JPH09173074A - 新規遺伝子、および該遺伝子を保有する形質転換体細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱
離反応を触媒する酵素を多量に製造すること、ひいては
バニリン酸からのプロトカテキュ酸およびシリンガ酸か
らの没食子酸の効率的な生産を可能にする。 【解決手段】 微生物由来のバニリン酸およびシリンガ
酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺
伝子を含有するＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片を保有
する形質転換体細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はバニリン酸およびシ
リンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片
が組み込まれた組換え体ベクターを保有する形質転換体
細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基
の脱離反応を触媒する酵素は、植物成分など天然物中に
大量に存在するリグニン、リグナン、その他の抽出成分
のメチルエーテル構造を水酸基に転換する酵素であり、
上記天然成分をカテコール、ピロガロール構造に転換す
る際に重要な役割を果たす。従って、バニリン酸および
シリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子
を見出し、該遺伝子にコードされるバニリン酸およびシ
リンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素を量産す
ることはプロトカテキュ酸、カテコール、ピロガロール
の生産に極めて重要である。一方、酵素などのタンパク
質の量産技術として組換えＤＮＡ技術の発展は近年めざ
ましく、数多くの酵素、生理活性タンパク質等が組換え
ＤＮＡ技術を利用した量産化に成功している。しかしな
がら、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反
応を触媒する酵素は分離されていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、バニリン酸
およびシリンガ酸をそれぞれプロトカテキュ酸および没
食子酸に変換する際に重要な、バニリン酸およびシリン
ガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含有
するＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片を組み込んだ形質
転換体細胞を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはリグニンの
構造モデル化合物を分解する微生物について鋭意研究を
行った結果、組換えＤＮＡ技術を利用してバニリン酸お
よびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、その塩基配列を明らか
にすることに成功し、本発明を完成するに至った。すな
わち本発明は、（１） 配列番号１で示されるアミノ酸
配列で表わされる、バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
ル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片、（２） 配列番号２で示される塩基
配列で表わされる遺伝子であって、バニリン酸およびシ
リンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡ断片、（３） シュードモ
ナス ポーシモビリスＳＹＫ−６株に由来する、バニリ
ン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する
酵素の遺伝子を含有するＤＮＡ断片、（４） 上記１、
２または３記載のＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体ベ
クターを保有する形質転換体細胞、および（５） エッ
シェリキア コリＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５３１１）である上記４記載の形質転換体細
胞に関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】次に本発明を詳述する。微生物か
らバニリン酸及びシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触
媒する酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離には、微生物
の宿主−ベクター系を用いることができる。該ＤＮＡ断
片は、例えば組換えＤＮＡ技術を利用して次の如くして
製造される。すなわち、まずＤＮＡ供与体としてバニリ
ン酸やシリンガ酸などのリグニンの構造モデル化合物分
解能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素などにより切断しＤＮＡ断片とす
る。一方、ファージ、プラスミド等のベクターＤＮＡを
制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が挿入可能な制
限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮＡ断片と直鎖
状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用いて結合
させ、組換え体ＤＮＡを得る。該組換え体ＤＮＡを宿主
細胞に移入し、目的の組換え体ＤＮＡを保有する形質転
換体細胞を選択する。目的の組換え体ＤＮＡは該形質転
換体細胞より分離することができる。ついで、目的に応
じて該組換え体ＤＮＡよりあらたなる組換え体ＤＮＡを
作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞へ移入する。該組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞によってバニリ
ン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する
酵素を生産し、該酵素の作用によってバニリン酸からは
プロトカテキュ酸が、シリンガ酸からは没食子酸が生産
される。

【０００６】本発明のＤＮＡ供与体としては、バニリン
酸やシリンガ酸を分解する能力を有する微生物であれば
特に制限されず、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏ
ｍｏｎａｓ）属の微生物等が挙げられる。具体的には、
シュードモナス ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）ＳＹＫ−６株等が挙
げられるが、特にシュードモナス ポーシモビリスＳＹ
Ｋ−６株が好ましい。該微生物からのゲノムＤＮＡの抽
出は、該微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアー
ゼＫにて菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タ
ンパク質処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処
理、アルコールによるゲノムＤＮＡの沈殿、遠心分離な
どの方法を適宜組み合わせて行うのが好ましい。分離さ
れたゲノムＤＮＡを断片化するには、例えば該ゲノムＤ
ＮＡの制限酵素の消化により行われる。

【０００７】ベクターとしては、宿主微生物内で自立的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから組換えＤＮ
Ａを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。
かかるプラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とする
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１
８、ｐＵＣ１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−
３等、シュードモナス ポーシモビリスを宿主とするｐ
ＫＴ２３０ＭＣ、ｐＶＫ１００等が好ましい。これらの
ベクターは、例えば制限酵素を用いてＤＮＡ断片が挿入
可能な制限酵素末端を作製し、必要に応じてその末端を
脱リン酸処理した後に用いられる。ゲノムＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡ断片の結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、
例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ等を用いて行うことができ
る。

【０００８】得られる組換え体ＤＮＡを移入させる宿主
微生物としては、該組換え体ＤＮＡが安定にかつ自立的
に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発
現するものであれば良いが、例えば大腸菌、シュードモ
ナス ポーシモビリスあるいはそれらの変異株を用いる
ことができる。宿主微生物に組換え体ＤＮＡを移入する
方法としては、例えは接合法、エレクトロポレーション
法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法等のいずれの方法も用いること
ができる。

【０００９】形質転換体の選択は、用いたベクターの選
択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲
得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質
転換体の中から目的の組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体の選択は、例えば、本来バニリン酸やシリンガ酸を
分解する能力を有するシュードモナス ポーシモビリス
から得られるバニリン酸やシリンガ酸を分解する能力を
失った変異株にバニリン酸やシリンガ酸を分解する能力
を付与する性質を指標に、あるいは大腸菌を宿主とする
場合、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反
応を触媒する酵素遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法によ
り行うのが好ましい。このプローブの標識としては、例
えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等のいずれ
も用いることができる。

