CN117448361A - 一种产异源碱性蛋白酶的重组菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产异源碱性蛋白酶的重组菌株，含有组合DNA片段，所述组合DNA片段含有2个串联的启动子、信号肽和碱性蛋白基因，筛选优化后的双启动子及信号肽对外源基因进行调控表达，能更好的提高碱性蛋白酶的表达水平。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种产异源碱性蛋白酶的重组菌株。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶。根据蛋白酶的来源可分为动物性蛋白酶、植物性蛋白酶以及微生物蛋白酶。相对于动物蛋白酶和植物蛋白酶，微生物来源的蛋白酶作用范围广，水解底物种类多。微生物来源的蛋白酶根据其最适反应pH环境可将蛋白酶分为酸性、中性和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是一类在碱性条件下水解蛋白质的酶类，碱性蛋白酶因具有较强的水解能力，广泛的应用于食品、洗涤、饲料等工业领域。生物来源的碱性蛋白酶在发酵酶活水平及应用性能方面均有待提高，如何提高碱性蛋白酶产品的竞争力，是急待解决的问题。
不同来源的碱性蛋白酶基因，其对应分泌表达的碱性蛋白酶的酶学性质以及应用性能各不相同，通过挖掘筛选，可以得到酶特性及应用性能提高的碱性蛋白酶基因；启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，通过启动子的优化，来提高外源蛋白的分泌量，从而实现外源蛋白的高效表达；信号肽也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。专利CN110106128A公开了一种生产重组碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法，该专利选用Ply-2+SPDacB与克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因构建重组表达载体，转入解淀粉芽孢杆菌中得到重组菌株，最终得到的重组菌株摇瓶酶活最高达18000U/mL，5L发酵罐最高达58000U/mL。专利CN 109022401 A公开了一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法，该专利将地衣芽胞杆菌来源的嗜碱性蛋白酶基因克隆到重组表达载体，得到重组菌株，该重组酶具有良好的pH稳定性，在37℃、pH12.0下保温1h后还有90％以上的酶活，摇瓶发酵酶活达575U/mL。专利CN108570477A公开了一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，该专利将一酶活高的碱性蛋白酶Bmp-opt基因在不同启动子信号肽的调控下，在重组枯草芽孢杆菌菌株中表达，得到重组菌株，其在最优启动子信号肽的调控下，摇瓶酶活最高达1100U/mL，20L发酵罐最高达12000U/mL。目前已有的异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌株的调控元件基本都为单启动子，用双启动子进行调控表达的研究很少。
发明内容
针对现有技术中的微生物碱性蛋白酶表达量低的问题，本发明提供了一种产异源碱性蛋白酶的重组菌株。
本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种组合DNA片段，所述组合DNA片段含有2个串联的启动子、信号肽和碱性蛋白基因，所述的信号肽选自SPamyE或SPamyQ，所述的启动子选自PHpaII、PamyQ、PpLY2和P43中的两个。
优选地，所述的2个串联的启动子和信号肽为PHpaII+PamyQ+SPamyQ。
优选地，所述的PHpaII+PamyQ+SPamyQ的核苷酸序列包含SEQ ID NO.1所述，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.1所示的序列或者由SEQ ID NO.1所示的序列组成。
优选地，所述的碱性蛋白基因为aprE，包含SEQ ID NO.2所示的序列，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.2所示的序列，或者由SEQ ID NO.2所示的序列组成。
第二方面，本发明提供了一种重组表达载体，包含所述的组合DNA片段。
优选地，所述的表达载体选自PHY300PLK、pMA5、PT49中的一种，优选为PHY300PLK，
优选的，重组表达载体为PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SpamyQ。
第三方面，本发明提供一种基因工程菌，包含所述的表达载体或基因组中整合有所述的组合DNA片段。
优选地，所述基因工程菌表达碱性蛋白，所述碱性蛋白的氨基酸序列包含如SEQID NO.3所示的序列，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.3所示的序列，或者由SEQ ID NO.3所示的序列组成，更优选的，基因工程菌为PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-SCK6。
