JP2530275B2 - α−グルコシダ−ゼ遺伝子、ベクタ−、形質転換体及びそれを用いたα−グルコシダ−ゼの製造法 - Google Patents
α−グルコシダ−ゼ遺伝子、ベクタ−、形質転換体及びそれを用いたα−グルコシダ−ゼの製造法Info
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- JP2530275B2 JP2530275B2 JP4240114A JP24011492A JP2530275B2 JP 2530275 B2 JP2530275 B2 JP 2530275B2 JP 4240114 A JP4240114 A JP 4240114A JP 24011492 A JP24011492 A JP 24011492A JP 2530275 B2 JP2530275 B2 JP 2530275B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスペルギルス・オリ
ゼーから得られた新規α−グルコシダーゼ遺伝子、これ
を含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリ
ゼーに移入した形質転換体及びその形質転換体によるα
−グルコシダーゼの製造法に関するものである。
ゼーから得られた新規α−グルコシダーゼ遺伝子、これ
を含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリ
ゼーに移入した形質転換体及びその形質転換体によるα
−グルコシダーゼの製造法に関するものである。
【０００２】アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシ
ダーゼは産業上重要な酵素であり、本発明によって得ら
れた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら本酵素
を用いる産業界に大いに貢献するものである。
ダーゼは産業上重要な酵素であり、本発明によって得ら
れた形質転換体は本酵素を著量に生産し、これら本酵素
を用いる産業界に大いに貢献するものである。
【０００３】
【従来技術及びその問題点】一般にα−グルコシダーゼ
は、マルトース及びオリゴ糖の非還元末端のグルコシル
基をグルコースまたはオリゴ糖の６位あるいは３位の水
酸基に転移する活性をもつ酵素であり、動物、植物およ
び微生物に広く分布している。（「化学大辞典３」共立
出版（昭42−９−10） ｐ．139−140）。
は、マルトース及びオリゴ糖の非還元末端のグルコシル
基をグルコースまたはオリゴ糖の６位あるいは３位の水
酸基に転移する活性をもつ酵素であり、動物、植物およ
び微生物に広く分布している。（「化学大辞典３」共立
出版（昭42−９−10） ｐ．139−140）。
【０００４】澱粉工業において製造されるイソマルトオ
リゴ糖は、清酒、味噌、醤油などに少量含まれうま味を
つける天然の食品成分として知られている。また、イソ
マルトオリゴ糖は、人の腸内に常在するビフィズス菌な
どの有用細菌に対する増殖効果あるいは、虫歯に対する
抗う蝕効果などの機能性を有しており非常に重要な糖類
であり、この糖類は、α−グルコシダーゼの作用により
製造される。
リゴ糖は、清酒、味噌、醤油などに少量含まれうま味を
つける天然の食品成分として知られている。また、イソ
マルトオリゴ糖は、人の腸内に常在するビフィズス菌な
どの有用細菌に対する増殖効果あるいは、虫歯に対する
抗う蝕効果などの機能性を有しており非常に重要な糖類
であり、この糖類は、α−グルコシダーゼの作用により
製造される。
【０００５】また、麹菌アスペルギルス・オリゼーの生
産するα−グルコシダーゼにより、イソマルトース、イ
ソマルトトリオース、コウジビオース、パノース等のオ
リゴ糖が清酒のうま味、こくの成分として生成されてお
り、清酒醸造においても本酵素は重要な役割をもってい
る。従って、本酵素の高生産を図るため、培養方法の検
討や菌株の育種等が行われてきた。
産するα−グルコシダーゼにより、イソマルトース、イ
ソマルトトリオース、コウジビオース、パノース等のオ
リゴ糖が清酒のうま味、こくの成分として生成されてお
り、清酒醸造においても本酵素は重要な役割をもってい
る。従って、本酵素の高生産を図るため、培養方法の検
討や菌株の育種等が行われてきた。
【０００６】しかしながら、従来の育種法は、主とし
て、紫外線や変異誘発剤によって得られる変異株から選
択する方法に限られていたため、安定な変異体を単離す
るのが困難であった。また、従来法の場合、好まざる形
質変化をともなうことも多く、その結果現在までにα−
グルコシダーゼを高生産する能力を有するアスペルギル
ス・オリゼーの育種には成功していない。
て、紫外線や変異誘発剤によって得られる変異株から選
択する方法に限られていたため、安定な変異体を単離す
るのが困難であった。また、従来法の場合、好まざる形
質変化をともなうことも多く、その結果現在までにα−
グルコシダーゼを高生産する能力を有するアスペルギル
ス・オリゼーの育種には成功していない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記問題点を
解決するためになされたものであって、α−グルコシダ
ーゼを著量生産する微生物を開発する目的でなされたも
のである。そして上記目的達成のため各方面から検討し
た結果、目的とする微生物を創製するには、古典的な変
異法よりは遺伝子を直接使用する遺伝子操作による方法
が好適であるとの観点にたった。
解決するためになされたものであって、α−グルコシダ
ーゼを著量生産する微生物を開発する目的でなされたも
のである。そして上記目的達成のため各方面から検討し
た結果、目的とする微生物を創製するには、古典的な変
異法よりは遺伝子を直接使用する遺伝子操作による方法
が好適であるとの観点にたった。
【０００８】この観点に立ち、α−グルコシダーゼ生産
菌として多用されている、アスペルギルス・オリゼーの
α−グルコシダーゼ遺伝子に着目した。そして研究、検
討を重ねた結果、同菌由来の染色体ＤＮＡライブラリー
を作製し、このライブラリーから目的とするα−グルコ
シダーゼをコードする遺伝子をクローニングするのに成
功した。
菌として多用されている、アスペルギルス・オリゼーの
α−グルコシダーゼ遺伝子に着目した。そして研究、検
討を重ねた結果、同菌由来の染色体ＤＮＡライブラリー
を作製し、このライブラリーから目的とするα−グルコ