【００１０】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換え体ＤＮＡを抽出するには、常法により抽出す
れば良く、例えば大腸菌の溶菌法（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いることができ
る。抽出される組換え体ＤＮＡは、必要に応じて再び組
換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができる。得ら
れる組換え体ＤＮＡから、本発明のＤＮＡ断片を切り出
すには、制限酵素などを用いることができる。

【００１１】後記実施例に示すごとく、上述した方法に
従って、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離
反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するもっ
ともコンパクトな組換え体プラスミドとしてｐＤＥ０５
（図１）を得た。プラスミドｐＤＥ０５から分離した該
酵素をコードする遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸
配列を配列表３に示す。また該塩基配列および該推定ア
ミノ酸配列をそれぞれ配列表２および配列表１に示す。
組換え体プラスミドｐＤＥ０５を保有する微生物、エッ
シェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）は、工業技術院生命工
学工業技術研究所にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＦＥＲＭ Ｐ− １５３１１として寄託されている。
なお、上記遺伝子を含有するＤＮＡ断片の例としては、
上記遺伝子そのもの、および上記組換え体プラスミドｐ
ＤＥ０５のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ断片およびＥｃｏＲＩ−
ＰｓｔＩ断片、組換え体プラスミドｐＤＥ０１（図１）
のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、組換え体プラスミドｐＤ
Ｅ０２（図１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片等が挙げら
れる。本発明の、上記遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、
通常プラスミドベクターやファージベクター中に保存さ
れるので、その配列の長さはおのずと規制される。

【００１２】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。（１） 遺伝子ライブラリーの調製 シュードモナス ポーシモビリス ＳＹＫ−６株を試験
管内のグルコースを含むＬＢ培地（トリプトン；１０ｇ
／Ｌ、酵母エキス；５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、ｐ
Ｈ７．０）へ接種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を
作製した。この前培養液をフラスコ内の新しく用意した
前記と同様の培地に接種し２８℃にて再び終夜培養し
た。該培養液の遠心により集菌した。該菌体をＴＥ（１
０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に
懸濁した後、最終濃度０．５％ ＳＤＳおよび最終濃度
１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫにて３７℃、１時間処
理し、１／６容の５Ｍ食塩を混合した。ついで、１０％
ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、０．７Ｍ食塩を１
／１０容量加え、６５℃で１０分間静置した。等量のク
ロロホルム−イソアミルアルコール液を加えてよく混和
し、ついで遠心した。水層を等量のフェノール−クロロ
ホルム液で抽出し、水層にエタノールを加えてゲノムＤ
ＮＡを沈殿させ、減圧乾燥の後、ＴＥを加え溶解した。

【００１３】該ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝
酒造社、以下同様）により部分消化し、１％アガロース
ゲル（和光純薬工業社、アガロース１６００）にて電気
泳動した。緩衝液としてＴＡＥ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏ
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いた。電気泳
動後のアガロースゲルは１μｇ／ｍｌエチジウムブロマ
イドに１５分間浸漬した後水洗し、紫外線照射によりＤ
ＮＡ断片の蛍光を確認した。サイズマーカーとしてλフ
ァージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物（宝酒造社）を同
時に電気泳動し、該ＤＮＡ断片の泳動距離からゲノムＤ
ＮＡ消化物の分子量を求めた。約２０ｋｂｐのゲノムＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化物を含むアガロースゲルを切
り出し、セシウムクロライドを用いた超遠心法にてＤＮ
Ａ断片の精製を行った。

【００１４】コスミドベクターｐＶＫ１００（ＡＴＣＣ
３７１５６株より取得）（図１）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
（宝酒造社）により完全消化した。同反応液にアルカリ
ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎ
ｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造社）を添加し、
制限酵素にて消化したコスミドベクターの末端の脱リン
酸化を行った。上記反応液に１／１０倍容量の３Ｍ酢酸
ナトリウムｐＨ５．２と２倍容量のエタノールを添加し
−８０℃にて２時間冷却し、９，０００×ｇにて１０分
間遠心し、ベクターＤＮＡのペレットを得た。７０％エ
タノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、この
リンス液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥したベ
クターＤＮＡをＴＥに溶解した。

【００１５】前記シュードモナス ポーシモビリス Ｓ
ＹＫ−６株の約２０ｋｂｐのＤＮＡ断片、および上記の
ごとく処理したベクターＤＮＡを、Ｔ４リガーゼ（宝酒
造社）を用いて結合した。上記リガーゼ反応物をインビ
トロパッケージングキット（ＧｉｇａｐａｃｋＰＬＵ
Ｓ， ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ 社製）にてλファージに
パッケージングした。１０ｍＭの硫酸マグネシウムと
０．２％のマルトースを含むＴＢ培地（トリプトン；１
０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）で終夜培
養した大腸菌ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４、以下同
様）を１０ｍＭの硫酸マグネシウムを含むＴＢ培地４ｍ
Ｌに懸濁し、１５分間、３７℃で静置した。これをパッ
ケージング反応液と混合し、ＬＢ培地を加え３７℃で３
０分間放置した。該大腸菌は最終濃度が２５μｇ／ｍｌ
になるようにカナマイシンを添加したＬＢ平板培地（Ｌ
Ｂに寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）に塗布し、３
７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１を宿主としたシュードモナス ポーシモビリス
ＳＹＫ−６株の遺伝子ライブラリーとした。

