KR101347685B1 - 신규 미생물, 그로부터 단리된 알긴산 분해 효소 및 그를 이용한 알긴산 당화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류에 다량 함유되어 있는 알긴산을 바이오연료로 활용하기 위하여, 알긴산 분해능이 있는 신규 Sphingomonas 속 균주 및 그로부터 분리된 알긴산 분해효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 그를 이용한 알긴산 당화방법을 제공한다.

Description

신규 미생물, 그로부터 단리된 알긴산 분해 효소 및 그를 이용한 알긴산 당화 방법{Novel microorganism, oligoalginate lyase isolated therefrom, method for saccharifying oligoalginates using the same}

본 발명은 신규 미생물, 그로부터 단리된 효소 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 신규 미생물, 그로부터 단리된 알긴산 분해 효소 및 그를 이용한 알긴산 당화 방법에 관한 것이다.

알긴산은 단량체인 글루로네이트(guluronate, G)와 마누로네이트(mannuronate, M)로 구성된 선형다당류로 갈조류와 일부 박테리아에 의해 생성된다. 높은 점성과 겔 형성능을 가지고 있어 식품과 제약 산업에서 널리 이용되며, 금속이온 존재 하에서 젤 비드를 형성하는 성질을 가지고 있어 동물세포 배양에서 고정화 배지로 사용할 수도 있다(Draget et al., "Alginate from Algae." in "Polysaccharides and polyamides in the food industry: properties, production, and patents." Eds. Steinbㆌchel, A. and Rhee, S. K., Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2005). 알긴산에서 만들어진 올리고당은 대식세포에서 사이토카인 생성을 향상시키고 사람의 각질세포(keratinocyte)와 내피세포(endothelial cell)의 성장과 같은 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Iwamoto et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67: 258-263, 2003; Iwamoto et al., FEBS Lett., 579: 4423-4429, 2005; Kawada et al., Arch. Dermatol. Res., 291: 542-547, 1999; Yamamoto et al., Carbohydr. Res., 342: 1133-1137, 2007). 한편, 병원성 P. aeruginosa는 아셀틸화 알긴산으로 생물막(biofilm)을 형성하며, 이를 통해 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자의 폐 감염시 효과적인 항생제 치료를 막는다. 분리된 아세틸화 알긴산을 이들 환자에 투여할 경우 이에 대한 항체 형성을 통해 이들 균에 대한 저항성을 유도하므로, 아세틸화 알긴산은 낭포성 섬유증 환자에서 Pseudomonas aeruginosa에 의한 폐 감염을 예방하기 위한 중요한 치료제 후보로 여겨지고 있다(Boyd and Chakrabarty, Appl. Environ. Microbiol., 60: 2355-2359, 1994; Ramsay et al., Mol. Microbiol., 56: 309-322, 2005).

알긴산 분해효소(Alginate lyase)는 알긴산을 분해하는 효소이다. 알긴산 분해효소는 베타-제거(β-elimination) 반응을 통해 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 자름으로써 알긴산을 올리고당류 및 단당류로 분해한다(Wong et al., Annu. Rev. Microbiol., 54: 289-340, 2000). 종래에 다양한 알긴산 분해효소들은 클로닝되었고 특성화되어 왔다(Cao et al., J. Agric. Food Chem., 55: 5113-5117, 2007; Gimmestad et al., J. Bacteriol., 191: 4845-4853, 2007; Han et al., Mitochondrial DNA, 15: 344-350, 2004; Iwamoto et al., Biosci. Biotehcnol. Biochem., 65: 133-142, 2001; Kawamoto et al., Mar. Biotechnol. 8: 481-490, 2006, Matsubara et al., J. Biosci. Bioeng., 89: 199-202 2000, Suzuki et al., Carbohydr. Res., 341: 1809-1819, 2006). 알긴산 분해효소에 의한 알긴산 분해방법은 내부형(endolytic-type)과 말단형(exolytic-type)으로 분류할 수 있다. 미생물 유래의 내부형 알긴산 분해효소는 알긴산을 이중결합을 가지는 이당류, 삼당류, 사당류 등 알긴산 올리고당으로 분해할 수 있다. 말단형 올리고알긴산 분해효소는 이중결합 또는 단일결합을 비환원말단에 가지는 알긴산 또는 올리고알긴산을 모두 인식하여, 이를 단일 또는 이중결합을 가지는 단당류로 분해할 수 있다고 보고된 바 있다(Ogura et al., Miyake et al., J. Mol. Biol. 380: 373-385; Yoon et al., J. Mol. Biol. 290: 505-514; Protein Expres. Purif., 29: 33-41, 2003).

현재 조류의 총 바이오매스의 20% 이상을 차지하고 있는 알긴산은 적절한 당화효소 및 당화공정의 부재로 인하여, 바이오연료 또는 바이오화합물의 생산을 위한 원료로 사용되지 않고 있는 실정이다. 알긴산을 분해하는데 활용할 수 있는 효소인 알긴산 분해효소에 대한 기존의 연구들은 미생물 등에서 알긴산 합성과 분해 과정에서 어떠한 역할을 수행하고, 단백질 구조가 어떠한지에 대한 연구가 주를 이루었다. 산업적 응용측면에서의 연구도 생리활성 작용이 있을 것으로 기대되는 알긴산 올리고당을 제조하는데 응용하는 것으로 국한되어 왔다. 자연계에 풍부하게 존재하는 알긴산을 이용하여 바이오연료 또는 바이오화합물 생산에 활용하기 위한 단당류로의 분해에 대한 기술 개발은 진행되지 못했다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 신규 미생물, 그로부터 단리된 알긴산 분해 효소 및 그를 이용한 알긴산 당화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 알긴산 분해능이 있는 신규 스핑고모나스(Sphingomonas)속 MJ-3 균주가 제공된다.