シダーゼをコードする遺伝子をクローニングするのに成
功した。
【０００９】そして更に、このクローン化したα−グル
コシダーゼをコードする遺伝子を有する染色体ＤＮＡ断
片を、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryza
e）の宿主ベクター系に移入することにも成功し、得ら
れた形質転換体においてα−グルコシダーゼ遺伝子が分
泌生産されること等も確認し、これらの新知見に基き、
本発明を完成した。
コシダーゼをコードする遺伝子を有する染色体ＤＮＡ断
片を、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryza
e）の宿主ベクター系に移入することにも成功し、得ら
れた形質転換体においてα−グルコシダーゼ遺伝子が分
泌生産されること等も確認し、これらの新知見に基き、
本発明を完成した。
【００１０】即ち、本発明は、アスペルギルス・オリゼ
ーのα−グルコシダーゼ遺伝子に着目し、アスペルギル
ス・オリゼーの染色体ＤＮＡより図１の制限酵素切断地
図で規定されるα−グルコシダーゼ遺伝子をコードする
ＤＮＡ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オ
リゼーの宿主ベクター系を用いて形質転換し、得られた
形質転換体を、培地に培養し、培養物α−グルコシダー
ゼを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製
造法に関するものであり、その態様を列挙すれば次のと
おりである。
ーのα−グルコシダーゼ遺伝子に着目し、アスペルギル
ス・オリゼーの染色体ＤＮＡより図１の制限酵素切断地
図で規定されるα−グルコシダーゼ遺伝子をコードする
ＤＮＡ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オ
リゼーの宿主ベクター系を用いて形質転換し、得られた
形質転換体を、培地に培養し、培養物α−グルコシダー
ゼを採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製
造法に関するものであり、その態様を列挙すれば次のと
おりである。
【００１１】（１）アスペルギルス・オリゼーから単離
したα−グルコシダーゼ遺伝子。 （２）（１）のα−グルコシダーゼ遺伝子を連結したア
スペルギルス・オリゼーのベクター。 （３）（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られるα−グルコシダーゼ高分
泌能を有する形質転換体。 （４）（３）の形質転換体を用いることによってα−グ
ルコシダーゼを効率的に著量生産する方法。
したα−グルコシダーゼ遺伝子。 （２）（１）のα−グルコシダーゼ遺伝子を連結したア
スペルギルス・オリゼーのベクター。 （３）（２）のベクターをアスペルギルス・オリゼーに
移入することによって得られるα−グルコシダーゼ高分
泌能を有する形質転換体。 （４）（３）の形質転換体を用いることによってα−グ
ルコシダーゼを効率的に著量生産する方法。
【００１２】以下、本発明について詳しく説明するが、
本発明に用いた染色体ＤＮＡの供与体はアスペルギルス
・オリゼーであり、具体的には例えばＲＩＢ４０株であ
る。
本発明に用いた染色体ＤＮＡの供与体はアスペルギルス
・オリゼーであり、具体的には例えばＲＩＢ４０株であ
る。
【００１３】本菌株から染色体ＤＮＡを抽出するには、
例えばAgric. Biol. Chem., Vol.51, 323-328(1987)に
記載されたアスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡの
抽出に関する方法に準じて行われる。
例えばAgric. Biol. Chem., Vol.51, 323-328(1987)に
記載されたアスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡの
抽出に関する方法に準じて行われる。
【００１４】次に、得られた染色体ＤＮＡを適当な制限
酵素で処理し、部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠
心法で分画して10Kbp−20Kbpの断片を得る。同じ接着末
端を生じさせる制限酵素で処理したファージに上記で得
られたＤＮＡ断片を挿入して染色体ジーンライブラリー
を作製する。当該ファージとしてはEMBL3 (J. Mol. Bio
l., Vol.170， 827-842(1983)）が用いられる。また、
サブクローンにはMethods in Enzymology Vol.153, 3-1
1(1987）に記載のpUC118を用いた。
酵素で処理し、部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠
心法で分画して10Kbp−20Kbpの断片を得る。同じ接着末
端を生じさせる制限酵素で処理したファージに上記で得
られたＤＮＡ断片を挿入して染色体ジーンライブラリー
を作製する。当該ファージとしてはEMBL3 (J. Mol. Bio
l., Vol.170， 827-842(1983)）が用いられる。また、
サブクローンにはMethods in Enzymology Vol.153, 3-1
1(1987）に記載のpUC118を用いた。
【００１５】上記で得られた染色体ジーンライブラリー
からの当該遺伝子の単離にあたっては、アスペルギルス
・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニガーのα−グル
コシダーゼ遺伝子の塩基配列（日本農芸化学会1990年度
大会講演要旨集、510頁）に基づいて合成オリゴＤＮＡ
を作製し、それをプローブに用いてアスペルギルス・ニ
ガーの染色体ジーンライブラリーよりスクリーニングを
行い、制限酵素切断地図（日本農芸化学会1990年度大会
講演要旨集、510頁）に一致する2.5KbpのEcoRI断片を取
得した。このＤＮＡ断片をマルチプライム法（Anal. Bi
ochem., Vol.137, 266-267(1984)）により標識した後、
プローブに用いてプラークハイブリダイゼーションを行
いアスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝
子のＤＮＡをクローニングする。得られたＤＮＡ断片は
