BR112019027888A2 - levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico - Google Patents

Abstract

Célula de levedura aprimorada com produção aumentada de ácido succínico com base no rendimento e na titulação. A atividade aumentada de uma ou mais enzimas envolvidas na via das pentoses fosfato, redução do fluxo através da fosfoglicose isomerase, aumento do fluxo de acetil-CoA citoplasmática, o uso de uma enzima málica e/ou uso de uma formato desidrogenase leva ao aumento da produção de ácido succínico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CÉLULA DE

LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA COM PRODUÇÃO AUMENTADA DE ÁCIDO SUCCÍNICO”. REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N° 62/527,351 depositado em 30 de junho de 2017.

DECLARAÇÃO REFERENTE À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Não aplicável.

ACORDO DE PESQUISA CONJUNTA

[0003] Não aplicável.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A invenção se refere ao campo da produção química com base em substâncias biológicas. Mais especificamente, a invenção se refere à produção de ácido succínico a partir de fontes de carbono renováveis usando leveduras geneticamente modificadas.

[0005] O ácido succínico é um intermediário no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e muitas bactérias são conhecidas por terem a capacidade natural de produzir succinato como principal produto de fermentação. A demanda comercial por ácido succínico ou um sal de ácido succínico (ambos também denominados de "succinato") está em expansão.

Um relatório do Departamento de Energia dos EUA em

2004 intitulado "Top Value Added Chemicals from Biomass"

identificou o ácido succínico como uma das doze substâncias químicas básicas que podem ser produzidas a partir de matéria-prima renovável.

O ácido succínico é usado como matéria-prima na fabricação de vários produtos químicos especiais, tais como 1,4-butanodiol, tetra-hidrofurano,

gama-butirolactona e N-metilpirrolidona.

O ácido succínico,

como uma substância química em grande volume, tem o potencial de ser usado na fabricação de vários produtos, incluindo ração animal, plastificantes, congelantes, polímeros, fibras e plásticos, principalmente o succinato de polibutila

(também conhecido como "succinato de polibutileno" ou

"PBS"). Muitos dos polímeros feitos de succinato biodegradam em uma taxa muito mais rápida do que outros polímeros derivados de petróleo, tais como polietileno, polipropileno,

poliestireno e tereftalato de polietileno (PET). Como tal,

os plásticos feitos a partir de succinato são altamente desejáveis, pois degradam mais rapidamente em aterros ou outros ambientes de compostagem (Kunioka, Ninomiya &

Funabashi, 2009). Esta propriedade se estende a muitos outros polímeros e plásticos nos quais as subunidades monoméricas são compostos biologicamente derivados ou seu equivalente químico, em vez de compostos petroquimicamente derivados os quais, normalmente, não são encontrados abundantemente em organismos vivos. Por exemplo, polímeros derivados de ácido fumárico (fumarato), ácido málico (malato), ácido adípico (adipato), ácido L-láctico (L-lactato), ácido D-láctico (D- lactato) e/ou outros ácidos orgânicos de ocorrência natural são todos degradados mais facilmente do que muitos polímeros derivados petroquimicamente em ambientes de compostagem. Como tal, para o benefício da humanidade, é desejável substituir polímeros e plásticos feitos atualmente de petroquímicos por polímeros e plásticos feitos de substâncias bioquímicas.

[0006] Muitas substâncias bioquímicas, tais como succinato, fumarato e adipato, podem ser fabricadas a partir de petróleo, e muitos processos atualmente usados para produzir PBS e náilons usam monômeros derivados de petróleo. No entanto, uma vez que o suprimento mundial de petróleo é finito, também seria desejável desenvolver materiais e métodos para a produção de monômeros bioquímicos por meio de fermentação a partir de fontes renováveis de carbono, tais como açúcares, polímeros de açúcar, glicerol, ácidos graxos, dióxido de carbono, lignina ou qualquer outra forma de biomassa ou resíduos derivados de biomassa. Assim, é desejável desenvolver processos para a fabricação de plásticos biodegradáveis a partir de recursos biorrenováveis.

[0007] Os bioprocessos que produzem muitas das substâncias bioquímicas supracitadas usam organismos que não conseguem crescer em baixo pH. Portanto, enquanto o ácido orgânico está sendo produzido, o meio de cultura deve ser mantido em um pH de cerca de 5 a cerca de 7,5 mediante adição de base, geralmente um hidróxido, carbonato, bicarbonato, ou uma mistura dos mesmos, de sódio, potássio, amônio, magnésio ou cálcio. Como um resultado, o ácido orgânico no caldo de cultura existe como um sal, e a maioria das moléculas de ácido orgânico é carregada. O estado carregado apresenta uma vantagem e uma desvantagem. A vantagem é que o sal carregado não difunde facilmente através da membrana celular para dentro da célula. A desvantagem é que a química da polimerização ou outro uso químico adicional do ácido orgânico geralmente requer a forma protonada (também conhecida como "ácido livre") do ácido orgânico, de modo que os sais produzidos pela fermentação requerem processamento a jusante potencialmente caro para fornecer a forma de ácido livre. Como tal, seria vantajoso produzir ácidos orgânicos em baixo pH (um pH próximo ou, mais preferivelmente, abaixo do pKa mais baixo do ácido orgânico), em que a maioria das moléculas esteja no estado ácido livre. Outras considerações à parte, um caldo de fermentação de baixo pH deve ser mais barato de processar para fornecer uma preparação pura do ácido livre, uma vez que muito menos contra-íons (tais como sódio, potássio, amônio, magnésio, cálcio) teriam de ser fornecidos durante a fermentação e depois separados para proporcionar ácido succínico protonado após fermentação.

[0008] Há vários processos para a produção de ácidos orgânicos em baixo pH usando várias leveduras como hospedeiros de produção. O documento WO 2012/103261 descreve cepas de Issatchenkia orientalis que foram modificadas para produzir succinato ou malato. Estas cepas foram derivadas de um progenitor de tipo selvagem que foi escolhido como o mais resistente em altas concentrações de succinato em baixo pH entre uma coleção de muitas espécies diferentes de leveduras. Em particular, a cepa de I. orientalis escolhida foi mais resistente ao succinato quando comparada com uma cepa de Kluyveromyces marxianus. No entanto, conforme anteriormente descrito (WO 2014/043591), foi isolada uma nova cepa de K. marxianus de tipo selvagem que é mais tolerante ao succinato em baixo pH do que uma cepa de I.

orientalis, quando cultivada em um meio rico. Assim, há claramente alguma variabilidade entre diferentes cepas dentro de uma espécie com relação à tolerância a ácidos orgânicos em baixo pH e as condições precisas sob as quais a escolha é feita podem influenciar o resultado de tais escolhas. Adicionalmente, foram desenvolvidas cepas de Saccharomyces cerevisiae para a produção de succinato, porém, novamente, a cepa de K. marxianus descrita (WO 2014/043591) é mais resistente ao succinato em baixo pH. Além disso, K. marxianus pode fermentar xilose nativamente, por isto tem uma segunda vantagem sobre a S. cerevisiae como levedura hospedeira para a produção de succinato.

[0009] Apesar da vantagem teórica de produzir ácidos dicarboxílicos, tal como ácido succínico, em fermentações de baixo pH com leveduras, em virtude da compartimentalização subcelular na forma de organelas ligadas à membrana em leveduras, desenvolver a produção de succinato em leveduras não é tão direta como em E. coli ou outra bactéria. Primeiro, em Saccharomyces, e provavelmente na maioria das leveduras, se não todas, sob condições aeróbicas, o ciclo de TCA funciona dentro das mitocôndrias ou promitocôndrias (WO 2008/128522, WO 2010/043197). Na ausência de transportadores de succinato específicos, a membrana interna mitocondrial é impermeável ao succinato (Lee et al., 2011), porém, sabe-se que os transportadores de proteínas importam succinato para as mitocôndrias em troca de fumarato ou fosfato (Palmieri et al., 2000). Contudo, não há mecanismos conhecidos para secretar o succinato da mitocôndria para o citoplasma, de modo que o succinato produzido a partir do ciclo de TCA,

mesmo em um modo ramificado, não seria facilmente transportado para fora das mitocôndrias e, portanto, para fora da célula.

