JPS62228284A - 酵母分泌ベクタ− - Google Patents

酵母分泌ベクタ−

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JPS62228284A
JPS62228284A JP61302747A JP30274786A JPS62228284A JP S62228284 A JPS62228284 A JP S62228284A JP 61302747 A JP61302747 A JP 61302747A JP 30274786 A JP30274786 A JP 30274786A JP S62228284 A JPS62228284 A JP S62228284A
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gene
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glucoamylase
cerevisiae
vector
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ロバート・エス・デイブス
ロバート・ロジャース・ヨーカム
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は酵母（ｙｅａｓｔ）に於ける遺伝子工学に関す
るものである。
［従来技術］ 組み換えＤＮＡ技術によるタンパク質の商業的産生に於
いては、望みのタンパク質の回収を容易にするために、
望みのタンパク質が培地中に分泌されることがしばしば
有利である。細胞からのタンパク質の分泌は、一般的に
、初Ｍ翻訳産物のアミン末端を構成している、疎水性ア
ミノ酸の短い領域の存在によって行なわれる。この疎水
性領域は“分泌シグナル配列”と呼ばれ、上記シグナル
配列は異種タンパク質の分泌を行なわせるための使用が
可能である。これは、一般的に、分泌シグナル配列をコ
ードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターの搭造に、望み
の異種タンパク質をコードする遺伝子を挿入することに
より行なわれる。上記プラスミドが宿主細胞に形質転換
されると、宿主細胞は望みのタンパク質産物を発現し、
同タンパク質を培地中に分泌する。
上記分泌ベクターは、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｃギ
ルバー１−　（ａ　１ｌｂｅｒｔ）ら、米国特許第４，
３３８，３９７号〕、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）　、Ｓ、リビダンス（Ｓ　、　１ｉｖｉｄａｎｓ）お
よびＳ．セレビジエ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
を含む多種の微生物のために考案されている。
Ｓ．セレビジエ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ｃ
ｙ）遺伝学才よび分子生物学に関して知られている多量
の情報のなめ、酵母は分泌系への使用に望ましい生物体
である。クルシャン（ｘ　ｕｒｊａｎ）ら（米国特許第
４．５４６，０８２号）は、アルファ因子遺伝子由来シ
グナル配列を基礎とした酵母分泌ベクターを示している
。
［発明の構成コ 概述すると、本発明はサツカロミセス・シアスタテイカ
ス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｄｉａｓｔａｔｉ
ｃｕｓ）あるいはＳ．セレビジエ＜　ｓ　、　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シ
グナル配列をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに関
するものである；シグナルコード配列の上流には、酵母
中で転写を促進することの可能なりＮＡ配列を含み、同
転写促進配列制御下でシグナルコード配列の転写を行な
い：シグナルコード配列の下流に、シグナルコード配列
と同じ読み枠で異種ＤＮＡ配列をベクターに挿入する部
位を有する。
好ましい実施態様に於いては、挿入部位に、例えばアス
ペルギルス・ニガー（Ｌｕと近旦匹■赳Ωグルコアミラ
ーゼ遺伝子のような異種遺伝子が挿入されており、異種
遺伝子の転写は分泌シグナルコード配列の転写を制御す
る転写促進配列の制御下にある；望ましい上記配列は、
Ｓ．セレビジエのＴＰＩ遺伝子あるいはＧＡＬＩ遺伝子
のプロモーターあるいは上流活性化配列である。
望みのタンパク質をコードする遺伝子を上記ベクターの
挿入部位に挿入し、酵母細胞中にこのベクターを形質転
換し、酵母細胞を培養し、タンパク質を培地から回収す
ることにより、同タンパク質を産生することが可能であ
る。
別のＮ点に於いては、本発明は、可視染色剤を共有結合
的に結合させた澱粉を含む固体栄養培地を塗布した固相
支持体上に細胞を７レーテイングし、コロニーが増殖す
るまで細胞を培養し、細胞と支持体を水和性有機溶媒と
接触させ、支持体上のハロー（ｈａｌｏ）形成をグルコ
アミラーゼ産生の指標として検出することを含む、グル