図１の制限酵素切断地図を有していた。
からの当該遺伝子の単離にあたっては、アスペルギルス
・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニガーのα−グル
コシダーゼ遺伝子の塩基配列（日本農芸化学会1990年度
大会講演要旨集、510頁）に基づいて合成オリゴＤＮＡ
を作製し、それをプローブに用いてアスペルギルス・ニ
ガーの染色体ジーンライブラリーよりスクリーニングを
行い、制限酵素切断地図（日本農芸化学会1990年度大会
講演要旨集、510頁）に一致する2.5KbpのEcoRI断片を取
得した。このＤＮＡ断片をマルチプライム法（Anal. Bi
ochem., Vol.137, 266-267(1984)）により標識した後、
プローブに用いてプラークハイブリダイゼーションを行
いアスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝
子のＤＮＡをクローニングする。得られたＤＮＡ断片は
図１の制限酵素切断地図を有していた。
【００１６】上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギル
ス・オリゼーのベクターとして例えばargB遺伝子をマー
カーにもつpRBG1（Agric. Biol. Chem., Vol.53, 2549-
2555(1987)）に挿入し得られたＤＮＡをargB欠損株のア
スペルギルス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。
argB欠損株として、更に具体的にはM-2-3株（Agric.Bio
l. Chem., Vol.53, 2549-2555(1987)）が挙げられる。
形質転換法としては公知の方法例えばAgric. Biol. Che
m., Vol.51, 323-328(1987）に記載された方法あるいは
これに準じた方法が取られる。
ス・オリゼーのベクターとして例えばargB遺伝子をマー
カーにもつpRBG1（Agric. Biol. Chem., Vol.53, 2549-
2555(1987)）に挿入し得られたＤＮＡをargB欠損株のア
スペルギルス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。
argB欠損株として、更に具体的にはM-2-3株（Agric.Bio
l. Chem., Vol.53, 2549-2555(1987)）が挙げられる。
形質転換法としては公知の方法例えばAgric. Biol. Che
m., Vol.51, 323-328(1987）に記載された方法あるいは
これに準じた方法が取られる。
【００１７】このようにして得たアスペルギルス・オリ
ゼーの形質転換体を培地に培養し、培養液中に分泌生産
されるα−グルコシダーゼを採取するのである。ここで
用いる培地としては例えばマルトースあるいは澱粉を唯
一炭素源とする培地が挙げられる。ここで得た培養液中
のα−グルコシダーゼ活性の測定は４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−グルコシドを基質として作用させ遊離してく
る４−ニトロフェノールを定量させることにより行われ
る。こうして形質転換体を培養することにより、α−グ
ルコシダーゼを効率よく製造できる。
ゼーの形質転換体を培地に培養し、培養液中に分泌生産
されるα−グルコシダーゼを採取するのである。ここで
用いる培地としては例えばマルトースあるいは澱粉を唯
一炭素源とする培地が挙げられる。ここで得た培養液中
のα−グルコシダーゼ活性の測定は４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−グルコシドを基質として作用させ遊離してく
る４−ニトロフェノールを定量させることにより行われ
る。こうして形質転換体を培養することにより、α−グ
ルコシダーゼを効率よく製造できる。
【００１８】次に本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例１】
【００２０】染色体ＤＮＡのジーンライブラリーの作製
【００２１】アスペルギルス・オリゼーRIB40の分生胞
子１白金耳をデキストリン・ペプトン培地(２％デキス
トリン、１％ポリペプトン、0.5％KH2PO4、0.1％NaN
O3、0.05％MgSO4・7H2O）200mlに接種し、30℃、３日間
回転振とう培養後、得られた菌体を３Ｇ１ガラスフィル
ターで集め、滅菌水で洗浄した。
子１白金耳をデキストリン・ペプトン培地(２％デキス
トリン、１％ポリペプトン、0.5％KH2PO4、0.1％NaN
O3、0.05％MgSO4・7H2O）200mlに接種し、30℃、３日間
回転振とう培養後、得られた菌体を３Ｇ１ガラスフィル
ターで集め、滅菌水で洗浄した。
【００２２】次にこの菌体の水分を濾紙により除去した
後、あらかじめ−８０℃に冷却した乳鉢を用いて液体窒
素中ですりつぶした。この菌体破砕物をＴＥ溶液(10mM
Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に懸濁した後、溶菌溶液
（0.5％SDS、50mM EDTA）を等量加えて緩やかに攪拌
後、37℃、30分間放置した。得られた溶菌液を3000rp
m、20分間冷却遠心分離後、上清を取得した。その上清
を等量のフェノール・クロロホルム混合液で２回処理し
て、夾雑するタンパク質を除去後、2.5倍容の冷エタノ
ールを加えＤＮＡを沈澱させた。この沈澱物を0.1mg/ml
のRNaseを含むＴＥ溶液に緩やかに溶解して30℃、30分
間反応した。この溶液をフェノール・クロロフォルム処
理した後、2.5倍容の冷エタノールを添加し、生じた染
色体ＤＮＡをパスツールピペットで巻取った。巻取った
ＤＮＡを乾燥後、ＴＥ溶液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液
を調製した。
後、あらかじめ−８０℃に冷却した乳鉢を用いて液体窒
素中ですりつぶした。この菌体破砕物をＴＥ溶液(10mM
Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に懸濁した後、溶菌溶液
（0.5％SDS、50mM EDTA）を等量加えて緩やかに攪拌
後、37℃、30分間放置した。得られた溶菌液を3000rp
