KR20190115447A - 대상 분자의 생성을 위한 유전자 최적화 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO 효소 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하고, 해당과정 경로가 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된 미생물에 관한 것이며, 상기 미생물은 외인성 분자를 생성하고/하거나 내인성 분자를 과생성하도록 유전자 변형된다. 본 발명에 따르면, 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지는 또한 적어도 부분적으로 억제될 수 있다. 본 발명은 또한 대상 분자의 생성 또는 과생성을 위한 이러한 유전자 변형 미생물의 용도 및 대상 분자의 합성 또는 생물전환을 위한 공정에 관한 것이다.

Description

대상 분자의 생성을 위한 유전자 최적화 미생물
본 발명은 대상 분자의 생성을 위해 적어도 부분적인 탄소원으로서 이산화탄소를 사용할 수 있는 유전자 변형 미생물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 적어도 해당과정 경로가 적어도 부분적으로 억제된 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 미생물을 사용하여 적어도 하나의 대상 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다.
지난 몇 년 동안 다량의 대상 분자를 생성할 수 있는 다수의 미생물학적 공정이 개발되었다.
예를 들어, 발효 공정은 미생물에 의한 글루코스와 같은 발효성 탄소원으로부터의 분자 생성에 사용된다.
미생물이 동화할 수 없는 보조 기질을 상기 미생물이 대상 분자로 전환시킬 수 있도록 하기 위한 생물전환 공정이 또한 개발되었다. 여기서 다시 탄소원이 필요하지만, 이는 대상 분자의 실제 생성이 아니라, 생물전환에 필요할 수 있는 보조 인자, 더욱 특히 NADPH의 생성을 위해 필요한 것이다. 일반적으로, 주로 보조 인자에 대한 필요성과 산화환원 대사 반응의 평형의 어려움 때문에 이러한 미생물학적 공정의 생성 수율은 낮다. 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소원이 여전히 필요하기 때문에, 이러한 분자의 비용이 문제가 된다. 즉, 현재 미생물학적 공정을 통해 대상 분자를 생성하기 위해서는 확실히 산업적 가치가 더 낮으나, 경제적으로 유리하지 않은 특정 분자를 생성하기에 충분한 분자 (글루코스 또는 기타)를 제공할 필요가 있다.
동시에, 대기로의 방출이 지속적으로 증가하는 이산화탄소 (CO2)는 현재의 미생물학적 공정에서 거의 사용되지 않고, 일부 경우, 전혀 사용되지 않지만, 대상 분자의 생성을 위한 미생물에 의한 소모는 생성 비용을 감소시킬뿐만 아니라, 특정 생태적 문제를 해결할 것이다.
따라서, 현재 공정보다 더 낮은 비용으로 대량의 대상 분자를 생성할 수 있는 미생물학적 공정이 여전히 필요하다.
CO2를 포획하고, 이를 식물 및 광합성 미생물과 동일한 방식으로 주요 탄소원으로 사용하도록 유전자 변형된 비 광합성 미생물을 사용하는 이점은 이미 입증되었다. 예를 들어, 일부 캘빈 회로를 재현하고, 이산화탄소 분자를 포획함으로써, 리불로스-5-포스페이트를 2개의 3-포스포글리세레이트 분자로 전환시키기 위해, 기능성 RuBisCO (리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 - EC 4.1.1.39) 및 기능성 PRK (포스포리불로키나제 - EC 2.7.1.19)를 발현하도록 변형된 미생물이 개발되었다.
탄소원으로서 CO2를 사용하여 대상 분자를 생성하기 위해, 캘빈 회로에 의해 제공되는 용액을 연구함으로써, 본 발명자는 해당과정의 적어도 부분적 억제와 캘빈 회로 (PRK/RuBisCO)의 일부를 결합시킴으로써, 대상 분자의 생성 수율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지(oxidative branch)를 또한 적어도 부분적으로 억제함으로써, 대상 분자의 생성 동안 외인성 CO2의 소모를 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 이렇게 개발된 미생물은 아미노산, 유기산, 테르펜, 테르페노이드, 펩타이드, 지방산, 폴리올 등과 같이 다수의 대상 분자를 산업적으로 유리한 수율로 대규모로 생성할 수 있다.