Como tal, foi reconhecido no estado da técnica que seria desejável desenvolver a biossíntese de ácidos dicarboxílicos, tais como malato e succinato no citoplasma, organizando enzimas-chave na via redutiva para malato e succinato, tais como piruvato carboxilase, malato desidrogenase e fumarase, para estarem presentes e suficientemente ativas no citoplasma, fora das mitocôndrias

(US 2008/0090273, US 2012/0040422, WO 2010/003728, WO

2011/023700, WO 2009/101180 e WO 2012/038390, WO

2008/128522, WO 2010/043197). No entanto, o estado da técnica não reconheceu ou abordou completamente o problema de como exportar o succinato das mitocôndrias ou como obter equilíbrio redox sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas, ao mesmo tempo em que maximiza o rendimento de succinato a partir de glicose ou outra fonte de carbono em leveduras.

Além disso, a regulação da produção e atividades de todas as enzimas relevantes, tanto dentro como fora das mitocôndrias, é extremamente complicada e não é óbvio como desenvolver níveis adequados.

Finalmente, a membrana mitocondrial não é permeável ao NAD e NADH, e não é óbvio como obter um equilíbrio redox eficiente entre a matriz mitocondrial e o citoplasma sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas. A invenção descrita aqui reconhece estes desafios e fornece soluções para estes problemas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção fornece células de levedura com vias metabólicas alteradas úteis na produção de ácido orgânico, tais como ácido málico, ácido fumárico e ácido succínico, no citoplasma. Mais especificamente, a presente invenção fornece células de levedura com vias metabólicas redox equilibradas operacionais no citoplasma e que são úteis na produção de ácido succínico.

[0011] Em uma modalidade, as células de levedura recombinantes da presente invenção têm uma via redutiva de ácido succínico a partir de fosfoenol piruvato a ácido succínico que é operacional no citoplasma e envolve as enzimas piruvato quinase, enzima málica, fumarase e fumarato redutase.

[0012] Em outra modalidade, as células de levedura recombinante da presente invenção têm uma via redutiva de ácido succínico a partir de fosfoenol piruvato a ácido succínico e operacional dentro do citoplasma e envolvem as enzimas fosfoenol piruvato carboxilase, fosfoenol piruvato carboxiquinase, malato desidrogenase, fumarase e fumarato redutase.

[0013] A presente invenção também fornece células de levedura nas quais a via redutiva para a produção de ácido succínico operacional no citoplasma é redox equilibrada por meio de aumento da operação de uma via de pentose fosfato dentro do citoplasma. Um aumento no nível de equivalentes redutivos resultante da operação aprimorada de uma via de pentose fosfato ajuda a satisfazer os equivalentes redutivos necessários para a operação de uma via redutiva para a produção de ácido succínico no citoplasma. Em um aspecto desta modalidade, o aprimoramento da operação da via da pentose fosfato é alcançado por meio de aumento da atividade de uma enzima glicose-6-fosfato desidrogenase. Em outro aspecto desta modalidade, o aprimoramento da operação da via da pentose fosfato é alcançado por meio do bloqueio da atividade de fosfoglicose isomerase. Em ainda outra modalidade da presente invenção, o aprimoramento da operação de uma via de pentose fosfato é alcançado por meio de aumento da atividade de uma enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e por meio de bloqueio da atividade de fosfoglicose isomerase.

[0014] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece células de levedura uma derivação de glioxilato modificado operacional no citoplasma, o que poderia fornecer os equivalentes redutivos adicionais necessários para equilíbrio redox da via redutiva para a via de ácido succínico operacional no citoplasma. Em um aspecto desta modalidade, a piruvato formato liase é expressa no citoplasma para produzir formato e acetil-CoA no citoplasma. O formato produzido a partir de piruvato sofre a ação da enzima formato desidrogenase para produzir NADH e CO2. Em outro aspecto desta modalidade, as enzimas mitocondriais, tais como citrato sintase, isocitrato liase e malato sintase, são expressas no citoplasma para que haja uma produção direta de ácido succínico a partir da operação de uma derivação de glioxilato modificado, além da introdução de uma via redutiva adicional para a produção de ácido succínico operacional no citoplasma.

[0015] A menos que definido de outra forma, todos os termos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a invenção se refere. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências citadas aqui são incorporados por referência na íntegra. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições e nomenclaturas, prevalecerá. Os materiais, métodos, exemplos e desenhos incluídos aqui são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A Figura 1 é um diagrama que representa as vias do fluxo de carbono em uma célula de levedura. A caixa externa nesta figura representa a membrana externa/parede celular de uma célula de levedura. A caixa dentro da célula de levedura representa as mitocôndrias. O piruvato que entra nas mitocôndrias se combina com o ácido oxaloacético (OAA) e inicia o ciclo de ácido cítrico, conforme mostra as setas sólidas. O carbono proveniente do ciclo de ácido cítrico também entra no ciclo de glioxilato, conforme mostrado pelas setas em linhas pontilhadas e tracejadas. Há também reações de carboxilação no citosol, levando à conversão de piruvato e fosfoenol piruvato (PEP) em ácido oxaloacético e, finalmente, levando à produção de ácido succínico através de uma via redutiva, conforme mostrado pelas setas em linhas tracejadas. A via fermentativa de piruvato em etanol é mostrada por setas em linhas pontilhadas.

[0017] A Figura 2 é um diagrama que representa a via redutiva para a produção de ácido succínico nas células de levedura. O fosfoenol piruvato (PEP) é carboxilado por uma enzima fosfoenol piruvato carboxiquinase (Pck) para produzir uma molécula de oxaloacetato (OAA). Quando uma molécula de oxaloacetato é convertida em uma molécula de succinato, dois equivalentes redutivos são consumidos. O PEP também pode sofrer a ação da piruvato quinase para produzir piruvato, o qual pode ser carboxilado pela piruvato carboxilase para produzir oxaloacetato.

[0018] A Figura 3 é um diagrama que representa a via para a produção de malato no citoplasma a partir de fosfoenol piruvato (PEP). A piruvato quinase (Pyk) atua sobre o PEP para produzir piruvato, o qual sofre a ação de uma enzima málica dependente de NADH ou uma enzima málica dependente de NADPH na presença de dióxido de carbono para produzir malato, o qual pode entrar na via redutiva.

[0019] A Figura 4 é um diagrama que representa as vias para a produção de malato a partir de PEP no citoplasma. O fosfoenol piruvato (PEP) é carboxilado pela piruvato quinase (Pck) ou fosfoenol piruvato carboxilase (Ppc) para produzir ácido oxaloacetato, o qual é reduzido pela malato desidrogenase usando NADH para produzir malato. O PEP também pode sofrer a ação da Pyk para produzir piruvato, o qual pode ser carboxilado para obter oxaloacetato o qual, por sua vez, pode ser reduzido em malato. Além disso, o piruvato pode ser carboxilado por uma enzima málica dependente de NADH ou uma enzima málica dependente de NADPH para produzir malato. Independentemente da via de produção, o malato atua como ponto de partida para a via redutiva da produção de ácido succínico no citoplasma da célula de levedura.

[0020] A Figura 5 é um diagrama que representa o fluxo de carbono através da via de pentose fosfato. A glicose-6- fosfato (glicose) é submetida à glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF) para produzir ribulose-5-fosfato (Ru5P). No curso normal das reações glicolíticas dentro da célula de levedura, a glicose-6-fosfato é convertida em glicose-1-fosfato por uma enzima fosfoglicose isomerase (não representada). A fim de aumentar o fluxo de carbono na via de pentose fosfato, a atividade de ZWF é aumentada, enquanto que a atividade da enzima fosfoglicose isomerase é diminuída ou inibida.

[0021] A Figura 6 é um diagrama que representa o fluxo de piruvato e acetato através da membrana mitocondrial mostrada nesta figura como duas linhas verticais. O piruvato proveniente da glicólise no citoplasma entra na mitocôndria através de difusão simples. O piruvato é descarboxilado para produzir acetil-CoA, o qual é usado para produzir succinil- CoA e acetato. O acetato se difunde das mitocôndrias através de difusão simples e sofre a ação da acetil-CoA sintase para produzir acetil-CoA o qual, por sua vez, se combina com oxaloacetato para produzir citrato ácido. O citrato entra na derivação de glioxilato para produzir glioxilato e succinato (SAC). A área à esquerda das duas linhas verticais representa as mitocôndrias e a área à direita das duas linhas verticais representa o citoplasma.

[0022] A Figura 7 é um diagrama que representa a formação de acetil CoA no citoplasma. A piruvato formato liase (PFL) atua sobre o piruvato para produzir formato e acetil-CoA. O formato sofre a ação da formato desidrogenase para produzir dióxido de carbono e NADH. O acetil-CoA reage com o ácido oxaloacetato para produzir ácido cítrico que isomeriza para produzir isocitrato o qual, por sua vez, é dividido em glioxilato e succinato. O glioxilato e acetil- CoA se combinam para produzir malato, o qual é finalmente convertido em ácido succínico.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0023] Para facilitar o entendimento da invenção, várias definições e nomenclaturas são fornecidas aqui.

[0024] Um gene ou região codificadora de uma bactéria, tal como E. coli é, em geral, nomeado com três letras minúsculas em itálico, algumas vezes seguido por uma letra maiúscula, por exemplo, "mdh" para o gene que codifica a malato desidrogenase e "fumB" para o gene que codifica fumarase B. A enzima ou proteína codificada por um gene pode ser nomeada com as mesmas letras, porém, com a primeira letra maiúscula e sem itálico, por exemplo "Mdh" para malato desidrogenase e "FumB" para fumarase B. Um gene ou região codificadora de uma levedura, tal como S. cerevisiae ou K.

marxianus é, em geral, nomeado com três letras maiúsculas, algumas vezes seguidas de um número inteiro, tudo em itálico, por exemplo "PDC1" para um gene que codifica piruvato descarboxilase. A enzima ou proteína codificada por um gene pode ser nomeada com as mesmas letras, porém, com a primeira letra maiúscula e sem itálico, por exemplo, "Pck" para fosfoenol piruvato carboxiquinase. A enzima ou proteína também pode ser denominada pelo nome mais descritivo, por exemplo, malato desidrogenase, fumarase B e PEP carboxiquinase para os exemplos supracitados. Ao se referir a um gene ou enzima de uma espécie específica de levedura, um par de letras que abrevia a primeira letra do gênero e espécie pode ser colocado na frente do gene ou enzima para designar uma versão específica do gene ou enzima. Por exemplo, "ScMDH1" designa um gene que codifica a isozima 1 de malato desidrogenase de S. cerevisiae, enquanto que "KmMDH1" designa uma isozima 1 de malato desidrogenase de K.

marxianus. Observe que tais designações não são necessariamente únicas, uma vez que qualquer designação específica pode não estar limitada a uma sequência de DNA ou proteína específica, já que qualquer espécie pode ter muitas cepas diferentes, e diferentes cepas podem ter genes ou enzimas diferentes que desempenham a mesma função. Além disso, um gene ou região codificadora que codifica uma enzima exemplificativa que tem uma atividade catalítica específica pode ter vários nomes diferentes em virtude de origens historicamente diferentes ou porque o gene se origina de uma espécie diferente. Por uma questão de brevidade no presente relatório descritivo, e uma vez que um gene pode ser transferido de um micróbio para outro, um nome que consiste em três letras maiúsculas pode se referir a um gene ou enzima de uma bactéria ou levedura. Por exemplo, "PCK" pode se referir a uma fosfoenol piruvato carboxiquinase ou a um gene que codifica a fosfoenol piruvato carboxiquinase em ou de uma bactéria ou em ou de uma levedura. Se a designação em três letras maiúsculas se refere a um gene ou proteína pode ser inferido a partir do contexto de uso específico.

[0025] Qualquer ácido carboxílico ou ácido dicarboxílico pode ser denominado usando um nome de ácido livre, tal como "ácido succínico", ou como um sal, éster, tioéster ou amida; neste caso, o nome seria "succinato". Sob condições fisiológicas, o ácido livre e o sal estarão ambos presentes até certo ponto; portanto, para fins da presente invenção, os dois tipos de nomes devem se referir a ambas as formas. O mesmo vale para todos os outros ácidos orgânicos.

[0026] O termo "cassete de expressão" ou "cassete" significa uma sequência de DNA que pode ser parte de um cromossomo ou plasmídeo que contém pelo menos um promotor e um gene ou região que codifica uma enzima ou outra proteína, de modo que a região codificadora seja expressa pelo promotor e a enzima ou proteína seja produzida por uma célula hospedeira que contém a sequência de DNA. Um "cassete de expressão" pode ser pelo menos parcialmente sintético ou construído por meio de métodos de engenharia genética, de modo que a região codificadora seja expressa a partir de um promotor que não esteja naturalmente associado à região codificadora. Opcionalmente, o "cassete de expressão" pode conter um terminador de transcrição que pode ou não ser um terminador que está naturalmente associado à região codificadora. Um "cassete de expressão" pode ter regiões codificadoras para mais de uma proteína; neste caso, ele pode ser denominado óperon ou óperon sintético.

[0027] O termo "promotor constitutivo forte" significa uma sequência de DNA que normalmente fica a montante (do lado 5' de um gene quando representado na orientação 5' para 3' convencional) de uma sequência de DNA ou um gene que é transcrito por uma RNA polimerase e que faz com que a dita sequência de DNA ou gene seja expresso através de transcrição por uma RNA polimerase em um nível que é facilmente detectado direta ou indiretamente por qualquer procedimento de ensaio apropriado. Exemplos de procedimentos de ensaio apropriados incluem (1) transcriptase reversa quantitativa mais reação em cadeia de polimerase (PCR), (2) ensaio enzimático de uma enzima codificada, (3) gel de proteína corado com azul de

Coomassie ou (4) produção mensurável de um metabólito que é produzido indiretamente como um resultado da dita transcrição e tal transcrição mensurável ocorre independentemente da presença ou ausência de uma proteína que regula especificamente o nível de transcrição, um metabólito ou substância química indutora.

Um exemplo de um promotor que não é um "promotor constitutivo forte" é o promotor do óperon de lactose de E. coli ou o promotor na frente do gene KmLAC4, uma vez que ambos os genes são negativamente regulados na ausência de um indutor, tal como lactose.

Usando métodos bem conhecidos na técnica, um

"promotor constitutivo forte" pode ser usado para substituir um promotor nativo (um promotor que existe naturalmente a montante de uma sequência de DNA ou gene), resultando em um cassete de expressão que pode ser colocado em um plasmídeo ou cromossomo e que confere um nível de expressão de uma sequência de DNA ou gene desejado em um nível superior ao nível do promotor nativo.

Um promotor constitutivo forte pode ser específico para uma espécie ou gênero, porém, muitas vezes um promotor constitutivo forte de uma bactéria ou levedura pode funcionar bem em uma bactéria ou levedura distante, respectivamente. Por exemplo, um promotor de S.

cerevisiae pode funcionar bem em K. lactis ou K.

marxianus (Lee et al., 2012). Exemplos de promotores constitutivos fortes são promotores que controlam a expressão dos genes que codificam enzimas em uma via glicolítica, por exemplo, ENO (enolase), ou uma via fermentativa, por exemplo, PDC ou álcool desidrogenase (ADH), genes que codificam proteínas ribossômicas e genes que codificam fatores de alongamento de tradução, por exemplo, TEF1 (Sun et al., 2012).

[0028] O termo "superexpressão" significa um gene ou região codificadora que faz com que a enzima ou proteína codificada por este gene ou região codificadora seja produzida em um micro-organismo hospedeiro em um nível superior ao nível encontrado na versão de tipo selvagem do micro-organismo hospedeiro sob condições de crescimento iguais ou similares. Isto pode ser realizado, por exemplo, através de um ou mais dos seguintes métodos: (1) incorporação de um promotor mais forte, (2) incorporação de um sítio de ligação ribossômica mais forte, (3) incorporação de um terminador ou um terminador mais forte, (4) melhora da escolha de códons em um ou mais sítios na região codificadora, (5) melhora da estabilidade do mRNA e (6) aumento do número de cópias gênicas, ou por introdução de várias cópias no cromossomo ou colocação de um cassete em um plasmídeo com múltiplas cópias. Diz-se que uma enzima ou proteína produzida a partir de um gene que é superexpresso é "superproduzida". Um gene que está sendo "superexpresso" ou uma proteína que está sendo "superproduzida" pode ser aquela que é nativa de um micro-organismo hospedeiro ou pode ser aquela que foi transplantada por meio de métodos de engenharia genética de um organismo doador para um micro- organismo hospedeiro; neste caso, a enzima ou proteína e o gene ou região codificadora que codifica a enzima ou proteína são denominados "estranhos" ou "heterólogos". Genes e proteínas estranhos ou heterólogos são, por definição, superexpressos e superproduzidos, uma vez que não estão presentes no organismo hospedeiro não manipulado.

[0029] O termo "plasmídeo" significa uma molécula de DNA circular ou linear que é substancialmente menor do que um cromossomo, separada do cromossomo ou cromossomos de um micro-organismo e que se replica separadamente do cromossomo ou cromossomos. Um "plasmídeo" pode estar presente em cerca de uma cópia por célula ou em mais de uma cópia por célula. A manutenção de um plasmídeo dentro de uma célula microbiana requer, em geral, uma seleção de antibióticos, porém, a complementação de uma auxotrofia também pode ser usada.

[0030] A incorporação dos cassetes de expressão pode ser realizada por meio de integração não homóloga ou, de preferência, homóloga, no cromossomo ou pela incorporação de um plasmídeo de replicação que contém os cassetes desejados. A montagem de mais de um gene, cada um com seu próprio promotor e terminador, em um pacote que pode ser manipulado como uma sequência de DNA contígua para integração em um cromossomo ou em um plasmídeo de replicação, é bem conhecida na técnica (Shao et al., 2012).

[0031] O termo "heterólogo" significa um gene ou proteína que não é natural ou nativamente encontrada em um organismo, mas que pode ser introduzida em um organismo por meio de engenharia genética, tal como através de transformação, cruzamento ou transdução. Um gene heterólogo pode ser integrado (inserido) em um cromossomo ou contido em um plasmídeo.

[0032] O termo "exógeno" significa um gene ou proteína que foi introduzido ou alterado em um organismo com o objetivo de aumentar, diminuir ou eliminar uma atividade por meio de engenharia genética, tal como transformação, cruzamento, transdução ou mutagênese. Um gene ou proteína exógena pode ser heteróloga ou pode ser um gene ou proteína nativa do organismo hospedeiro, porém, que foi alterada através de um ou mais métodos, por exemplo, mutação,

eliminação, alteração do promotor, alteração do terminador, duplicação ou inserção de uma ou mais cópias adicionais no cromossomo ou em um plasmídeo. Assim, por exemplo, se uma segunda cópia do gene KmPCK for inserida em um sítio no cromossomo distinto do sítio nativo, a segunda cópia seria exógena.

[0033] O termo "homólogo" significa um primeiro gene, sequência de DNA ou proteína que é um segundo gene, sequência de DNA ou proteína que desempenha uma função biológica similar àquela do dito primeiro gene, sequência de DNA ou proteína e que tem uma identidade de sequência estatisticamente significativa (ao comparar sequências de proteínas ou comparar uma sequência de proteínas derivada de uma sequência gênica usando o código genético apropriado) com o dito primeiro gene ou proteína, conforme determinado pelo programa de computador BLAST para comparação de sequências (Saliola et al., 2004; Altschul et al., 1997; Altschul et al., 1990) e permitir eliminações e inserções. Um exemplo de um homólogo do gene ScURA3 de S. cerevisiae, o qual codifica orotidina-5-fosfato descarboxilase, seria o gene KmURA3 de K. marxianus.

[0034] O termo "análogo" significa um primeiro gene, sequência de DNA ou proteína que é um segundo gene, sequência de DNA ou proteína que desempenha uma função biológica similar àquela do dito primeiro gene, sequência de DNA ou proteína, porém, onde não há identidade de sequência estatisticamente significativa (ao comparar sequências de proteínas ou comparar a sequência de aminoácidos derivada de sequências gênicas) com o dito primeiro gene, sequência de DNA ou proteína, conforme determinado pelo programa de computador BLAST para comparação de sequências (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997) e permitir eliminações e inserções. Por exemplo, o gene KmFum1p, fumarase 1 de K.

marxianus, é um análogo do gene FumB de E. coli, uma vez que ambos funcionam como fumarase, mas não há homologia de sequência significativa entre as duas enzimas ou seus respectivos genes. Aqueles versados conhecedores da técnica saberão que muitas enzimas e proteínas que têm uma função biológica específica, por exemplo, fumarase ou malato desidrogenase, podem ser encontradas em muitos organismos diferentes como homólogos ou análogos e, contanto que os membros de tais famílias de enzimas ou proteínas compartilhem a mesma função, embora possam ter uma estrutura leve ou substancialmente diferente, os diferentes membros da mesma família podem, em muitos casos, ser usados para desempenhar a mesma função biológica usando os presentes métodos de engenharia genética. Assim, por exemplo, o gene KmFum1p de fumarase de K. marxianus e o gene FumB de fumarase de E.

coli catalisam a mesma reação, de modo que ambos podem resultar na produção de ácido fumárico e, finalmente, ácido succínico no contexto apropriado e a escolha de qual usar, em última análise, pode ser feita ao escolher aquele que leva a um titulação mais alta de ácido fumárico ou succínico sob condições de fermentação similares.

[0035] O termo "mutação" significa qualquer alteração em uma sequência de DNA que a torne diferente de uma sequência de tipo selvagem relacionada. Uma "mutação" pode compreender uma única alteração de base, eliminação, inserção, substituição, derivação de quadro, inversão, duplicação ou qualquer outro tipo de alteração em uma sequência de DNA. O termo "mutação" se refere, em geral, a uma alteração que tem um efeito negativo sobre a função ou reduz a atividade de um gene ou produto gênico; no entanto, aqui, o termo "mutação" também pode se referir a uma alteração que aumenta a atividade de um gene ou produto gênico. Por exemplo, uma mutação resistente ao feedback no gene aroG de E. coli aumenta a atividade de AroG na presença de um inibidor, tal como fenilalanina. A substituição de um promotor por um promotor diferente e mais forte também resulta em uma mutação que pode aumentar a atividade de um gene ou produto gênico. O termo "mutação nula" significa uma mutação, tal como uma eliminação da maioria ou de todo um gene, que elimina efetivamente a função de um gene.

[0036] O termo "mutante" significa uma cepa ou isolado que compreende uma ou mais mutações quando comparado com uma cepa progenitora ou precursora. Um genótipo de levedura mutante é designado ao escrever o gene com mutação em letras minúsculas em itálico. Por exemplo, ura3 designa que a cepa compreende uma mutação no gene URA3.

[0037] O termo "alteração genética" significa qualquer mutação, inserção ou adição de sequência de DNA ou gene, inserção ou adição de um cassete gênico, duplicação de uma sequência de DNA ou gene, eliminação de uma sequência de DNA, seja no cromossomo da célula hospedeira ou em um plasmídeo incorporado em uma célula hospedeira que resulta, deliberada ou acidentalmente, em um resultado desejado, tal como um aumento ou diminuição de uma atividade enzimática ou um aumento ou diminuição da concentração no estado estacionário ou produção de um metabólito quando a célula resultante da dita alteração genética é comparada com uma célula relacionada que não compreende a dita alteração genética. Em alguns casos, uma alteração genética resultará em um aumento ou diminuição da atividade de uma enzima; neste caso, o resultado desejado pode ser medido pela atividade específica de uma atividade enzimática (por exemplo, em micromoles de substrato consumido ou produto produzido por miligrama de proteína por células inteiras, células permeáveis, extrato celular, preparação de organela (por exemplo, mitocôndria) ou preparação de membrana celular. Em outros casos, uma alteração genética resultará em um aumento na titulação, no rendimento ou na produtividade específica de um metabólito desejado, tal como ácido succínico, o qual pode ser avaliado através de um método analítico apropriado, tal como cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Em outros casos, uma alteração genética resultará em uma diminuição na titulação, no rendimento ou na produtividade específica de um metabolito indesejado, tal como ácido pirúvico ou ácido acético.

[0038] A primeira etapa na manipulação de uma levedura para a produção de succinato a partir de glicose é criar uma cepa hospedeira onde as vias fermentativas indesejadas foram eliminadas. Em leveduras dos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia e Issatchenkia, as vias fermentativas predominantes são para o etanol (mais dióxido de carbono) e o glicerol. A via de etanol pode ser bloqueada pela eliminação de todos os genes que codificam a piruvato descarboxilase (PDC; EC 4.1.1.1). Saccharomyces cerevisiae tem três destes genes, ScPDC1, ScPDC5 e ScPDC6. Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces marxianus têm apenas um, KIPDC1 e KmPDC1, respectivamente. A via de glicerol pode ser bloqueada pela eliminação de todos os genes que codificam a glicerol-3- fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.8; EC 1.1.99.5; EC1.1.1.177; EC 1.1.1.94). S. cerevisiae contém três destes genes, GUT2, GPD1 e GPD2. K lactis contém dois destes genes, KIGUT2 (Saliola et al., 2008) e KIGPD1 (Neves et al., 2004).

[0039] O termo "principal produto de fermentação" significa um produto de fermentação que não água ou dióxido de carbono, produzido em uma concentração maior do que qualquer outro produto de fermentação.

[0040] A eliminação de genes pode ser realizada por meio de vários métodos conhecidos na técnica. Em um de tais métodos, a sequência de DNA que codifica um gene alvo de eliminação (por exemplo, PDC1) pode ser substituída por uma sequência de DNA que codifica um gene que complementa um marcador auxotrófico. Marcadores comumente usados para eliminação e substituição de genes incluem a complementação de auxotrofias de uracila, histidina, adenina, triptofano e leucina, por exemplo, nos mutantes de levedura ura3, his3, ade1, trp5 ou leu2. O uso destes marcadores auxotróficos requer primeiro que as cepas sejam deficientes em uma etapa da via biossintética. Um marcador auxotrófico comumente empregado usa o gene URA3. O gene URA3, quando ligado a um promotor e terminador funcional, permite que a cepa deficiente em orotidina-5-fosfato descarboxilase (ura3)

cresça em um meio mínimo sem uracila.

As cepas deficientes em orotidina-5-fosfato descarboxilase podem ser selecionadas encontrando mutantes capazes de crescer em ácido 5-

fluoroorótico (5-FOA). As cepas com orotidina-5-fosfato descarboxilase funcional incorporam o composto fluorado no

RNA e não são viáveis.

Desta maneira, as cepas podem ser selecionadas a favor ou contra a inclusão de um gene URA3 funcional.

Em geral, a primeira etapa envolve a seleção em um meio sem uracila, onde a presença de URA3 é necessária.

O marcador URA3 pode ser eliminado e reutilizado em um ou mais ciclos adicionais de modificação genética se o gene URA3 for flanqueado, nas duas extremidades, por pelo menos uma cópia da mesma sequência de DNA, ambas na mesma orientação, de modo que a recombinação homóloga entre os dois flancos resulte na eliminação do gene URA3 interveniente.

Esta abordagem pode ser denominada de forma variada como o uso de "repetições em tandem", "sequências de DNA repetidas em tandem",

"sequências de DNA repetitivas", "repetições diretas" e assim por diante.

Quando uma cepa com URA3 flanqueado por repetições em tandem é cultivada em 5-FOA, o gene URA3 é

"eliminado" ou "recirculado" e pode ser reutilizado para subsequente engenharia genética.

[0041] A clonagem dos genes necessários pode ser alcançada por meio de qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, construção de uma biblioteca gênica em um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura apropriado, seguido por rastreio usando uma sonda de DNA ou seleção através de complementação funcional em uma célula hospedeira mutante apropriada, por exemplo, uma cepa de bactéria ou levedura. A sequência de DNA para muitos destes genes foi publicada e está disponível no site do National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, por exemplo, de E. coli, S. cerevisae e Kluyveromyces marxianus. Para estes casos, o gene desejado pode ser amplificado e clonado através de reação em cadeia de polimerase (PCR) e depois clonado em um vetor apropriado. Para obter a sequência de DNA para um gene desejado a partir de um organismo para o qual a sequência de DNA ainda não foi publicada, por exemplo, de Issatchenkia orientalis ou Kluyveromyces marxianus, pode-se obter a sequência de DNA para todo o genoma por meio de métodos bem estabelecidos e localizar o gene desejado através de homologia com um gene conhecido de outro organismo (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 1990). Então, o gene desejado pode ser amplificado por PCR e clonado em um vetor de expressão ou cassete de expressão apropriado. As sequências de DNA desejadas também podem ser obtidas por meio da encomenda de fragmentos sintéticos, por exemplo, como "gBlocks" da Integrated DNA Technologies, Woodland, Texas, EUA. Os fragmentos de DNA podem ser unidos através de ligação convencional ou por meio do método de "Gibson" usando um kit NEBuilder da New England Biolabs, Ipswitch, Massachusetts, EUA.

[0042] Após clonagem de cada gene desejado, qualquer sequência que direcione a proteína nativa (tipo selvagem) para uma organela subcelular que não o citoplasma pode ser eliminada ou sofrer mutação para impedir substancialmente a importação da proteína para a dita organela. Métodos para realizar isto são bem conhecidos na literatura. Por exemplo, sabe-se que a sequência de proteínas N-terminal de uma proteína direcionada à matriz mitocondrial (a câmara interna da mitocôndria) pode ser eliminada para redirecionar a proteína para o citoplasma. As "sequências de direcionamento N-terminal" também são denominadas de sequências de direcionamento à matriz (MTSs), uma vez que elas também levam o N-término através da membrana interna para a matriz. Na ausência de mais informações sobre seleção, elas direcionam proteínas para a matriz.

Elas foram estudadas em detalhes consideráveis e suas principais características são conhecidas há mais de 10 anos.

Elas consistem em cerca de 10 a 80 resíduos de aminoácidos que têm o potencial de formar hélices anfipáticas com uma face hidrofóbica e uma carregada positivamente.

Não há consenso quanto à estrutura primária a qual, muitas vezes, difere consideravelmente mesmo entre ortólogos intimamente relacionados.

No entanto, as propriedades gerais destas hélices anfipáticas são

"amplamente conservadas entre fungos e animais" (Neuport e

Hermann, 2007). Um exemplo específico é que a fumarase de tipo selvagem codificada pelo gene ScFUM1 é direcionada tanto para as mitocôndrias quanto para o citoplasma, porém,

se as sequências de DNA que codificam os 17 aminoácidos N-

terminais forem eliminadas, nenhuma enzima será encontrada nas mitocôndrias (Stein et al., 1994). Um exemplo de redirecionamento de uma malato desidrogenase peroxissômica ao citoplasma foi obtido ao eliminar os 9 pares de bases que codificam a sequência tripeptídica C-terminal, SKL,

do gene MDH3 (Zelle et al., 2008). Além de eliminar ou alterar qualquer sequência de direcionamento de organelas,

o gene para cada enzima desejada pode ser funcionalmente acoplado a um promotor constitutivo.

Em uma modalidade preferida, cada um dos genes desejados é acoplado a um promotor diferente, de modo que os cassetes de expressão gênica individuais possam ser montados juntos em um cassete da via sem ter quaisquer sequências de DNA substancialmente repetidas no cassete de via o que, por sua vez, torna mais conveniente integrar o cassete da via montado em um cromossomo da cepa hospedeira pretendida ou em um plasmídeo como um veículo para introdução do cassete da via. Após montagem do cassete da via, ele é incorporado na cepa hospedeira descrita acima.

[0043] A incorporação de cassetes de expressão pode ser realizada por meio de integração não homóloga ou, de preferência, homóloga, no cromossomo ou pela incorporação de um plasmídeo de replicação que contém os cassetes desejados. Opcionalmente, a incorporação de um cassete de expressão pode ser combinada com a eliminação de um ou mais dos genes indesejados, por exemplo, KmPDC1, de modo que o cassete substitua o gene indesejado ao realizar duas das etapas desejadas ao mesmo tempo. O promotor gênico indesejado pode ser arranjado para ser usado para controlar a expressão de um dos genes desejados. Por exemplo, a integração de um cassete concebido para conferir expressão do gene pck de E. coli no locus KmPDC1 pode ser concebida para que o quadro de leitura aberta do pck substitua precisamente o quadro de leitura aberta do KmPDC1. Se mais de um gene tiver de ser expresso a partir do cassete, ele poderá ser arranjado de modo que o último gene da matriz seja funcionalmente acoplado ao terminador KmPCD1.

[0044] O termo "via biossintética de ácido succínico" significa qualquer série de reações químicas enzimáticas e opcionalmente não enzimáticas que começam com uma ou mais fontes de carbono, tais como açúcar ou glicerol, e que levam finalmente ao ácido succínico. Há três vias biossintéticas tradicionais de ácido succínico: o ramo redutivo de TCA, o ramo oxidativo de TCA e a derivação de glioxilato (Figura 1). Uma quarta nova via, a qual envolve uma enzima málica, é um dos aspectos desta patente. Uma "enzima málica" é uma enzima que converte piruvato diretamente em malato pela adição de dióxido de carbono e um equivalente redutivo, ignorando o oxaloacetato como intermediário. Há duas versões da enzima málica encontradas na natureza. A primeira versão é denominada "enzima málica dependente de NADH", também conhecida como EC 1.1.1.39 e EC 1.1.1.38, a qual prefere NADH ao NADPH como cofator. Em outras palavras, a enzima tem uma afinidade mais alta (menor Km) pelo NADH do que pelo NADPH ou é capaz de atingir um Vmax mais alto ao usar NADH como um cossubstrato do que ao usar NADPH como um cossubstrato. A segunda versão é denominada "enzima málica dependente de NADPH", também conhecida como EC 1.1.1.40, a qual prefere NADPH ao NADH como seu cofator. Em outras palavras, a enzima tem uma afinidade maior (menor Km) pelo NADPH do que pelo NADH ou é capaz de atingir um Vmax mais alto ao usar NADPH como um cossubstrato do que ao usar NADH como um cossubstrato.

[0045] O ramo redutivo de TCA (a via redutiva para a produção de succinato) começa com a carboxilação de fosfoenol piruvato (PEP) ou piruvato para produzir oxaloacetato (Figura 2). A carboxilação de PEP pode ser realizada através de qualquer uma das enzimas fosfoenol piruvato carboxilase (PPC) ou fosfoenol piruvato carboxiquinase (PCK). O uso da enzima PCK é preferido em uma via produtora de succinato, uma vez que um trifosfato de adenosina (ATP) é gerado juntamente com oxaloacetato. A carboxilação do piruvato pode ser alcançada pela piruvato carboxilase (PYC). O oxaloacetato é reduzido em malato pela malato desidrogenase (MDH). O malato é convertido em fumarato pela fumarase (FUM). Finalmente, o succinato é produzido a partir de fumarato pela fumarato redutase (FRD). O ramo redutivo de TCA é uma via de alto rendimento, porém, é um consumidor líquido de equivalentes redutivos na forma de NADH, NADPH e/ou FADH. O termo "equivalente redutivo" significa uma forma quimicamente reduzida de hidrogênio que é transportada por um cofator redox e pode ser usada por uma enzima para reduzir quimicamente um substrato.

Por exemplo, NADH é a forma reduzida do dinucleotídeo nicotinamida adenina, o qual pode doar seu átomo de hidrogênio reduzido ao fumarato para formar succinato, catalisado pela enzima fumarato redutase.

Em tal reação, o cofator é convertido à forma oxidada, neste exemplo NAD, que precisa ser reciclada novamente à forma reduzida para funcionar em uma via biossintética de ácido succínico.

O termo "cofator redox"

significa qualquer composto que é usado como cossubstrato em uma reação enzimática para doar um equivalente redutivo a outro substrato ou receber um equivalente redutivo de outro substrato.

Os cofatores redox existem em pares de formas reduzida e oxidada.

Exemplos de tais pares incluem, mas não estão limitados a, NADH/NAD (algumas vezes escrito como

NAD+), NADPH/NADP (algumas vezes escrito como NADP+),

FAD/FADH (algumas vezes escrito como NADH2) e FMN/FMNH

(algumas vezes escrito como FMNH2). O termo "cofator redutivo" significa a forma quimicamente reduzida de um cofator redox, por exemplo, NADH, NADPH, FADH ou

FMNH.

Durante a glicólise, um equivalente redutivo é produzido (NADH) durante a produção de PEP, porém, são necessários dois equivalentes redutivos (por exemplo, NADH,

NADPH e/ou FADH) para a conversão de PEP em succinato.

O processo de fornecer o nível necessário de equivalentes redutivos para operação da via redutiva para a produção de ácido succínico no citoplasma usando os equivalentes redutivos gerados a partir da via oxidativa de ácido succínico ou via de glioxilato em ácido succínico é denominado redox, o qual equilibra a via redutiva para a produção de ácido succínico no citoplasma.

[0046] Tanto o ramo oxidativo de TCA quanto a derivação de glioxilato constituem vias de menor rendimento para succinato do que o ramo redutivo de TCA, mas também podem fornecer os equivalentes redutivos adicionais necessários para alcançar o equilíbrio redox para a biossíntese de succinato pela via redutiva de glicose ou outras fontes de carbono de carboidratos sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas. O ramo oxidativo de TCA (produção oxidativa de ácido succínico) começa com a citrato sintase (CIT) que forma citrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato. O citrato é convertido em isocitrato pela aconitase (ACN). A isocitrato desidrogenase (IDH) converte o isocitrato em - cetoglutarato, o qual é posteriormente convertido em succinil-CoA pela alfa-cetoglutarato desidrogenase (KGD). O succinato é, então, produzido a partir de succinil-CoA pela succinil-CoA sintetase (SCS) ou succinato tioquinase ou succinato-CoA ligase. A succinato-CoA ligase é uma enzima que catalisa a reação reversível de succinil-CoA em succinato. Para cada succinato produzido através do ramo oxidativo de TCA, são produzidos cinco equivalentes redutivos. Durante a operação da derivação de glioxilato (via de glioxilato para a produção de ácido succínico), o isocitrato é dividido em succinato e glioxilato pela isocitrato-liase (ICL). A malato sintase (MLS) forma malato a partir de glioxilato e acetil-CoA. O malato é, então, convertido em fumarato e depois em succinato. Os equivalentes redutivos máximos produzidos através da derivação de glioxilato são oito equivalentes redutivos para cada quatro moléculas de succinato produzidas a partir de três moléculas de glicose.

[0047] O equilíbrio redox de uma via redutiva para a produção de succinato no citoplasma com os equivalentes redutivos gerados a partir da operação de uma via oxidativa para a produção de succinato, tal como a direção oxidativa do ciclo de TCA ou uma via de glioxilato, não é fácil de alcançar, então ainda há a necessidade de identificar vias dentro das células de levedura que possam fornecer equivalentes redutivos necessários para operação da via redutiva para a produção de ácido succínico no citoplasma. Vias adicionais para a produção de succinato precisam produzir equivalentes redutivos suficientes.

[0048] Uma fonte alternativa para a redução de equivalentes é a via da pentose fosfato (PPP). A via de pentose fosfato é uma fonte de equivalentes redutivos

(NADPH), bem como uma fonte de dióxido de carbono e cinco fosfatos de açúcar de carbono necessários para a síntese de nucleotídeos.

Depois que a glicose entra na célula e é fosforilada a glicose-6-fosfato, a PPP oxidativa converte glicose-6-fosfato em ribulose-5-fosfato juntamente com duas moléculas de NADPH e um CO2 pelas enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD ou ZWF), 6-fosfogluconolactonase (SOL ou

PGL) e 6-fosfogluconato desidrogenase (GND). Ao aumentar a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase e/ou 6-

fosfogluconolactonase (PGL) e/ou 6-fosfogluconato desidrogenase (GND) e/ou diminuir a atividade de glicose-6-

fosfato isomerase (PGI), pode-se orientar a um aumento no fluxo de carbono através da PPP, gerando os equivalentes redutivos necessários para equilibrar o ramo redutivo de TCA para a produção de succinato (Figura 3). A PGI pode ser reduzida em atividade ou completamente inativada através de uma eliminação genética ou outra mutação, deste modo,

forçando todo o fluxo de carbono da glicose através da

PPP.

Uma eliminação de PGI causa uma eliminação de crescimento em glicose em Saccharyomyces cerevisiae, porém,

em outros micro-organismos (por exemplo, a bactéria E.

coli ou a levedura Kluyvermyces lactis), uma eliminação de

PGI é tolerada.

Em geral, o crescimento celular é dificultado nestas bases de cepas deficientes em PGI, pelo menos inicialmente.

Mutantes de PGI foram estudados e os mutantes de crescimento mais rápido foram caracterizados (Sekar et al., 2017). Para restaurar o crescimento parcial ou total quando comparado com as cepas de tipo selvagem, as células precisam usar o excesso de equivalentes redutivos produzidos via PPP.

Em E. coli, o NADPH pode ser convertido em NADH, o qual é mais facilmente usado pela célula para a biossíntese de succinato.

As cepas evoluídas frequentemente abrigam mutações na transidrogenase solúvel ou ligada à membrana que permite a interconversão destes equivalentes redutivos.

Além disso, foi mostrado que o aumento do fluxo para a PPP pelo aumento da atividade de ZWF melhora as taxas de crescimento de cepas deficientes em PGI (Sekar et al., 2017). Assim, em uma modalidade, o fluxo através da PPP de glicose-6-fosfato para gliceraldeído-3-fosfato e frutose-6-fosfato é aprimorado por uma ou mais alterações genéticas que aumentam a atividade de uma ou mais enzimas da PPP e/ou bloqueiam ou reduzem o fluxo diretamente através da via de Embden-

Meyerhof-Parnas, diminuindo ou eliminando a atividade de fosfoglicose isomerase (PGI). As enzimas PPP incluem glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF), 6-

fosfogluconolactonase (PGL), 6-fosfogluconato desidrogenase (GND), transcetolase (TKT), transaldolase (TAL), ribulose- 5- fosfato epimerase (RPE) e ribulose-5-fosfato isomerase (RPI).

[0049] Conforme mencionado anteriormente, a derivação de glioxilato é comumente usada como uma fonte para equivalentes redutivos durante a produção de succinato, porém, particularmente em leveduras, esta via sofre limitações consideráveis. Em leveduras concebidas para a produção de outros produtos que não o etanol, a piruvato descarboxilase (PDC) é responsável por subprodutos indesejáveis, acetaldeído e etanol. A eliminação de piruvato descarboxilase da levedura também elimina a única fonte totalmente citosólica de acetil-CoA. Nas bases de cepas deficientes em PDC, o piruvato deve ser transportado para a mitocôndria e convertido em acetil-CoA pela piruvato desidrogenase (PDH). O acetil-CoA é, então, convertido em acetato dentro da mitocôndria e depois transportado de volta para o citosol, onde a acetil-CoA sintase (ACS) pode converter o acetato em acetil-CoA. Esta via tortuosa não apenas é ineficiente, como também resulta em maior gasto de energia pela célula. O acetil-CoA produzido pela ACS usa ATP e resulta em AMP, exigindo muito mais energia do que a formação de acetil-CoA pela via tradicional. Uma via bacteriana comum para acetil-CoA depende da piruvato formato-liase (PFL). A PFL converte o piruvato em acetil-CoA e formato. O formato pode ser adicionalmente oxidado em CO2 pela formato desidrogenase (FDH), produzindo equivalentes redutivos necessários para a produção de succinato. A PFL requer a proteína catalítica e uma enzima ativadora. Sabe- se que a PFL é uma enzima sensível ao oxigênio que requer reativação para atividade. Grupos anteriores expressaram PFL em S. cerevisiae e mostraram que ele é capaz de produzir acetil-CoA necessário pela célula no lugar das vias nativas. Estudos posteriores mostraram que a coexpressão de ferredoxinas pode melhorar significativamente a tolerância ao oxigênio da enzima quando expressa em leveduras (Zhang et al., 2015). O acetil-CoA produzido a partir de PFL pode ser usado pelas enzimas na derivação de glioxilato e os equivalentes redutivos formados pela FDH podem ser usados no ramo redutivo de TCA (Figuras 4 e 5).

EXEMPLOS Exemplo 1 Incorporação da Via Redutiva de TCA

[0050] Em levedura, as enzimas envolvidas no ciclo de TCA são direcionadas à mitocôndria. A glicólise até a produção de piruvato e oxaloacetato ocorre no citoplasma. Para ter uma via ideal de produção de succinato,

é preferível ter todas as enzimas necessárias no citoplasma. Para um ramo redutivo citoplasmático de TCA, as enzimas MDH, FUM e FRD devem estar localizadas no citoplasma. Isto pode ser conseguido ao expressar genes bacterianos que não têm uma sequência de direcionamento mitocondrial ou eliminar a sequência de direcionamento mitocondrial encontrada nas proteínas de levedura. Além disso, também é desejável um aumento da atividade de PCK para produzir uma via mais energeticamente favorável ao succinato. Uma elevada atividade de MDH, FUM, FRD e PCK pode ser alcançada ao associar a expressão dos genes a promotores de alta resistência. Exemplos destes promotores de alta resistência incluem, mas não estão limitados a, PDC, TDH (triose fosfato desidrogenase), ENO (enolase), TPI (triose fosfato isomerase), TEF (fator de alongamento de tradução), ADH (álcool desidrogenase) e GDP (glicerol-3-fosfato desidrogenase). Em geral, os promotores de genes envolvidos na glicólise são promotores fortes constitutivamente expressos e são boas opções para a superexpressão gênica.

[0051] A incorporação dos cassetes de expressão pode ser realizada por meio de integração não homóloga ou, de preferência, homóloga, no cromossomo ou pela incorporação de um plasmídeo de replicação que contém os cassetes desejados. Os sítios de integração no genoma podem ser locais que contêm genes de subprodutos indesejados, tais como PDC ou ADH envolvidos na formação de etanol, ou GPP e GDP envolvidos na formação de glicerol. A montagem de mais de um gene, cada um com seu próprio promotor e terminador, em um pacote que pode ser manipulado como uma sequência de DNA contígua para integração em um cromossomo ou em um plasmídeo de replicação é bem conhecida na técnica (Shao et al., 2012).

Exemplo 2 Via de Succinato Com Fluxo Aumentado Através da Via de Pentose Fosfato e Eliminação ou Redução da Atividade de PGI

[0052] Uma vez que a cepa hospedeira foi construída com expressão do ramo redutivo de TCA, são necessários equivalentes redutivos adicionais para uma via de succinato de alto rendimento. Uma maneira pela qual equivalentes redutivos adicionais podem ser produzidos é pelo redirecionamento do fluxo de carbono através da via de pentose fosfato (PPP). Pelo menos um redirecionamento parcial pode ser alcançado ao aumentar a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF) usando os métodos de superexpressão anteriormente descritos. Um redirecionamento mais completo de carbono pode ser alcançado ao diminuir ou eliminar a atividade de glicose-6-fosfato isomerase (PGI). A eliminação resulta na maior produção de NADPH através da PPP quando de crescimento em glicose. Em outra modalidade, tanto um aumento na atividade de ZWF, PGL e/ou GND como uma eliminação ou redução na glicose-6-fosfato isomerase são modificados na mesma célula.

[0053] Em uma modalidade, a sequência de DNA de PGI é substituída pelo gene URA3, flanqueado por repetições diretas. Em uma segunda etapa, após seleção usando 5-FOA, o marcador URA3 é removido. Em outra modalidade, a sequência de DNA de PGI não é apenas removida, mas é substituída pela sequência de DNA que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase. Isto não apenas direciona o fluxo para a PPP pela eliminação de PGI, mas aumenta a atividade de ZWF em uma única etapa. Outra modalidade permite usar o NADPH produzido pela PPP para produção de malato, fumarato ou succinato por meio de introdução ou aumento da atividade de uma enzima málica. A enzima málica pode ser aquela que prefere NADPH ou que prefere NADH como substrato. Uma enzima málica que prefere NADPH, em outras palavras, uma enzima málica que tem um menor Km para NADPH do que para NADH, ou uma que tenha um Vmax mais alto com NADPH quando comparado com NADH, é denominada de forma abreviada aqui e nas reivindicações como uma "enzima málica dependente de NADPH". Em uma modalidade preferida, a enzima málica prefere NADPH como um substrato, uma vez que NADPH é a forma de equivalente redutivo que é produzida pela PPP. Um exemplo de um gene que codifica esta atividade é o gene maeB de E.

coli. A enzima málica (MaeB) carboxila o piruvato usando um NADPH, produzindo malato. O malato produzido é posteriormente convertido em succinato pela MDH, FUM e FRD.