상기 신규 스핑고모나스 속 MJ-3 균주는 수탁번호 KCTC12026BP로 기탁된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 상동성이 적어도 70% 이상이고, 알긴산 분해능을 갖는 폴리펩티드가 제공된다. 이때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열과 적어도 상동성이 70% 이상이고 그에 의해 암호화된 폴리펩티드가 알긴산 분해능을 가질 수 있으며, 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터가 제공된다. 상기 벡터는, 플라스미드, 코스미드, 포스미드 또는 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC), 바이러스 벡터(viral vector), 포유동물 벡터(mammalian vector) 등일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 세포가 제공된다. 이때 상기 숙주세포는 세균, 진균세포, 식물세포, 곤충세포, 포유동물세포일 수 있고, 상기 세균은 그람음성균, 그람양성균, 남세균 또는 고세균일 수 있고, 상기 진균세포는 효모 또는 원생생물일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 작동가능하게 연결한 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환 숙주세포를 제조하는 단계; 상기 형질전환 숙주세포를 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 및 상기 배양된 숙주세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 상기 폴리펩티드의 생산방법이 제공된다. 이때, 상기 형질전환 숙주세포 배양단계 이후 또는 동시에 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 단계가 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 형질전환 세포, 상기 형질전환 세포의 배양액 또는 상기 폴리펩티드에 알긴산 또는 올리고알긴산을 접촉시키는 단계를 포함하는 알긴산의 당화방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 종래에 바이오연료로 활용되지 못한 알긴산을 당화시킴으로써, 바이오연료 및 바이오화합물의 생산을 위한 원료로 사용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 16S-23S rRNA 유전자간 전사 스페이서(intergenic transcribed spacer, ITS)의 구조(a) 및 Sphingomonas sp. MJ-3 균주와 다른 박테리아의 계통수(b)를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 배양 배지에 따른 생장곡선을 나타내는 그래프로서, a는 다양한 농도의 알긴산을 함유한 M19 배지에서의 생장곡선이고, b는 다양한 농도의 알긴산을 함유한 LB 배지에서의 생장곡선을 나타낸다. 생장정도는 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 정하였다.
도 3은 본 발명의 Sphingomonas sp. MJ-3 균주를 배양배지를 달리하여 배양한 후 분쇄한 분쇄물의 알긴산 분해능을 측정한 그래프로서, a는 다양한 농도의 알긴산을 함유한 M19 배지에서의 알긴산 분해활성을 나타내고, b는 다양한 농도의 알긴산을 함유한 LB 배지에서의 알긴산 분해활성을 나타낸다. 알긴산 분해활성은 235 nm에서의 흡광도를 측정하여 정하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소의 핵산서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 잔기 1 내지 20을 포함하는 박스는 신호 펩티드 서열을 의미하고, *는 종결코돈을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소와 다른 알긴산 분해효소 사이의 다중 서열 정렬을 나타낸 그림이다:
Avin_46500, Azotobacter vinelandii DJ 알긴산 분해효소;
MJ-3 Lyase, 본 발명의 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소;
Smal_2067, Stenotrophomonas maltophilia R551-3 균주 유래 헤파리나제 II/III 계 단백질
Smlt2602, Stenotrophomonas maltophilia K279a 잠재적 알긴산 분해효소;
Mmar10_0256, Maricaulis maris MCS10의 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질;
Sde_3284, Saccharophagus degradans 2-40의 이론상 단백질;
*, 고도로 보존된 잔기;
:, 단일 아미노산 치환이 발견되는 보전 정도가 매우 높은 잔기;
., 복수의 아미노산 치환이 발견되는 보전 정도가 약간 높은 잔기;
▼, 알긴산 분해 촉매반응에 중요한 아미노산 잔기; 및
●, 올리고알긴산 도메인.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소와 다른 알긴산 분해효소(atu3025, A1-Ⅳ 및 A1-Ⅳ')의 도메인 구조를 간략하게 나타낸 그림이다
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터인 pET21b(+)/MJ-3 로 형질전환된 대장균을 IPTG 유도 없이 배양한 후의 파쇄액(1번 레인), 상기 대장균을 IPTG로 유도하여 배양한 후의 파쇄액(2번 레인) 및 정제된 효소(3 μg 단백질 적재)에 대한 SDS-PAGE(왼쪽 판넬) 및 면역블롯팅 결과(오른쪽 판넬)를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소를 대장균에서 발현시켜 정제한 후, pH 조건(a) 및 온도 조건(b)에 따른 알긴산 분해활성을 측정한 결과는 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소를 대장균에서 발현시켜 정제한 후, 각종 기질에 대한 상대적 분해활성을 나타낸 그래프이다:
Alginate: 알긴산;
Poly-M: poly-M 블록;
Poly-G: poly-G 블록;
Poly-MG: poly-MG 블록;
Agar: 한천;
Agarose: 아가로스;
Starch: 녹말; 및
Heparin: 헤파린.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 알긴산 분해효소에 의한 알긴산 분해 과정을 보여주는 박막크로마토그램(a)와 반응 시간에 다른 최종 분해산물에 대한 FPLC 크로마토그램(b)이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sphingomonas sp. MJ-3 균주 유래의 재조합 알긴산 분해효소를 이용한 알긴산 당화 과정을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 알긴산을 분해하는 해양 박테리아의 선별 및 배양

알긴산을 분해하는 해양 박테리아는 염장 및 발효된 멸치젓갈을 갈조류에 넣어 발효한 것으로부터 분리했다. 미역은 발효된 젓갈과 함께 잘 혼합하여 해조류가 완전히 액화될 때까지 상온에 보관하였다. 발효된 액체는 순차적으로 증류수로 희석하여 0.8%(w/v) 알긴산이 포함된 M9 한천 평판배지에 배양하였다. 이를 20℃로 10일 동안 배양하고 기준 평판배지(master plate)로 4℃에 보관하였다. 색깔을 가진 몇몇의 콜로니들이 배지상에서 성장하였는데, 가장 빠른 성장속도를 가진 불투명하고 평평한 콜로니를 더 상세한 연구를 위해 선택하였다. 분리된 박테리아는 세포 성장에 있어서 알긴산의 영향을 분석하기 위하여 알긴산을 포함한 M9 배지 또는 LB 배지에서 배양하였다.

실시예 2: 분리된 균주의 분자적 특성과 화학적 분류

2-1: 생화학적 분석

상기 실시예 1에서 분리된 균주는 0.8%(w/v) 알긴산을 포함한 M9 한천 평판배지에서 25℃로 표준 희석-평판 기술(standard dilution-plating technique)을 이용하여 분리하였다. 분리된 균주는 연한 노란색을 띠었으며, 그람 염색 수행 결과, 그람음성균으로 규명되었고, 이를 MJ-3로 잠정 명명하였다. 그람 염색은 제조사의 지시에 따라 염색키트(Difco, USA)를 사용하여 수행하였다.

효소 활성과 당 활용은 API 20 NE 키트 및 API ZYM 시스템(bioMerieux, France)을 사용하여 확인하였다. 표 2는 상기 분석결과에 따른 생화학적 특성을 보여준다. 분리된 MJ-3의 생화학적 특성은 Brevundimonas vesicularis와 97% 유사함을 보였다. MJ-3는 에스쿨린(esculin) 가수분해와 말토스를 이용할 수 있는 능력을 갖지만 슈크로스는 이용하지 못한다. 이 균주를 트립톤 소이 액체배지에서 배양했을 때 최적온도는 25 - 30℃였다.