본 발명은 따라서 기능성 RuBisCO 효소 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하도록 유전자 변형되고, 해당과정 경로가 적어도 부분적으로 억제되는 미생물에 관한 것이며, 상기 미생물은 RuBisCO 또는 포스포리불로키나제 효소 이외에 대상 외인성 분자를 생성하고/하거나 대상 내인성 분자를 과생성하도록 유전자 변형된다.
특정의 일 실시형태에서, 유전자 변형 미생물은 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 또한 적어도 부분적으로 억제된다.
본 발명은 또한 우선적으로는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 폴리올 및 유기산으로부터 선택되는 대상 분자의 생성 또는 과생성을 위한 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 대상 분자를 생성하거나, 과생성하는 생명공학적 공정에 관한 것이며, 이는 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물을 상기 미생물에 의한 상기 대상 분자의 합성 또는 생물전환을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 선택적으로 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이는 또한 대상 분자를 생성하는 공정에 관한 것이며, 이는 (i) 상기 분자의 합성 또는 생물전환에 관여하는 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 서열을 본 발명에 따른 재조합 미생물에 삽입하는 단계, (ii) 상기 미생물을 상기 효소의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 선택적으로 (iii) 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함한다.
도 1: 해당과정, 5탄당 포스페이트 경로 및 엔트너-도우도로프 경로의 일반적 도해;
도 2: 본 발명에 따른, 해당과정 경로의 억제의 개략도;
도 3: 본 발명에 따른, 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지의 억제와 조합한 해당과정 경로의 억제의 개략도.
정의
용어 "재조합 미생물", "변형된 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 혼용되며, 내인성 뉴클레오타이드 서열을 발현하거나, 과발현하거나, 이종 뉴클레오타이드 서열을 발현하도록 유전자 변형되거나, 내인성 유전자의 발현이 변이된 미생물을 지칭한다. "변이"는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 하위단위를 인코딩하는 유전자의 발현 또는 RNA 분자 또는 균등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 하위단위의 활성을 조절하여, 발현, 수준 또는 활성이 변형의 부재시 관찰되는 것보다 더 높거나, 더 낮도록 한 것을 의미한다.
용어 "재조합 미생물", "변형된 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"는 특정 재조합 미생물뿐만 아니라, 이러한 미생물의 하위 세대 또는 잠재적 하위 세대를 지칭하는 것으로 이해된다. 이후의 세대에서 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 일부 변형이 발생할 수 있으므로 이들 하위 세대는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이는 여전히 본 명세서에 사용되는 용어의 범위 내로 이해된다.
본 발명과 관련하여, 적어도 부분적으로 "억제된" 또는 "불활성화된" 대사 경로는 동일한 야생형 미생물 (상기 대사 경로가 억제되도록 유전자 변형되지 않음)과 비교하여, 고려된 미생물에서 더 이상 적절하게 기능하지 못하는 변이된 대사 경로를 지칭한다. 특히, 대사 경로가 중단되어, 중간 대사산물의 축적이 야기된다. 이러한 중단은, 예를 들어 고려된 대사 경로의 중간 대사산물의 분해에 필요한 효소를 억제하고/하거나, 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 달성될 수 있다. 대사 경로는 또한 감쇠, 즉 지연될 수 있다. 이러한 감쇠는, 예를 들어 고려되는 대사 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 부분적으로 억제하고/하거나, 이들 효소 중 적어도 하나를 인코딩하는 유전자의 발현을 부분적으로 억제하고/하거나, 특정 반응에 필요한 보조 인자를 이용함으로써 달성될 수 있다. "적어도 부분적으로 억제된 대사 경로"라는 표현은 고려되는 대사 경로의 수준이 야생형 미생물에서의 수준과 비교하여 적어도 20%, 더욱 우선적으로는 적어도 30%, 40%, 50% 이상 감소한 것을 의미한다. 감소는 더 클 수 있으며, 특히 적어도 60%, 70%, 80%, 90%를 초과할 수 있다. 본 발명에 따르면, 고려된 대사 경로가 상기 미생물에 의해 더 이상 사용되지 않는다는 의미에서 억제가 전면적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 억제는 일시적이거나 영구적일 수 있다.