m、20分間冷却遠心分離後、上清を取得した。その上清
を等量のフェノール・クロロホルム混合液で２回処理し
て、夾雑するタンパク質を除去後、2.5倍容の冷エタノ
ールを加えＤＮＡを沈澱させた。この沈澱物を0.1mg/ml
のRNaseを含むＴＥ溶液に緩やかに溶解して30℃、30分
間反応した。この溶液をフェノール・クロロフォルム処
理した後、2.5倍容の冷エタノールを添加し、生じた染
色体ＤＮＡをパスツールピペットで巻取った。巻取った
ＤＮＡを乾燥後、ＴＥ溶液に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液
を調製した。
【００２３】得られたＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分分
解後、分解断片を５−20％の蔗糖密度勾配超遠心法で分
画して10−20Kbpの断片を集めた。この断片をファージ
λEMBLE3-BamHIアーム（東洋紡績（株））にＴ４リガー
ゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをin vitro
パッケージングキット（ギガパックゴールド（東洋紡績
（株））を用いてパッケージングした後、E.coli LE392
にトランスフェクションし、染色体ＤＮＡのジーンライ
ブラリーを作製した。
解後、分解断片を５−20％の蔗糖密度勾配超遠心法で分
画して10−20Kbpの断片を集めた。この断片をファージ
λEMBLE3-BamHIアーム（東洋紡績（株））にＴ４リガー
ゼを用いて連結し、得られたファージＤＮＡをin vitro
パッケージングキット（ギガパックゴールド（東洋紡績
（株））を用いてパッケージングした後、E.coli LE392
にトランスフェクションし、染色体ＤＮＡのジーンライ
ブラリーを作製した。
【００２４】
【実施例２】
【００２５】染色体ＤＮＡのジーンライブラリーからの
アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝子
のクローニング
アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝子
のクローニング
【００２６】実施例１に記載の染色体ＤＮＡのジーンラ
イブラリーに保存されたファージのプラークを形成後、
プラークハイブリダイゼーションによりα−グルコシダ
ーゼ遺伝子を含むクローンの選択を行った。この一連の
操作は常法（Molecular cloning， pp63-67, Cold Spri
ng Harbor Loboratory(1982))によった。プラークハイ
ブリダイゼーションに用いたプローブは、アスペルギル
ス・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニガーのα−グ
ルコシダーゼ遺伝子の塩基配列（日本農芸化学会1990年
度大会講演要旨集、510頁)に基づいて合成オリゴＤＮＡ
を作製し、それをプローブに用いて、アスペルギルス・
ニガーの染色体ジーンライブラリーよりスクリーニング
を行い、制限酵素切断地図（日本農芸化学会1990年度大
会講演要旨集、510頁）に一致する2.5KbpのEcoRI断片を
取得した後、このＤＮＡ断片をマルチプライム法（Ana
l. Biochem., Vol.137, 266-267(1984)）により32Ｐで
放射能標識したものである。
イブラリーに保存されたファージのプラークを形成後、
プラークハイブリダイゼーションによりα−グルコシダ
ーゼ遺伝子を含むクローンの選択を行った。この一連の
操作は常法（Molecular cloning， pp63-67, Cold Spri
ng Harbor Loboratory(1982))によった。プラークハイ
ブリダイゼーションに用いたプローブは、アスペルギル
ス・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニガーのα−グ
ルコシダーゼ遺伝子の塩基配列（日本農芸化学会1990年
度大会講演要旨集、510頁)に基づいて合成オリゴＤＮＡ
を作製し、それをプローブに用いて、アスペルギルス・
ニガーの染色体ジーンライブラリーよりスクリーニング
を行い、制限酵素切断地図（日本農芸化学会1990年度大
会講演要旨集、510頁）に一致する2.5KbpのEcoRI断片を
取得した後、このＤＮＡ断片をマルチプライム法（Ana
l. Biochem., Vol.137, 266-267(1984)）により32Ｐで
放射能標識したものである。
【００２７】約10,000個のプラークの中から、上記のプ
ローブとハイブリダイゼーションする５個のクローンを
選択できた。これらのクローンの中に挿入されているア
スペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各制限酵
素、例えば、PstI、SalI、EcoRIで消化し、上記のプロ
ーブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったと
ころ、各種サイズのＤＮＡ断片を見いだし、これらのＤ
ＮＡ断片の中からPstIで消化して得られた最も大きな7.
0KbpのＤＮＡ断片を含むクローンからこの7.0KbpのＤＮ
Ａ断片を回収した。この7.0KbpのPstI断片をプラスミド
ベクターpUC118のPstI部位に連結し、サブクローンpTGF
-1を得て、図１に示す如く当該挿入断片の制限酵素切断
地図を作製した。次に、ここで得られたサブクローンpT
GS-1を各種制限酵素で消化後、アガロース電気泳動で分
離し、上記プローブを用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ったところ、図１中の斜線部分のHindIIIとEco
RVの領域とハイブリダイズしたため、7.0KbpのPstI断片
はα−グルコシダーゼ遺伝子を十分にコードしていると
判断した。
ローブとハイブリダイゼーションする５個のクローンを
選択できた。これらのクローンの中に挿入されているア
スペルギルス・オリゼー由来のＤＮＡ断片を各制限酵
素、例えば、PstI、SalI、EcoRIで消化し、上記のプロ
ーブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったと
ころ、各種サイズのＤＮＡ断片を見いだし、これらのＤ
ＮＡ断片の中からPstIで消化して得られた最も大きな7.