コアミラーゼ産生に関して酵母細胞をスクリーニングす
る方法である。
有機溶媒は、エタノール、メタノール、インプロパツー
ル、あるいは、イソアミルアルコールなどのアルコール
類、あるいはＤＭＳＯ１酢酸あるいはアセトンのうち一
つが望ましく、最も望ましいものは、５０−１００％エ
タノールである。他の有機溶媒は、グルコアミラーゼを
分泌することが既知の酵母株を用いて上記方法で溶媒を
試験することにより、上記溶媒としての有用性を選別す
ることが可能である。
上記方法は、分泌されなグルコアミラーゼの染色剤を結
合させた澱粉に対する作用によって形成されるハローは
、コロニー増殖後直接的には検出し難いが、コロニーと
固相支持体をエタノールのような極性溶媒に接触させる
ことにより、上記ハローを可視的にし得るという我々の
発見を利用するものである。上記溶媒は培地中に拡散し
、染色剤の結合した澱粉の分解産物とある種の反応（恐
らく沈降反応を含む）を起こし、上記産物の視覚的性質
を変化させる；ハロー自体が本過程において明確にはな
るわけではないが、非分解物質と組織的に区別されるよ
うになるため容易に観察し得るようになる。
酵母細胞は、商業的に重要なタンパク質分子産生のため
の宿主としていくつかの利点を有する。
酵母細胞は数叶紀にわたり商業的発酵に使用されできた
ため、望みのタンパク質を合成するために遺伝子工学的
処理をした酵母細胞の発酵に上記経験を利用することは
有利である。
サツカロミセス属、例えばＳ．セレビジエは、一枚の原
形質膜のみしか持たず、そのためタンパク質のあるもの
は、培地中に分泌される。それに対して、大腸菌細胞は
２つの膜、すなわち“内膜”および゛外膜”を有し、そ
のため大腸菌細胞中のタンパク質は２つの膜の間の細胞
周辺腔（ｐｅｒｉｐｉａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ）に通常
分泌される。
少 Ｓ．セレビジエは培地中に比較的小数のタンパクｆｆ（
１０−２０種）しか分泌しないことが知られており、分
泌されな異稲タンパク質の精製を細胞質性タンパク質の
精製に比べて比敦的簡弔にしている。
さらに、Ｓ．セレビジエは枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）とは異なり、比較的低水準の細胞外プロテアーゼ
を産生ずる。最後に、Ｓ．セレビジエは安価な培地上で
良好に増殖する。
一般的に、培地中への分泌は、望みのポリペプチドの精
製を非常に簡略化するという点で望ましい（分泌シグナ
ルは同ポリペプチドから分泌中に切断される）、；ｔな
、分泌により、多くのタンパク質の生物学的活性に不可
欠なジスルフィド結合の正確な形成が促進される。
Ｓ、シアスタテイカスＤＥＸ４グルコアミラーゼ遺伝子
からのシグナル配列は、α−因子のような、小さなペプ
チドよりも真のタンパク質の分泌を誘導する；また、イ
ンベルター８オスフアターゼなどのタンパク質が見いだ
される細胞周辺腔ではなく、酵母培養液の上清への分泌
を促すという点に於いて特に有利な選択である。ＤＥＸ
４シグナルは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで構成された゛非天然
′°構造に適切に作用することが示されている。以上の
ように、ＤＥＸ４シグナル配列が酵母細胞から別の異種
タンパク質の分泌を促すのに有効であることが期待され
ている。
その発現および分泌が広く有用となり得る異種タンパク
質の一つは、Ａ、ニガー由来酵素グルコアミラーゼであ
る。この酵素には、醸造、コーンシロップ産生、および
蒸留エタノール産生のための穀物発酵への適用を含む多
数の商業的利用法が存在する。
本発明の他の特徴および利点、は以下の望ましい実施例
の説明および前述の特許請求の範囲から明らかになるで
あろう。
第１図は、本発明のプラスミド、ｐＲＤ　１１２の略図
およびその作製の概要である。制限酵素切断部位の略号
は、以下の通りである：Ａ、ＸｂａＩ　；Ｂ、ＢａｍＨ
Ｉ　；　ＢＩＩ、Ｂｓ５ＨＩＩ　；Ｅ、ＥｃｏＲＩ　；
Ｈ，Ｈｉｎｄ　ＩＩ［；に、　ＫｐｎＩ　；Ｍ、　５ｌ
ａＩ　；ＰＩＩ。
ＰＶｕＩ［；Ｘ、　ＸｈｏＩ　；Ｓ、　Ｓ　ａｊ！　Ｉ
、長方形の箱で示した部分は、幾つかのタンパク質コー
ド領域である。内側の同心円は、プラスミド各部分のＤ
ＮＡの由来を示す、なお、ｐＲＹ　２７１は２つのＤＮ
Ａｌｌ１片の内部に２箇所の欠失部分、すなわち、ｐＢ
Ｒ３２２由来部分）２７５塩基対Ｂａ１ＨＩから５ａＪ
ＩＩまでの欠失、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼ
分解に続（ＥｃｏＲＩリンカ−（５′　−ＡＧＡＡＴＴ
ＣＴ）の挿入によって生じなＴＰＩ遺伝子転子３００塩
基対の欠失を含む。（Ｅ）はプラスミド作製段階で破壊
された元のＥｃｏＲＩ部位を表す。
第２図はｐＧＭｌｌおよびｐＧ　Ｍ　１３へのＳ、シア
スタテイカスＤＮＡ挿入物の制限酵素切断地図を示す。
略号は、第１図と同じものに以下の略号を付は加えたも
のである：Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｇ。
Ｂ（］　ＩＩＩＩ　；Ｈｌｌ、ＨｐａＩ　；Ｐ、Ｐｓｔ