【００１６】（２）シュードモナス ポーシモビリス
ＳＹＫ−６株からバニリン酸およびシリンガ酸を分解す
る能力を失った変異株の作製 シュードモナス ポーシモビリス ＳＹＫ−６株を０．
２％のバニリン酸を含む２００ｍＬの表１に示す培地１
に一白金耳接種して、４８時間、２８℃にて振とう培養
した。この培養液を５０００×ｇで遠心集菌後、リン酸
緩衝液１０ｍＬに再懸濁した。これに、最終濃度５０μ
ｇ／ｍｌになるようにＮＴＧ（＝Ｎ−メチル−Ｎ´−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を添加し、室温で２０
分、３０分および４０分反応させ、ついでこれらの反応
物を混合した。上記のＮＴＧ処理菌懸濁液を５０００×
ｇで遠心集菌後、リン酸緩衝液１０ｍＬに再懸濁した。
この操作を３度繰り返した。最後にリン酸緩衝液１０ｍ
Ｌに再懸濁し、適当に希釈してＬＢ平板培地に塗布、２
８℃で４８時間培養した。生じたコロニー約３０００個
を０．２％のバニリン酸を含む培地１の平板培地（培地
１に寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）および０．２
％のプロトカテキュ酸を含む培地１の平板培地にピック
アップし、２８℃で５日間培養した。

【００１７】以上の操作で、バニリン酸では生育でき
ず、プロトカテキュ酸で生育できる変異株シュードモナ
ス ポーシモビリス ＤＣ４９株を得た。該変異株をＬ
Ｂ培地で培養し菌体集菌後、０．２％のバニリン酸、プ
ロトカテキュ酸、シリンガ酸、３−メチルガリック酸を
それぞれ含む培地１に再懸濁し、２８℃で振とう培養し
た。培養２４時間後の各培養液のＵＶスペクトルを調べ
たところ、バニリン酸、シリンガ酸、はまったく減少し
ていなかったが、プロトカテキュ酸、３−メチルガリッ
ク酸は完全に消失していた。

【００１８】

【表１】 表１ 培地１

【００１９】（３）バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
ル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む形質転換体
細胞の選択 上記（１）にて取得した大腸菌ＨＢ１０１の形質転換体
細胞から成るシュードモナス ポーシモビリスＳＹＫ−
６株の遺伝子ライブラリーから目的のバニリン酸および
シリンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子
を含む形質転換体細胞の選択には、上記（１）のシュー
ドモナス ポーシモビリスＳＹＫ−６株のライブラリー
を構成する大腸菌ＨＢ１０１から上記（２）の変異株シ
ュードモナス ポーシモビリス ＤＣ４９株に接合伝達
法を用いてプラスミドを移行し、バニリン酸やシリンガ
酸を分解する能力を回復したシュードモナス ポーシモ
ビリス ＤＣ４９株の組換え株を選抜することによって
行った。

【００２０】 シュードモナス ポーシモビリスＳＹＫ−
６株のライブラリーを構成する大腸菌ＨＢ１０１および
ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を有する大腸菌ＨＢ
１０１をそれぞれ試験管に調整した２５μｇ／ｍＬのカ
ナマイシンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に一白金耳植菌
し、３７℃で振とう培養した。また、シュードモナスポ
ーシモビリスＤＣ４９を試験管に調整した１０ｍＬのＬ
Ｂ培地に一白金耳植菌し、２８℃で振とう培養した。そ
れぞれ十分に生育したら、試験管に調整した１０ｍＬの
ＬＢ培地に０．５ｍＬ植菌し、上記と同様の温度で振と
う培養した。それぞれＯＤ５５０が０．５になるまで培
養を続け、３つの培養液を等量ずつ混合した。この混合
液を孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルター上
に集菌し、ＬＢ寒天平板上において、２８℃で４時間培
養した。培養後、フィルター上の菌体を１ｍＬの生理的
食塩水に懸濁させた。上記の菌懸濁液を適当に希釈して
２５μｇ／ｍＬのカナマイシンと２５μｇ／ｍＬのナリ
ジキン酸を含むＬＢ平板培地に塗布し、２８℃で３日間
培養した。生じたコロニー約３０００個を０．２％のバ
ニリン酸を含む培地１の平板培地および０．２％のプロ
トカテキュ酸を含む培地１の平板培地にピックアップ
し、２８℃で５日間培養した。この結果、バニリン酸で
の生育が回復した組換え体、１株を得た。

【００２１】（４）バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
ル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドｐＤＥ２０の分離 実施例１−（３）記載のバニリン酸やシリンガ酸を分解
する能力の回復を指標に選択した、バニリン酸およびシ
リンガ酸のメチル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を
含むシュードモナス ポーシモビリスＤＣ４９の形質転
換体を最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイ
シンを添加したＬＢ液体培地１ｍｌへ接種して２８℃で
終夜培養した。遠心により集菌し、ＴＥ １００μｌに
懸濁し、室温で５分間放置した。溶液Ｉ（１％ＳＤＳ、
０．２Ｍ水酸化ナトリウム）２００μｌを添加し、氷中
にて５分間冷却した。さらに溶液ＩＩ（５Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ４．８）１５０μｌを添加し、氷中にて５分間
冷却した。遠心分離にて、上清をデカンテーションによ
り分離した。Ｒｎａｓｅを添加し、３０分間静置し、つ
いでフェノールクロロホルムを加えてよく混和し、遠心
した。水層に２倍容量のエタノールを添加し−８０℃に
て２時間冷却した。１５，０００×ｇにて１０分間遠心
し、ＤＮＡのペレットを得た。７０％エタノールを適量
加え遠心管の壁面を２回リンスし、エタノールを簡単に
除去した後減圧乾燥し精製プラスミドｐＤＥ２０（図
１）を得た。

【００２２】（５）組換えプラスミドｐＤＥ０１、ｐＤ
Ｅ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０４、ｐＤＥ０５およびｐ
ＤＥ０６の作製。（５）−１． 組換えプラスミドｐＤＥ２０を制限酵
素ＢａｍＨＩ（宝酒造社、以下同様）で完全に消化し、
同じく制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化しアルカリフォ
スファターゼで末端脱リン酸化したプラスミドベクター
ｐＵＣ１１９（宝酒造社）を混合し、ライゲーションキ
ット（宝酒造社）を用いて結合反応を行った。次にハナ
ハン法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６６，
ｐ５５７−５８０， １９８３）にて大腸菌ＨＢ１０１
をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主とし
て上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最
終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを
添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養し
た。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップ
し、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシ
リンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜
培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラ
スミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制
限酵素ＢａｍＨＩで完全消化した。（１）に記載する電
気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片
の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結
果、ＢａｍＨＩによる消化で約６ｋｂｐの断片を生じる
１種類の組換えプラスミド、ｐＤＥ０１（図１）を確認
した。