0KbpのＤＮＡ断片を含むクローンからこの7.0KbpのＤＮ
Ａ断片を回収した。この7.0KbpのPstI断片をプラスミド
ベクターpUC118のPstI部位に連結し、サブクローンpTGF
-1を得て、図１に示す如く当該挿入断片の制限酵素切断
地図を作製した。次に、ここで得られたサブクローンpT
GS-1を各種制限酵素で消化後、アガロース電気泳動で分
離し、上記プローブを用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ったところ、図１中の斜線部分のHindIIIとEco
RVの領域とハイブリダイズしたため、7.0KbpのPstI断片
はα−グルコシダーゼ遺伝子を十分にコードしていると
判断した。
【００２８】
【実施例３】
【００２９】アスペルギルス・オリゼーにおけるα−グ
ルコシダーゼ遺伝子のコピー数
ルコシダーゼ遺伝子のコピー数
【００３０】実施例２で得られたα−グルコシダーゼ遺
伝子のアスペルギルス・オリゼーにおけるコピー数を以
下の方法により決定した。
伝子のアスペルギルス・オリゼーにおけるコピー数を以
下の方法により決定した。
【００３１】アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ
を各種制限酵素、例えば、EcoRI、SalI、PstI等で消化
後、アガロース電気泳動で分離し、実施例２で得られた
7.0KbpのPstI断片をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼーションを行いバーオキシダーゼが触媒するルミノー
ルの酸化反応によるケミルミネセンスを検出するという
原理を応用したアマシャム（株）のＥＣＬ検出システム
によりバンドの検出を行った結果、主な６塩基認識の制
限酵素での消化物とハイブリダイズしたバンドは一本だ
けであることが判明し、アスペルギルス・オリゼーには
本クローンのα−グルコシダーゼ遺伝子が一つだけ存在
することを明らかにした。
を各種制限酵素、例えば、EcoRI、SalI、PstI等で消化
後、アガロース電気泳動で分離し、実施例２で得られた
7.0KbpのPstI断片をプローブとしてサザンハイブリダイ
ゼーションを行いバーオキシダーゼが触媒するルミノー
ルの酸化反応によるケミルミネセンスを検出するという
原理を応用したアマシャム（株）のＥＣＬ検出システム
によりバンドの検出を行った結果、主な６塩基認識の制
限酵素での消化物とハイブリダイズしたバンドは一本だ
けであることが判明し、アスペルギルス・オリゼーには
本クローンのα−グルコシダーゼ遺伝子が一つだけ存在
することを明らかにした。
【００３２】
【実施例４】
【００３３】活性アスペルギルス・オリゼーα−グルコ
シダーゼを分泌生産するためのアスペルギルス・オリゼ
ーで機能するベクターの構築
シダーゼを分泌生産するためのアスペルギルス・オリゼ
ーで機能するベクターの構築
【００３４】実施例２で述べたサブクローンpTGF-1のア
スペルギルス・オリゼー由来の7.0KbpのPstI断片には、
α−グルコシダーゼを十分に含むと思われ、この断片を
アスペルギルス・オリゼーで複製可能なベクターpRBG1
（Agric. Biol. Chem., Vol.51, 323-328(1987)）に次
の方法で連結した。
スペルギルス・オリゼー由来の7.0KbpのPstI断片には、
α−グルコシダーゼを十分に含むと思われ、この断片を
アスペルギルス・オリゼーで複製可能なベクターpRBG1
（Agric. Biol. Chem., Vol.51, 323-328(1987)）に次
の方法で連結した。
【００３５】先ず、pTGF-1 10μｇをPstI制限酵素で消
化した後、0.8％アガロース電気泳動にかけ分離した7.0
Kbpの断片をゲルから切取り、そのゲル片からジーンク
リーンキット（バイオ101社製）を用いてＴＥ溶液（10m
M Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に回収した。
化した後、0.8％アガロース電気泳動にかけ分離した7.0
Kbpの断片をゲルから切取り、そのゲル片からジーンク
リーンキット（バイオ101社製）を用いてＴＥ溶液（10m
M Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に回収した。
【００３６】一方、pRBG1をPstI制限酵素で消化後、小
牛腸のアルカリフォスファターゼ（CIAP）で処理し、
５′末端のリン酸基を除去してpRBG1の自己連結を防ぎ
ながら上記の7.0Kbp ＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用い
て連結し、図２に示すベクターpRTG-F7を作製した。こ
のベクターはE.coli HB101に移入することにより、カナ
マイシン耐性を有する形質転換体を作製し、これを用い
てpRTG-F7を大量に取得することができる。
牛腸のアルカリフォスファターゼ（CIAP）で処理し、
５′末端のリン酸基を除去してpRBG1の自己連結を防ぎ
ながら上記の7.0Kbp ＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用い
て連結し、図２に示すベクターpRTG-F7を作製した。こ
のベクターはE.coli HB101に移入することにより、カナ
マイシン耐性を有する形質転換体を作製し、これを用い
てpRTG-F7を大量に取得することができる。
【００３７】
【実施例５】
【００３８】活性アスペルギルス・オリゼーのα−グル
コシダーゼを多量に分泌生産するアスペルギルス・オリ
ゼー形質転換体の作製
コシダーゼを多量に分泌生産するアスペルギルス・オリ
ゼー形質転換体の作製
【００３９】実施例４で述べたベクターpRTG-F7に挿入
されている7.0Kbpのアスペルギルス・オリゼー由来のＤ
ＮＡ断片には、α−グルコシダーゼを発現分泌生産する
のに必要な情報が含まれていると予想される。そこで次
のようにpRTG-F7のアスペルギルス・オリゼーへの移入
を行った。
されている7.0Kbpのアスペルギルス・オリゼー由来のＤ
ＮＡ断片には、α−グルコシダーゼを発現分泌生産する
のに必要な情報が含まれていると予想される。そこで次