MJ-3 균주의 생화학적 특성

그람염색	음성
색상	연한 황색
효소활성		인돌생성	-
Ala-Phe-Pro-arylamidase	+	산성화(acidification)
Glu-gly-arg-arylamidase	-	글루코스(Glucose)	-
L-PyroGlu-arylamidase	-	동화
Glu-arylaminase pNA	+	아도니톨(Adonitol)	-
-Ala-arylamidase	-	L-아라비톨(L-Arabitol)	-
L-Pro-arylamidase pNA	+	D-셀로비오스(D-Cellobiose)	-
Tyr-arylamidase	+	D-글루코스(D-Glucose)	+
Gly-arylamidase	+	D-말토스(D-Maltose)	+
α-glucosidase	+	D-만노스(D-Mannose)	-
-Glucosidase	+	D-이소말토스(D-Isomaltose)	-
-glucurnoidase	-	D-솔비톨(D-Sorbitol)	-
-Xylosidase	-	슈크로스(Sucrose)	-
Urease	-	D-타가토스(D-Tagatose)	-
Arginine dihydroase	-	D-트레할로스(D-Treholose)	-
Oxidase	+	구연산(Citrate)	-
엘만(티올기)	+	말론산(Malonate)	-
질산환원	-	5-케토-D-글루콘산(5-Keto-D-gluconate)	-
황화수소 생성	-	쿠마린산(Courmarate)	-
		L-말산(L-Malate)	+

MJ-3 균주의 지방산 메틸 에스테르는 미생물 확인 시스템(MIDI, USA)을 이용하여 표준방법에 따라서 분석하였고, 지방산 분석은 TSBA40 방법을 이용하여 가스크로마토그래피를 통하여 확인하였다. 균주 MJ-3 세포 지방산 조성은 표 2에 나타낸 바와 같이 분석되었다. 주요한 4개의 지방산은 C_18:1 ω7c(63.1%), C_16:0(24.3%), C_14:0 2-OH(4.9%) 그리고 11-메틸-C_18:1 ω7c(2.0%)이다. 프로테오박테리아(proteobacteria)의 α-4 아계(subclass)의 알려진 균주들은 그들의 세포막에 α-히드록시미리스트산(α-hydroxymyristic acid), C_{14 :0} 2-OH)가 존재하는 특성이 있다(Sly et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 49: 483-488, 1999).

MJ-3 균주의 지방산 조성(%)

지방산	조성비(%)
C14:0 2-OH	4.9
C16:0	24.3
C16:0 2-OH	1.1
C17:1 ω6c	1.0
C18:0	1.2
C18:1 ω7c	63.1
C18:1 ω5c	1.2
11-methyl-C18:1 ω7c	2.0
C14:0, iso-C15:0 2-OH, C16:1 ω7c,	< 1.0

항생제 민감성은 다음의 항생제를 각각 포함한 TSA 평판배지를 사용하여 시험하였다: 노르플록사신(norfloxacin) 10 μg, 반코마이신(vancomycin) 30 μg, 독시사이클린(doxycycline) 30 μg, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 μg, 클로람페니콜(chloramphenicol) 30 μg), 카나마이신(kanamycin) 30 μg, 앰피실린(ampicillin) 30 μg, 에리트로마이신(erythromycin) 15 μg, 아밀카신(amilkacin) 30 μg, 세포탁심(cefotaxime) 30 μg, 세팔로틴(cephalothin) 30 μg, 젠타마이신(gentamicin) 10 μg, 네틸마이신(netilmicin) 30 μg, 토브라마이신(tobramycin) 10 μg, 설파메톡사졸/트리메토프림(sulfamethoxazole/trimethoprim) 25 μg, 리팜핀(rifampin) 5 μg, 테트라사이클린(tetracycline) 30 μg 및 아목시실린/클불란산(amoxicillin/clavulanic acid) 30 μg. 그 결과, MJ-3는 앰피실린(30 μg), 세포탁심 (30 μg) 그리고 설파메톡사졸/트리메토프림(25 μg)를 제외하고 위에서 설명한 다양한 항생제에 민감하였다.

2-2: 서열 및 계통분석

분리된 균주의 16S 리보좀 DNA 염기서열은 Kim 등(Mar. Biotechnol., 11: 10-16, 2009)의 연구에서 설명되어진 방법대로 확인하였다. 16S rDNA를 증폭하기 위하여 서열번호 3로 기재된 정방향 프라이머 16S-27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 서열번호 4로 기재된 역방향 프라이머 16S-1518R(5'-AAGGAGGTGATCCANCCRCA-3')를 사용하였다. 16S rDNA 염기서열(서열번호 5)은 균주 MJ-3가 분류학적으로 Caulobacter leidyia(99.1%), Caulobacter endosymbiont(99.0%), Asticcacaulis excentricus(98.9%), Sphingomonas mali(97.6%), Sphingomonas pruni(97.6%) 그리고 Sphingomonas asaccharolytica(97.2%)와 유사성을 나타냈다. Abraham 등은 C. leidyia는 Sphingomonas 속의 종이 가지는 클러스터(cluster)가 관찰되므로 Sphingomonas 속에 속한다고 발표한 바 있다(Abraham et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 49: 1053-1073, 1999).

따라서, 본 발명자들은 균주 MJ-3의 보다 명확학 동정을 위하여 16S-23S rRNA의 유전자간 전사 스페이서(intergenic transcribed spacer, ITS) DNA를 분석하고 계통수(phylogenetic tree)를 구축하였다. 16S-23S ITS DNA는 하기의 프라이머쌍을 사용하여 증폭하였다: 16S rDNA 3'-말단 서열(서열번호 6: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3'), 23S rDNA 5'-말단 서열(서열번호 7: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3'). PCR 산물은 T-평활말단 벡터(SolGent, Korea)에 삽입한 후, BigDye 종결 서열결정방법을 사용하여 그 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자와 16S-23S ITS 부분은 BLAST 알고리즘과 CLUSTAL W 프로그램을 사용하여 GenBank 데이터베이스 상의 다중 서열 데이터와 상동성 분석을 수행하고, 정렬하였다. 계통수(phylogenetic tree)는 이웃-결합 알고리즘(neighbor-joining algorithms)를 사용하여 구축하였다. 그 결과, MJ-3 균주의 16S-23S ITS 지역의 PCR 산물은 약 900 bp 사이즈였으며(서열번호 8), 본 발명자들은 2011년 8월 21일자로 상기 ITS 서열을 GenBank 등록번호 JN091778로 등록하였다. 상기 MJ-3 균주의 16S-23S rDNA ITS 서열에 대한 분석결과, tRNA^Ile(75 bp)와 tRNA^Ala(76 bp)를 암호화하는 유전자가 보존되어 있음이 확인되었다(도 1a). 도 1b는 ITS 지역의 뉴클레오타이드 염기서열을 기초하여 계통수를 보여준다. MJ-3 균주는 Sphingomonas와 Novosphingobium가 속하는 Sphingomonad 속과 가장 밀접하게 관계가 있는 것으로 밝혀졌고, MJ-3 균주의 ITS 지역과 가장 밀접한 관계를 보인 Sphingomonas wittichii MA03 ITS 지역은(EU334830)은 MJ-3 균주(916 bp)보다 짧은 ITS 지역(482 bp)을 가지지만 tRNA^Ile와 tRNA^Ala 유전자들이 고도로 보존되어 있었다. 본발명자들은 화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석 결과를 기초로 하여 MJ-3 균주를 신규 균주로서 Sphingomonas sp. MJ-3로 명명하였고, 이를 대한민국 대전에 소재한 국제기탁기관인 KCTC에 2011년 10월 4일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC12026BP를 부여받았다.

2-3: 알긴산 분해효소 활성 분석

본 발명의 Sphingomonas sp. MJ-3 균주는 기본적으로 알긴산 분해능에 기반하여 동정된 것이기 때문에, 본 발명자들은 세포 성장시 알긴산 분해효소 활성을 보다 정밀하게 분석하였다. 구체적으로 세포를 0 - 0.8 %(w/v) 알긴산 나트륨이 포함된 M9 배지 또는 LB배지에서 30℃, 180 rpm에서 5일 동안 배양하였다. 종배양액을 각각의 배양배지가 포함된 15개의 플라스크에 접종하고 성장 속도를 측정하기 위하여 흡광도 600 nm에서 주기적으로 측정하였다(도 2). 그 결과, 어떠한 종류의 탄소 기질도 없는 M9 배지에서는 세포가 전혀 자랄 수 없었다. 알긴산이 존재하는 M9 배지에서는 세포가 잘 자랐고 세포의 최종양은 첨가된 알긴산의 양과 비례적인 관계가 있었다. 이는 Sphingomonas sp. MJ-3가 단일 탄소원으로 알긴산을 잘 사용하고 알긴산에서 그들의 대사를 위한 많은 종류의 알긴산 분해 효소를 가짐을 시사한다. LB 배지에서 Sphingomonas sp. MJ-3의 성장 특성 또한 분석하였는데, 알긴산이 없는 LB 배지에서 배양된 세포는 LB 배지는 효모 추출물과 펩톤과과 같은 충분한 영양소를 가지고 있기 때문에 잘 자랐다. 흥미로운 것은 성장 속도와 성장 정도가 알긴산 존재 하에서 더 높았다는 것이다. 0.2, 0.4, 0.6 그리고 0.8%(w/v)의 알긴산이 포함된 LB 배지를 사용했을 때 세포들은 잘 자랐고 최종 성장 정도는 알긴산 농도가 0.6%(w/v)일 때까지 증가하였다. 0.6%(w/v) 알긴산 함유 LB에서 자란 세포의 성장 속도는 알긴산이 없는 LB에서 자란 것보다 거의 두 배였다. 이러한 결과들로부터 Sphingomonas sp. MJ-3 균주에서의 알긴산 동화는 효모 추출물과 펩톤과 같은 다른 영양분 존재에 심하게 저해를 받지 않고 상당히 다른 수송과 동화 경로가 존재할 것으로 결론 내렸다. Sphingomonas sp. MJ-3 균주에서 알긴산 분해와 대사를 위하여 수송과 동화 대사 경로를 더 연구하는 것은 흥미로울 것이다.

Sphingomonas sp. A1에서 알긴산 중합체는 세포 표면의 고랑(pit), 페리플라즘( periplasm)의 알긴산-결합 단백질 그리고 내막의 ATP-결합 카세트 트랜스포터로 이루어진 채널을 통하여 세포로 바로 수송된다. 알긴산은 A1-Ⅰ, A1-Ⅱ 그리고 A1-Ⅲ와 같은 세 가지 내부형(endolytic-type) 알긴산 분해효소에 의해 이당-, 삼당- 및 사당-류을 포함하는 올리고알긴산으로 분해되고, 올리고알긴산은 말단형(exolytic-type) 알긴산 분해효소 A1-Ⅳ에 의해 이중결합을 가지는 단당류로 분해되는 것으로 알려져 있다(Hashimoto et al., Biochem, 44: 13783-13794, 2005).

이에, 본 발명자들은 회분배양 중인 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 알긴산 분해효소 활성을 M9과 LB 배지에 알긴산의 유무에 따라 확인하였다. 알긴산 분해효소 활성을 측정하기 위하여 배양시간에 따라 회수된 세포를 ultrasonicator Vibra Cell CX400(Sonics & Materials Inc, USA)을 이용하여 50 mM 포타슘 인산 완충용액(pH 7.2)에서 초음파 분쇄하였고 분쇄물을 16000 × g에서 40분동안 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액에 기질로서 0.2%(w/v) 알긴산 나트륨이 포함된 50 mM 인산 완충용액을 첨가하여 pH 7.0, 30℃로 반응시켰다. 알긴산 분해효소 활성은 235 nm에서의 흡광도 증가를 측정하거나(Yoon et al., Protein Expres. Purif., 19: 84-90, 2000) 또는 티오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA) 방법을 사용하여 측정하였다(Warren, Nature, 186: 237, 1960).

그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이, 알긴산 분해효소 활성은 알긴산이 없는 M9 배지에서 세포 성장을 측정했을 때 알긴산 분해효소 활성을 무시해도 좋을 정도인 반면, 알긴산이 함유된 배지에서 배양된 MJ-3 균주의 경우, 알긴산 분해효소 활성은 정지기까지 계속 증가하고 세포가 정지기에 접어들면 일정하게 유지되었다. 이는 알긴산 분해효소 활성이 세포 성장과 직접적인 관계가 있다는 것을 나타낸다. 동량의 세포에서 알긴산 분해효소 활성 정도는 알긴산 농도가 증가함에 따라 선형으로 증가하였다. 알긴산 분해효소 활성은 또한 알긴산이 있는 LB 배지에서 자란 세포에서도 측정하였는데(도 3b), 알긴산 분해효소 활성은 알긴산이 있는 M9 배지에서 자란 세포와 비교하였을 때 약 절반 정도였다.

상기 결과를 기초로 하여 다양한 알긴산 분해효소 활성을 가진 새롭게 분리된 Sphingomonas sp. MJ-3 균주는 세포 성장을 위해 알긴산을 단당류로 분해한다고 결론내릴 수 있다.

실시예 3: 알긴산 분해효소의 클로닝 및 분석

3-1: 게놈 DNA 라이브러리의 구축

게놈 DNA는 유기화학 용매 추출방법으로 세포에서 분리하였다(Gimmestad et al., J. Bacteriol., 191: 4845-4853, 2009). 제노텍(Korea)에 의뢰하여 게놈 DNA를 30 - 40 kb 크기로 잘라 포스미드 벡터인 CopyControl^TM pCC1FOSTM 벡터(Epicentre, USA)에 삽입하고 이를 파지로 포장하여 EPI300-T1^R 도말 세포 상에 도말하였다. 35개의 LB 평판배지로부터 수득한 약 10,000개의 콜로니들을 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 재조합 EPI300-T1^R 세포들을 가진 각각의 마이크로플레이트는 사본을 만들어 두고 클로람페니콜 12.5 μg/ml가 포함된 LB 배지에 배양하였다. 각각의 마이크로플레이트 한 세트는 글리세롤에 저장하여 -75℃ 극저온 냉동고에 보관하였다.

3-2: 양성 포스미드 클론의 선별

최근 Hashimoto 등(J. Bacteriol., 182: 4572-4577, 2000)과 Miyake 등(Protein Expres. Purif., 29: 33-41, 2003)은 알긴산을 완벽하게 단량체로 분해하는 말단형 알긴산 분해효소를 가지는 균주 Sphingomonas sp. A1을 보고한바 있고, Ochiai 등은 균주 Agrobacterium tumefaciens C58로부터 수득한 알긴산 분해효소가 말단형 분해활성을 나타내고 이것의 기본 결정 구조는 α/α-barrel과 역-평행 β-sheet을 가진다는 결과를 보고한 바 있다(Res. Microbiol., 157: 642-649, 2006; J. Biol. Chem., 285: 24519-24528, 2010). Sphingomonas sp. A1 말단형 올리고알긴산 분해효소의 염기서열을 분석했을 때 C-말단에 헤파리나제(heparinase) Ⅱ/Ⅲ 계열 도메인을 볼 수 있는 반면, 내부형 알긴산 분해효소는 이러한 도메인을 가지고 있지 않는다. 상기와 같은 이유로 알긴산을 이중결합을 가지는 단당류로 분해할 수 있는 알긴산 분해효소를 암호화하는 포스미드 클론(fosmid clone)을 스크리닝하기 위하여 다양한 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질들의 상동성 서열을 기초로 하여 클로닝용 프라이머들을 제작하였다.

MJ-3 게놈 DNA 라이브러리로부터 알긴산 분해효소 유전자가 포함된 포스미드를 선별하기 위하여 프라이머로는 Sphingomonas sp. A1의 올리고알긴산 분해효소의 C-말단 서열에 헤파리나제-유사 도메인이 있다는 점에 착안하여, 헤파리나제-유사 단백질 도메인의 상동성 서열을 기초로 하여 디자인하였다. 구체적으로 하기 염기서열이 프라이머 디자인을 위해 사용되었다: Smal_2067(Stenotrophomonas maltophilia R551-3), Smlt_2602(Stenotrophomonas maltophilia K279a), BresuDraft_1835(Brevundimonas subvibrioides ATCC 15264), Avin_46500(Azotobacter vinelandii DJ), Sde_3284(Saccharophagus degradans 2-40), Mmar10_0256(Maricaulis maris MCS10). 올리고알긴산 분해효소를 선별하기 위한 한 쌍의 프라이머로는 5MJ-3-Hepa790F(서열번호 9: 5'-GAAGGSCCCTACTACCAGCGCTATGC-3')와 3MJ-3-Hepa1430R(서열번호 10: 5'-ACVACCARGGTGTTGTGSGCSAYGGTCTG-3')을 사용하였다.

35개의 포스미드 라이브러리 플레이트의 각각의 콜로니를 보관하기 위하여 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 양성 콜로니를 가지는 플레이트와 96-웰 마이크로플레이트를 확인하기 위하여 각각의 플레이트의 콜로니들을 스프레더(spreader)를 이용하여 플레이트별로 모으고 소량의 물로 끓이고 원심 분리한 다음 상층액은 1차 PCR을 수행하는데 사용하였다. 양성 콜로니 확인을 위한 PCR 프라이머로는 5MJ-3-Hepa790F와 3MJ-3-Hepa1430R을 사용하였다(표 3). 그 결과, 두 개의 양성 마이크로플레이트(#14-1와 #19-2)는 604 bp의 양성 PCR 산물이 나타났기 때문에 다음 스크리닝을 위해 선택하였다. 이어, 상기 양성 96-웰 마이크로플레이트의 모든 12-웰의 세포들을 혼합하여 8 lane으로 구분한 후 2차 PCR을 수행하였다. 이 때도 마찬가지로 5MJ-3-Hepa790F와 3MJ-3-Hepa1430R을 PCR을 위한 프라이머로 사용하였다. 그 결과 #14-1A lane과 #19-2H lane에서 640 bp PCR 산물이 나타났다. 양성 콜로니들을 가지는 양성 웰을 확인하기 위하여 #14-1A와 #19-2H lane들의 각각의 웰의 세포들을 3차 PCR을 수행하는데 사용하였다. 그 결과 #14-1A-2 웰과 #19-2H-2 웰에서 640 bp 사이즈의 DNA 밴드가 나왔다. 최종적으로 #14-1A-2와 #19-2H-2 포스미드 DNA의 염기서열을 분석했을 때, #14-1A-2의 DNA만 Azotobacter vinelandii DJ의 알긴산 분해효소와 Brevundimonas subvibrioides ATCC 15264의 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질과 각각 70%, 60%의 단백질 서열 상동성을 가졌다. 결론적으로 포스미드 #14-1A-2 클론은 부분적 C-말단 헤파리나제-유사 단백질 유전자(nt 256에서 nt 2196까지)와 다른 하위 유전자들을 가진다고 설명된다.

알긴산 분해효소 클로닝에 사용된 프라이머 목록

프라이머명	염기서열(5'→3')	서열번호
포스미드 스크리닝용
5MJ-3-Hepa790F	GAAGGSCCCTACTACCAGCGCTATGC	9
3MJ-3-Hepa1430R	ACVACCARGGTGTTGTGSGCSAYGGTCTG	10
3MJ-3-Hepa300R	GTTGAGGCTCTGCCAGAACAGACG	11
5MJ-3-PolyM1170F	CCSGCAACCTGATCGTCAACCGC	12
3MJ3-Hepa870R	GAAATAGCCGTCATAGGTCGTCTGG	13
내부서열 결정용
5MJ-3-Hepa1330F	CATGCCATCGTGACCGATTACGGCGC	14
5MJ-3-Hepa2080F	CTCGGCCGATGCCAATGCTGCAC	15
MJ-3 알긴산 분해효소 유전자의 pET21b(+) 벡터로의 삽입용
5MJ-3-OligoMF (NdeI)	GCATATGCAGACCGCGCCGGGCGATCAG	16
3MJ-3-OligoR (HindⅢ)	GAAGCTTGTTCCCCTTGCCCGCATCGAAG	17

3-3: 잠재적 알긴산 분해효소 유전자의 클로닝 및 발현벡터 제작

상기 잠재적 MJ-3 알긴산 분해효소 유전자의 전체 염기서열을 확인하고 클로닝 하기 위해 상기 표 3에 기재된 프라이머들을 사용하여 분석을 수행하였다. 구체적으로, #14-1A-2 클론의 포스미드 DNA 서열에는 N-말단서열이 없었으므로, 폴리마누론산 분해효소(polymannuronate lyase)의 상동 서열(5MJ-3-PolyM1170F, 서열번호 12)과 헤파리나제-유사 단백질의 N-말단 서열(3MJ-3-Hepa300R, 서열번호 11)을 사용하여 PCR을 수행하였고, PCR을 위한 주형으로는 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 게놈 DNA가 사용되었다. 3MJ-3-Hepa300R 서열은 3MJ3-Hepa870R(서열번호 13)을 가지는 표적 포스미드 DNA의 염기서열로부터 얻어졌다. 5MJ-3-Hepa1330F와 5MJ-3-Hepa2080F는 #14-1A-2 clone의 표적 포스미드을 먼저 5MJ-3-Hepa790F로 1500 bp 정도까지 염기서열을 결정하고, 다음 서열을 결정하기 위하여 앞에서 결정된 염기서열 중에서 알맞은 프라이머(5MJ-3-Hepa1330F)를 제작하고 상기 프라이머를 이용하여 다음 염기서열을 결정하였고, 결정된 서열 중에서 다시 적당한 프라이머(5MJ-3-Hepa2080F)를 제작하여 염기서열을 결정함으로써 전체 염기서열을 얻을 수 있었다.

게놈 DNA로부터 얻은 MJ-3 알긴산 분해효소의 N-말단을 클로닝하기 위하여 5MJ-3-PolyM1170F(서열번호 12)와 3MJ-3-Hepa300R(서열번호 11) 두 개의 프라이머를 제작하고 PCR을 수행하는데 사용하였다. Stenotrophomonas maltophilia R551-3의 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질과 48% 상동성을 가지는 MJ-3 알긴산 분해효소의 N-말단을 포함한 560bp PCR 산물을 수득하였다. 560 bp PCR 산물은 또한 잠재적 폴리-(β-D-마누론산 ) 분해효소의 C-말단 부분을 포함한다. C-말단 헤파리나제-유사 단백질 유전자와 N-말단 서열의 DNA 염기서열 정보를 기초로 하여 단백질 발현벡터인 pET21b(+)로의 클로닝을 위해 정방향(5MJ3-OligoMF (NdeI), 서열번호 16)와 역방향 프라이머(3MJ3-OligoR (HindⅢ), 서열번호 17)를 제작하였다. 상기 프라이머들은 각각 신호 펩티드 서열과 종결 코돈이 없도록 디자인하였다. PCR은 Pfu-X DNA polymerase(SolGent, Korea)를 사용하여 수행하였고, PCR 산물은 이미 만들어진 T-blunt vector(SolGent, Korea)에 삽입한 후 pET21b(+) 벡터(Novagen, USA)에 옮겼다.

3-4: MJ-3 알긴산 분해효소의 서열 및 상동성 분석

최종적으로 클로닝된 유전자의 염기서열 및 이에 의해 추론되는 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과 잠재적 MJ-3 알긴산 분해효소 유전자는 2,196개의 뉴클레오티드를 가지고(서열번호 2), 잠재적 MJ-3 알긴산 분해효소 단백질은 731개의 아미노산(서열번호 1)으로 구성됨을 확인하였고(도 4), 이를 2011년 8월 21일자로 각각 GenBank 등록번호 JN091777와 AEM45874로 등록하였다. 신호 펩티드 절단 부위는 SignalP 3.0 서버(//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 예측하였는데, Signal 3.0 서버로 MJ-3 알긴산 분해효소 단백질이 신호 펩티드 서열(¹Met - ²⁰Ala)를 가짐을 확인하였다.

MJ-3 알긴산 분해효소의 추측되는 아미노산 염기서열은 다른 알긴산 분해효소 또는 헤파리나제 계열 단백질과 다중 서열 정렬을 통해 분석하였다(도 5). MJ-3 알긴산 분해효소의 아미노산 염기서열은 Azotobacter vinelandii DJ 게놈 DNA로부터 추측된 알긴산 분해효소(Avin_46500, 64% 상동성)와 가장 가까웠다. MJ-3 알긴산 분해효소는 다른 추측된 단백질과 비교했을 때 Stenotrophomonas maltophilia K279a의 잠재적 알긴산 분해효소 단백질(Smlt2602, 53% 상동성), Brevundimonas subvibrioides ATCC 15264의 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질(BresuDraft_1835, 53% 상동성), Maricaulis maris MCS10의헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ계 단백질(Mmar10_0256, 49% 상동성), Saccharophagus degradans 2-40의 hypothetical protein(Sde_3284, 48% identity)과도 유사성을 보였다. MJ-3 알긴산 분해효소의 아미노산 염기서열을 다른 Sphingomonas sp. A1(A1-Ⅳ)과 A. tumefaciens strain C58(atu3025 protein)의 말단형 알긴산 분해효소의 염기서열과 비교했을 때 MJ-3 알긴산 분해효소의 부분 N-말단 아미노산 염기서열(aa 1에서 aa 350까지)은 말단형 알긴산 분해효소의 앞쪽 단편(α/α-barrel 지역)과 각각 27.0%와 28.6% 이하의 서열 상동성을 보였지만 A1-Ⅳ와 atu3025 사이의 서열 상동성은 약 56%였다. 이는 MJ-3 알긴산 분해효소가 다른 말단형 올리고알긴산 분해효소와 상당히 다르다는 것을 나타낸다.

MJ-3 알긴산 분해효소의 AlgL-유사 보존 도메인을 A1-Ⅲ(Sphingomonas sp. A1 균주의 폴리마누론산(polymannuronate) 분해효소)와 다중 서열 정렬하였을 때 서열 상동성은 27.9% 이하였지만 촉매반응에 중요한 ²⁰⁷Asn, ²⁰⁸His and ²⁵⁴Tyr와 같은 아미노산은 잘 보존되었고(도 5에 적색 ▼로 나타냄) MJ-3 알긴산 분해효소가 내부형 분해효소 활성 자리 또한 가지고 있을지 모름을 시사한다. MJ-3 알긴산 분해효소의 헤파린-유사 단백질 도메인(aa 350에서 aa 731까지의 잔기)은 2fuq.pdb(Pedobacter heparinus 기원의 헤파리나제 단백질)을 기본으로 상동성-모델링을 했을 때 ⁴⁰⁹His, ⁴⁴⁶Tyr 및 ⁴⁵⁵Lys 잔기들이 보존되어 있다(도 5에 적색 ●로 나타냄). 이 잔기들은 이중결합을 가지는 헤파린 이량체의 결합 부위에 중요한 아미노산일 것으로 예상된다(Shaya et al., J. Biol. Chem., 281: 15525-15535, 2006). 보존된 도메인을 살펴보기 위해 MJ-3 알긴산 분해효소의 단백질 염기서열을 GenBank에 제출했을 때 도 6에서 나타낸 바와 같이 AlgL 도메인(aa 163 - aa 350)과 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ-유사 도메인(aa 381에서 aa 506까지)이 보존되어 있는 것으로 나타났다.