【００２３】（５）−２． 組換え体プラスミドｐＤ
Ｅ２０を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで完全に消
化し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ（宝酒
造社、以下同様）で完全に消化したプラスミドベクター
ｐＵＣ１１９を混合し、ライゲーションキット（宝酒
造）を用いて結合反応を行った。次に上記ハナハン法に
て大腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、
該大腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形
質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３
７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ラン
ダムにピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌに
なるようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種
し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様
にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩
衝液中で過剰量の制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで
完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限
酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、
制限酵素地図を作成した。その結果、ＢａｍＨＩおよび
ＳｍａＩによる消化で約５ｋｂｐの断片を生じる１種類
の組換えプラスミド、ｐＤＥ０２（図１）を確認した。

【００２４】（５）−３． 組換えプラスミドｐＤＥ
２０を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社、以下同様）で完全
に消化し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造
製）を用いて平滑末端化したＤＮＡ断片と、制限酵素Ｓ
ｍａＩで完全に消化し、アルカリフォスファターゼで末
端脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵＣ１１９を混
合し、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反
応を行った。次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１
をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主とし
て上記反応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最
終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを
添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養し
た。出現したコロニーを１０株ランダムにピックアップ
し、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシ
リンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜
培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラ
スミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制
限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社、以下同様）とＥｃｏＲＩで
完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限
酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、
制限酵素地図を作成した。その結果、ＸｂａＩとＥｃｏ
ＲＩによる消化で約４ｋｂｐの断片を生じる１種類の組
換えプラスミド、ｐＤＥ０３（図１）を確認した。

【００２５】（５）−４． 組換え体ＤＮＡ、ｐＤＥ
０２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで完全に消化
した。生じた約５ｋｂｐの断片をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉ
ｎｇキット（宝酒造製）を用いて平滑末端化した。次
に、制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化したプラスミドベ
クターｐＵＣ１１９を同じくＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ
キットを用いて平滑末端化し、アルカリフォスファター
ゼで末端脱リン酸化した。これらのＤＮＡを混合し、ラ
イゲーションキット（宝酒造）を用いて結合反応を行っ
た。次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１をコンピ
テントセルとして調製し、該大腸菌を宿主として上記反
応液を形質転換した。該形質転換体大腸菌は最終濃度が
１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加した
ＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現
したコロニーを２０株ランダムにピックアップし、最終
濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添
加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜培養し
た。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラスミド
を抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素
ＰｓｔＩで完全消化した。（１）に記載する電気泳動を
行い、制限酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量
を解析し、制限酵素地図を作成した。その結果、図１に
示す１種類の組み換えプラスミド、ｐＤＥ０４を確認し
た。

【００２６】（５）−５． 組換えプラスミドｐＤＥ
０４を制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社、以下同様）および
ＳｍａＩで完全消化し、キロシークエンスキット（宝酒
造製）を用いて、３０℃、１０−３０分間のデリーショ
ン反応に付した。それぞれのデリーション反応液を、該
キットに従いｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ、
Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ処理に付した。次に、
これらの処理液を用いて、それぞれライゲーションキッ
ト（宝酒造製）にて結合反応を行った。それぞれの反応
液を大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセルに形質転換し
た。該形質転換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌ
になるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗
布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニーを、
それぞれの培養について１０株ランダムにピックアップ
し、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシ
リンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃にて終夜
培養した。（４）記載の方法と同様にそれぞれからプラ
スミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液中で過剰量の制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化した。
（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により
生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を
作成した。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ
Ｉでの消化で、約１．９ｋｂｐの断片を生じる組換えプ
ラスミド、ｐＤＥ０５（図１）および約１．５ｋｂｐの
断片を生じる組換えプラスミド、ｐＤＥ０６（図１）を
確認した。

【００２７】（６）バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
ル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ、ｐＤＥＭＣ０５の分離 上記組換えプラスミドｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ
０３、ｐＤＥ０５およびｐＤＥ０６をそれぞれ制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化し、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで完全消化したプラスミド
ｐＫＴ２３０ＭＣ（図２）と混合し、ライゲーションキ
ット（宝酒造）を用いてそれぞれ結合反応を行った。な
お、プラスミドｐＫＴ２３０ＭＣは、以下のような操作
で得られる。 広宿主プラスミドベクターＲＳＦ１０１０を制限酵素
ＰｓｔＩで消化して得られる約８ｋｂｐの断片と、大腸
菌プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１７７（ＡＴＣＣ３７
０３１株より取得）を同じく制限酵素ＰｓｔＩで消化し
て得られる３．７ｋｂｐの断片とをＴ４リガーゼを用い
て連結させる。こうして得られる１１．９ｋｂｐのサイ
ズを有するプラスミドのうちストレプトマイシン耐性遺
伝子を発現するものを選んでプラスミドｐＫＴ２３０を
得る。（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，
Ｇｅｎｅ １６，ｐ−２３７（１９８１））。 該プラスミドｐＫＴ２３０を制限酵素ＳａｃＩで消化
後、平滑末端化したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
する。 プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＰｖｕＩＩで消化して得られる約２００ｂｐの小断片を
調製する。 上記およびで得られるＤＮＡをＴ４リガーゼで連
結する。