Ｉ　；ＰＩ。
ＰｖｕＩ　；　Ｎ、ＮｃｏＩ　；　Ｖ、ＥｃｏＲＶ、制
限酵素切断地図の縦の矢印より右側は同等で矢印の左側
は興なっている。各節は、恐らくグルコアミラーゼをコ
ードしていると思われる長い各オーブンリーディングフ
レームを示す。
第３図は、ＢａＩＩＨＩ部位の直ぐ上流からＰｓｔＴ部
位の直ぐ下流までのＤＥＸ４遺伝子のＤＮＡ配列を示し
ている。ＤＥＸ４と５ＴＡＩ　（ＤＥＸ２）との間の約
９８％の相同性は、塩基＋９７から開始する。＋９７よ
り上流には明確な相同性は存在しない。
第４図は、合成アダプター配列を含む、１旦」−ＤＥＸ
４−Ａ、ニガーグルコアミラーゼ遺伝子融合物の５′末
端にわたる、ｐＲＤ　１１２の部分のＤ’ＮＡ配列を示
す。塩基−２２から＋９まではＴＰＩ由来である。塩基
＋１０から＋７３まではＤＥＸ４タンパク質のシグナル
配列を基にした合成配列から成る。シグナルアミノ酸を
変化させていないＤＥＸ４ＤＮＡ配列からの変化に注目
すべきである：Ｈｉｎｄｌ［［部位が塩基＋２８から＋
３３に導入されている。塩基＋７４から＋８７は合成Ｘ
ｈＯＩ−Ｂ　ｓｓＨＩＩアダプター由来であり、塩基＋
８８からは、以下により詳しく示すように、Ａ、ニガー
グルコアミラーゼｃＤＮＡクローン由来である。
第５図は、’Ｉ’ＰＩ−ＤＥＸ４−３￥Ｃ２融合物を含
む、本発明の別のベクター、１００Ｍ９４の構造を示す
ものである。略号は第１図および第２図と同様である。
第６図は、ｐＧＭ９４上に、ＴＰＩ−ＤＥＸ４−５ｖｃ
２Ｗｉ合物を作製するために使用した、合成２９７２８
−　ＩＩｅｒ　ＸｈｏＩ　−ＡｖａｆｆアダプターのＤ
ＮＡ配列、および対応するタンパク質配列を示すもので
ある。
〔ベクターの構成〕
上述したように、望みの異種ポリペプチドの産生および
分泌のための宿主酵母細胞の形質転換に有用な本発明の
ベクターは、幾つかの成分を含み、その成分を以下によ
り詳細に述べる。
翫亙里亘亙刀 酵母内で遺伝子の転写を促進する機能を有するいかなる
塩基配列も使用可能である。上記配列は、天然に存在す
る酵母プロモーターおよび酵母上流活性化配列と実質的
に同等であることが望ましい。
転写促進配列は、分泌シグナル配列および異種タンパク
質配列を読みとり枠内でコードするＤＮＡの上流に位置
することが望ましく、最Ｍ発現に影響するシグナルコー
ド配列の屈訳開始部位から雛れていることが望ましい。
転写を促進する、天然に存在する適当な塩基配列は以下
の遺伝子から作製される：ＧＡＬ１．ＧＡＬ７．ＧＡＬ
１０゜ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２，ＰＧＫ、ＰＹＫ、ＧＬＤ。
ＥＮＯ，ＴＰＩ、ＤＥＸＩ　（ＳＴＡ２）。
ＤＥＸ２　（ＳＴＡＩ　）、ＭＦαあるいは任意のリポ
ソームＲＮＡシストロン〔“酵母サツ力ロミセスノ分子
生物学（丁ｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　ｏｒ　ｔｈｅＹｅａｓｔ　５ａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃ
ｅｓ）″、Ｊ、シュトラーザン（Ｊ　、　Ｓ　ｔｒａｔ
ｈｅｒｎ）　、　Ｅ　、ジョーンズ（Ｅ、　ＪＯｎｅＳ
）およびＪ、ブロツナ（Ｊ　、　Ｂ　ｒｏａｃｈ）編集
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プ
レス、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハー
バ−の１〜３７ページのり、７ランケル（Ｄ　、　Ｆ　
ｒａｅｎｋｅｌ）著（１９８２）、炭水化物式ｐ４　（
ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｈｅｔａｂｏｌ　１ｓＩｌ
）の項参照〕。
分泌シグナル配列をコードするＤＮＡは、以下に詳述す
るように、Ｓ、シアスタテイカス・グルコアミラーゼ遺
伝子、あるいは同等なＳ．セレビジエ遺伝子から単離す
ることが望ましい。Ｓ、シアスタテイカスは、分泌され
るグルコアミラーゼ酵素をコードするいくつかの遺伝子
を持ち、その一つは栄養増殖中に発現しくＤＥＸＩ）、
また別の一つは一般的に胞子形成時にのみ発現する（Ｄ
ＥＸ４）、Ｓ．セレビジエはＤＥＸ４に相同な胞子形成
特異的グルコアミラーゼ遺伝子を有する。上記遺伝子は
全て分泌シグナル配列単離のための適当な源となる。
上記の代わりとして、慣用的なりＮＡ合成技術によって
、上記配列をコードするＤＮＡを合成的に生成すること
が可能である。さらに、上記ＤＮＡ（天然あるいは合成
による）は、異種ポリペプチドの分泌をひきおこす、コ
ードされたシグナル配列の能力を実質的に損わないよう
な方法で修飾することが可能である。
シグナル配列と異種ポリペプチドは一緒になって融合タ
ンパク質を形成し、シグナル配列のために小胞体膜を通
過し、宿主酵母細胞外へ分泌される０分泌過程に於いて
、シグナル配列（もし存在すれば、“プロ”配列も；後
述参照）は切断される。シグナル配列およびもし存在す
れば“プロ”配列の切断後、付随的アミノ酸はほとんど
あるいは全く存在しないであろう。
Ａ上ヱＡ 転写ターミネータ−として働く配列は、酵母などの真核