본 발명에 따르면, "유전자 발현의 억제"는 고려된 미생물에서 유전자가 더 이상 발현되지 않거나, 야생형 미생물 (유전자 발현이 억제되도록 유전자 변형되지 않음)과 비교하여, 그 발현이 감소함으로써, 해당 단백질의 생성의 부재 또는 그 생성의 유의한 저하 및 특히 20% 초과, 더욱 우선적으로는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 저하가 야기됨을 의미한다. 일 실시형태에서, 억제는 전면적일 수 있으며, 즉, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 더 이상 전혀 생성되지 않는다. 유전자 발현의 억제는 고려된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 돌연변이, 삽입 및/또는 치환에 의해 달성될 수 있다. 우선적으로, 유전자 발현의 억제는 해당 뉴클레오타이드 서열의 전면적인 결실에 의해 달성된다. 본 발명에 따르면, 당업자가 그 자체로 이해하고, 미생물에 적용 가능한 임의의 유전자 억제 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 억제는 상동성 재조합 (문헌[Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97:6640-5; Lodish et al., Molecular Cell Biology 4th ed. 2000. W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-3136-3]); 유전자 발현 및/또는 인코딩된 단백질 활성을 변형시키기 위한 무작위 또는 유도된 돌연변이 유발 (문헌[Thomas et al., Cell. 1987;51:503-12]); 그의 발현을 변이시키기 위한 유전자의 프로모터 서열의 변형 (문헌[Kaufmann et al., Methods Mol Biol. 2011;765:275-94. doi: 10.1007/978-1-61779-197-0_16]); 게놈 내의 유도된 국소 손상부의 표적화 (TILLING); 접합 등에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 특정 접근법은, 예를 들어 천연 또는 인위적 유래의 이동성 유전 요소 (트랜스포존 (transposon))를 이용한 트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 외래 서열의 삽입에 의한 유전자 불활성화이다. 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 유전자 발현의 억제는 녹아웃 (knock-out) 기법에 의해 달성된다. 유전자 발현의 억제는 또한 간섭, 리보자임 또는 안티센스 RNA를 사용하여 유전자를 소멸시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌[Daneholt, 2006]. 노벨 생리의학상 수상). 본 발명과 관련하여, 용어 "간섭 RNA" 또는 "iRNA"는 표적 유전자의 발현을 차단하고/하거나, 해당 mRNA의 분해를 촉진할 수 있는 임의의 iRNA 분자 (예를 들어, 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA)를 지칭한다. 유전자 억제는 또한 아연 핑거 뉴클레아제 (문헌[Kim et al., PNAS; 93: 1156-1160]), 전사 활성화기 유사 이펙터 뉴클레아제 또는 "TALEN" (문헌[Ousterout et al., Methods Mol Biol. 2016;1338:27-42. doi: 10.1007/978-1-4939-2932-0_3]), Cas9 뉴클레아제와 집합적인 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복 또는 "CRISPR" (문헌[Mali et al., Nat Methods. 2013 Oct; 10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.2649]), 또는 메가뉴클레아제 (문헌[Daboussi et al., Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79])의 조합 시스템의 사용을 통해 소정의 게놈의 유도된 유전자 변형을 가능하게 하는 게놈 편집 방법에 의해 달성될 수 있다. 유전자 발현의 억제는 또한 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 불활성화시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명과 관련하여, "NADPH-의존성" 또는 "NADPH-소모성" 생합성 또는 생물전환은 하나 이상의 효소가 NADPH 보조 인자의 산화에 의해 획득된 전자의 동시 공급이 필요한 모든 생합성 또는 생물전환 경로를 의미한다. "NADPH-의존성" 생합성 또는 생물전환 경로는 특히 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 트레오닌, 프롤린, 글루탐산염, 호모세린, 이소류신, 발린), γ-아미노부티르산, 테르페노이드 및 테르펜 (예를 들어, 파르네센), 비타민 및 전구체 (예를 들어, 판토에이트, 판토테네이트, 트랜스뉴로스포렌, 필로퀴논, 토코페롤), 스테롤 (예를 들어, 스쿠알렌, 콜레스테롤, 테스토스테론, 프로게스테론, 코르티손), 플라보노이드 (예를 들어, 프람비논, 베스티논), 유기산 (예를 들어, 시트르산, 숙신산, 옥살산, 이타콘산, 쿠마르산, 3-하이드록시프로피온산), 폴리올 (예를 들어, 소르비톨, 자일리톨, 글리세롤), 폴리아민 (예를 들어, 스페르미딘), NADP 의존성 시토크롬 p450을 통한, 입체 특이적 하이드록실화로부터의 방향족 분자 (예를 들어, 페닐프로파노이드, 테르펜, 지질, 탄닌, 향, 호르몬)의 합성과 관련된다.
다양한 분자 (뉴클레오타이드 서열, 펩타이드, 효소 등)와 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "외인성"은 고려되는 미생물에 정상적으로 또는 자연적으로는 존재하지 않고/하거나, 그에 의해 생성되지 않는 분자를 지칭한다. 반대로, 용어 "내인성" 또는 "천연"은 고려된 미생물에 정상적으로 또는 자연적으로 존재하고/하거나, 그에 의해 생성되는 분자를 나타내는 다양한 분자 (뉴클레오타이드 서열, 펩타이드, 효소 등)를 지칭한다.
미생물
본 발명은 내인성 또는 외인성 대상 분자의 생성을 위한 유전자 변형 미생물을 제시한다.
"유전자 변형" 미생물은 대상 분자의 생합성 또는 생물전환 경로에 관여하는 효소를 인코딩하거나, 그의 생물학적 활성 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 혼입하여, 미생물의 게놈을 변형시켰음을 의미한다. 상기 핵산 서열은 임의의 적합한 분자 클로닝 방법에 의해 상기 미생물 또는 그의 상위 세대 중 하나의 게놈에 도입될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 미생물의 게놈은 예를 들어 플라스미드, 에피솜, 합성 염색체 등에 포함된 염색체 외 유전 물질을 포함하여 미생물에 포함된 모든 유전 물질을 지칭한다. 도입된 핵산 서열은 이종 서열, 즉 상기 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 서열 또는 동종 서열을 포함한다. 유리하게는, 대상 핵산 서열을 갖는 전사 단위를 하나 이상의 프로모터의 제어하에 미생물의 게놈에 도입시킨다. 이러한 전사 단위는 또한, 유리하게는, 전사 종결인자, 및, 필요한 경우, 다른 전사 조절 요소와 같은 통상적인 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용 가능한 프로모터는 항시적 프로모터, 즉 대부분의 세포 상태 및 환경 조건에서 활성인 프로모터뿐만 아니라, 외인성의 물리적 또는 화학적 자극에 의해 활성화되거나 억제됨으로써, 이러한 자극의 유무에 따라 가변적인 발현 상태를 유도하는 유도성 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 미생물이 효모인 경우, 항시적 프로모터, 예컨대 TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1 중 유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 효모에서 사용할 수 있는 유도성 프로모터의 예는 tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PHO5이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 유전자 변형된 미생물은 다음과 같은 특징을 갖는다:
- 기능성 RuBisCO (EC 4.1.1.39)의 발현;
- 기능성 PRK (EC 2.7.1.19)의 발현;
- 해당과정의 적어도 부분적인 억제; 및
- 대상 분자의 합성 및/또는 생물전환에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현, 및/또는 대상 분자의 합성 및/또는 생물전환과 경쟁적인 활성을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자의 억제.