优选地，所述基因工程菌选自芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，进一步优选为枯草芽孢杆菌SCK6、枯草芽孢杆菌WB800N、地衣芽孢杆菌2709、地衣芽孢杆菌20204中的一种，更优选为枯草芽孢杆菌SCK6。
优选地，所述基因工程菌为含有重组表达载体PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SpamyQ的枯草芽孢杆菌SCK6。
第四方面，本发明提供了一种基因工程菌的构建方法，将所述的重组表达载体转化到宿主细胞中或将所述的组合DNA片段整合到宿主细胞的染色体基因组中。
第五方面，本发明提供了所述的基因工程菌在发酵生产碱性蛋白酶中的用途。
第六方面，本发明提供了一种发酵生产碱性蛋白酶的方法，包括：将所述的基因工程菌进行发酵得到。
优选地，其中，将基因工程菌的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养得到。
优选地，其中，所述发酵培养基含有蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾；
优选地，以发酵培养基为总量计，所述蛋白胨为10g/L-15g/L，所述酵母粉为22g/L-26g/L，所述甘油为8g/L-12g/L，所述磷酸氢二钾为20g/L-23g/L，所述磷酸二氢钾为1.9g/L-2.5g/L。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株可以稳定发酵生产碱性蛋白酶的基因工程菌株及其构建方法，使用了筛选优化后的双启动子及信号肽对外源基因进行调控表达，能更好的提高碱性蛋白酶的表达水平。
附图说明
图1所示为实施例3中重组菌株表达碱性蛋白酶的酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实验材料及培养基
1.生物材料
大肠杆菌Top10购于生工生物工程(上海)股份有限公司，枯草芽孢杆菌SCK6购于上海钦诚生物科技有限公司，载体骨架pMA5、PT49和PHY300PLK均购于http://www.bio-sci.com.cn/宝赛生物，枯草芽孢杆菌WB800N购于上海钦诚生物科技有限公司，地衣芽孢杆菌20204购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
2.酶与试剂
本发明实施例中所用的酶与试剂来源信息如下表1所示。
表1本发明所用酶及试剂厂商
3.培养基
LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，pH 7.0)；
发酵TB培养基(12g/L蛋白胨，24g/L酵母粉，10g/L甘油，21.52g/L磷酸氢二钾，2.32g/L磷酸二氢钾)；
大肠杆菌感受态制备培养基：
洗涤培养基(0.1mol/L CaCl2)；
悬浮培养基(0.1mol/L CaCl2，20％甘油)；
枯草芽孢杆菌感受态培养基：
LBS培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，0.5mol/L山梨醇，pH7.0)；
电转培养基(0.5mol/L山梨醇、0.5mol/L甘露醇、10g/L甘油，pH＝7.0)；
复苏培养基(LB培养基，0.5mol/L山梨醇、0.38mol/L甘露醇，pH＝7.0)；
本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB1886.174—2016附录A中福林酚法进行，即为1g或1mL酶，在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
实施例1碱性蛋白酶重组载体的构建
分别将核苷酸序列如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：7所示的四种不同的启动子PHpall、PamyQ、PpLY2、P43，核苷酸序列如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：9所示的两种不同的信号肽SPamyE_、SPamyQ和购于宝赛生物的三种不同的载体骨架PHY300PLK、pMA5、PT49来进行组合搭配，得到不同的双启动子、信号肽和载体骨架的组合，得到的重组质粒为PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-aprE，其中启动子和信号肽的组合PHpaII+PamyQ+SPamyQ的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
按照枯草芽孢杆菌密码子进行优化，通过全基因合成技术(武汉奥科鼎盛生物科技有限公司)获得SEQ ID NO：2所示的解淀粉芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3)，得到重组质粒pUC57-aprE。
以重组质粒pUC57-aprE为模板，以P1/P2为引物(引物序列参考表3)，PCR扩增获得aprE基因片段；以质粒PHY-PHpaII-PamyQ-SPamyQ为模板，以P3/P4为引物(引物序列参考表3)，PCR扩增获得载体骨架。利用Gibson双片段组装试剂盒进行重组载体的构建，连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，转化菌液涂布于LB(含Amp 100μg/mL)。过夜培养后挑取转化子进行菌落PCR验证，提取阳性转化子质粒外送测序，得到重组表达质粒PHY-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-aprE，其它重组质粒的构建方法相同，重组质粒见表4，命名方式为：表达载体-启动子-启动子-信号肽-碱性基因。
扩增目的基因时所用的反应体系为50μL，如下所示：
表2PCR反应体系
PCR扩增条件：98℃30s；98℃10s，56℃15s，72℃1min/2kb，32cycles；72℃5min。
重组表达质粒的组装反应按照Gibson双片段组装试剂盒中的说明书进行操作构建。
表3所用引物序列
表4重组质粒
| 序号 | 重组质粒 |
| 1 | PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-aprE |
| 2 | PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-aprE |
| 3 | PHY300PLK-PHpaII-P43-SPamyQ-aprE |
| 4 | PHY300PLK-PHpaII-P43-SPamyQ-aprE |
| 5 | pMA5-PHpaII-PHpaII-SPamyE-aprE |
| 6 | pMA5-PHpaII-PpLY2-SPamyQ-aprE |
| 7 | pMA5-P43-P43-SPamyQ-aprE |
| 8 | pMA5-PamyQ-P43-SPamyQ-aprE |
| 9 | PT49-P43-PHpaII-SPamyE-aprE |
| 10 | PT49-P43-PHpaII-SPamyE-aprE |
PHpaII+PamyQ+SPamyQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
GTTCGGATTCATCTATGGGAGGCAAGTGATGAAGGCTGGCGCTCTCGTAGTAATGATTCACCGGTTTGTACAGGTGCGGAGTCGTTTATTGCTGGTACTGCTAGTTGCCGCATTGAAGTAGAGGGAATTGATGAATTATATCAACATATTAAGCCTTTGGGCATTTTGCACCCCAATACATCATTAAAAGATCAGTGGTGGGATGAACGAGACTTTGCAGTAATTGATCCCGACAACAATTTGATTAGCTTTTTTCAACAAATAAAAAGCTAAAATCTATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGCGCGATTGCTGAATAAAAGATACGAGAGACCTCTCTTGTATCTTTTTTATTTTGAGTGGTTTTGTCCGTTACACTAGAAAACCGAAAGACAATAAAAATTTTATTCTTGCTGAGTCTGGCTTTCGGTAAGCTAGACAAAACGGACAAAATAAAAATTGGCAAGGGTTTAAAGGTGGAGATTTTTTGAGTGATCTTCTCAAAAAATACTACCTGTCCCTTGCTGATTTTTAAACGAGCACGAGAGCAAAACCCCCCTTTGCTGAGGTGGCAGAGGGCAGGTTTTTTTGTTTCTTTTTTCTCGTAAAAAAAAGAAAGGTCTTAAAGGTTTTATGGTTTTGGTCGGCACTGCCGACAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTGTTATACTTTACTTGGAAGTGGTTGCCGGAAAGAGCGAAAATGCCTCACATTTGTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATGGCGGCGTTCTGTTTCTGCTTCGGTATGTGATTGTGAAGCTGGCTTACAGAAGAGCGGTAAAAGAAGAAATAAAAAAGAAATCATCTTTTTTGTTTGGAAAGCGAGGGAAGCGTTCACAGTTTCGGGCAGCTTTTTTTATAGGAACATTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTTAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCACATCGGTTTGAAAGGAGGAAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGAATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAA
aprE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
GTTAGAGGCAAAAAAGTTTGGATTTCACTTCTGTTTGCACTTGCACTTATTTTTACAATGGCATTTGGCAGCACAAGCTCAGCACAGGCGGCAGGAAAAAGCAATGGAGAAAAGAAATATATCGTGGGATTCAAACAGACAATGTCAACAATGTCAGCGGCAAAAAAGAAAGATGTTATTAGCGAAAAGGGAGGAAAAGTTCAGAAACAATTCAAATATGTCGACGCAGCAAGCGCGACACTGAATGAAAAAGCAGTGAAAGAACTTAAAAAGGACCCTTCAGTTGCGTATGTTGAAGAAGATCATGTTGCGCATGCATACGCTCAAAGCGTTCCGTATGGCGTTTCACAGATTAAGGCACCGGCGCTGCATTCACAGGGATATACAGGCAGCAATGTGAAAGTGGCAGTGATTGATAGCGGAATTGATAGCTCACATCCGGATCTGAAAGTTGCGGGCGGCGCAAGCATGGTTCCGTCAGAAACAAATCCGTTTCAGGATAATAATAGCCATGGAACACATGTGGCAGGCACAGTTGCGGCACTGAATAATAGCATTGGAGTTCTGGGAGTTGCACCGAGCGCAAGCCTGTATGCAGTTAAAGTTCTTGGAGCAGATGGATCAGGACAATATAGCTGGATTATTAATGGAATTGAGTGGGCAATTGCAAATAATATGGATGTTATTAACATGAGCCTGGGAGGCCCGTCAGGCTCAGCAGCGCTGAAAGCAGCAGTTGATAAAGCAGTTGCGAGCGGAGTTGTGGTTGTTGCAGCAGCGGGAAATGAAGGAACATCAGGATCATCAAGCACAGTTGGCTATCCGGGCAAATATCCGAGCGTTATTGCGGTGGGAGCAGTGGATTCATCAAATCAAAGAGCGAGCTTTTCATCAGTGGGACCGGAACTGGATGTTATGGCGCCGGGAGTTAGCATTCAAAGCACACTGCCGGGCAATAAGTATGGCGCGTATAATGGCACAAGCATGGCGTCACCGCATGTTGCAGGAGCAGCGGCGCTGATTCTGTCAAAACATCCGAATTGGACAAATACACAGGTGAGATCAAGCCTGGAAAATACAACAACAAAACTTGGAGATTCATTCTATTACGGAAAAGGCCTTATTAATGTGCAAGCAGCGGCGCAGTAA
aprE的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
VRGKKVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ
PHpaII启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
GTTCGGATTCATCTATGGGAGGCAAGTGATGAAGGCTGGCGCTCTCGTAGTAATGATTCACCGGTTTGTACAGGTGCGGAGTCGTTTATTGCTGGTACTGCTAGTTGCCGCATTGAAGTAGAGGGAATTGATGAATTATATCAACATATTAAGCCTTTGGGCATTTTGCACCCCAATACATCATTAAAAGATCAGTGGTGGGATGAACGAGACTTTGCAGTAATTGATCCCGACAACAATTTGATTAGCTTTTTTCAACAAATAAAAAGCTAAAATCTATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGCGCGATTGCTGAATAAAAGATACGAGAGACCTCTCTTGTATCTTTTTTATTTTGAGTGGTTTTGTCCGTTACACTAGAAAACCGAAAGACAATAAAAATTTTATTCTTGCTGAGTCTGGCTTTCGGTAAGCTAGACAAAACGGACAAAATAAAAATTGGCAAGGGTTTAAAGGTGGAGATTTTTTGAGTGATCTTCTCAAAAAATACTACCTGTCCCTTGCTGATTTTTAAACGAGCACGAGAGCAAAACCCCCCTTTGCTGAGGTGGCAGAGGGCAGGTTTTTTTGTTTCTTTTTTCTCGTAAAAAAAAGAAAGGTCTTAAAGGTTTTATGGTTTTGGTCGGCACTGCCGACAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTGTTATACTTTACTTGGAAGTGGTTGCCGGAAAGAGCGAAAATGCCTCACATTTGTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACAT
PamyQ启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
GGCGGCGTTCTGTTTCTGCTTCGGTATGTGATTGTGAAGCTGGCTTACAGAAGAGCGGTAAAAGAAGAAATAAAAAAGAAATCATCTTTTTTGTTTGGAAAGCGAGGGAAGCGTTCACAGTTTCGGGCAGCTTTTTTTATAGGAACATTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTTAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCACATCGGTTTGAAAGGAGGAAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGA
PpLY2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
CATTATGTTTGAATTTCCGTTTAAAGAATGGGCTGCAAGCCTTGTGTTTTTGTTCATCATTATCTTATATTACTGCATCAGGGCTGCGGCATCCGGAATGCTCATGCCGAGAATAGACACCAAAGAAGAACTGCAAAAACGGGTGAAGCAGCAGCGAATAGAATCAATTGCGGTCGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTTACGATGTACGACAGGGGGATTCCCCATACATTCTTCGCTTGGCTGAAAATGATTCTTCTTTTTATCGTCTGCGGCGGCGTTCTGTTTCTGCTTCGGTATGTGATTGTGAAGCTGGCTTACAGAAGAGCGGTAAAAGAAGAAATAAAAAAGAAATCATCTTTTTTGTTTGGAAAGCGAGGGAAGCGTTCACAGTTTCGGGCAGCTTTTTTTATAGGAACATTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTGTGATAATTTTAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCACATCGGTTTGAAAGGAGGAAGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGA
P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
TGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAGCCATTGAACATACGGTTGATTTAATAACTGACAAACATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAGGACGCTGCCGCCGGGGCTGTTTGCGTTTTTACCGTGATTTCGTGTATCATTGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGCTGTAATGGCTGAAAATTCTTACATTTATTTTACATTTTTAGAAATGGGCGTGAAAAAAAGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC
SPamyE信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAAACGGCGAACAAATCGAATGAGCTTACA
SPamyQ信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：
ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAA
实施例2分泌表达碱性蛋白酶重组菌株的构建
从上述构建好的大肠杆菌重组工程菌株中提取构建好的表4中所示的重组质粒，将重组质粒电转至三种不同的表达宿主(枯草芽孢杆菌SCK6、WB800N，地衣芽孢杆菌20204)，电转化方法如下：
(1)将置于75％乙醇中保存的2mm电转杯取出，于紫外下照射并风干20min，再置于冰上预冷备用；
(2)无菌条件下吸取约1μg质粒DNA至100μL感受态细胞中，于冰上静置约20min；
(3)将感受态细胞吸至电转杯中，2.5kV条件下点击4-6ms，电击完后立刻加入1mL复苏培养基，于37℃、100rpm条件下复苏培养3h，在抗性板上涂布，37℃过夜培养。
经过全部转化表达三种不同的表达宿主后(枯草芽孢杆菌SCK6、枯WB800N，地衣芽孢杆菌20204)，最终筛选出了一株效果最好的枯草SCK6重组菌株PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SPamyQ-SCK6。
构建好的分泌表达碱性蛋白重组菌株见下表5，命名方式为：表达载体-启动子-启动子-信号肽-碱性基因-宿主菌株。
表5
实施例3重组菌株碱性蛋白酶的表达及分析
将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌在抗性LB平板上划线，得到单菌落，挑取单菌落至含LB试管中37℃、200rpm过夜培养，得到一级种子培养液，将一级种子培养液按1％接种量接种至50mL LB培养基中，于37℃、200rpm过夜培养，得到二级种子液，最后将二级种子培养液按1％接种量接种至50mL TB培养基中，持续发酵取样，跟踪检测发酵过程中的生物量以及蛋白酶酶活，见表6。
按照国家标准GB1886.174—2016附录A中福林酚法对重组基因工程菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶的酶活进行检测。结果如下表6中所示，其以PHY300PLK为骨架，在PHpaII-PamyQ-SamyQ启动子信号肽的调控下，该SCK6重组菌株摇瓶发酵168h碱性蛋白酶酶活达到324U/mL。
将上述以PHY300PLK为骨架、在PHpaII-PamyQ-SamyQ启动子信号肽的调控下、枯草芽孢杆菌SCK6重组菌株放大至50L发酵罐进行发酵验证，其发酵44h最高酶活可达1811U/mL。
表6重组菌株表达碱性蛋白酶的酶活(单位：U/mL)
实施例4重组碱性蛋白酶的应用实验分析
以大豆蛋白为原料，对得到的重组基因工程菌分泌表达的碱性蛋白酶的应用性能与地衣芽孢杆菌2709进行分析比对，具体操作如下：
(1)准确称取50g大豆分离蛋白四份并分装，按1:9的料水比加水450g至总重量500g，搅拌均匀；
(2)将样品置于55℃水浴锅中，开启搅拌预热，温度至55℃，分别添加蛋白酶(10万U/g)，酶解6h，酶解过程保持搅拌开启；
(3)酶解过程中控制反应温度在55℃，pH自然，酶解结束，90℃以上灭酶15min；
(4)冷切至常温后进行离心，4500rpm，10min，取清液；
(5)收集清液，浓缩6倍左右，检测浓缩液相关数据指标。
水解后肽段分布结果如表7所示，肽分子量分布中，2000以下的含量：地衣芽孢杆菌2709为85.85，枯草芽孢杆菌SCK6为89.48，均超过80％；且在1000以下的分布中，枯草芽孢杆菌SCK6为81.38％，明显高于地衣芽孢杆菌2709的68.67％。
表7水解肽段分布
水解后总氮、氨氮、粗蛋白、酸溶蛋白、游离氨基酸含量如表8所示，枯草芽孢杆菌SCK6的蛋白酶收率略大于地衣芽孢杆菌2709，游离氨基酸(折干)均低于10，酶解效果显示枯草芽孢杆菌SCK6＞地衣芽孢杆菌2709。
表8水解总氮、氨氮、粗蛋白、酸溶蛋白、游离氨基酸含量
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (14)
1.一种组合DNA片段，其特征在于，所述组合DNA片段含有2个串联的启动子、信号肽和碱性蛋白基因，所述的信号肽选自SPamyE或SPamyQ，所述的启动子选自PHpaII、PamyQ、PpLY2和P43中的两个。
2.根据权利要求1所述的组合DNA片段，其特征在于，所述的2个串联的启动子和信号肽为PHpaII+PamyQ+SPamyQ。
3.根据权利要求2所述的组合DNA片段，其特征在于，所述的PHpaII+PamyQ+SPamyQ的核苷酸序列包含SEQ ID NO.1所述的序列，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.1所示的序列或者由SEQ ID NO.1所示的序列组成。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合DNA片段，其特征在于，所述的碱性蛋白基因为aprE，包含SEQ ID NO.2所示的序列，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.2所示的序列，或者由SEQ ID NO.2所示的序列组成。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的组合DNA片段。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体选自PHY300PLK、pMA5、PT49中的一种，优选为PHY300PLK，优选的，重组表达载体为PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SpamyQ。
7.一种基因工程菌，其特征在于，包含权利要求5-6任一项所述的表达载体或基因组中整合有权利要求1-4任一项所述的组合DNA片段。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达碱性蛋白，所述碱性蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的序列，其序列中有部分缺失、代替或修饰的SEQ ID NO.3所示的序列，或者由SEQ ID NO.3所示的序列组成。
9.根据权利要求7或8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌选自芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，进一步优选为枯草芽孢杆菌SCK6、枯草芽孢杆菌WB800N、地衣芽孢杆菌2709、地衣芽孢杆菌20204中的一种，更优选为枯草芽孢杆菌SCK6。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为含有重组表达载体PHY300PLK-PHpaII-PamyQ-SpamyQ的枯草芽孢杆菌SCK6。
11.权利要求7-10任一项所述的基因工程菌的构建方法，将权利要求5-6任一项所述的重组表达载体转化到宿主细胞中或将权利要求1-4任一项所述的组合DNA片段整合到宿主细胞的染色体基因组中。
12.一种发酵生产碱性蛋白酶的方法，包括：将权利要求7-9中任一项所述的基因工程菌进行发酵得到。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，将基因工程菌的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养得到。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述发酵培养基含有蛋白胨、酵母粉、甘油、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾；
优选地，以发酵培养基为总量计，所述蛋白胨为10g/L-15g/L，所述酵母粉为22g/L-26g/L，所述甘油为8g/L-12g/L，所述磷酸氢二钾为20g/L-23g/L，所述磷酸二氢钾为1.9g/L-2.5g/L。
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