のようにpRTG-F7のアスペルギルス・オリゼーへの移入
を行った。
【００４０】アスペルギルス・オリゼーのアルギニン要
求性株（argB）、例えば、M-2-3株（Agric. Biol. Che
m., Vol.53, 2549）をデキストリン・ペプトン培地（２
％デキストリン、１％ポリペプトン、0.5％KH2PO4、0.0
5％MgSO4・7H2O）で30℃、3日間振とう培養した後、得ら
れた菌糸を無菌水で洗浄した。
求性株（argB）、例えば、M-2-3株（Agric. Biol. Che
m., Vol.53, 2549）をデキストリン・ペプトン培地（２
％デキストリン、１％ポリペプトン、0.5％KH2PO4、0.0
5％MgSO4・7H2O）で30℃、3日間振とう培養した後、得ら
れた菌糸を無菌水で洗浄した。
【００４１】この菌糸を細胞壁溶解液Ａ（10mMリン酸緩
衝液pH6.0、0.8M NaCl、5mg/mlノボザイム234(ノボノル
ディスク社製）、５mg/mlセルラーゼR-10(ヤクルト本社
製)）あるいは細胞壁溶解液Ｂ（10mMリン酸緩衝液pH6.
0、0.8M NaCl、20mg/mlヤタラーゼ（宝酒造（株）社
製））に懸濁し、30℃、３時間振とうすることによりプ
ロトプラスト化を図った。得られたプロトプラストをガ
ラスフィルターでろ過することにより残存する菌糸を除
去した。
衝液pH6.0、0.8M NaCl、5mg/mlノボザイム234(ノボノル
ディスク社製）、５mg/mlセルラーゼR-10(ヤクルト本社
製)）あるいは細胞壁溶解液Ｂ（10mMリン酸緩衝液pH6.
0、0.8M NaCl、20mg/mlヤタラーゼ（宝酒造（株）社
製））に懸濁し、30℃、３時間振とうすることによりプ
ロトプラスト化を図った。得られたプロトプラストをガ
ラスフィルターでろ過することにより残存する菌糸を除
去した。
【００４２】次に、このプロトプラストを0.8M NaClで
２回洗浄した後、形質転換溶液１(50mM Tris-HCl(pH 7.
5)、0.8M NaCl、10mM CaCl2）に2.5×106個／mlになる
ような懸濁液を調製した。この懸濁液に１／４容の形質
転換溶液２（40％(W/V）ポリエチレングリコール4000、
50mM CaCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)) 1/100容のジメチ
ルスルホキシドを添加してコンピテントセルを調製し
た。
２回洗浄した後、形質転換溶液１(50mM Tris-HCl(pH 7.
5)、0.8M NaCl、10mM CaCl2）に2.5×106個／mlになる
ような懸濁液を調製した。この懸濁液に１／４容の形質
転換溶液２（40％(W/V）ポリエチレングリコール4000、
50mM CaCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)) 1/100容のジメチ
ルスルホキシドを添加してコンピテントセルを調製し
た。
【００４３】このコンピテントセル0.2ml(4.0×107個）
にpRTG-F7 10μｇを加え氷中で30分間放置した後、１ml
の形質転換溶液２を加えよく混合した後、室温で20分間
放置した。得られたコンピテントセルを10mlの形質転換
溶液１で洗浄後、0.8M NaClを含むツァペック・ドック
ス培地（0.2％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4・7H
2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4、２％グルコース、pH 5.
5）の平板上に塗布し、その上に 0.8M NaClを含む0.5％
寒天を重層して30℃で培養した。pRTG-F7は、アルギニ
ン要求性を相補する遺伝子（argB）を含んでおり、最小
培地（ツァペック・ドックス培地）で生育可能な形質転
換体を取得した。これをアスペルギルス・オリゼー Ａ
ＧＴ２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＡＧ
Ｔ２）と命名し、微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１３０７７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３０７７）として寄託
した。
にpRTG-F7 10μｇを加え氷中で30分間放置した後、１ml
の形質転換溶液２を加えよく混合した後、室温で20分間
放置した。得られたコンピテントセルを10mlの形質転換
溶液１で洗浄後、0.8M NaClを含むツァペック・ドック
ス培地（0.2％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4・7H
2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4、２％グルコース、pH 5.
5）の平板上に塗布し、その上に 0.8M NaClを含む0.5％
寒天を重層して30℃で培養した。pRTG-F7は、アルギニ
ン要求性を相補する遺伝子（argB）を含んでおり、最小
培地（ツァペック・ドックス培地）で生育可能な形質転
換体を取得した。これをアスペルギルス・オリゼー Ａ
ＧＴ２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＡＧ
Ｔ２）と命名し、微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１３０７７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３０７７）として寄託
した。
【００４４】
【実施例６】
【００４５】アスペルギルス・オリゼーの形質転換によ
るα−グルコシダーゼの生産
るα−グルコシダーゼの生産
【００４６】実施例５で得た形質転換体（アスペルギル
ス・オリゼー ＡＧＴ２，ＦＥＲＭＰ−１３０７７）の
分生胞子を15mlの培地（３％マルトース、１％ポリペプ
トン、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4・7H2O、0.05％KCl、0.