【００２８】次に上記ハナハン法にて大腸菌ＨＢ１０１
をコンピテントセルとして調製し、該大腸菌を宿主とし
て上記反応液それぞれを形質転換した。該形質転換体大
腸菌は最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにカナマイ
シンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃にて終夜
培養した。それぞれから出現したコロニーを１０株ラン
ダムにピックアップし、最終濃度が２５μｇ／ｍｌにな
るようにカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種
し、３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様
にそれぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩
衝液中で過剰量の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで
完全消化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限
酵素消化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、
制限酵素地図を作成した。その結果、組換えプラスミド
ｐＤＥ０１、ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０５およ
びｐＤＥ０６にそれぞれ対応する、組換えプラスミドｐ
ＤＥＭＣ０１、ｐＤＥＭＣ０２、ｐＤＥＭＣ０３、ｐＤ
ＥＭＣ０５およびｐＤＥＭＣ０６（図２）を確認した。

【００２９】 次に上記５種のプラスミドを（４）記載の
接合伝達法で変異株シュードモナスポーシモビリス Ｄ
Ｃ４９株に移行し、該組換え体を２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンと２５μｇ／ｍｌのナリジキン酸を含むＬＢ培
地で培養し、菌体集菌後、０．２％のバニリン酸および
０．２％のシリンガ酸をそれぞれ含む液体培地に再懸濁
し、２８℃で振とう培養した。培養２４時間後の各培養
液のＵＶスペクトルを調べたところ、上記５種の組換え
プラスミドのうち、ｐＤＥＭＣ０１、ｐＤＥＭＣ０２お
よびｐＤＥＭＣ０５を導入した変異株シュードモナス
ポーシモビリスＤＣ４９株では、バニリン酸およびシリ
ンガ酸は完全に消失していた。この結果、変異株シュー
ドモナス ポーシモビリスＤＣ４９株のバニリン酸およ
びシリンガ酸を分解する能力を回復させる活性を有する
最小の組換えプラスミド、ｐＤＥＭＣ０５を得た。該組
換えプラスミドｐＤＥＭＣ０５の構造を図２に示す。

【００３０】（７）バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
ル基の脱離反応を触媒する酵素遺伝子の塩基配列解析 組換えプラスミドｐＤＥ０２を制限酵素ＰｓｔＩで完全
に消化して、フェノール−クロロホルムを加えてよく混
和し、ついで水層を取り、２倍量のエタノールを添加し
て、−２０℃で静置して沈殿を生じさせ、該沈殿から制
限酵素を除去した後、ライゲーションキット（宝酒造）
を用いて結合反応を行った。次に上記ハナハン法にて大
腸菌ＨＢ１０１をコンピテントセルとして調製し、該大
腸菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転
換体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように
アンピシリンを添加したＬＢ平板培地に塗布し、３７℃
にて終夜培養した。出現したコロニーを１０株ランダム
にピックアップし、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになる
ようにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、
３７℃にて終夜培養した。（４）記載の方法と同様にそ
れぞれからプラスミドを抽出し、それぞれ適当な緩衝液
中で過剰量の制限酵素ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで完全消
化した。（１）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消
化により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵
素地図を作成した。その結果、制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＳｍａＩによる消化で約１ｋｂｐの断片を生じる１種類
の組換えプラスミド、ｐＤＥ０２１（図１）を確認し
た。

【００３１】 次に上記プラスミドｐＤＥ０２１および上
記５で得られた組換えプラスミドｐＤＥ０３、ｐＤＥ０
５およびｐＤＥ０６を用いて、組換えプラスミドｐＤＥ
０５に含まれる約２ｋｂｐＤＮＡ断片の塩基配列の解析
を行った。塩基配列の解析は、Ｍ１３ダイデオキシ法
（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔｃ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７４， ５４６３−
５４６７（１９７７））にてシークエンシング反応を行
い、そのための装置として自動レーザー蛍光シークエン
シング装置（ファルマシアバイオテク社）を用いた。塩
基配列解析の結果、該ＤＮＡ断片上にシュードモナス
ポーシモビリスＳＹＫ−６のコドンユーセイジに適合す
る唯一のオープンリーディングフレーム（１６７１ｂ
ｐ）が見出された。該オープンリーディングフレームを
完全に含むｐＤＥ０５で形質転換された形質転換細胞エ
ッシェリキア コリＭＶ１１９０（ｐＤＥ０５）は、既
述のごとく、工業技術院生命工学工業技術研究所にＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＦＥＲＭ Ｐ−１５３
１１として寄託されている。以上のようにして得られた
バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱離反応を触
媒する酵素遺伝子の塩基配列（＝上記１６７１ｂｐのオ
ープンリーディングフレーム）とコードされているアミ
ノ酸配列を、既述のごとく、配列番号３に示す。また、
既述のごとく、該塩基配列を配列番号２に、該アミノ酸
配列を配列番号１に示す。