[0054] Em outra modalidade, a célula é desenvolvida para ter um aumento na atividade de uma enzima málica que prefere NADH, em outras palavras, uma enzima málica que tem um Km menor para NADH do que para NADPH, ou uma que tem um Vmax maior com NADH quando comparado com NADPH, a qual é denominada de forma abreviada aqui e nas reivindicações como uma "enzima málica dependente de NADH". Um exemplo de um gene que codifica esta atividade é o gene maeA ou sfcA de E.

coli. A enzima málica (MaeA) carboxila o piruvato, produzindo NADH e malato. O malato produzido pode ser posteriormente convertido em fumarato e/ou succinato pela MDH, FUM e FRD.

Exemplo 3 Via Exógena para Acetil-Coa pela PFL

[0055] A redução de equivalentes necessários para equilibrar o ramo redutivo de TCA também pode ser gerada ao executar a derivação de glioxilato. Nativamente, a derivação de glioxolato fornece uma maneira pela qual as células crescem em unidades de acetato ou 2-carbono como única fonte de carbono.

A derivação de glioxolato começa com a formação de citrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato pela citrato liase (CIT). Então, isocitrato é produzido a partir de citrato pela aconitase (ACO). A isocitrato-liase (ICL)

converte o isocitrato em glioxolato e succinato.

A malato sintase (MLS) condensa acetil-CoA e glioxilato para formar malato.

O malato produzido é posteriormente convertido em succinato pela FUM e FRD.

O acetil-CoA citosólico normalmente é produzido em levedura via PDC.

No entanto, em leveduras concebidas para outros produtos que não o etanol,

a PDC é, tipicamente, inativada.

Isto apresenta à célula a dificuldade de produzir acetil-CoA citosólico.

Isto pode ser conseguido usando o acetato produzido mitocondrialmente e transportando-o para o citoplasma e convertendo o acetato em acetil-CoA, embora requeira a conversão de ATP em AMP, uma reação que consome energia celular.

Uma via bioquímica mais favorável, tanto em termos de uso de energia (por exemplo,

ATP) quanto de potencial de redução, usa piruvato formato-

liase (PFL) e formato desidrogenase (FDH). A PFL requer dois polipeptídeos para a funcionalidade, PflA e PflB.

PflA é uma enzima ativadora que gera um radical glicila na enzima catalítica PflB.

A PFL não é nativa de nenhuma levedura conhecida, porém, pesquisas anteriores mostraram que a PFL pode ser funcionalmente expressa em leveduras.

Uma questão potencial é que a PFL é conhecida como uma enzima anaeróbica e, dependendo das condições de cultura (por exemplo, elevada aeração), a PFL poderia ser inativada.

Pesquisas recentes mostraram que, através da superexpressão de flavodoxina ou ferredoxina, juntamente com suas respectivas redutases parceiras, a funcionalidade aeróbica da PFL em leveduras poderia ser aprimorada. "Flavodoxina" e "ferredoxina" se referem a várias pequenas proteínas que atuam em reações redox e que podem funcionar para aumentar a atividade específica de uma PFL através de ativação, reativação ou proteção contra oxidação.

Uma PFL funcional geraria acetil-

CoA, o qual pode entrar na via de derivação de glioxilato e também formato.

O formato pode ser ainda convertido em

CO2 pela formato desidrogenase, ao mesmo tempo em que também gera uma NADH para aumentar ainda mais o poder redutivo disponível desta via.

Se a cepa hospedeira foi concebida para expressar um ramo redutivo de TCA citosólico, as quatro enzimas necessárias para derivação de glioxolato (CIT, ACO,

ICL e MLS) também podem ser expressas no citoplasma usando os métodos anteriormente descritos.

Para esta cepa, os genes pflA e plfB de E. coli podem ser introduzidos no cromossomo ou em plasmídeos.

Além disso, a ferrodoxina ou flavodoxina e seu parceiro associado oxido-redutase, por exemplo, fdxB e CG0639 de Corynebacterium glutamicum

ATCC 13032 ou jldA e fpr de E. coli K-12, também podem ser adicionados e/ou superexpressos, se necessário para aumentar a atividade da PFL ou protegê-la contra inativação. Finalmente, a atividade de FDH (formato desidrogenase) pode ser adicionada ou aumentada ao incorporar um gene de S. cerevisiae ou uma fonte bacteriana. Uma cepa concebida para produzir succinato que compreende uma atividade de formato desidrogenase adicionada ou aumentada pode ser opcionalmente alimentada com formato, além de glicose, de modo a fornecer equivalentes redutivos para uma via redutiva de succinato na forma de NADH.

[0056] Uma cepa concebida para fornecer oxaloacetato pelo uso de uma enzima málica e equivalentes redutivos de PPP pode ser opcionalmente concebida para reduzir ou eliminar a atividade de piruvato carboxilase (PYC), de modo a forçar a célula a contar mais fortemente com a via enzimática málica para a biossíntese de oxaloacetato.

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Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico caracterizada por compreender pelo menos uma modificação genética que aumenta o fluxo através da via das pentoses fosfato e pelo menos uma modificação genética que aumenta a atividade de pelo menos uma enzima em pelo menos uma via biossintética de ácido succínico.

2. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos uma modificação genética que aumenta o fluxo através da via das pentoses fosfato aumentar a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF).

3. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos uma modificação genética que aumenta o fluxo através da via das pentoses fosfato diminuir a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase e fosfoglicose isomerase (PGI).

4. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos uma modificação genética que aumenta o fluxo através da via das pentoses fosfato diminuir a atividade de fosfoglicose isomerase (PGI) e aumentar a atividade de uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em glicose-6- fosfato desidrogenase (ZWF), 6-fosfogluconato lactonase (PGL) e 6-fosfogluconato desidrogenase (GND).

5. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita pelo menos uma enzima em pelo menos uma via biossintética de ácido succínico ser selecionada a partir do grupo que consiste em enzima málica (MAE), fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PCK), piruvato carboxilase (PYC), fosfoenolpiruvato carboxilase (PPC), malato desidrogenase (MDH), fumarase (FUM) e fumarato redutase (FRD).

6. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda pelo menos uma modificação genética que diminui a atividade de uma piruvato carboxilase.

7. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico caracterizada por compreender pelo menos uma modificação genética que aumenta a atividade de uma enzima málica e pelo menos uma modificação genética que aumenta a disponibilidade de pelo menos um cofator de redução selecionado a partir do grupo que consiste em NADH, NADPH e FADH.

8. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a dita enzima málica ser uma enzima málica dependente de NADH.

9. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a dita enzima málica ser uma enzima málica dependente de NADPH.

10. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a dita pelo menos uma modificação genética que aumenta a disponibilidade de pelo menos um cofator de redução ser a adição de uma piruvato- formato liase exógena.

11. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender ainda uma formato desidrogenase exógena.

12. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender ainda:

uma proteína que ativa a dita piruvato-formato-liase, e uma ferredoxina e uma ferredoxina redutase, ou uma flavodoxina e uma flavodoxina redutase.

13. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender ainda pelo menos uma modificação genética que diminui a atividade de uma piruvato carboxilase.

14. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico caracterizada por compreender uma enzima málica exógena e pelo menos uma modificação genética que aumenta a disponibilidade de pelo menos um cofator de redução selecionado a partir do grupo que consiste em NADH, NADPH e FADH.

15. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a dita enzima málica exógena ser uma enzima málica dependente de NADH.

16. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a dita enzima málica exógena seré uma enzima málica dependente de NADPH.

17. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a dita pelo menos uma modificação genética que aumenta a disponibilidade de pelo menos um cofator de redução ser a adição de uma piruvato- formato liase exógena.

18. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreender ainda uma formato desidrogenase exógena.

19. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreender ainda: uma proteína que ativa a dita piruvato-formato liase, e uma ferredoxina e uma ferredoxina redutase, ou uma flavodoxina e uma flavodoxina redutase.

20. Célula de levedura geneticamente modificada com produção aumentada de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender ainda pelo menos uma modificação genética que diminui a atividade de uma piruvato carboxilase.