001％FeSO4、pH 5.5）に２×105個接種し、30℃で３日
間振とう培養後得られた培養物を３Ｇｌガラスフィルタ
ーでろ過することにより培養上清を得た。この培養上清
をセントリカットU-20（倉敷紡績（株）製）を用いて濃
縮した後、20mM酢酸緩衝液（pH5.0）中で５℃、一夜透
析して得た粗酵素液を用いてSDS-PAGE及び酵素活性の測
定を以下のように行った。
ス・オリゼー ＡＧＴ２，ＦＥＲＭＰ−１３０７７）の
分生胞子を15mlの培地（３％マルトース、１％ポリペプ
トン、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4・7H2O、0.05％KCl、0.
001％FeSO4、pH 5.5）に２×105個接種し、30℃で３日
間振とう培養後得られた培養物を３Ｇｌガラスフィルタ
ーでろ過することにより培養上清を得た。この培養上清
をセントリカットU-20（倉敷紡績（株）製）を用いて濃
縮した後、20mM酢酸緩衝液（pH5.0）中で５℃、一夜透
析して得た粗酵素液を用いてSDS-PAGE及び酵素活性の測
定を以下のように行った。
【００４７】まず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動は、ラエムリ(Laemmli）の方法（Nature, Vol.22
7,680(1970)）で行い、泳動後のゲルはクマシーブリア
ントブルーR250を用いて染色した。以上の操作により、
形質転換体はα−グルコシダーゼに相当する分子量のタ
ンパク質が多量に分泌していることを確認し、また、α
−アミラーゼ、グルコアミラーゼに相当する分子量のタ
ンパク質の分泌量が減少していることも合わせて確認し
た。以上の結果より、培養液中に含まれる主な夾雑酵素
（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ）は、形質転換体
においては、非常に減少していることが判明し、より高
純度な、α−グルコシダーゼの分泌生産が可能となっ
た。
気泳動は、ラエムリ(Laemmli）の方法（Nature, Vol.22
7,680(1970)）で行い、泳動後のゲルはクマシーブリア
ントブルーR250を用いて染色した。以上の操作により、
形質転換体はα−グルコシダーゼに相当する分子量のタ
ンパク質が多量に分泌していることを確認し、また、α
−アミラーゼ、グルコアミラーゼに相当する分子量のタ
ンパク質の分泌量が減少していることも合わせて確認し
た。以上の結果より、培養液中に含まれる主な夾雑酵素
（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ）は、形質転換体
においては、非常に減少していることが判明し、より高
純度な、α−グルコシダーゼの分泌生産が可能となっ
た。
【００４８】次に、α−グルコシダーゼ活性は、基質と
して0.2％４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシドを
含む10mM酢酸緩衝液（pH 5.0）に粗酵素液を添加して37
℃で反応させた後、0.5MNa2CO3を加えることにより反応
を停止させ、反応中に遊離してくる４−ニトロフェノー
ルを405 nmの吸光度の上昇で測定した。また、α−アミ
ラーゼ活性は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（生物
化学実験法１、18頁−19頁）を用いて生成してくる還元
糖によりＤＮＳから還元的に生成される３−アミノ−５
−ニトロサリチル酸を500 nmの吸光度で直接比色定量し
て測定した。グルコアミラーゼ活性は、可溶性澱粉を基
質として反応させ生成してくるグルコースをムロターゼ
・ＧＯＤ法（Clin. Chim. Acta, Vol.37. 538-540(197
2))に基づくグルコース測定用キット（グルコースＣ−
テストワコー（和光純薬（株）製）を用いて測定した。
以上の酵素活性の測定結果を下記の表１に示した。
して0.2％４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコシドを
含む10mM酢酸緩衝液（pH 5.0）に粗酵素液を添加して37
℃で反応させた後、0.5MNa2CO3を加えることにより反応
を停止させ、反応中に遊離してくる４−ニトロフェノー
ルを405 nmの吸光度の上昇で測定した。また、α−アミ
ラーゼ活性は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（生物
化学実験法１、18頁−19頁）を用いて生成してくる還元
糖によりＤＮＳから還元的に生成される３−アミノ−５
−ニトロサリチル酸を500 nmの吸光度で直接比色定量し
て測定した。グルコアミラーゼ活性は、可溶性澱粉を基
質として反応させ生成してくるグルコースをムロターゼ
・ＧＯＤ法（Clin. Chim. Acta, Vol.37. 538-540(197
2))に基づくグルコース測定用キット（グルコースＣ−
テストワコー（和光純薬（株）製）を用いて測定した。
以上の酵素活性の測定結果を下記の表１に示した。
【００４９】
【表１】
【００５０】上記結果から明らかなように、形質転換体
のα−グルコシダーゼ活性は、ベクター（pRBG1）のみ
の形質転換体と比べて活性、比活性ともに約１３倍増加
した。また、形質転換体のα−アミラーゼ活性は約１／
50、グルコアミラーゼ活性は約１／10に減少した。
のα−グルコシダーゼ活性は、ベクター（pRBG1）のみ
の形質転換体と比べて活性、比活性ともに約１３倍増加
した。また、形質転換体のα−アミラーゼ活性は約１／
50、グルコアミラーゼ活性は約１／10に減少した。
【００５１】以上により明らかな如く、本発明により得
られる培養液は、対照に比べてα−グルコシダーゼ活性
が著しく増加するのみならず、α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ等の他の酵素分泌量が減少するため、本発明
に従い上記したアスペルギルス・オリゼーの形質転換体
を培養することにより、培地中にα−グルコシダーゼが
大量分泌生産され、なおかつ、夾雑酵素も少なく高純度
であることが判明した。
られる培養液は、対照に比べてα−グルコシダーゼ活性
が著しく増加するのみならず、α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ等の他の酵素分泌量が減少するため、本発明
に従い上記したアスペルギルス・オリゼーの形質転換体
を培養することにより、培地中にα−グルコシダーゼが
大量分泌生産され、なおかつ、夾雑酵素も少なく高純度
であることが判明した。
【００５２】
【発明の効果】上述したことから明らかな如く、本発明
によれば、α−グルコシダーゼ遺伝子の組み込まれた組