【００３２】

【発明の効果】本発明の、バニリン酸およびシリンガ酸
のメチル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片を保有するベクターで形質転換
した細胞を用いれば、該酵素を大量に生産することがで
き、バニリン酸からはプロトカテキュ酸が、シリンガ酸
からは没食子酸を効果的に生産できる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ala Gln Gly Ser Asp Ile Glu Ile Ala Arg Glu Glu Arg Met Gln 1 5 10 15 Asn Ile Ala Glu Val Gly Ala Lys Val Gly Ile Pro Gln Asp Ala Leu 20 25 30 Leu Asn Tyr Gly Pro Tyr Lys Ala Lys Leu Ser Trp Asp Phe Ile Asn 35 40 45 Ser Val Gln Gly Asn Gln Asp Gly Lys Leu Ile Leu Val Thr Ala Ile 50 55 60 Asn Pro Thr Pro Ala Gly Glu Gly Lys Thr Thr Thr Thr Val Gly Leu 65 70 75 80 Ala Asp Gly Leu Asn Arg Ile Gly Lys Lys Thr Val Ala Ala Leu Arg 85 90 95 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Cys Phe Gly Val Lys Gly Gly Ala Ala Gly 100 105 110 Gly Gly Tyr Ala Gln Val Val Pro Met Glu Asp Ile Asn Leu His Phe 115 120 125 Thr Gly Asp Phe His Ala Ile Thr Ser Ala Asn Asn Leu Leu Ala Ala 130 135 140 Leu Ile Asp Asn His Ile Tyr Trp Gly Asn Lys Leu Gly Leu Asp Pro 145 150 155 160 Arg Arg Ile Ala Trp Arg Arg Val Leu Asp Met Asn Asp Arg Val Arg 165 170 175 Ser Ile Val Asn Ser Leu Gly Gly Val Ser Asn Gly Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 Asp Gly Phe Asp Ile Thr Val Ala Ser Glu Val Met Ala Ile Leu Cys 195 200 205 Leu Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Glu Arg Arg Leu Gly Asn Ile His 210 215 220 Ala Gly Tyr Thr Arg Glu Arg Lys Ala Val Leu Ala Ser Glu Leu Asn 225 230 235 240 Ala Ser Gly Ala Met Thr Val Leu Leu Lys Asp Ala Leu Gln Pro Asn 245 250 255 Met Val Gln Thr Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Ile His Gly Gly Pro 260 265 270 Phe Ala Asn Ile Ala His Gly Cys Asn Ser Val Leu Ala Thr Lys Thr 275 280 285 Ala Leu Lys Ile Ala Asp Tyr Val Val Thr Glu Ala Gly Phe Gly Ala 290 295 300 Asp Leu Gly Ala Glu Lys Phe Phe Asp Ile Lys Cys Arg Lys Ala Gly 305 310 315 320 Leu Lys Pro Ser Ala Ala Val Ile Val Ala Thr Ile Arg Ala Leu Lys 325 330 335 Met His Gly Gly Val Asp Lys Ala Asp Leu Gly Thr Ala Asn Pro Glu 340 345 350 Ala Val Arg Lys Gly Gly Val Asn Leu Ala Arg His Ile Glu Asn Val 355 360 365 Arg Gln Phe Gly Val Pro Val Val Val Ala Ile Asn Gln Phe Ile Thr 370 375 380 Asp Thr Asp Glu Glu Met Ala Met Val Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ala 385 390 395 400 Gly Ala Glu Ala Val Leu Cys Ser His Trp Ala Asn Gly Ser Ala Gly 405 410 415 Thr Glu Glu Leu Ala Arg Lys Val Val Ala His Ala Glu Ser Gly Ser 420 425 430 Ser Asn Phe Ala Pro Leu Tyr Glu Asp Ser Met Pro Leu Phe Glu Lys 435 440 445 Ile Asp Thr Ile Ala Lys Arg Ile Tyr Arg Ala Thr Glu Ala Thr Ala 450 455 460 Asp Ser Ser Val Arg Asn Lys Leu Lys Gly Trp Glu Ala Asp Gly Phe 465 470 475 480 Gly His Leu Pro Val Cys Met Ala Lys Thr Gln Tyr Ser Phe Ser Thr 485 490 495 Asp Pro Ala Leu Arg Gly Ala Pro Thr Asp His Val Val Pro Val Arg 500 505 510 Asp Val Ile Leu Ser Ala Gly Ala Glu Phe Ile Val Ala Val Cys Gly 515 520 525 Asp Ile Met Arg Met Pro Gly Leu Pro Lys Val Pro Ser Ala Asp Phe 530 535 540 Ile Lys Leu Asp Glu Gln Gly Gln Ile Gln Gly Leu Phe 545 550 555

【００３３】 配列番号：２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉ
ｌｉｓ 株名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌ
ｉｓ ＳＹＫ−６ 配列： ATGGCACAAG GCTCCGATAT CGAGATCGCC CGCGAAGAAA GGATGCAGAA TATCGCGGAG 60 GTCGGCGCGA AAGTCGGCAT CCCGCAGGAC GCGCTGCTGA ACTACGGCCC CTACAAGGCC 120 AAGCTGAGCT GGGACTTCAT CAACAGCGTT CAGGGCAACC AGGACGGCAA GCTGATCCTC 180 GTCACCGCGA TCAACCCGAC GCCGGCCGGC GAAGGCAAGA CCACGACCAC CGTGGGCCTG 240 GCCGACGGCC TCAACCGCAT CGGCAAGAAG ACCGTGGCGG CGCTGCGCGA GCCTTCGCTC 300 GGCCCCTGTT TCGGCGTGAA GGGCGGCGCG GCCGGCGGCG GCTATGCGCA GGTCGTGCCG 360 ATGGAGGACA TCAACCTTCA CTTCACCGGT GACTTCCATG CCATCACCTC GGCGAACAAC 420 CTGCTCGCCG CGCTGATCGA CAACCACATC TACTGGGGCA ACAAGCTCGG CCTCGATCCG 480 CGCCGCATCG CATGGCGCCG CGTGCTCGAC ATGAACGACC GGGTGCGCTC GATCGTCAAT 540 TCGCTGGGCG GCGTCTCGAA TGGCTATCCG CGCGAGGACG GCTTCGACAT CACCGTGGCT 600 TCGGAAGTCA TGGCGATCCT GTGCCTTTCC TCGGACCTCA AGGACCTCGA GCGGCGCCTC 660 GGCAACATCC ACGCCGGCTA CACGCGCGAG CGCAAGGCCG TGCTGGCCAG CGAGCTGAAT 720 GCCTCGGGCG CCATGACCGT GCTGCTCAAG GACGCGCTGC AGCCGAACAT GGTGCAGACG 780 CTGGAGAATA ATCCGGTGCT CATCCATGGC GGCCCGTTCG CGAACATCGC GCATGGCTGC 840 AACTCGGTGC TCGCCACCAA GACCGCGCTC AAGATCGCCG ATTATGTGGT GACGGAAGCC 900 GGCTTCGGTG CCGACCTGGG TGCGGAGAAG TTCTTCGACA TCAAATGCCG CAAGGCGGGC 960 CTCAAGCCCT CGGCCGCAGT GATCGTGGCG ACGATCCGCG CGCTCAAGAT GCATGGCGGC 1020 GTCGACAAGG CCGATCTCGG CACGGCGAAC CCGGAGGCGG TCCGCAAGGG CGGCGTCAAT 1080 CTCGCTCGCC ACATCGAGAA TGTCCGCCAG TTCGGCGTGC CGGTGGTGGT CGCGATCAAC 1140 CAGTTCATCA CGGACACCGA CGAGGAAATG GCCATGGTGA AGGAAATCGC CGAGGCCGCG 1200 GGCGCCGAGG CGGTACTGTG CAGCCACTGG GCCAACGGCT CGGCCGGCAC CGAGGAACTG 1260 GCGCGCAAGG TCGTCGCGCA CGCCGAGAGC GGTTCGTCCA ACTTCGCGCC GCTCTATGAA 1320 GACAGCATGC CGCTGTTCGA GAAGATCGAC ACGATCGCCA AGCGCATCTA CCGCGCGACC 1380 GAGGCCACGG CGGACAGCAG CGTGCGCAAC AAGCTCAAGG GCTGGGAAGC GGACGGCTTC 1440 GGCCATCTGC CGGTCTGCAT GGCCAAGACG CAGTACAGCT TCTCGACCGA CCCGGCGCTG 1500 CGCGGCGCCC CGACCGACCA TGTCGTGCCC GTGCGCGACG TGATCCTCTC GGCCGGCGCG 1560 GAGTTCATCG TGGCGGTCTG CGGCGACATC ATGCGCATGC CCGGCCTGCC CAAGGTCCCC 1620 TCGGCAGACT TCATCAAGCT CGACGAGCAG GGCCAGATCC AGGGCCTGTT C 1671