실시예 4: 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소의 발현 및 활성 분석

4-1: 재조합 세포배양 및 단백질 발현

재조합 pET21b/MJ3-알긴산 분해효소 플라스미드 DNA를 형질전환 시킨 Escherichia coli BL21(DE3)을 50 μg/ml 앰피실린을 첨가한 LB 배지에 접종하여 250 rpm, 37℃의 조건으로 진탕배양기에서 OD₆₀₀ = 0.4 - 0.6 될 때까지 2 - 3시간 진탕 배양하였다. 이후, MJ-3 알긴산 분해효소 유전자의 발현을 유도하기 위해 1 mM IPTG를 첨가하고 24시간 진탕 배양하였다.

4-2: 재조합 알긴산 분해효소의 확인

상기 MJ-3 알긴산 분해효소 유전자의 발현을 유도한 대장균을 분쇄한후, SDS-PAGE 와 면역블롯팅으로 단백질 발현 여부를 분석하였다(도 7). 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 전기 이동시켰다. 1차 항체로는 항-헥사이스티딘다클론 항체(H-15, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), 2차 항체로는 퍼옥시다제-결합 항-토끼 IgG(Jackson Immunoresearch, USA)를 사용하였으며 CN/DAB(4-chloronaphthol/3,3'-diaminobenzidine) 용액(Pierce, USA)으로 발색하여 단백질의 유무를 확인하였다.

Sphingomonas sp. MJ-3의 알긴산 분해효소 유전자의 예상되는 아미노산 개수는 731개이며 분자량은 79.9 kDa이고, 신호 펩티드가가 없는 재조합 알긴산 분해효소의 경우 단백질 크기는 아미노산 711개이며 분자량은 약 78.0 kDa으로 예상되었다. Kim 등(Mar. Biotechnol., 11: 10-16, 2009)의 이전 연구에서 알긴산 분해효소가 신호 펩티드를 가지는 경우보다 신호 펩티드를 가지지 않는 경우 활성이 더 좋은 것으로 나타났기 때문에 신호 펩티드가 없는 알긴산 분해효소를 클로닝 하였다. (His)₆-tag이 붙은 재조합 단백질을 발현시켰을 때 MJ-3 알긴산 분해효소 단백질의 크기는 724개의 아미노산을 가진 79.6 kDa으로 추정된다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 그리고 이뮤노블랏 상에서 MJ-3 알긴산 분해효소의 분자량에 해당하는 밴드가 발견되었다.

4-3: 재조합 알긴산 분해효소의 정제

재조합 대장균을 수확하여 용해 완충용액(50 mM 포타슘 인산완충용액(pH 7.2), 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10%(v/v) 글리세롤, 0.5%(v/v) Triton X-100, 1 mg/ml 리소자임, 1 mM PMSF)에서 초음파 분쇄하였다. 발현된 (His)6-tag가 붙은 MJ-3 알긴산 분해효소를 함유하고 있는 세포 균질액은 50 mM 인산 완충용액(pH 7.2)와 0.5 M NaCl로 평형시킨 Ni-Sepharose 칼럼에 장착하였다. 칼럼은 50 mM 이미다졸이 함유된 동일한 완충용액로 세척하고, MJ-3 알긴산 분해효소 단백질은 300 mM 이미다졸이 함유된 동일한 완충용액으로 용출하였다. 활성이 있는 분획은 HiTrap^TM 탈염 칼럼(Amersham Biosciences, USA)을 이용하여 염을 제거하였다.

실시예 5: 정제된 MJ-3 알긴산 분해효소의 활성 분석

5-1: 효소의 생화학적 특성 분석

Sphingomonas sp. MJ-3의 재조합 알긴산 분해효소의 분해활성에 pH와 온도가 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 온도의 범위는 30 - 60℃, pH범위는 10 mM의 종류가 다른 4가지 완충용액(초산 완충용액, pH 3.6 - 5.8; 포타슘 인산완충용액, pH 5.6 - 8.0; Tris-HCl 완충용액, pH 7.0 -10.0; 및 소디움 카보네이트 완충용액, pH 9.0 - 11.0)를 사용하여 변화를 주었다.

결과, 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소는 pH 5 - 9사이에서 활성을 나타내고, pH 7에서 최대 활성을 보였으며(도 8a), 온도는 20℃에서 50℃까지 상승시켰을 때, 활성이 증가하였으나, 60℃에서 급격하게 활성이 떨어지는 양상을 나타냈다(도 8b). 따라서, 활성 온도 범위는 20 내지 약 60℃의 범위로 추정된다.

MJ-3 알긴산 분해효소의 기질 특이성은 알긴산 나트륨과 Haug 등의 방법에 따라 산 가수분해된 올리고머 블록인 poly-M 블록, poly-G 블록, poly-MG 무작위 블록 그리고 알긴산 나트륨를 사용하여 분석하였다 (Haug et al., Acta. Chem. Scand., 20: 183-190). MG 비율은 Ertesvㅵg 등 및 Grasdalen 등의 방법을 사용하여 ¹H-NMR spectra로 계산하였다(Ertesvㅵg et al., J. Bacteriol., 180: 3779-3784, 1998; Grasdalen et al., Carbohydr. Res., 68: 23-31, 1979). 분석 결과, 도9에서 나타낸 바와 같이, 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소는 상대적으로 poly-M 블록에 높은 분해 활성을 보였으며, poly-MG 블록, poly-G 블록 그리고 알긴산 나트륨에 대해서도 분해 활성을 보였다. 흥미롭게도 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소는 헤파리나제 Ⅱ/Ⅲ-유사 도메인을 가지고 있지만 헤파린은 분해할 수는 없었다. 결론적으로 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소는 기질특이성 분석 결과에 기초하여 알긴산, poly-M 블록, poly-G 블록 그리고 poly-MG 블록 모두를 분해할 수 있음을 확인하였다.

5-2: MJ-3의 재조합 알긴산 분해효소의 올리고 알긴산 분해산물 분석

본발명자들은 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소가 이중결합을 가진 알긴산 올리고당을 분해할 수 있는지 여부에 대하여 조사하였다. 만일 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소가 말단형 분해효소 활성을 가지고 있다면, 알긴산 올리고당을 알긴산 단당류로 완전히 분해할 수 있다. 알긴산 올리고당은 Streptomyces sp. ALG-5로부터 재조합된 내부형 알긴산 분해효소를 사용하여 준비하였다. 알긴산 올리고당은 주로 이당류, 삼당류와 사당류로 구성된다. 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소를 이용한 알긴산 올리고당의 최종 분해산물을 명확히 분석하기 위하여 동결 건조된 알긴산 분해 혼합물을 소량의 증류수에 녹인 다음 BioGel P2 gel filtration chromatography (1.5×360 cm, BioRad, USA)를 사용하여 크기별로 분획하였다. 이 혼합물을 0.2 M NH₄HCO₃ 완충용액을 이용하여 0.3 ml/min 유속으로 용출하여 분획을 2 ml/tube씩 모았다. 이중결합을 가진 우론산 분획은 235nm에서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 알긴산 분해 분획은 모아서 증발시켜 분자량 분석을 하기 위해서 동결 건조하였다. MJ-3 알긴산 분해효소의 알긴산 분해 패턴을 분석하기 위하여, ALG-5 lyase(poly-G를 특이적으로 분해하는 효소)에 의해 준비된 일부 분해된 5%(w/v) 올리고알긴산 혼합물에 MJ-3 알긴산 분해효소를 처리하고 분해산물은 TLC와 FPLC를 이용하여 분석하였다. 아울러 각각의 분획의 분자량은 전자스프레이-이온화 질량분석기(electrospray-ionization mass spectroscopy, 6410 Triple Quadrupole LC-MS, Agilent, USA)로 측정하였다. 겔여과 크로마토그래피로부터 얻은 각각의 분획은 메탄올:물 혼합용액(1:1, v/v)으로 녹인 다음 전자스프레이 소스 조건으로 LC-MS에 0.5 ml/min 유속으로 주입하였다. 이동상은 10 mM 초산암모늄:메탄올 혼합용액(1:1, v/v)이었고 MS는 이온스프레이 전압 4 kV, 소스 온도 350^oC의 음이온 모드로 수행하였다. 알긴산 올리고당 혼합물의 분해 반응 후, 피크들은 반응이 진행됨에 따라 이당류, 삼당류 그리고 사당류가 사라졌다(그림 10a). 단량체 알긴산은 황산을 첨가한 TLC 판에서 거의 확인하기 힘들기 때문에 알긴산 단당류의 형태를 확인하기 위해서 FPLC와 LC-MS를 사용하여 반응산물을 분석하였다. FPLC 크로마토그램은 17.9분에 대부분 한 개의 피크를 보여준다(그림 10b의 세번째 판넬). 15.7, 16.8, 17.94 분의 머무름 시간의 피크는 그 후에 ESI-MS로 분석했다. 피크의 ESI-MS 데이터를 음이온 모드([M-H]^-)로 분석했을 때, m/z의 주요 피크는 각각 527(RT = 15.66 min, 삼당류), 351 (RT = 16.70 min, 이당류) 그리고 175 (RT = 17.94 min, 단당류)였다. 마지막 피크는 이중결합이 있는 단당류의 분자량이 176 Da이므로 이중결합을 가진 단당류임을 확인하였다. 이러한 모든 결과는 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소가 알긴산 올리고당을 단당류로 완벽히 분해하는 활성을 가지고 있음을 명확히 나타낸다.

기질 특이성, 분해산물, 다중 서열 정렬 그리고 보존된 도메인들의 분석을 기초로 하여 Sphingomonas sp. MJ-3 재조합 알긴산 분해효소는 알긴산, 알긴산 올리고당, poly-M 블록, poly-G 블록 그리고 poly-MG 블록에 대하여 분해효소 활성을 가지고 있는 올리고알긴산 분해효소로 확인되었다.

다중 서열 정렬 부분에서 언급된 것처럼 다른 말단형 알긴산 분해효소와 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소의 염기서열 동일성은 매우 낮다. 그러므로 Sphingomonas sp. MJ-3의 올리고알긴산 분해효소는 다른 말단형 알긴산 분해효소에 비교하여 다른 3-D 구조를 가질 수 있다.

재조합 MJ-3 알긴산 분해효소는 poly-M 블록, poly-G 블록, poly-MG 블록, 알긴산 올리고당 그리고 알긴산을 알긴산 단당류로 효율적으로 분해할 수 있기 때문에 알긴산의 당화를 위한 생촉매로 사용될 수 있다.

실시예 6: 재조합 MJ-3 알긴산 분해효소를 이용한 알긴산 당화

알긴산 분해반응은 MJ-3 알긴산 분해효소의 분쇄물 0.2 mg/ml, 1%(w/v) 알긴산 나트륨이 포함된 20 mM 포타슘인산완충용액 (pH6.5)에서 720분 동안 40℃에서 반응하였다. 알긴산 분해 생성물은 5분, 10분, 20분, 40분, 80분, 160분, 480분 그리고 720분에서 샘플을 추출한 후 티오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA)방법을 사용하여 분석하였다.

Sphingomonas sp. MJ-3 유래의 유전자재조합 알긴산 분해효소를 이용하여 1% (w/v) 알긴산에 대한 회분식 당화 반응을 진행하였다. 알긴산 당화반응이 진행됨에 따라 반응액의 점도가 줄어듬을 확인할 수 있었으며, 단당류의 생성을 티오바비투르산(thiobarbituric acid, TBA)방법을 사용하여 정량 분석하였다. 도 11을 통해 볼 수 있듯이 알긴산 효소를 이용하여 알긴산으로부터 단당류를 2 mg/ml 이상의 수준으로 제조할 수 있었다.

본 발명은 상기 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12026BP 20111004

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. 알긴산 분해능이 있는 신규 Sphingomonas sp. MJ-3 균주(수탁번호: KCTC12026BP).
2. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 알긴산 분해능을 갖는 분리된 폴리펩티드.
3. 삭제
4. 제2항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
5. 제4항에 있어서,
   서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
6. 삭제
7. 제4항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터.
8. 제7항에 있어서,
   플라스미드, 코스미드, 포스미드 또는 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC), 바이러스 벡터(viral vector) 또는 포유동물 벡터(mammalian vector)인, 벡터.
9. 제8항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 세포.
10. 제9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 세균, 진균세포, 식물세포, 곤충세포, 포유동물세포인, 형질전환 세포.
11. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 알긴산 분해능을 갖는 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 작동가능하게 연결한 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환 숙주세포를 제조하는 단계;
    상기 형질전환 숙주세포를 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 및
    상기 배양된 숙주세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 알긴산 분해능을 갖는 분리된 폴리펩티드의 생산방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 형질전환 숙주세포 배양단계 이후 또는 동시에 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 단계가 추가적으로 포함되는, 생산방법.
13. 제9항의 형질전환 세포, 상기 형질전환 세포의 배양액 또는 제2항의 폴리펩티드에 알긴산 또는 올리고알긴산을 접촉시키는 단계를 포함하는 알긴산의 당화방법.

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