換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・オリゼーを培地に
培養することにより、極めて効率よくα−グルコシダー
ゼを分泌生産させることができ、発酵工業のみならず、
食品工業、医薬品工業において様々な用途に利用するこ
とができ産業上極めて有用である。
によれば、α−グルコシダーゼ遺伝子の組み込まれた組
換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・オリゼーを培地に
培養することにより、極めて効率よくα−グルコシダー
ゼを分泌生産させることができ、発酵工業のみならず、
食品工業、医薬品工業において様々な用途に利用するこ
とができ産業上極めて有用である。
【００５３】したがって、このようにして効率的に生産
されたα−グルコシダーゼを用いて、例えばイソマルト
オリゴ糖を効率的に生産し、清酒、味噌、醤油等のうま
味成分として利用できるほか、ビフィズス菌増殖、抗う
蝕等の用途にも利用できる。
されたα−グルコシダーゼを用いて、例えばイソマルト
オリゴ糖を効率的に生産し、清酒、味噌、醤油等のうま
味成分として利用できるほか、ビフィズス菌増殖、抗う
蝕等の用途にも利用できる。
【００５４】更にまた、α−グルコシダーゼ遺伝子の組
み込まれた組換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・オリ
ゼーを用いて製麹した麹を利用して清酒を醸造すれば、
イソマルトース、イソマルトトリオース、コウジビオー
スその他のオリゴ糖が生成し、清酒にうま味やこくを付
与することができ、従来にない新しいタイプの清酒も醸
造することが可能となる。したがって本発明は、清酒の
新しい需要を開拓する点でも大いに期待されるものであ
る。
み込まれた組換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス・オリ
ゼーを用いて製麹した麹を利用して清酒を醸造すれば、
イソマルトース、イソマルトトリオース、コウジビオー
スその他のオリゴ糖が生成し、清酒にうま味やこくを付
与することができ、従来にない新しいタイプの清酒も醸
造することが可能となる。したがって本発明は、清酒の
新しい需要を開拓する点でも大いに期待されるものであ
る。
【図１】アスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダー
ゼ遺伝子の制限酵素切断地図を示す。
ゼ遺伝子の制限酵素切断地図を示す。
【図２】実施例４で得たベクターpRTG-F7の制限酵素切
断地図を示す。
断地図を示す。
Ｐ： PstI Ｓｃ： ScaI Ｈ： HindIII Ｅ： EcoRI ＥＶ： EcoRV Ｓａ： SacI Ｂ： ＢａｍＨＩ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/26 (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ） Ｃ１２Ｒ 1:69） ） (72)発明者 五 味 勝 也 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内 (72)発明者 北 本 勝 ひ こ 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内 (72)発明者 熊 谷 知 栄 子 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税 庁醸造試験所内 (56)参考文献 日本農芸化学会1990年度大会講演要旨 集Ｐ．510 ＢＩＯＳＣＩ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ Ｌ．ＢＩＯＣＨＥＭ．56（８）（1992) Ｐ．1368−1370
Claims (4)
- 【請求項１】 下記図１に示す制限酵素切断地図で規定
されるアスペルギルス・オリゼーから単離したα−グル
コシダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 請求項１に記載のα−グルコシダーゼ遺
伝子を含有するＤＮＡ断片を含んだアスペルギルス・オ
リゼーのベクター。 - 【請求項３】 請求項２に記載のベクターをアスペルギ
ルス・オリゼーに移入することにより得られたα−グル
コシダーゼ生産能の上昇した形質転換体。 - 【請求項４】 請求項３に記載の形質転換体を培養し、
培養物からα−グルコシダーゼを採取することを特徴と
するα−グルコシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4240114A JP2530275B2 (ja) | 1992-08-18 | 1992-08-18 | α−グルコシダ−ゼ遺伝子、ベクタ−、形質転換体及びそれを用いたα−グルコシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4240114A JP2530275B2 (ja) | 1992-08-18 | 1992-08-18 | α−グルコシダ−ゼ遺伝子、ベクタ−、形質転換体及びそれを用いたα−グルコシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662868A JPH0662868A (ja) | 1994-03-08 |
| JP2530275B2 true JP2530275B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=17054701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4240114A Expired - Lifetime JP2530275B2 (ja) | 1992-08-18 | 1992-08-18 | α−グルコシダ−ゼ遺伝子、ベクタ−、形質転換体及びそれを用いたα−グルコシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2530275B2 (ja) |
-
1992
- 1992-08-18 JP JP4240114A patent/JP2530275B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＩＯＳＣＩ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．５６（８）（１９９２）Ｐ．１３６８−１３７０ |
| 日本農芸化学会１９９０年度大会講演要旨集Ｐ．５１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662868A (ja) | 1994-03-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |