK的甲基营养酵母细胞。转化经由载体元件(在本文中也被称作“表达盒”)发生，所述载体元件具有CSSK基因和在CSSK基因的上游和/或下游的整合序列用于在酵母基因组中同源重组。可以被线性化以促进整合的质粒和DNA片段/表达盒将借助于整合序列整合进宿主染色体中。在一个实施例中，整合通过在AOX1基因座处的至少一个交换重组而发生。

用于将载体引入甲基营养酵母中的方法包括原生质球技术(Cregg JM等人.1985.Mol Cell Biol 5:3376-3385)、电穿孔(Simon,J.R.&McEntee,K.1989.BiochemBiophys Res Commun 164:1157-1164)和氯化锂转化(Ito,H等人.1983.J Bacteriol 153:163-168)。在一个实施方案中，使用电穿孔方法。适用于培养甲基营养酵母细胞的方法是本领域已知的。

在本发明的一个实施方案中，用在巴斯德毕赤酵母启动子基因调节下的、含有编码CSSK的cDNA的线性DNA片段转化宿主酵母细胞，并且所述表达盒通过同源重组整合进宿主基因组中。

为了开发巴斯德毕赤酵母Mut菌株(Mut表示利用甲醇的表型)，所述载体可以整合进合适的基因座(诸如AOX1基因座)中。在一个实施例中，作为向AOX1基因座中整合的结果，可以得到Mut^S菌株。在Mut^S菌株中，AOX1基因被所述表达盒替换，且因此在该菌株中使用甲醇的能力下降。AOX1基因的丢失和因而大多数细胞醇氧化酶活性的丢失产生表现型上为Mut^S(甲醇利用缓慢)的菌株。这导致所述细胞的代谢甲醇的能力的下降。因此，所述细胞在甲醇培养基上表现出发育不全。由于AOX2基因产物的表达，用甲醇维持缓慢的生长速度。通过标记基因在表达盒上的存在，可以鉴别已经将所述表达盒整合进AOX1基因座(通过定点重组)中的经转化的细胞。可以如下针对它们的Mut^S基因型筛选选择的细胞：在有甲醇存在下培养它们并记录生长速度，或使用PCR来证实所述表达盒的存在。

针对CSSK生产克隆筛选酵母的方法

本发明的另一个实施方案提供了一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的载体转化至少一个酵母细胞以得到转化的酵母细胞；

(b)在含有甲醇的BMMY培养基中培养至少一个转化的酵母细胞以诱导CSSK蛋白的表达；

(c)将所述培养基与所述转化的酵母细胞分离以得到上清液；

(d)测试所述上清液的纤溶酶原活化；和

(e)通过检测所述细胞的上清液中的纤溶酶原活化，鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞。

在本发明的一个实施方案中提供了一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，其中在步骤(d)中的纤溶酶原活化试验如下完成：将所述上清液与纤溶酶原和生色团组合，并在405nm检测光吸收的变化。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，其中相对于代表已知量的CSSK的参考值，测量纤溶酶原活化。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，所述方法还包括通过SDS-PAGE分析证实在步骤(e)中鉴别出的细胞中的CSSK生产。

本发明也公开了凝块特异性链激酶(CSSK)和它的变体的基于平板的筛选方法，其能够快速地选择最好生产克隆。在该基于平板的方法的帮助下，可以在小规模改变不同的重要培养参数。

用于筛选转化的酵母细胞的基于平板的筛选方法可以鉴别生产凝块特异性链激酶(CSSK)的酵母细胞。所述方法包括以下步骤：(a)用本文中公开的编码CSSK的载体转化至少一个酵母细胞；(b)用甲醇培养所述酵母细胞以诱导CSSK蛋白的表达；(c)针对纤溶酶原活化来试验所述培养的细胞的上清液；和(d)通过检测细胞的上清液中的纤溶酶原活化，鉴别生产CSSK的酵母细胞。

在用携带目标基因的表达载体转化巴斯德毕赤酵母宿主菌株后，各个转化体通常表达宽泛地不同量的蛋白。因而需要许多轮的诊断和筛选转化体来获得高产克隆。通过本领域已知的方法(诸如聚合酶链式反应(PCR)、DNA印迹或RNA印迹)可以表征阳性转化细胞，但是取决于多肽组成和翻译后修饰，蛋白水平不总是与转录水平一致。因此，本申请提供了通过基于平板的活性测定直接检查蛋白水平的方法，所述测定能够快速地和有效地筛选所有得到的转化体。

建立了公开的基于平板的筛选方法来选择最佳克隆，没有耗时的浓缩步骤和样品的多个SDS-PAGE分析。此外，所述方法允许筛选大数目的得到的转化体，因而使错过罕见的最佳克隆的机会最小化。

使具有所述表型或期望的基因型的转化的菌株在摇瓶中生长用于通过基于平板的筛选方法证实选择的克隆。在不同的培养条件(例如，温度、pH、甲醇浓度和收获天)，针对甲醇诱导的CSSK表达试验选择的克隆。通过优选的标准方案利用发酵策略，但是针对最佳培养条件系统地修改以得到生物活性形式的CSSK蛋白的显著收率。

使通过期望的基因型和表型鉴别出的转化的甲基营养酵母在发酵罐中生长。使用抗-SK或纤连蛋白抗-血清和平行地用大肠杆菌表达和纯化的SK或CSSK标准品，通过纤溶酶原活化测定、SDS-PAGE、蛋白质印迹分析，可以确定分泌进培养基中的CSSK的水平。

通过将所述上清液与纤溶酶原和生色团组合，并通过检测吸光度的变化来检测纤溶酶原活化，可以试验纤溶酶原活化。在另一个实施例中，相对于代表已知量的CSSK的参考值，测量纤溶酶原活化。通过SDS-PAGE分析可以任选地证实在细胞中的CSSK生产。

组合物

本发明的一个实施方案提供了药物组合物，其包含通过本文中公开的方法生产的CSSK。这样的组合物可用于治疗循环系统病症，包括、但不限于，心肌梗塞、血管血栓形成、肺栓塞、卒中血管事件(包括急性缺血性卒中)、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠脉干预手术后的血栓性再闭塞、外周血管血栓形成、心力衰竭、X综合征和其中发生至少一条冠状动脉的变窄的障碍。

所述组合物包含在药学上可接受的载体中的有效量的CSSK。本文中使用的短语“药学上可接受的”是指，当施用给哺乳动物时不会造成不良反应的载体或媒介物。这样的载体是无毒的，且不会在体内产生炎症性的或变应性的应答。用于实践本发明的药学上可接受的载体包括众所周知的组分，例如，磷酸盐缓冲盐水。另外的药学上可接受的载体和它们的制剂是众所周知的，且通常描述在，例如，Remington's Pharmaceutical Science(第18版,Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)和Handbook ofPharmaceutical Excipients(第4版,Rowe等人编.Pharmaceutical Press,Washington,D.C.)，它们中的每一篇通过引用并入。

包含治疗量的CSSK的组合物的例子包括用于胃肠外、皮下、真皮内、肌肉内、冠状动脉内、心肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的液体制剂，诸如无菌的混悬液或乳剂。这样的组合物可以是与合适的载体、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)的混合物。还可以低压冻干所述组合物。所述组合物可以含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、凝胶或增加粘度的添加剂、防腐剂、矫味剂、颜料等，取决于施用途径和期望的制品。例如，低压冻干的组合物可以含有1、2、3或4种或更多种辅助物质，诸如明胶多肽、交联的明胶多肽、谷氨酸盐、L-谷氨酸钠和人白蛋白。