【００３４】 配列番号：３ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉ
ｌｉｓ 株名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌ
ｉｓ ＳＹＫ−６ 配列: ATG GCA CAA GGC TCC GAT ATC GAG ATC GCC CGC GAA GAA AGG ATG CAG 48 Met Ala Gln Gly Ser Asp Ile Glu Ile Ala Arg Glu Glu Arg Met Gln 1 5 10 15 AAT ATC GCG GAG GTC GGC GCG AAA GTC GGC ATC CCG CAG GAC GCG CTG 96 Asn Ile Ala Glu Val Gly Ala Lys Val Gly Ile Pro Gln Asp Ala Leu 20 25 30 CTG AAC TAC GGC CCC TAC AAG GCC AAG CTG AGC TGG GAC TTC ATC AAC 144 Leu Asn Tyr Gly Pro Tyr Lys Ala Lys Leu Ser Trp Asp Phe Ile Asn 35 40 45 AGC GTT CAG GGC AAC CAG GAC GGC AAG CTG ATC CTC GTC ACC GCG ATC 192 Ser Val Gln Gly Asn Gln Asp Gly Lys Leu Ile Leu Val Thr Ala Ile 50 55 60 AAC CCG ACG CCG GCC GGC GAA GGC AAG ACC ACG ACC ACC GTG GGC CTG 240 Asn Pro Thr Pro Ala Gly Glu Gly Lys Thr Thr Thr Thr Val Gly Leu 65 70 75 80 GCC GAC GGC CTC AAC CGC ATC GGC AAG AAG ACC GTG GCG GCG CTG CGC 288 Ala Asp Gly Leu Asn Arg Ile Gly Lys Lys Thr Val Ala Ala Leu Arg 85 90 95 GAG CCT TCG CTC GGC CCC TGT TTC GGC GTG AAG GGC GGC GCG GCC GGC 336 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Cys Phe Gly Val Lys Gly Gly Ala Ala Gly 100 105 110 GGC GGC TAT GCG CAG GTC GTG CCG ATG GAG GAC ATC AAC CTT CAC TTC 384 Gly Gly Tyr Ala Gln Val Val Pro Met Glu Asp Ile Asn Leu His Phe 115 120 125 ACC GGT GAC TTC CAT GCC ATC ACC TCG GCG AAC AAC CTG CTC GCC GCG 432 Thr Gly Asp Phe His Ala Ile Thr Ser Ala Asn Asn Leu Leu Ala Ala 130 135 140 CTG ATC GAC AAC CAC ATC TAC TGG GGC AAC AAG CTC GGC CTC GAT CCG 480 Leu Ile Asp Asn His Ile Tyr Trp Gly Asn Lys Leu Gly Leu Asp Pro 145 150 155 160 CGC CGC ATC GCA TGG CGC CGC GTG CTC GAC ATG AAC GAC CGG GTG CGC 528 Arg Arg Ile Ala Trp Arg Arg Val Leu Asp Met Asn Asp Arg Val Arg 165 170 175 TCG ATC GTC AAT TCG CTG GGC GGC GTC TCG AAT GGC TAT CCG CGC GAG 576 Ser Ile Val Asn Ser Leu Gly Gly Val Ser Asn Gly Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 GAC GGC TTC GAC ATC ACC GTG GCT TCG GAA GTC ATG GCG ATC CTG TGC 624 Asp Gly Phe Asp Ile Thr Val Ala Ser Glu Val Met Ala Ile Leu Cys 195 200 205 CTT TCC TCG GAC CTC AAG GAC CTC GAG CGG CGC CTC GGC AAC ATC CAC 672 Leu Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Glu Arg Arg Leu Gly Asn Ile His 210 215 220 GCC GGC TAC ACG CGC GAG CGC AAG GCC GTG CTG GCC AGC GAG CTG AAT 720 Ala Gly Tyr Thr Arg Glu Arg Lys Ala Val Leu Ala Ser Glu Leu Asn 225 230 235 240 GCC TCG GGC GCC ATG ACC GTG CTG CTC AAG GAC GCG CTG CAG CCG AAC 768 Ala Ser Gly Ala Met Thr Val Leu Leu Lys Asp Ala Leu Gln Pro Asn 245 250 255 ATG GTG CAG ACG CTG GAG AAT AAT CCG GTG CTC ATC CAT GGC GGC CCG 816 Met Val Gln Thr Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Ile His Gly Gly Pro 260 265 270 TTC GCG AAC ATC GCG CAT GGC TGC AAC TCG GTG CTC GCC ACC AAG ACC 864 Phe Ala Asn Ile Ala His Gly Cys Asn Ser Val Leu Ala Thr Lys Thr 275 280 285 GCG CTC AAG ATC GCC GAT TAT GTG GTG ACG GAA GCC GGC TTC GGT GCC 912 Ala Leu Lys Ile Ala Asp Tyr Val Val Thr Glu Ala Gly Phe Gly Ala 290 295 300 GAC CTG GGT GCG GAG AAG TTC TTC GAC ATC AAA TGC CGC AAG GCG GGC 960 Asp Leu Gly Ala Glu Lys Phe Phe Asp Ile Lys Cys Arg Lys Ala Gly 305 310 315 320 CTC AAG CCC TCG GCC GCA GTG ATC GTG GCG ACG ATC CGC GCG CTC AAG 1008 Leu Lys Pro Ser Ala Ala Val Ile Val Ala Thr Ile Arg Ala Leu Lys 325 330 335 ATG CAT GGC GGC GTC GAC AAG GCC GAT CTC GGC ACG GCG AAC CCG GAG 1056 Met His Gly Gly Val Asp Lys Ala Asp Leu Gly Thr Ala Asn Pro Glu 340 345 350 GCG GTC CGC AAG GGC GGC GTC AAT CTC GCT CGC CAC ATC GAG AAT GTC 1104 Ala Val Arg Lys Gly Gly Val Asn Leu Ala Arg His Ile Glu Asn Val 355 360 365 CGC CAG TTC GGC GTG CCG GTG GTG GTC GCG ATC AAC CAG TTC ATC ACG 1152 Arg Gln Phe Gly Val Pro Val Val Val Ala Ile Asn Gln Phe Ile Thr 370 375 380 GAC ACC GAC GAG GAA ATG GCC ATG GTG AAG GAA ATC GCC GAG GCC GCG 1200 Asp Thr Asp Glu Glu Met Ala Met Val Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ala 385 390 395 400 GGC GCC GAG GCG GTA CTG TGC AGC CAC TGG GCC AAC GGC TCG GCC GGC 1248 Gly Ala Glu Ala Val Leu Cys Ser His Trp Ala Asn Gly Ser Ala Gly 405 410 415 ACC GAG GAA CTG GCG CGC AAG GTC GTC GCG CAC GCC GAG AGC GGT TCG 1296 Thr Glu Glu Leu Ala Arg Lys Val Val Ala His Ala Glu Ser Gly Ser 420 425 430 TCC AAC TTC GCG CCG CTC TAT GAA GAC AGC ATG CCG CTG TTC GAG AAG 1344 Ser Asn Phe Ala Pro Leu Tyr Glu Asp Ser Met Pro Leu Phe Glu Lys 435 440 445 ATC GAC ACG ATC GCC AAG CGC ATC TAC CGC GCG ACC GAG GCC ACG GCG 1392 Ile Asp Thr Ile Ala Lys Arg Ile Tyr Arg Ala Thr Glu Ala Thr Ala 450 455 460 GAC AGC AGC GTG CGC AAC AAG CTC AAG GGC TGG GAA GCG GAC GGC TTC 1440 Asp Ser Ser Val Arg Asn Lys Leu Lys Gly Trp Glu Ala Asp Gly Phe 465 470 475 480 GGC CAT CTG CCG GTC TGC ATG GCC AAG ACG CAG TAC AGC TTC TCG ACC 1488 Gly His Leu Pro Val Cys Met Ala Lys Thr Gln Tyr Ser Phe Ser Thr 485 490 495 GAC CCG GCG CTG CGC GGC GCC CCG ACC GAC CAT GTC GTG CCC GTG CGC 1536 Asp Pro Ala Leu Arg Gly Ala Pro Thr Asp His Val Val Pro Val Arg 500 505 510 GAC GTG ATC CTC TCG GCC GGC GCG GAG TTC ATC GTG GCG GTC TGC GGC 1584 Asp Val Ile Leu Ser Ala Gly Ala Glu Phe Ile Val Ala Val Cys Gly 515 520 525 GAC ATC ATG CGC ATG CCC GGC CTG CCC AAG GTC CCC TCG GCA GAC TTC 1632 Asp Ile Met Arg Met Pro Gly Leu Pro Lys Val Pro Ser Ala Asp Phe 530 535 540 ATC AAG CTC GAC GAG CAG GGC CAG ATC CAG GGC CTG TTC 1671 Ile Lys Leu Asp Glu Gln Gly Gln Ile Gln Gly Leu Phe 545 550 555

【図面の簡単な説明】

【図１】 組換えプラスミドｐＤＥ２０、ｐＤＥ０１、
ｐＤＥ０２、ｐＤＥ０３、ｐＤＥ０４、ｐＤＥ０５、ｐ
ＤＥ０６およびｐＤＥ０２１の構造図、およびそれらの
組換えプラスミドの作製過程を示す。各制限酵素認識部
位は説明に必要なもののみを記載している。

【図２】 組換えプラスミドｐＤＥＭＣ０５の構造図、
および該組換えプラスミドの作製過程を示す。各制限酵
素認識部位は説明に必要なもののみを記載している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列で表
   わされる、バニリン酸およびシリンガ酸のメチル基の脱
   離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を含有するＤ
   ＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列で表わさ
   れる遺伝子であって、バニリン酸およびシリンガ酸のメ
   チル基の脱離反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を
   含有するＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 シュードモナス ポーシモビリスＳＹＫ
   −６株に由来する、バニリン酸およびシリンガ酸のメチ
   ル基の脱離反応を触媒する酵素の遺伝子を含有するＤＮ
   Ａ断片。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３記載のＤＮＡ断片
   が組み込まれた組換え体ベクターを保有する形質転換体
   細胞。
5. 【請求項５】 エッシェリキア コリＭＶ１１９０（ｐ
   ＤＥ０５）（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１１）である請求項
   ４記載の形質転換体細胞。