生物内での最１１３ｆｉ伝子発現に必要であると考えら
れている。ターミネータ−配列は、異種ＤＮＡ配列の挿
入部位から下流に位置する。３ｍ当なターミネータ−配
列は、“転写促進配列”の項で挙げた任意の遺伝子から
得られる。
−、ＤＮＡ　　ｌお　び　） 異種ＤＮＡ配列挿入部位は、シグナル配列をコードする
ＤＮＡの３′末端の下流に存在する。
この挿入部位は、シグナル配列の３′末端に直接隣接す
るか、あるいはある遺伝子中に見られ、分泌過程で鋤く
と思われる。付加的配列くすなわち、“プロ”配列）の
後に存在し得る。異種ＤＮＡ配列の挿入は、特定の制限
酵素切断部位がベクター内で一ケ所のみである場合に容
易である。上記部位はベクター内に天然に存在するもの
でも可能であり、あるいは、合成的に付加したものでも
よい。
異種遺伝子をベクターの、シグナルコード配列あるいは
“プロパ配列に隣接して挿入するよりも、ある場合には
（特に小さなペプチドおよびポリペプチドの場合）、酵
素グルコアミラーゼの全部あるいは一部を異種遺伝子に
よってコードされているポリペプチドと融合させた、融
合ポリペプチドを生成する方法で、異種遺伝子をベクタ
ーに導入する方が有利である。融合タンパク質は、望み
のポリペプチド単独の場合よりも、タンパク質分解に抵
抗性を持ち、そのため収率が増大する。融合ポリペプチ
ドの回収後、慣用的な技術によりグルコアミラーゼ部分
を切り離す。
異［ＤＮＡは、例えばホルモン、ワクチン、抗ウイルス
タンパク質、抗腫傷タンパク質、抗体あるいは血液凝固
タンパク質などの医学的に有用なタンパク質、および酵
素や有害生物防除薬（ｐｅｓｔ　ｉｃ　１ｄｅｓ　）の
ような農業的および工業的に有用なタンパク質など、あ
らゆる望みのポリペプチドをコードし得る。
本発明の２つの特定のベクター、ｐＲＤ１１２およびｐ
Ｇ　Ｍ　９４の構造について、第１図および第５図に示
し、さらに以下に説明する。
〔ベクターの構造〕
第１図は大腸菌およびＳ．セレビジエ内で複製可能な分
泌ベクター、ｐＲＤ　１１２の構造および作成法の模式
図であり、同ベクター内には、酵素グルコアミラーゼの
異種Ａ、ニガー遺伝子が、ＤＥＸ４　　Ｓ、シアスタテ
イカス・グルコアミラーゼシグナル配列に隣接して、Ｓ
．セレビジエ由来のトリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔ
Ｐ　Ｉ　）ブローモーターの転写制御下で挿入されてい
る。
第５図は、大腸菌およびＳ．セレビジエ内で複製可能な
分泌ベクター、９０Ｍ９４の模式図であり、同ベクター
内に、インベルターゼをコードするＳ．セレビジエ５ｖ
Ｃ２遺伝子が、ＤＥＸ４Ｓ、シアスタテイカス・グルコ
アミラーゼシグナル配列をコードするＩ）ＮＡに隣接し
、かつＳ．セレビジエ由来のトリオースリン酸イソメラ
ーゼ（ＴＰ　Ｉ　）プロモーターの転写制御下に押入さ
れている。
〔ベクターの作成〕
１）ＲＤ　１１２および９０Ｍ９４の作成の第１段階は
、Ｓ、シアスタテイカス・グルコアミラーゼ遺伝子の単
離であり、以下の様に行なわれな。
Ｇ、ステワルト（Ｇ、　Ｓｔｅｗａｒｔ）　　（ラバッ
ト・ブルーイング社）から入手したＳ、シアスタテイカ
ス１３５４株（ａ　　ＤＥＸＩ）のゲノムＤＮＡライブ
ラリを酵母２ミクロン・サークル由来の複製起点および
ｕｒａ３−酵母における形質転換体の選択のためのＵＲ
Ａ３遺伝子を含むＳ．セレビジエ−大腸菌シャトルベク
ター中に調整した（例えば、カールソン（ｃａｒｌｓｏ
ｎ）およびボトシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）　（１
９８２）　Ｃｅ１ｌ　２８二１４５−１５４参照〕。Ｓ
、シアスタテイカスの全ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩで部分分
解し、５キロベースから１０キロベースの間のＤＮＡフ
ラグメントを蔗糖密度勾配によって単離した。このＤＮ
Ａをベクターに連結し、大腸菌中に形質転換した。こう
して得なバンクは５キロベースから１０キロベースの範
囲のＳ、シアスタテイカス挿入物を有する約４０，００
０の独立なりローンを含んでいた。
上記Ｓ、シアスタテイカスのライブラリを、Ｓ。
セレビシェＲＤ６１−ＬＤ株（ａ　　１ｅｕ２　　ｈｉ
ｓｌｕｒａ　３　　ｈｏｒｎ　３　　ａｄｅ　２ｉｎｈ
　　ｄｅｘ　ｌｏ）に導入し、約１００，０００　ＵＲ
Ａ＋形質転換体を選択し、プールし、１００關シヤーレ
あたり約２００コロニーとなるように澱粉−アズールプ
レート（５ｔａｒｃｈ　−ａｚｕｒｅ　ｐｌａｔｅｓ＞
上にブレーティングした。澱粉−アズール〔Ｈ，リンダ
ークネヒト （Ｈ、Ｒ１ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ）ら、（１９６７）Ｅ
　ｘｐｅｒｉｌｅｎｔｉａ銭：８０５）プレートは、１
ｊＩあたり２０．アガー、。
７ｇディフコ酵１’ｌ？Ｊ素ベース、０．７ｇウラシル
・ドロップアウト・ミックス（Ｆ、ジャーマン（Ｆ、　
Ｓｈｅｒｍａｎ）　、　Ｊ、ヒックス（Ｊ　、　Ｈ１ｃ
ｋｓ）、およびＧ、フィフク（Ｇ、　Ｆ　１ｎｋ）　＜
１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−・プレス、米国ニューヨーク州コールドスプリン
グ・ハーバ−）、３０ｇグリセロール、および２０ｇエ
タノールの各成分を１１中に含む下層用アガー２０ｍ１
および、下層用アガーに０．５％澱粉アズール（シグマ
社）を添加した１０ｍ１の上層用アガーから成る。上層
用アアガー上にピペッティングする直前に注念深く混合
した。
コロニーが直径２〜３！ｕｌとなるまで増殖させた後（
通常４−７日）、各プレートのレプリカを、下層用アガ
ーに２％グルコースを添加したプレート上に作製した。
次に、澱粉アズール・マスタープレートを各１０ｍ１の
エタノールで溝たした。２０分後玉タノールをアスピレ
ーションによって除き、プレートを一晩冷却した。Ｓ、
シアスタテイカス・グルコアミラーゼ遺伝子を含むプラ
スミドクローンを澱粉アズールの分解によるハローに囲
まれなコロニーとして同定した。スクリーニングを行な
った６０　、０００コロニーからハローを形成した１８
個のクローンが見い出された。ハロー形成形質転換体は
、レプリカプレートから拾い、標準方法によりプラスミ
ドＤＮＡを再単離した〔ジャーマン（Ｓ　ｈｅｒｎａｎ
）ら、前出〕。
２個のプラスミドが酵母ＲＤ６１−ＬＤ株の再形買転換
でハローを形成する表現型を示し、さらに解析するため
に選ばれた。我々は、これらのプラスミドを　ｐＧ　Ｍ
　１１およびｐＧ　Ｍ　１３と名付けた。
ｐ　Ｇ　Ｍ　１１と　ｐＧ　Ｍ　１３の双方とも約６キ
ロベースのＤＮＡ挿入物を含んでいた。ｐＧＭｌｌおよ
びｐ　Ｇ　Ｍ　１３中の挿入物の制限酵素切断地図を第
２図に示す。この図から明らかなように、制限酵素切断
地図は、同一性を持つ領域と、２つの挿入物が異なって
いる領域を含む。ｐＧ　Ｍ　１１および１１０　Ｍ　１
３の様々な部分に由来する３２Ｐ標識制限フラグメント
をプローブとした、Ｓ．セレビジエおよびＳ、シアスタ
テイカスＤＮＡのサザン・プロットにより、ｐＧ　Ｍ　
１３は栄養成長中に発現する酵素グルコアミラーゼをコ
ードするＳ、シアスタテイカスＤＥＸＩ遺伝子を含み、
ＤＧＭ　１１はＳ。
セレビシェおよびＳ、シアスタテイカスの双方に存在し
我々がＤＥＸ４と呼ぶ異なる遺伝子を含むという結論を
得た。この遺伝子は恐らく、Ｓ．セレビジエで以前に同
定された胞子形成特異的グルコアミラーゼをコードする
と推定される〔コロナ（ｃ　ｏｌｏｎｎａ）およびマギ
ー（Ｍ　ａｇｅｅ）（１９７８）　　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙユ３４　：　　８４４
−８５３）。
Ｄ　Ｅ　Ｘ　４　ｉＦｔ伝子転子するマルチコピープラ
スミドを含むコロニーが澱粉アズールプレート上でコロ
ニー自身よりも大きなハローを示す事実は、ＤＥＸ４に
コードされたグルコアミラーゼが培地中に分泌されてい
ることを示唆する。実際に、液体培養液の上清中にグル
コアミラーゼ（ＧＡ）活性が見い出された。分泌された
ＧＡのアッセイを行なうため、１リツトルあたり７ｇデ
ィフコ酵母窒素ベース、０．７ｇウラシル・ドロップ・
アウト・ミックス、３０ｇグリセロールおよび２０．エ
タノールから成る液体培地中で細胞が飽和するまで培養
した。細胞を遠心によって除去し、１００μｇの上清を
１０■／　ｍｌマルトトリオース（シグマ社）を含む０
．１Ｍクエン酸ナトリウム、　ｐＨ５，０，１００μｆ
と混合した。混合液を３０℃で１時間インキュベートし
、２５μｍをイエロー・スプリングス・インストウルメ
ンツ・グルコース分析機でグルコースのアッセイを行な
った。ＧＡ活性１ユニットは、上記アッセイ条件下で１
０■／１のグルコース産生に要する酵素量と定義する０
本アッセイにより、ＤＥＸ４ｍ伝子は栄転子長中には、
わずかしか発現しない、−マルチコピープラスミドであ
るｐＧ　Ｍ　１１上に上記遺伝子を有するＲＤ６１−Ｉ
Ｄ株かられずか１０ユニツトのＯＡ活性しが産生されな
い−ことが示された。
ＤＥＸ４遺伝子にコードされた酵素グルコアミラーゼは
、商業的価値を持ち、そのため、本酵素の酵母株に於け
る効果的な発現を行なわせることが望まれる。栄養成長
中の発現を増大させるために、ＤＥＸ４プロモーターお
よび上流活性化配列（ｕｐｓｔｒｅａｎ　ａｃｔｉｖａ
ｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　ｕＡｓ）を酵１チドリ
オースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）３ｆｉ仏子の同等
な領域と置換した。ＴＰＴプロモーターは、第１図に示
されるように、プラスミドｐＲＹ　２７１に含まれてい
る。プラスミドｐＲＹ２７１はｐＢＲ３２２および酵母
２ミクロンサークルの双方由来の複製起点を有し、同プ
ラスミドおよびｐＲＹ　２７１山来のここに示すプラス
ミドは、大腸菌およびＳ．セレビジエのシャトルベクタ
ーである。
１）ＲＹ２７１をＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、粘着端をフ
ィル−インし、Ｂａｎ＋ＨＩリンカ−と連結した。次に
、ＤＮＡをＢａ１ＨＩで切断し、ｐＲＹ　２７１の２つ
のＨｉｎｄｌ１部位をＢａｍＨＩ部位に変えて再連結し
た。
ＴＰＩプロモーターを含むＢａｎ＋Ｈ■フラグメントの
プラスミド主部分に関する方向性のみｌ−十なる２つの
プラスミド、ｌ］ＧＭ２４およびｐＧ　Ｍ　２５が得ら
れた。
ＴＰＩおよびＤＥＸ４の開始部分の３アミノ酸は同等な
ため（Ｍｅｔ−Ａ　ｌａ　−Ａｒｇ）　、本発明者らは
第３コドン〔第３図およびアルバー（Ａｌｂｅｒ）およ
びカワサキ（１９８２）　Ｈｏｔ、＾ｐｐ１．　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　。
１　：　　４１９−４３４参照〕に融合連結部を作製し
、ｉｎ　ＶｉｔｒＯでＥｃｏＲＩリンカ−を挿入した。
上記ＤＥＸ４のＥＣｏＲＩ部位とＸｈＯＩ部位の間のＤ
ＮＡ配列を第４図に示した合成６５／　６９−　ｌｅｒ
と再構成した。ＤＥＸ４遺伝子の２．５キロ塩基Ｘｈｏ
■−Ｋｔ＋ｎ−Ｉフラグメントをこれらの酵素によって
切断することにより　ｐＧ　Ｍ　１１から除去し、ゲル
電気泳動により精製した。プラスミドＤＧ　Ｍ　２５を
Ｅ　ｃｏＲＩ　、緑豆のヌクレアーゼ、およびＫｐｎＩ
で切断し、得られたＤＮＡを６５／　６９ｂｐ合成リン
カ−およびＤＥＸ４遺伝子のＸｈｏＩ　−１１ｎＩ　７
ラグメントと連結しな。得られたプラスミドｐＧ　Ｍ　
３０中では、Ｄ　Ｅ　Ｘ　４　Ｆ転子はＴＰＩプロモー
ターおよび上流アクティベーター配列（すなわち、第１
図のＭからＥフラグメント）の下流に位置し、ＴＰＩタ
ーミネータ−配列（第１図ＡからＢ）の上流に位置して
いる。酵母ＲＤ６１−ＩＤ株に形質転換されると、ｌ’
ｌＧＭ３０は前述のアッセイで約７０ユニツトのＧＡ活
性を示した。ｐＧＭ２９と呼ばれる、ｐＧ　Ｎ　３０に
類似のプラスミドは、出発材料のプラスミドがｐＧ　Ｍ
　２５ではなく、　ｐＧ　Ｍ　２４である点を除き、ｐ
ＧＭ３０に関して述べたものと同様の方法で作製した。
ＤＥＸ４遺伝子の向きは、ＤＥＸ４の発現に影響を及ぼ
さなかった。
ＤＥＸ４グルコアミラーゼ遺伝子は、他の転写促進配列
の制御下に於いても、Ｓ．セレビジエ中で発現しな０例
えば、Ｓ．セレビジエＧＡＬＬ遺伝子由来の上流活性化
配列を含むＤＮＡフラグメントを前述と類似した方法に
よりＤＥＸＪａ伝子の上転子位置するようにした。この
構造を有するプラスミド（ｐＧ　Ｍ　１９）もＳ．セレ
ビジエに形質転換した際にＳ、シアスタテイカス・グル
コアミラーゼの発現を誘導する。
ＤＥＸ４シグナルコード配列の下流に異種ポリペプチド
をコードするＤＮＡを挿入することにより、ｐＧ　Ｍ　
３０あるいはｐＧＭ２９をあらゆる望みの！Ａ桟ポリペ
プチドの分泌のための分泌ベクターとして使用し得る。
Ａ、ニガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子およびＳ．セ
レビジエ由来の５ＶＣ２遺伝子を用いた以下の例は、例
示的なものである。
ｐＧＭｌｌのＢａｍＨＩ部位から最も右側の５ｐｈｉ部
位までのＤＥＸ４のＤＮＡ配列が標準的塩基配列決定法
により決定され、第３図に示されている。
＋９７塩基対以後の上記ＤＮＡ配列は、５ＴＡＩ（ＤＥ
Ｘ２）の一部と密接に付合する〔ヤマシタら（１９８５
）、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１６１：　　５６７−　５７
３）　、しかしなから、＋９７塩基対から上流は、ＤＪ
ＥＸ４のＤＮＡ配列は５ＴＡＩ　（以旦Ｘユ）のＤＮＡ
配列と完全に異なっている。５′末端におけるこの相違
にもかかわらず、ＤＥＸ４は、Ａ　Ｔ　Ｇコドンから始
まり、５′末端の塩基性アミノ酸およびアミノ酸アラニ
ン２４およびロイシン２５の間の有利なシグナルペプチ
ド切断部位を含めて分泌シグナル配列に望まれる全ての
性質を有する疎水性配列を含む、長いオープン・リーデ
ィング・フレームを含有している Ａ、二　−・　ルコ　ミーーゼを−のＩＡ、ニガー・グ
ルコアミラーゼをコードする遺伝子は、１９８５年５月
２１日に出願されたヨーカム（Ｙｏｃｕｎ）らの米国特
許出願第７３６．４５０号に述べられた方法で得られる
。グルコアミラーゼ遺伝子からそれ自身のシグナル配列
を除いたものを、プラスミドｐＲＤ１０５　　（ヨーカ
ム（Ｙｏｃｕｉ）　、前出〕からＢ　ｓｓＨＩＩによる
部分分解およびそれに続くＸｂａＩによる分解によって
単離した。この遺伝子を有する２、２キロ塩基フラグメ
ントを、ゲル電気泳動により単離した。
＋７３塩基対のＸｔ＋ｏＩ部位の下流のＤＥＸ４配列を
Ｘ　ｈａ　■およびＸｂａＩによる　ｐ　Ｇ　Ｍ　３０
の切断によって除去した。上記切断したプラスミドをＡ
。
ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子のＢｓ５ＨＩＩ−Ｘｂ
ａＩフラグメント、および、第４図に示される配列の合
成１４塩基ＸｈｏＩ　−Ｂ　ｓｓＨＩアダプターと連結
した。これによってプラスミドＩＩＲＤ　１１２が得ら
れ、アスペルギルス・ニガー遺伝子はＴＰＩプロモータ
ーの下流にあり、かつＤＥＸ４分泌シグナルコード配列
の下流（こ、読み枠が一致して存在している。また、Ａ
、ニガーＧＡ遺伝子はＴＰＩターミネータ−配列の上流
にある。上記合成配列を含む遺伝子融合物の５′末端の
ＤＮＡ配列を第４図に示す。
酵母ＲＤ６１−ＩＤ株に形質転換゛すると、ｐＲＤ１１
２は約１００ユニツトの分泌ＧＡ活性を与える。
また、形質転換体は澱粉アズールプレート上にノーロー
を形成する。ＤＥＸ４シグナル配列が実際に異種Ａ、ニ
ガーＧＡの分泌の原因となることの証明は、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏミュータジエネシスによってアミノ酸１７番目の
バリンをグルタミン酸と交換することによって得られた
。この疎水性シグナル配列の分断により、分泌ＧＡの劇
的な減少が起きた。
Ｓ．セレビジエＳＶＣ１−の１ ＤＥＸ４シグナル配列の制御下で分泌される別の有用な
タンパク質は酵素インベルターゼであり、この酵素は酵
母Ｓ’ｌＣ２遺伝子によってコードされている〔タウシ
ッヒ（ＴａｕｓｓｉＱ）およびカールソン（ｃａｒｌｓ
ｏｎ）　（１９８３）、　Ｎｕｃ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
、　　１１　：１９４３−１９５３　、ブラウン（Ｂｒ
ｏｗｎ）ら（１９８４）、　Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、胆７　　：　　３５１−３５７
　）　、　ＴＰ　Ｉ　−ＤＥＸ４−８ＶＣ２融合物を以
下の２段階によって作製した。ｓ　ｖ　ｃ　２３Ｈ伝子
はプラスミドｐＡＢ４（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、前
出〕に保有すれており、プランダイス大学のり、パール
マン氏（Ｄ　、　Ｐ　ｅｒｌｌａｎ）から入手した。５
ｖＣ２遺伝子ノ＋９０から＋８３２塩基を含むｐＡＢ４
のＡｖａ［からＸｂａＩ＝Ｊ、でのフラグメント〔タウ
シツヒ（ｔａｕｓｓｉ（］）およびカールソン（ｃａｒ
ｌｓｏｎ）、前出〕を２９／２８−　ｌｅｒ　ＸｈｏＩ
　−Ａｖａｆｆ合成アダプター（第６図参照）とともに
ｐＧＭ２９のＸｈＯＩからＸｂａＩの骨組み中にクロー
ン化し、ｐＧ　Ｍ　８０を得た。５ＶＣ２のＡ　ｖａ　
ｆｌ　−、Ｘ、ｂａ　１フラグメントと合成アダプター
の゛いずれもシグナル配列を含まない。
次に、５ｖＣ２遺伝子の３′末端を、ｐＡ　Ｂ　４中５
ＶＣ２の下流のＳａＮ■部位〔ブラウン（Ｂ　ｒｏｗｎ
）ら、前出〕からＸ　ｂａ　■部位を、合成Ｘｂａニリ
ンカーと交換し、ＸｂａＩで切断して得られな１．３キ
ロ塩基Ｘｂａ■フラグメント上に導入した。上記過程に
よりｐＧ　Ｍ　９４が得られ、このプラスミドは５ｕｃ
−株、ＹＴ４５５（（Ｚ　−Ｕｒａ　３　、　ａｄｅ　
２　。
ｓｕｃ　２Δ９）を形質転換によってＳＵＣ＋に変える
ことができた。以上の事は上記形質転換を行なつな酵母
株中で５ＶＣ２遺伝子が発現され、分泌されている証拠
となった。インベルターゼは、元来は、酵母細胞の細胞
周辺腔に分泌される。
肛立ユ五月旦匠 ｐＧＭ２９．　　ｐＧＭ３０．　　ｐＲＤ１１２由来の
プラスミドを用いて酵ｆＭＢ胞により、任意の分泌タン
パク質が得られる。分泌されるタンパク質をコードする
ＤＮＡフラグメントを、同タンパク質元来のシグナル配
列をコードする領域を含めずに単離して、上記ベクター
のいずれかの適当なりＮＡ骨組みに挿入できる。ＤＥＸ
４シグナル配列は１）ＲＤ１１２の、クローニングの際
に破壊されたＥＣｏＲＩ部位とＸ　ｈａ　Ｉ部位の間に
含まれ、本来のシグナル配列を含まないタンパク質コー
ド配列はｐＲＤ１１２のＸ　ｈａ　Ｉ部位に挿入され得
る。ｐＧＭ２９゜ｐ　Ｇ　Ｍ　３０およびＩ）ＲＤ　１
１２は各々ＡＴＧ翻訳開始コドンを与える。これらのプ
ラスミドはまた、ＸｈｏＩ部位と複数のＢａｌＨＩ部位
のひとつとの間に転写ターミネターを与える。多くの場
合には、異種遺伝子の上記ベクターへの挿入は、ｐＲＤ
１１２の作成で使用した１４塩基Ｘｈｏ１−　Ｂｓ５Ｈ
ＩＩアダプターのような、短い合成アダプターＤＮＡフ
ラグメントの使用により容易になるであろう（第４図参
照）。
疋−−１ プラスミドｐＲＤ　１１２およびｐＧＭ３０で形質１云
換した大腸菌細胞は米国ミズーリ州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、
それぞれＡＴＣＣ受託番号５３３４６号および５３３４
５号を与えられている。出願人＾は、ここに発行された
特許期間終了前に上記培養物が死滅した場合は、再寄託
する責任があり、上記特許の発行の際に寄託物が公共に
利用可能となったことをＡＴＣＣに知らせる責任がある
ことを承認する。
賎二犬里Ｂ ＤＥＸ４シグナル配列は宿主酵母細胞中で任意の分泌可
能なタンパク質の分泌を行なわせるために使用され得る
。上記配列は、複製ベクターばかりでなく、組み込みベ
クターにも使用し得る。また、衣なる転写促進配列およ
びターミネータ−配列とも使用できる。
ＤＥＸＩシグナル配列もまた、本明細書でれる
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のプラスミド、ｐＲＤ　１１２の略図
およびその作製の概要である。 第２図はｐＧＭｌｌおよびｐＧ　Ｍ　１３へのＳ、シア
スタテイカスＤＮＡ挿入物の制限酵素切断地図を示す。 第３図は、ＢａＩＩＨＩ部位の直ぐ上流からＰｓｔＩ部
位の直ぐ下流までのＤＥＸ４Ｗ伝子のＤＮＡ配列を示し
ている。 第４図は、合成アダプター配列を含む、ＴＰＩ−ＤＥＸ
４−Ａ、ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子融合物の５′
末端にわたる、ｐＲＤ１１２の部分のＤＮＡ配列を示す
。 第５図は、ＴＰＩ−ＤＥＸ４−３’ＩＣ２融合物を含む
本発明の別のベクター、１００Ｍ９４の構造を示すもの
である。 第６図は、ｐＧ　Ｍ　９４上にＴＰＩ−ＤＥＸ４−主竺
立ユ融合物を作製するために使用した、合成２９／２８
−　ｎｅｒ　ＸｈｏＩ−Ａｖａ［アダプターのＤＮＡ配
列、および対応するタンパク質配列を示すのである。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）サッカロミセス・ジアスタティカス （￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｉａｓｔａｔｉｃ
    ｕｓ￥）あるいはＳ．セレビジエ（￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
    ｓｉａｅ￥）由来グルコアミラーゼの分泌シグナルコー
    ド配列と実質的に同等である分泌シグナル配列をコード
    するＤＮＡ配列； 上記シグナルコード配列の上流に存在して、上記シグナ
    ルコード配列の転写を制御する、酵母内での転写を促進
    できるＤＮＡ配列；および上記シグナルコード配列の下
    流に存在して、異種ＤＮＡ配列を上記シグナルコード配
    列の読み枠でベクターに挿入するための部位； を含むベクター。
  2. （２）上記異種ＤＮＡ配列が、上記転写促進配列の制御
    下に置かれるように上記部位に挿入される、特許請求の
    範囲第１項記載のベクター。
  3. （３）上記グルコアミラーゼ遺伝子がＳ．ジアスタティ
    カス（￥Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ￥）あるいはＳ．
    セレビジエ（￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）の￥ＤＥ
    Ｘ４￥遺伝子である、特許請求の範囲第１項記載のベク
    ター。
  4. （４）上記転写を促進することのできるＤＮＡ配列が、
    Ｓ．セレビジエ（￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）の￥
    ＴＰＩ￥遺伝子あるいは￥ＧＡＬ１￥遺伝子のいずれか
    由来のプロモーターあるいは上流活性化配列を含む、特
    許請求の範囲第１項記載のベクター。
  5. （５）上記異種ＤＮＡ配列が、アスペルギルス・ニガー
    （￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ￥）由来のグ
    ルコアミラーゼ遺伝子である、特許請求の範囲第２項記
    載のベクター。
  6. （６）ｐＲＤ１１２である、特許請求の範囲第５項記載
    のベクター。
  7. （７）特許請求の範囲第２項記載のベクターで形質転換
    された酵母細胞。
  8. （８）（ａ）望みのタンパク質をコードする遺伝子を、
    特許請求の範囲第１項記載のベクターの上記挿入部位に
    挿入すること； （ｂ）上記ベクターを酵母細胞中に形質転換すること； （ｃ）上記酵母細胞を培養すること； （ｄ）上記タンパク質を成長培地から回収すること； を含む、上記望みのタンパク質を産生する方法。
  9. （９）上記望みのタンパク質がＡ、ニガー （￥Ａ．ｎｉｇｅｒ￥）由来のグルコアミラーゼである
    、特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. （１０）Ｓ．ジアスタティカス（￥Ｓ．ｄｉａｓｔａｔ
    ｉｃｕｓ￥）由来のグルコアミラーゼをコードする遺伝
    子を含む、Ｓ．セレビジエ（￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
    ｅ￥）中で複製可能なベクター。
  11. （１１）上記グルコアミラーゼコード遺伝子がＴＰＩプ
    ロモーターの転写制御下にある、特許請求の範囲第１０
    項記載のベクター。
  12. （１２）可視的な染色剤が共有結合で結合した澱粉を含
    む固体栄養培地を塗布した固体支持体上に酵母細胞をブ
    レーティングし、上記細胞をコロニーが増殖するまで培
    養し、上記細胞および上記支持体を水和性有機溶媒を含
    む液体と接触させ、上記支持体上のハロー形成をグルコ
    アミラーゼ産生の指標として検出する、グルコアミラー
    ゼ産生に関して酵母細胞をスクリーニングする方法。
  13. （１３）上記有機溶媒が、エタノール、メタノール、イ
    ソプロパノール、イソアミルアルコール、ＤＭＳＯ、酢
    酸およびアセトンから成る群から選択される、特許請求
    の範囲第１２項記載の方法。
  14. （１４）上記液体が５０％ないし１００％（ｖ／ｖ）の
    エタノールから成る特許請求の範囲第１３項記載の方法
    。
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