可以将CSSK包装在纤维蛋白溶解活性的单位中，例如，在以下范围内的瓶：每瓶约1,000,000至约2,000,000国际单位(IU)的纤维蛋白溶解活性，或每瓶约1,250,000至约1,750,000IU的纤维蛋白溶解活性，或每瓶约1,500,000IU的纤维蛋白溶解活性。确定纤维蛋白溶解活性的国际单位的方法是本领域已知的，例如，在商购可得的链激酶制剂中，诸如STREPTASE(CSL Behring,加拿大)。在另一个实施例中，可以将低压冻干的CSSK包含在瓶或其它容器中，其含有：每瓶约1,000,000至约2,000,000国际单位(IU)的纤维蛋白溶解活性；每瓶约10至约40mg、或约20至约30mg、或约25mg的交联的明胶多肽；每瓶约10至约40mg、或约20至约30mg、或约25mg的L-谷氨酸钠；和每瓶约10至约200mg、或约50至约150mg、或约100mg的人白蛋白。通过加入适当体积的赋形剂，可以制备用于静脉内和/或冠状动脉内施用的组合物。

治疗方法

如本文中所述生产的CSSK是溶血栓药物。因而，根据本发明生产的CSSK可以用在与血栓形成有关的病症中。包含CSSK的组合物可以用于治疗或预防循环系统病症，包括、但不限于，心肌梗塞、血管血栓形成、肺栓塞、卒中(包括急性缺血性卒中)、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠脉干预手术后的血栓性再闭塞、外周血管血栓形成、心力衰竭、X综合征和至少一条冠状动脉的变窄。

所述CSSK会溶解血块。在一个实施方案中，本公开内容涉及通过给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的如本文中所述生产的CSSK来定点溶解血块的方法。

本文中使用的术语“治疗”等包括改善或消除疾病或病症，或减轻与这样的疾病或病症有关的一种或多种征状。如本文中使用的，这些术语也包括，取决于患者的状况，改善疾病或病症或与疾病或病症有关的征状，包括减轻疾病或病症或与其有关的征状的严重程度。本文中使用的术语“治疗有效量”和“有效量”互换使用，表示本申请的组合物的量，该量足以阻止或抑制如上所述的循环系统病症的发生、复发或发作，减轻循环系统病症的严重程度和持续时间，改善循环系统病症的一种或多种征状，阻止循环系统病症的进展，和/或增强或改善循环系统病症的其它治疗的治疗效果。

可以将治疗有效量在一个或多个剂量中施用给患者，所述剂量足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展或以其它方式减少疾病的病理后果、或减少疾病的征状。改善或减少不需要是永久的，但是可以持续至少1小时、至少1天或至少1周或更久的一段时间。有效量通常由医师基于个例确定，并且是在本领域技术人员的技术范围内。当确定适当剂量以达到有效量时，通常考虑几种因素。这些因素包括患者的年龄、性别和重量，要治疗的病症，病症的严重程度，以及施用途径，剂型和方案和所期望的结果。

本文中使用的术语“阻止”或“预防”表示减小罹患疾病或病症或与疾病或病症有关的征状的趋势或可能性，特别是在罹患所述疾病或病症之前易于罹患所述疾病或病症的那些。在罹患之前这样的预防或减小表示将CSSK施用给没有处于罹患疾病或病症的施用时间的患者。“预防”也包括阻止疾病或病症或与其有关的征状的复发或复发-预防，例如在改善阶段以后。

本发明的一个实施方案提供了一种治疗或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，所述疾病选自心肌梗塞、血管血栓形成、肺栓塞、卒中、急性缺血性卒中、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠脉干预手术后的血栓性再闭塞、外周血管血栓形成、心力衰竭、X综合征和至少一条冠状动脉的变窄，所述方法包括通过注射或输注给所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含凝块特异性链激酶和药学上可接受的载体。

通过医学和兽医领域的技术人员众所周知的剂量和技术，考虑到诸如特定患者的年龄、性别、重量和状况以及用于施用的组合物形式(例如，液体)等因素，可以施用组合物。熟练的技术人员从本公开内容、本文中引用的文件和本领域中的知识，无需过多实验可以确定用于人类或其它哺乳动物的剂量。

在一个实施方案中，治疗方法包括静脉内施用，作为输注(例如，约10分钟至约2小时、或约10至约90分钟、或约20至约80分钟、或约30至约60分钟的静脉内施用)或缓慢推注(在约3分钟或更少、或约5分钟或更少、或约10分钟或更少、或约15分钟或更少内施用的填充的注射器)。在一个实施方案中，所述治疗方法是在约1、或约2、或约3、或约4ml/min的速率的推注静脉内注射。预见到在约1至约4ml液体的总体积中每次施用约0.1至约1.9、或约0.3至约1.1的剂量(mg/kg)。根据治疗医师的判断，可以约每30至约90分钟、或约每1、2、3、4、8、12、或24小时重复所述剂量。

当以液体形式施用时，将CSSK溶解于盐水溶液、糖溶液诸如右旋糖或其它生理上可接受的媒介物诸如等渗的且具有在约6.5至约7.5范围内的pH(例如，中性pH)的媒介物中。在一个实施方案中，用约0.9％(w/w)盐水溶液或约5％(w/w)右旋糖溶液或等渗的且在前述pH范围内的其它生理上可接受的媒介物配制CSSK。在另一个实施方案中，从酵母细胞(诸如巴斯德毕赤酵母)生产和纯化的CSSK含有人纤连蛋白的纤维结合结构域4和5(FBD 4,5)或其具有纤维蛋白亲和力的衍生物或FBD 4,5(连接至链激酶的每个末端)。所述纤维蛋白结合结构域掩蔽链激酶组分与血液纤溶酶原相互作用的能力。所述CSSK因而在血液循环中保持无活性且不会将血液纤溶酶原转化成纤溶酶，直到凝块结合的纤溶酶切割纤维蛋白结合结构域。这不同于天然的链激酶，其无差别地将纤溶酶原转化成纤溶酶；如此制备的CCSK能够裂解人血块，而不降低残余的血浆纤维蛋白原水平。

下述非限制性实施例进一步例证了本公开内容。

实施例

实施例1.用于毕赤酵母属表达的凝块特异性链激酶基因载体的构建

根据例如在以下文献中描述的标准方法，进行在下述实施例中公开的表达载体的构建：J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis(Molecular cloning:A laboratoryManual,第2版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA)。

通过将来自人纤连蛋白蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(“FBD(4,5)”)添加到链激酶(SK)基因上，将4和5结构域的拷贝置于链激酶基因的N-端以及C-端(图1A)，开发编码凝块特异性链激酶(CSSK)的基因。来自似马链球菌H46A的SK基因的DNA序列、和来自人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5、以及生产CSSK的方法公开在美国专利号7,163,817和美国专利号8,143,027中，它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文中。该CSSK具有聚-gly接头和转谷氨酰胺酶位点，其将SK的C-端末端连接至在SK C-端附近的FBD(4,5)结构域(图1B)。在本文实施例中利用的CSSK是具有在SK的N-端和C-端末端处的FBD 4,5结构域的链激酶，例如，FBD(4,5)-SK-FBD(4,5)。

用在CSSK基因前面的天然毕赤酵母属α交配信号序列构建表达载体。将CSSK序列从含有CSSK的pET23d载体[pET23(d)FBD(4,5)-SK-FBD(4,5)](如在美国专利号8,143,027中公开的)亚克隆进毕赤酵母属表达载体pPIC9K(Invitrogen/Life Technologies)中。pPIC9K载体(图2)具有用于甲醇诱导的5′AOX1(醇氧化酶-1)启动子，具有5′AOX1引物位点的启动子序列；用于从宿主细胞分泌表达的多肽的毕赤酵母属α-因子分泌信号，具有α-因子引物位点的分泌信号序列；多克隆位点(MCS)；3′AOX1引物位点；3′AOX1转录终止(TT)区域；组氨酸-4(HIS4)开放读码框(ORF)；卡那霉素抗性基因；3′AOX1片段；用于在大肠杆菌中复制的pBR322起点；和氨苄西林抗性基因。

pPIC9K载体具有细菌复制起点，但是不具有酵母复制起点。稳定的转化体仅可以在所述质粒和毕赤酵母属基因组之间发生重组事件时产生。α-因子分泌信号造成重组蛋白分泌进培养基中。MCS具有四个独特的限制位点，其可以用于在框架内克隆具有α-交配信号序列的靶基因。HIS4 ORF允许在不含组氨酸的平板上选择转化体(野生宿主GS115是his4，且因此需要组氨酸才能生长)。如果用Sac I和Sal I线性化，转化导致重组后His+Mut+细胞在GS115中的产生，而如果用Bgl II线性化，它导致His+和Mut^s细胞的产生。

对于亚克隆，将pET23(d)FBD(4,5)-SK-FBD(4,5)用限制性酶EcoRI和NotI切割，并将消化的产物在0.8％琼脂糖凝胶上拆分。根据生产商的说明书，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen Sciences)，将与CSSK对应的片段(1860bp)(图1C)从凝胶洗脱。将洗脱的片段用EcoRI和Not1限制性酶消化，并连接进EcoRI-和Not1-消化的pPIC9K载体中。通过热激转化方法将穿梭载体引入大肠杆菌XL1-BL中。将得到的载体(称作pPIC9K-CSSK)用EcoRI和NotI酶消化。通过使用5’AOX1正向引物序列(SEQ ID NO:30；5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)和3’AOX1反向引物(SEQ ID NO:31；5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)扩增和测序，证实对齐和序列。

CSSK的多肽序列如在SEQ ID NO.1中所示。编码CSSK的多核苷酸序列如在SEQ IDNO.2中所示。

实施例2.包含经修饰的α信号序列的毕赤酵母属CSSK表达载体的构建.

在pPIC9K载体的α-因子信号多核苷酸序列(SEQ ID NO:15)中，所述信号多肽序列的初步切割通过KEX2蛋白的作用而发生。KEX2切割发生在多肽序列Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala(SEQ ID NO:16)中的精氨酸和谷氨酰胺之间。随后由STE13蛋白切割Glu-Ala重复。但是，所述Glu-Ala重复对于KEX2的切割而言不是必需的，因为KEX2将识别和切割其它序列，取决于在Glu-Lys-Arg序列后面的氨基酸。作为一个关注点，STE13切割可以是不完全的，从而导致Glu-Ala重复保留在表达的目标蛋白的NH₂-端上和异源蛋白在细胞外培养基中的低效分泌。

以低水平从pPIC9K-CSSK载体表达CSSK。另外，对CSSK N-端进行GLU-ALA氨基酸添加，其显然源自不完全的或无效的STE13切割。信号序列的有效蛋白水解加工会促进表达的异源蛋白分泌进细胞外环境中。因此，通过删除STE13蛋白酶切割位点来设计经修饰的α信号序列(图3-4)。图4显示了从天然α交配因子信号序列除去STE13切割位点的策略。在用XhoI和NotI消化以后，从pPIC9K载体除去具有KEX2和STE13信号切割位点的α交配因子信号序列段(如在SEQ ID NO:18中所示的多核苷酸序列和如在SEQ ID NO:19中所示的多肽序列)。正向引物如在中所示[XhoI限制位点加下划线，且KEX2切割位点(AAAAGA)为斜体]，其用于扩增CSSK，整合邻近KEX2切割位点(AAAAGA)的XhoI位点(CTCGAG)，从而得到pPIC9K-α修饰的没有STE13切割位点的CSSK表达载体，从而建立‘经修饰的’α交配因子信号序列。将NotI位点(GCGGCCGC)从信号序列的末端移动至CSSK的末端。

经修饰的α信号的多肽序列如在SEQ ID NO:9中所示，且经修饰的α信号的多核苷酸序列如在SEQ ID NO:10中所示。

将具有经修饰的α信号多肽序列的CSSK的多核苷酸序列(SEQ ID NO:26)克隆进pPIC9K中。利用在SEQ ID NO:33(GACAGCCTCGAGAAAAGAGTGCAAGCTCAACAA)[XhoI限制位点加下划线]中所示的引物，所述引物分别包含在5’端的XhoI限制位点、KEX2切割位点和在3’端的NotI限制位点，从pET23(d)-CSSK扩增CSSK多核苷酸序列，随后将CSSK PCR产物用Xho I和Not I酶双重消化。还将pPIC9K载体用XhoI和NotI消化，这导致STE13位点的切割以及pPIC9K载体的两个片段的产生(由于在载体中存在两个XhoI位点)。随后，XhoI和NotI消化的pPIC9K载体的片段(由于pPIC9K中的两个XhoI限制位点所致的两个片段，一个刚好存在于多克隆位点(MCS)前面，另一个在卡那霉素抗性基因中)和CSSK的三块连接导致具有‘经修饰的’α-因子信号序列的重组pPIC9K-CSSK质粒的形成，其缺乏STE13切割位点。具有‘经修饰的’α-因子信号序列的重组pPIC9K-CSSK质粒的示意图显示在图5中。将得到的载体命名为pPIC9K-α修饰的CSSK(图6,7)。将pPIC9K-α修饰的CSSK质粒用XhoI和NotI消化并在0.8％琼脂糖凝胶上跑胶。在双重消化以后鉴别出1860bp DNA片段(图8)，从而指示具有α修饰的信号序列的pPIC9K载体中的CSSK的成功克隆。通过热激转化方法将穿梭载体引入大肠杆菌XL1BL细胞中，并分别使用5’AOX1正向引物(SEQ ID NO:30)和3’AOX1反向引物(SEQ IDNO:31)通过扩增和测序证实对齐和序列。

实施例3.包含经修饰的α信号序列和经修饰的CSSK基因的表达载体的构建.

为了得到CSSK蛋白从酵母巴斯德毕赤酵母表达的更好收率，修饰了CSSK核酸序列，其中考虑到在巴斯德毕赤酵母中表达的大多数基因的优先密码子，同时将限制位点添加在合成基因的末端以促进向巴斯德毕赤酵母表达载体中的克隆。在修饰过程中，在适用时避免以下顺式作用序列基序：内部TATA-盒，chi-位点和核糖体进入位点；富含AT的或富含GC的序列段；RNA不稳定性基序；重复序列和RNA二级结构；在高等真核生物中的(隐含的)剪接供体和受体位点。在修饰过程中，保留所述基因中的几个独特位点，例如，Afl II限制位点，用于产生融合构建体。

所述修饰产生序列，其中在可能时消除负面顺式作用位点(诸如剪接位点、聚腺苷酸信号、TATA框等)，调节GC-含量来延长mRNA半衰期，并实现好的CAI(密码子适应指数)。CAI描述了密码子与靶生物体的密码子选择偏好的匹配程度。因而，1.0的CAI将是完美的，而>0.8的CAI被视作好的(即允许高表达)。为巴斯德毕赤酵母修饰的CSSK具有0.87的CAI值。经修饰的基因因此应当允许在巴斯德毕赤酵母中的高的和稳定的表达速率。最终，合成了适合用于在巴斯德毕赤酵母中表达的密码子修饰的序列。

经修饰的CSSK基因的多核苷酸序列如在SEQ ID NO.4中所示，且由经修饰的CSSK基因编码的多肽序列如在SEQ ID NO:3中所示。SEQ D NO:3与SEQ ID NO:1具有100％同一性。使用该序列转化巴斯德毕赤酵母的宿主细胞来表达CSSK。

描绘了具有‘经修饰的’α-因子信号序列的重组pPIC9K-Opt CSSK质粒的构建的示意图(图9)。将CSSK的多核苷酸序列(SEQ ID NO:4)使用分别具有在5’端的XhoI限制位点和KEX2切割位点以及在3’端的Not I限制位点的引物从含有经优化的CSSK核苷酸序列的质粒扩增，随后将扩增的优化的CSSK PCR产物用XhoI和NotI酶双重消化。还将pPIC9K载体用XhoI和NotI消化，这导致STE13位点的切割以及pPIC9K载体的两个片段的产生(由于在所述载体中存在两个XhoI位点)。随后，XhoI和NotI消化的pPIC9K载体的片段(两个片段)和CSSK的三块连接导致具有‘经修饰的’α交配因子信号序列的重组pPIC9K-Opt CSSK质粒的形成。通过DNA测序证实正确的克隆。此外，在所述基因的5’区域中，引入与酿酒酵母α信号序列的KEX2的位点和XhoI的限制位点对应的序列。在所述基因的3’端处，引入终止密码子和NotI的限制位点。具有经修饰的α序列的经修饰的CSSK基因的多核苷酸序列如在SEQ ID NO:23中所示，且多肽序列如在SEQ ID NO:24中所示。

实施例4.包含经修饰的α信号序列以及5’区域修饰的CSSK和CSSK基因的3’区域的嵌合体的表达载体的构建

在图10中描绘了具有‘经修饰的’α-因子信号序列的嵌合重组pPIC9K-Opt+NativeCSSK质粒的构建的示意图。AOX1启动子和CSSK包含分别在pPIC9K-Opt CSK和pPIC9K-Native CSSK重组质粒中的独特的Sac I和Afl II限制位点，并将这些位点用于制备嵌合重组质粒。具有经修饰的CSSK的5’区域(精确地，1-516bp；总计516bp，如下划线所示)和原始CSSK的3’区域(517-1860bp；总计1344bp)的嵌合CSSK基因1(opt+天然CSSK基因)的多核苷酸序列如在SEQ ID NO:6中所示。由嵌合的CSSK基因1编码的多肽序列的序列如在SEQ IDNO:5中所示。

原始CSSK基因序列(SEQ ID NO:2)和嵌合CSSK基因(SEQ ID NO:6)之间的多核苷酸序列比对的结果揭示了嵌合CSSK基因1序列和原始CSSK基因序列之间的93％同一性。

实施例5.具有经修饰的α信号序列、原始CSSK的5’区域和经修饰的CSSK基因的3’区域的表达载体的构建.

在图10中显示了具有‘经修饰的’α-因子信号序列的嵌合重组pPIC9K-Native+OptCSSK质粒的构建的示意图。在pPIC9K-Opt CSK和pPIC9K-Native CSSK重组质粒中，CSSK具有AOX1启动子和独特的Sac I和Afl II限制位点，且将这些位点用于制备嵌合重组质粒。具有CSSK基因的5’区域(精确地，1-516bp；共516bp)和经修饰的CSSK基因的3’区域(517-1860bp；共1344bp，如下划线所示)的嵌合CSSK基因2(天然+optCSSK基因)的多核苷酸序列如在SEQ ID NO:8中所示。由嵌合的CSSK基因2编码的多肽的序列如在SEQ ID NO:7中所示。

实施例6.用载体转化巴斯德毕赤酵母和转化体中的CSSK表达的筛选.

一旦建立表达载体pPIC9K-CSSK、pPIC9K-α修饰的CSSK、pPIC9K-optCSSK、pPIC9K-天然+optCSSK和pPIC9K-opt+天然CSSK，用内切核酸酶Sac I或BglII进行消化以将所述质粒线性化，随后转化进酵母菌株GS115中。将YPD板用GS115甘油储备物划线，并在30℃温育48-72h。将单个分离的菌落接种进5ml YPD培养基中，并在30℃温育过夜，随后将500μl该过夜培养的培养物接种进1升烧瓶内的250ml新鲜YPD培养基中。培养物O.D达到1.3-1.5以后，将细胞在4℃在5000rpm离心5min，并重新悬浮在250ml冰冷的无菌水中。将细胞再次离心，随后用125ml冰冷的无菌水和10ml 1M山梨醇洗涤2次。洗涤以后，将细胞重新悬浮在1ml 1M山梨醇中。接着，将细胞在相同条件下离心，并重新悬浮在1ml冰冷的1M山梨醇中。通过QIAGEN质粒纯化试剂盒制备CSSK构建体的表达载体，并通过乙醇沉淀方法浓缩。将10μgDNA用BglII限制性酶消化。将线性化的DNA通过乙醇沉淀方法再次浓缩。最后将DNA沉淀物溶解在10μl无菌水中至1μg/μl的终浓度。将电感受态的细胞的等分试样与10μl线性化的DNA(10μg DNA)混合。然后将混合物转移至冰冷的0.2cm电穿孔容器并在冰上温育5min。使用基因脉冲器电穿孔设备(Biorad)，在1.5KV、25μF和200Ω电阻的设置用线性化的DNA转化细胞，将1ml冰冷的1M山梨醇立即加入容器中，并如在Invitrogen用户手册中所述。将容器内容物转移至无菌的微量离心管。然后将细胞在没有摇动下在30℃温育1-2h，并将内容物铺展在MD平板上。将平板在30℃温育直到菌落出现。

首先通过不需要组氨酸的生长来选择转化体，且如果必要的话，进一步通过G418(遗传霉素)抗性来选择。通过这些选择，分别得到表达CSSK蛋白的菌株pPIC9K-CSSK/GS115、pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115、pPIC9K-optCSSK/GS115、pPIC9K-天然+optCSSK/GS115和pPIC9K-opt+天然CSSK/GS115。

通过针对CSSK表达进行筛选来分析转化体.

为了评估CSSK表达，将转化巴斯德毕赤酵母所得到的克隆分别接种进5ml BMGY培养基中并在30℃在摇动下培养至对数期直到O.D达到2-6。将细胞通过在室温在5000rpm离心5分钟进行收集，并将细胞沉淀物在含甲醇的BMMY培养基中重新悬浮至1的O.D用于诱导。每24h以后以0.5％的终浓度加入另外的甲醇，共7天。在每个时程以后将甲醇诱导的培养物上清液转移至微量离心管，并通过在室温在6000rpm离心5min收获细胞。将上清液转移至新鲜试管。将时程样品浓缩，并然后在12％SDS-PAGE凝胶上分析。结果揭示，在几个克隆中，仅极少克隆被证实在CSSK的分泌表达方面是阳性的。

实施例7.针对巴斯德毕赤酵母CSSK菌株的基于平板的筛选方法的开发.

通过浓缩甲醇诱导的培养物上清液和它们的SDS-PAGE分析来选择不同转化体中的最好生产克隆是一项劳动密集型操作，且“筛选”最好生产者是巴斯德毕赤酵母表达系统中的瓶颈。因此，为了克服筛选数百个转化体和选择最好生产克隆的常规的使人厌烦的方法，开发了一种直接的基于平板的筛选方法(PBS-方法)。

在该筛选方法中，在甲醇诱导以后培养表达CSSK的克隆，并将上清液用于活性测定。为了优化PBS-方法，使用不同体积的CSSK培养液进行基于表达的CSSK的外源纤溶酶原活化的功能测定，以绘制活性相对于剂量的应答曲线。所述活性测定结果清楚地表明CSSK活性随着含有CSSK的培养液的体积的增加而逐步增加，直到小于10μl的小体积，此后应答在增加体积后达到饱和，随后活性下降，这可能是由于存在于培养液中的培养基组分对酶活性的干扰。

为了得到高产克隆，将各个转化体在含有2.5ml BMGY培养基的falcon试管中培养12-16h，直到O.D达到2-6。然后将细胞在BMMY培养基中稀释至1的O.D。将培养维持10天，每24h将甲醇补充至1％的终浓度以补偿甲醇蒸发。每24h后，将细胞离心并收集培养液用于活性测定。对于测定，使用每个孔中的100μl反应混合物，其由50mM Tris-Cl、21.2uM纤溶酶原(PG)、0.5mM chromozyme(甲苯磺酰基-Gly-Pro-Lys-对硝基苯胺)和3μl上清液组成。通过在微孔滴定板读数器(VERSAmax,Molecular Devices)上记录随时间变化的在405nm的吸光度变化，执行活性测定。96-孔格式的筛选方法和得到的结果显示在图11-12中。将菌株分别接种进5ml BMGY培养基中并在30℃在摇动下培养至对数期直到O.D达到2-6。将细胞通过在室温在5000rpm离心5分钟进行收集，并将细胞沉淀物在含甲醇的BMMY培养基中重新悬浮至1的O.D用于诱导。在每个时程以后将甲醇诱导的培养物上清液转移至微量离心管，并收获细胞。

在表达CSSK的菌株(例如，pPIC9K-CSSK/GS115、pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115、pPIC9K-optCSSK/GS115、pPIC9K-天然+optCSSK/GS115和pPIC9K-opt+天然CSSK/GS115)中检查CSSK蛋白的表达水平。

基于采用已知浓度的大肠杆菌表达和纯化的CSSK相对于活性斜率的标准图(图13)，使用纤溶酶原活化(表1)确定培养物上清液中的CSSK的总收率。结果显示在表1中。

表1.来自标准曲线的CSSK的计算表.

在10倍稀释后针对活性再次试验基于活性测定选择的克隆，并通过SDS-PAGE分析进一步验证(图14A-B)。

表2提供了在巴斯德毕赤酵母中采用不同的核苷酸序列(但是具有相同的α修饰的信号序列)用CSSK得到的分泌表达水平的对比。如在表2中所见，CSSK表达在用5’优化的/3’天然的CSSK转化的克隆中最高。

表2.在巴斯德毕赤酵母中采用不同的核苷酸序列用CSSK得到的分泌表达水平.

实施例8.培养和CSSK蛋白的纯化.

尽管毕赤酵母属菌株中的CSSK的分泌表达相对于CSSK的细菌生产简化了蛋白提取操作，但是CSSK必须与其余的培养基组分分离。为了改善分离步骤，试验了允许CSSK以高效率结合柱中的HIC材料的不同盐和盐浓度，并得到选择性地允许它以更纯形式洗脱的低盐浓度，并且最终确定了在不影响蛋白稳定性的情况下使与苯基琼脂糖珠子的结合最大化的盐条件。在2L烧瓶中执行CSSK蛋白的大规模表达。基于使用基于平板的筛选方法的适当好的活性谱，在30℃在摇动(280rpm)下在125ml BMGY培养基中培养巴斯德毕赤酵母重组菌株(pPIC9K-α修饰的CSSK/GS115)和产生最大量的蛋白的pPIC9K-opt+天然CSSK/GS115的克隆，直到培养物达到2-6的O.D₆₀₀。将细胞在1500g离心10min并重新悬浮在500ml BMMY培养基中。每24h加入纯的甲醇至1％的终浓度。48h以后，将细胞在5000g重新离心12min，并将培养液重新悬浮在平衡缓冲液(0.25M NaCl和25mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4)中。为了纯化CSSK，用相同缓冲液填充和平衡苯基-琼脂糖柱。将培养液应用于平衡过的柱，然后将其用8床体积的相同缓冲液洗涤，随后用25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤，并然后将蛋白用无菌水以1.0ml/min的流速洗脱。将洗脱级分收集为1ml级分(图15)。在色谱法系统(GEHealthcare Life Sciences)中在4℃执行所有纯化步骤。

实施例9.纯化的CSSK蛋白的分析

得自单步骤纯化的CSSK蛋白的表征.

使用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶执行SDS-PAGE。在还原条件下将包括色谱级分的样品溶解在SDS样品缓冲液中(图16A-16B)。将凝胶用考马斯亮蓝R-250(Sigma)染色用于蛋白带的显影。色谱级分分析揭示在大约1520分钟的峰，其对应于表达的CSSK蛋白。SDS-PAGE分析清楚地揭示毕赤酵母属表达的CSSK蛋白与大肠杆菌表达的CSSK相比分子大小的上移。作为表达宿主，酵母会在真核蛋白处理、折叠和翻译后修饰方面提供许多胜过大肠杆菌的优点。因而，增加的毕赤酵母属衍生出的CSSK的大小的解释可能是翻译后修饰，诸如糖基化。

生化测定和与细菌表达的CSSK的对比：

毕赤酵母属表达的CSSK纯化的蛋白应当表现出与大肠杆菌表达的CSSK纯化的蛋白可比较的活性。试验了纤溶酶原活化，并发现在毕赤酵母属表达的CSSK和大肠杆菌表达的CSSK之间是基本上相同的。另外，在有递增量的加入反应中的纤溶酶存在下，活性的延迟逐渐下降(图17)。这表示，酵母衍生出的CSSK与大肠杆菌衍生的CSSK一样有活性，并且对纤溶酶具有相同的依赖性才能活化。纤溶酶原活化能力对小量纤溶酶的存在(如存在于血块中)的依赖性允许纤维蛋白凝块特异性起作用，因为不同于天然SK，CSSK(酵母或大肠杆菌衍生的)现在在血液循环中是无活性的(因为纤溶酶在其中被迅速灭活)，但是选择性地在病理性血块内借助于其中的“隔离”纤溶酶被活化。该性质在来源于酵母的CSSK中的存在清楚证实，在该系统中生产的CSSK，同从大肠杆菌制备的CSSK一样，在它的纤溶酶原活化剂活性特征方面具有相同的(最重要的)生物学特征。

使用SK和纤维蛋白结合结构域的免疫印迹法.

通过蛋白质印迹将CSSK批次与细菌表达的CSSK和天然的未糖基化的SK进行了对比。如在图20中所见，毕赤酵母属表达的CSSK由于糖基化而具有更高的分子量。蛋白质印迹法揭示，从5个5L批次(图20,泳道1-5)和1个100L生产批次(图20,泳道6)纯化的蛋白是一致的，从而指示毕赤酵母属表达的CSSK在批次和批大小之间具有相同的分子量。

纯化的CSSK的生物物理学表征

N-端测序：通过电印迹将具有‘经修饰的’α-因子信号序列的纯化的CSSK蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将蛋白带切离并处理用于N-端测序。SEQ ID NO:20提供了经修饰的α信号序列的序列和成熟的CSSK蛋白的开始。在该序列中，冒号(:)表示成熟蛋白编码序列的起点和不同信号序列的处理的位点，且加下划线的残基描绘了确定的成熟CSSK蛋白的N-端序列。未加下划线的残基是经修饰的α信号序列。

SEQ ID NO:20

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR:QAQQIVPIAEKC

使用Edman降解通过自动化的蛋白测序仪实现蛋白的N-端测序。将Edman试剂异硫氰酸苯酯(PTC)与12％三甲胺的弱碱性缓冲溶液一起加给吸附的蛋白。然后通过加入无水酸将现在被衍生化的末端氨基酸选择性地脱离。所述衍生物然后异构化以得到被取代的苯硫乙内酰脲，将其洗掉并通过色谱法鉴别，并重复所述循环。

执行N-端测序来检查通过酵母表达生产的CSSK蛋白的N-端是否具有与大肠杆菌表达的CSSK蛋白相同的N-端，通过电印迹将来自发酵生产的几批的纯化蛋白吸附到PVDF膜上。类似地，用纯化的大肠杆菌表达和纯化的CSSK制备印迹。将所述蛋白印迹加载到Applied Biosystems Procise Protein Sequencer Model 491cLC的BLOTT^TM筒(反应室)上。它利用Edman降解化学造成衍生化以后从蛋白的N-端的连续氨基酸降解。

N-端测序结果揭示了正确的蛋白水解加工和信号序列的除去。信号序列的切除产生了期望的CSSK N-端序列。因而，使用经修饰的α信号序列的CSSK的分泌表达导致N-端序列，没有未切离的信号序列和与大肠杆菌表达的CSSK相同的N-端序列的问题。

实施例10.纯化的CSSK的糖基化研究

CSSK的酶促去糖基化.

使用内切糖苷酶Hf和PNGase F(New England Biolabs,Beverly,USA)，使用它们各自的去糖基化缓冲液和条件，根据生产商的说明书，执行从巴斯德毕赤酵母分泌的CSSK(20μg)的去糖基化。将去糖基化的蛋白在10％SDS-PAGE凝胶上分析，并用考马斯亮蓝R-250染色以确定蛋白分子量相对于未经处理的对照的任何转移。当将毕赤酵母属CSSK与endoH酶一起温育时，观察到分子大小从85kDa向70kDa(等同于大肠杆菌表达的CSSK)的减小(图18)。去糖基化CSSK的分子量是69,695Da，而酵母表达的糖基化CSSK的分子量是80,515Da。这些结果指示，当在酵母细胞中表达时，毕赤酵母属表达的CSSK发生糖基化，但是与没有任何糖基化的大肠杆菌表达的CSSK相比，这没有影响它的生物活性。

PAS染色.为了检查糖基化的部分的存在，将SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝G-250染色，并平行地将另一个凝胶用糖蛋白检测试剂盒(Sigma,USA)处理。该检测系统是过碘酸-希夫(PAS)方法的改进，并产生具有淡粉红色或无色背景的洋红色带。按照生产商的说明书进行PAS染色方案。将毕赤酵母属表达的CSSK通过过碘酸-希夫(PAS)染色进行染色，从而证实糖基化的存在(图19A-19B)。

在发酵罐中培养表达CSSK的菌株.将7升发酵罐(具有接近5升的工作体积)用于发酵。所述发酵罐配有在期望设定点的温度、pH、溶解氧和通气量的自动控制。所述发酵罐还配有用于在线记录运行参数的数据记录软件。在插入pH、溶氧的探头和连接空气和排气过滤器以后，将所述发酵罐与生长培养基一起灭菌。灭菌和冷却以后，在无菌条件下将培养基的剩余组分加入容器中。将液氨用于pH控制和作为氮源。将pH设定在期望设定点以后和在校准DO探头以后，给发酵罐培养基接种种子培养物。在发酵过程中将pH、温度和溶解氧维持在期望设定点。将搅拌器速度维持在300-900rpm之间，并将通气量维持在1.0±0.2vvm。批式阶段结束后，通过在预定流速加入补料培养基，开始补料分批阶段。连接纯氧并根据DO控制器的需要来供给。使培养物生长至期望的光密度，并通过加入甲醇进行诱导。定期取出样品并试验OD₆₀₀和通过活性测定确定表达水平。在达到最大表达水平以后，在诱导后第10天收获该批。

为了在更高规模(100升)从毕赤酵母属发酵得到CSSK，将15L发酵罐(具有接近10L的工作体积)用于接种物制备。给具有接近100L的工作体积的生产发酵罐(140L)接种10％接种物。这两个发酵罐都配有在期望设定点的温度、pH、溶氧、通气量的自动控制。所述发酵罐还配有用于在线记录运行参数的数据记录软件。在插入pH、溶解氧的探头并连接空气和排气过滤器以后，将发酵罐与生长培养基一起使用在位蒸汽(SIP)原位灭菌。灭菌和冷却以后，在无菌条件下将培养基的剩余组分加入生产(100L)发酵罐中。将液氨用于pH控制和作为氮源。将pH设定在期望设定点以后和在校准DO探头以后，给发酵罐培养基接种种子培养物。在发酵过程中将pH、温度和溶解氧维持在期望设定点。将搅拌器速度维持在150-400rpm之间，并将通气量维持在1.0±0.2vvm。批式阶段结束后，通过在预定流速加入补料培养基，开始补料分批阶段。连接纯氧并根据DO控制器的需要来供给。使培养物生长至期望的光密度，并通过加入甲醇进行诱导。定期取出样品并试验OD₆₀₀和通过活性测定确定表达水平。在达到最大表达水平以后，在诱导后第10天收获该批。通常得到超过2g CSSK/升的收率。

纯化.固液分离:从发酵罐收集发酵液并进行离心以从培养基分离细胞。记录得到的湿细胞重量和培养物上清液的总体积。向上清液中，将氯化钠和磷酸盐缓冲液的终浓度分别维持为0.1M和20mM以达到最终电导率50±10mS/cm，并将它立即加载到色谱柱上。对生物质进行高压灭菌，随后烧灼灭菌。在100L规模，使用0.2μm中空纤维筒使用Grand立式中空纤维系统(G.E Healthcare)执行液体培养基的澄清。在加载到色谱柱上之前，使用5M NaCl和1M PB(pH 7.2)将含有期望蛋白的渗透物的电导率设定至50±10mS/cm。

色谱法:使用疏水相互作用色谱法(HIC)柱从培养物上清液纯化经修饰的链激酶。将培养物上清液加载到柱上，在用不同的缓冲液充分洗涤以后，洗脱蛋白。然后将来自该步骤的纯化的蛋白应用到离子交换柱上用于除去一些阳离子杂质。将来自该步骤的蛋白浓缩，并使用横向流超滤(30kDa)脱盐，然后进行低压冻干。将终产物无菌过滤并在-80℃储存。

实施例11.在血栓形成的灵长类动物模型中的CSSK剂量-应答的体内研究.

研究了食蟹猴(3.3-6.9kg)中对CSSK的溶血栓应答。对动物进行外科手术以接近股动脉以便引入血流量探头用于监测股动脉血流。另外，将针电极引入股动脉中以诱导血栓形成。通过使电流(150uA)经过所述电极，这导致血管的内衬里的内皮破坏，继之以血小板向损伤部位的附着，自发地产生富含血小板的/纤维蛋白凝块。血小板聚集之后是纤维蛋白沉积和交联。通过快速推注来施用CSSK，以确定所述试剂作为有效溶解剂在以前形成血栓的股动脉中的剂量应答特征。监测达到再灌注的时间、再灌注的发生和达到再闭塞的时间，以及残余血栓重量、出血时间和血浆纤维蛋白原的系列实验室测量结果。

在动物处理、进行技术操作和外科手术准备之前将动物使用含有0.2mg/kg乙酰丙嗪和0.02mg/kg阿托品的混合液镇静，随后经由头部或隐静脉静脉内导管(i.v.)注射4mg/kg丙泊酚。镇静以后，为外科手术/操作准备动物：将动物立即插管，并提供2.5％-4％的吸入异氟烷麻醉剂用于诱导和0.5-2.5％的吸入异氟烷麻醉剂用于维持，其通过调节体积的呼吸机或重复呼吸设备递送。通过IV导管执行药物施用，并记录药物、剂量、途径和施用部位。在外科手术中以10ml/kg/小时施用含乳酸盐的林格溶液。

给股动脉安装器械用于监测动脉血压和心率。将股静脉插管用于血液取样和施用静脉内流体。将对侧股动脉使用局部应用的盐酸利多卡因(2％溶液)小心地从股静脉分离以辅助血管痉挛的预防。将2.0mm血管周围流动探头(Transonic Systems)定位在股动脉上在腹壁下动脉从股动脉分叉点远侧大约15mm的位置。血管周围空间被粘稠的听觉凝胶填充，其允许通过超声渡越时间方法(Transonic Systems)测量阶段和平均股动脉血流量。

将从25号皮下注射针形成的小电极用于产生内皮损伤。将所述电极在腹壁下动脉分支和血流量探头之间引入血管腔。在血栓形成并已经老化1小时以后，给动物推注施用CSSK。在老化过程中，静脉内地施用肝素钠来预防凝块延伸(阻塞以后静脉内100U/kg，和另外的静脉内50U/kg/小时)。在基线、血栓性阻塞后、即将CSSK静脉内推注施用之前，然后在CSSK施用以后30min、1小时、2小时、3小时和4小时，收集并记录血液样品。在指定的时间点从独立的耳边缘静脉穿刺术收集血液，用于aPTT、ACT和纤维蛋白原确定。为每个时间点收集共～5mL血液。

凝固试验.完成大约1.8mL向柠檬酸钠试管(0.2mL 3.8％柠檬酸钠)中的血液抽吸。将血液样品保持在冰上，直到在4℃在1,500g离心15分钟来制备血浆。将含柠檬酸盐的血浆样品使用移液器吸出，并均匀地分入2个单独的清洁的带标签的试管中。将样品在-80℃储存用于分析激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。在现场运行ACT。分析1瓶，并将1瓶作为储存样品保存。

血浆纤维蛋白原:得到大约3mL血液并加入EDTA/PPACK试管中。将血液样品保持在冰上，直到在4℃在1,500g离心15分钟。将血浆EDTA/PPACK样品使用移液器吸出，并均匀地分入2个单独的清洁的带标签的试管中。将样品在-80℃储存用于在以后分析血浆纤维蛋白原。使用沉淀方法分析1瓶以确定血浆纤维蛋白原水平(Orsonneau,J.,等人,Clin.Chem.,35:2233,1989)。

药代动力学(PK).在时间0、1、3、10、15、30、60、120、240、300和360min从研究中的每只动物得到用于CSSK血浆水平的PK分析的血液样品。在S2251酰胺分解生物测定中分析这些样品(Grierson DS和Bjornsson TD,Clin Pharmacol Ther.1987Mar；41(3):304-13)。

出血时间.在前臂上确定皮肤出血时间，所述前臂通过置于上臂上的闭合袖(occluder cuff)发生40mmHg静脉郁滞。用SURGICUT模板出血装置做出均匀切口(5mm长x1mm深)。将出血时间确定为形成初期血小板塞所需的时间(按秒计)，所述初期血小板塞足以阻止来自切口部位的血流。

血压、心率和治疗血管血流量.按照描述在操作过程中得到经皮动脉入口，并用于动脉血压监测。将动脉鞘的侧端口连接至Datascope Passport System用于监测收缩期动脉压(SAP)、舒张期动脉压(DAP)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)。在操作过程中在AD仪器上监测并连续地以数字方式记录所有数据。

结果

溶血栓效力和残余的血栓质量.

通过CSSK的恢复以前形成血栓的并完全阻塞的股动脉中的血流的能力，评估了溶栓效力。通过对血管内表面的电解损伤，其导致内皮破坏和随后的血小板附着、血小板聚集和纤维蛋白沉积，实现血栓性阻塞。

表3解释了CSSK研究的主要端点：再灌注的发生、达到再灌注的时间、再闭塞的发生和达到再闭塞的时间。在25,000、50,000和100,000U/kg的静脉内推注剂量评价CSSK。基于CSSK的比活性(70,000U/mg)，将这3种CSSK剂量分别转化成0.35、0.71和1.42mg/kg。每个剂量组研究了2只动物。

表3.CSSK在食蟹猴股动脉中的溶血栓效力

以25,000U/kg(0.35mg/kg)施用的CSSK没有在研究的2只猴中引起靶血管的再灌注。与用更高剂量的CSSK治疗的其它组相比，残余血栓质量是相对高的，从而指示所述低剂量在该动物模型中不足以充分地降解凝块以实现成功的再灌注(定义为与诱导血栓之前的基线流量相比50％或更大的血流量恢复)。

以下一个更高剂量50,000U/kg(0.71mg/kg)施用的CSSK在研究的2只动物中的1只中引起了成功的再灌注，且在2只动物中，残余血栓质量是非常低的。

在使用的CSSK的最高剂量(100,000U/kg或1.42mg/kg)，成功的再灌注发生在2只动物中，具有低残余血栓质量，如在以前的中剂量CSSK组中所见。

图21表示了股动脉血流的实时分析.时间线的开放区域指示，靶血管是开放的，且血液以如上定义的50％或更大水平流动。封闭区域指示，所述血管形成血栓，没有血流量。在箭头处施用CSSK，并然后可以在视觉上实现溶解效应的进展。该惯例最初由Gold等人(Circ.,77(3):673,1988)描述，以描述tPA和有关的类似物的作用。

在图22A-22B中提供了在有效的CSSK诱导的溶栓时的实时股动脉血流描记图。顶部描记图是随着心舒期和心缩期波动的搏动血流图样，且底部描记图是穿过靶血管(股动脉)的平均血流。用最高剂量的CSSK(100,000U/kg或1.4mg/kg)治疗的两只动物分别在35和162min有效地再灌注。

血浆纤维蛋白原水平.在表4中解释了血浆纤维蛋白原水平。CSSK在治疗后仅引起纤维蛋白原水平的微小波动，具有随时间下降的趋势，即以前在仅PBS治疗的食蟹猴中观察到的现象。

表4.血浆纤维蛋白原水平(mg/dl)

出血时间.出血时间在该研究中波动，且没有观察到响应于CSSK的一致图样。

平均动脉血压和心率.在每个实验的持续期间不断地监测平均动脉血压和心率。CSSK在试验的所有剂量没有显著地改变平均动脉血压或心率。

结论.主要目的是确定CSSK在模型中的剂量-应答特征，所述模型尽可能接近人血栓情形。在本文中利用的非人灵长类动物模型为新颖血栓溶解剂的开发提供了关键数据，特别是在提供关于用于人临床试验的剂量选择的重要信息中。在本研究中得到的数据为CSSK的人定量施用提供了坚实药理学基础。在研究的两只动物中有效的1.42mg/kg(100,000U/kg)的CSSK剂量在2只以前研究的食蟹猴中也是有效的，并且因而该剂量现在在4只非人灵长类动物中的全部4只中共同有效地引起成功再灌注。

在该研究中在0.35mg/kg(25,000U/kg)的低剂量也鉴别出剂量应答的其它末端。该剂量没有再灌注2只动物；但是，在以前的研究中，该剂量有效地裂解凝块，但是血管快速地重新阻塞。因而，0.35mg/kg剂量定义了剂量-应答曲线的近似底末端。

利用0.70mg/kg(50,000U/kg)的中剂量再灌注了试验的2只动物中的1只。在以前的研究中，该剂量也是在50％水平有效的，且因而在该剂量总计是4只中的2只。

因而证实，体内CSSK(0.7-1.4mg/kg，作为静脉内推注)溶解了食蟹猴中的实验性地诱导的股动脉血栓，具有血浆纤维蛋白原、前臂出血时间或血液动力学的相对小波动。

预测的大约0.5mg/kg的CSSK人剂量接近非人灵长类动物的剂量应答范围。非人灵长类动物对人-衍生的纤溶酶原活化剂不太敏感，因而不足令人惊奇的是，该人剂量可能稍微低于从非人灵长类动物预测到的剂量。

在雄性和雌性食蟹猴中在1、3和10mg/kg/天的剂量进行使用CSSK的GLP安全性研究，连续5天。在这些剂量水平的CSSK通常在雄性和雌性猴中被良好地耐受。因而，认为1mg/kg的低剂量是在食蟹猴中经由静脉内推注注射施用的CSSK的每天重复剂量施用的未观察到不良作用水平(NOAEL)。

可以作为单次推注施用的血栓溶解剂对于在乡村情形(在此处接近医院设备不夸张地需要数小时)下诊断出的患者而言具有许多优点。由于进行中的心肌梗塞的速度，时间是极其重要的，且因而可以作为单次推注施用的凝块特异性溶解药物(如CSSK)可能挽救处于梗塞风险中的心肌并由此挽救人们的生命。

实施例12.如本文中所述生产的CSSK的快速推注在具有ST-段升高急性心肌梗塞(STEMI)的患者中的效力和安全性

该研究在印度进行，更具体地，在印度的Nagpur、Baroda、Karamsad。

施用途径:历时2min的静脉内推注，周围静脉

剂量:20mg如本文中所述生产的CSSK

将10位具有记录的STEMI的患者自愿地招募在3个中心(Nagpur、Baroda和Karamsad，印度)。在从他们的报告的胸痛开始小于6小时，用CSSK治疗所有患者(n＝10)。用CSSK治疗9位男性和1位女性，年龄范围为40-61岁，重量为41-80kg。在CSSK施用以后90分钟通过血管造影评价患者，并给全部安装支架(独立于TIMI流速0-3)。

结果总结在下表中。

表5:冠状动脉TIMI血流特征和患者结果

其它结果如下：

●没有小或大出血素质发生在10位用20mg CSSK治疗的患者中的任一位中

●CSSK施用没有可察觉地改变血液动力学(BP、心率、呼吸频率)。

●CSSK治疗基本上没有改变生化和临床实验室凝固参数。

●没有来自CSSK的肝损伤的血清化学证据。但是，存在肝酶的轻微升高，但是这些是SGOT(和轻微SGPT)，但是这些被认为继发于在这些患者中发生的急性心肌缺血事件。

●在给药前和直到CSSK施用后36小时，在所有患者中评价血浆纤维蛋白原。存在预期的且一致的血浆纤维蛋白原水平的下降，其在药物施用以后4-8小时恢复。没有患者具有下降至小于100mg/dL的纤维蛋白原，如在图23中所示。

●如效力证实的，在10位患者中的5位中用静脉内推注SMRX-11(20mg)实现了TIMI等级2或3流。

●所有患者出院。

参考文献

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书籍

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●第18版,Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990

●第4版,Rowe等人编.Pharmaceutical Press,Washington,D.C

专利

●美国专利号7,163,817 1/2007 Sahni等人435/212

●美国专利号8,143,027 3/2012 Sahni等人435/71.1

Claims

1.包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含酵母甲醇诱导型启动子序列、经修饰的α信号基因序列、编码凝块特异性链激酶的核酸序列和转录终止子序列，其中所述编码凝块特异性链激酶的核酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有85％同一性。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述编码凝块特异性链激酶核苷酸序列的核酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。

3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述经修饰的α信号基因序列如在SEQ ID NO:10中所示。

4.表达载体，其包含根据权利要求1-3中的任一项所述的表达盒。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述表达载体包含与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的多核苷酸序列具有至少85％同一性的多核苷酸。

6.转化的酵母细胞，其表达根据权利要求1所述的表达盒，其中所述核酸序列编码包含以下各项的凝块特异性链激酶(CSSK)：(a)由似马链球菌(Streptococcus equisimilis)生产的链激酶(SK)，或SK的具有活化纤溶酶原的能力的衍生物；和(b)人纤连蛋白的纤维蛋白结合结构域4和5(FBD 4,5)，或其FBD 4,5的具有纤维蛋白亲和力的衍生物。

7.转化的酵母细胞，其表达权利要求1和2中所述的经修饰的α信号序列，其中所述转化的酵母细胞在细胞外生产凝块特异性链激酶(CSSK)。

8.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述表达载体编码与选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27和SEQID NO:29的多肽序列具有至少85％同一性的多肽。

9.具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28的核酸序列的多核苷酸。

10.根据权利要求6所述的转化的酵母细胞，其中所述CSSK在所述链激酶序列的N-和C-端中的每一个处包含：

a.与SEQ ID NO:11所示的多肽序列具有至少85％同一性的链激酶序列；和

b.与SEQ ID NO:22所示的多肽序列具有至少85％同一性的多肽序列。

11.根据权利要求6所述的转化的酵母细胞，其中所述CSSK由选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的多核苷酸序列编码。

12.根据权利要求6所述的转化的酵母细胞，其中所述酵母是选自毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属种(Candidaspecies)的甲基营养酵母。

13.根据权利要求12所述的转化的酵母细胞，其中所述酵母选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、异常毕赤酵母(Pichiaanomola)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)。

14.根据权利要求13所述的转化的酵母细胞，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母。

15.根据权利要求14所述的转化的酵母细胞，其中所述酵母是具有登记号MTCC 25071的巴斯德毕赤酵母。

16.由根据权利要求10-15中任一项所述的转化的酵母细胞生产的凝块特异性链激酶，其中所述凝块特异性链激酶被糖基化，具有80,515Da的分子量并且通过细胞外方式分泌。

17.组合物，其包含根据权利要求16所述的凝块特异性链激酶和药学上可接受的载体。

18.治疗或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，所述疾病选自心肌梗塞、血管血栓形成、肺栓塞、卒中、急性缺血性卒中、心绞痛、肺栓塞、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、冠脉干预手术后的血栓性再闭塞、外周血管血栓形成、心力衰竭、X综合征和至少一条冠状动脉的变窄，所述方法包括通过注射或输注给所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求17所述的组合物。

19.筛选酵母细胞以鉴别生产凝块特异性链激酶的转化的酵母细胞的方法，所述方法包括：

(a)用根据权利要求5所述的载体转化至少一个酵母细胞以得到转化的酵母细胞；

(b)在含有甲醇的BMMY培养基中培养至少一个转化的酵母细胞以诱导CSSK蛋白的表达，

(c)将所述培养基与所述转化的酵母细胞分离以得到上清液；

(d)测试所述上清液的纤溶酶原活化；和

20.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(d)中的纤溶酶原活化测试如下完成：将所述上清液与纤溶酶原和生色团组合，并在405nm检测光吸收的变化。

21.根据权利要求20所述的方法，其中相对于代表已知量的CSSK的参考值，测量纤溶酶原活化。

22.根据权利要求19所述的方法，所述方法还包括通过SDS-PAGE分析证实在步骤(e)中鉴别出的细胞中的CSSK生产。

23.定点溶解血块的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用有效量的根据权利要求17所述的组合物。