본 발명에 따르면, 임의의 미생물이 사용될 수 있다. 우선적으로는 미생물은 우선적으로는 효모, 진륜류, 미세조류로부터 선택되는 진핵 세포, 또는 원핵 세포, 우선적으로는 박테리아 또는 시아노박테리아이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 우선적으로는 자낭균류 (스페르모프토라세아에 (Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세아에 (Saccharomycetaceae)), 담자균류 (레우코스포리듐 (Leucosporidium), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus), 필로바시듐 (Filobasidium), 및 필로바시디엘라 (Filobasidiella)) 및 펀자이 임페르펙티 (Fungi imperfecti)에 속하는 불완전균류 효모 (스포로볼로미세타세아에 (Sporobolomycetaceae), 및 크립토코카세아에 (Cryptococcaceae)) 중 선택되는 효모이다. 우선적으로는, 본 발명에 따른 유전자 변형된 효모는 피치아 (Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 캔디아 (Candida), 리포마이세스 (Lipomyces), 로도토룰라 (Rhodotorula), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 야로위아 (Yarrowia), 또는 데바료마이세스 (Debaryomyces) 속에 속한다. 더욱 우선적으로는, 본 발명에 따른 유전자 변형된 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마륵시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 디아스타티쿠스 (Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시 (Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리 (Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스 (Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스 (Saccharomyces oviformis), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis), 로도스포리듐 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 데바료마이세스 한세니 (Debaryomyces hansenii) 및 리포마이세스 스타르케이 (Lipomyces starkeyi)로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 진균류, 및 더욱 특히 "사상균류"이다. 본 발명과 관련하여, "사상균류"는 하위 분류인 유마이코티나 (Eumycotina)의 모든 사상균 형태를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유전자 변형된 진균류는 아스페르길루스 (Aspergillus), 트리코데르마 (Trichoderma), 네우로스포라 (Neurospora), 포도스포라 (Podospora), 엔도티아 (Endothia), 무코르 (Mucor), 코클리오볼루스 (Cochliobolus) 또는 피리쿨라리아 (Pyricularia) 속에 속한다. 우선적으로는, 본 발명에 따른 유전자 변형 진균류는 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 아요마리 (Aspergillus awomari), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 테레우스 (Aspergillus terreus), 네우로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 및 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride)로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 미세조류이다. 본 발명과 관련하여, "미세조류"는 클로로피세아에 (Chlorophyceae), 크리소피세아에 (Chrysophyceae), 프림네시오피세아에 (Prymnesiophyceae), 디아토마에 (Diatomae) 또는 바실라리오피타 (Bacillariophyta), 에우글레노피세아에 (Euglenophyceae), 로도피세아에 (Rhodophyceae), 또는 트레보욱시오피세아에 (Trebouxiophyceae) 강 또는 상강에 속하는 모든 진핵 미세 조류를 지칭한다. 우선적으로는, 본 발명에 따른 유전자 변형 미세조류는 난노클로로프시스 (Nannochloropsis) 종 (예를 들어, 난노클로로프시스 오굴라타 (Nannochloropsis oculata), 난노클로로프시스 가디타나 (Nannochloropsis gaditana), 난노클로로프시스 살리나 (Nannochloropsis salina), 테트라셀미스 (Tetraselmis) 종 (예를 들어, 테트라셀미스 수에시카 (Tetraselmis suecica), 테트라셀미스 쿠이 (Tetraselmis chuii)), 클로렐라 (Chlorella) 종 (예를 들어, 클로렐라 살리나 (Chlorella salina), 클로렐라 프로토테코이데스 (Chlorella protothecoides), 클로렐라 엘리프소이데아 (Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에메르소니 (Chlorella emersonii), 클로렐라 미누티시마 (Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사 (Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 소로키니아나 (hlorella sorokiniana), 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)), 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 종 (예를 들어, 클라미도모나스 레인하르드티 ((Chlamydomonas reinhardtii)), 두날리엘라 (Dunaliella) 종 (예를 들어, 두날리엘라 테르티올렉타 (Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 살리나 (Dunaliella salina)), 파에오닥툴룸 트리코르누툼 (Phaeodactulum tricornutum), 보트리코쿠스 브라우니 (Botrycoccus braunii), 크로오모나스 살리나 (Chroomonas salina), 사이클로텔라 크립티카 (Cyclotella cryptica), 사이클로텔라 (Cyclotella) 종, 에틀리아 텍센시스 (Ettlia texensis), 에우글레나 그라실리스 (Euglena gracilis), 김노디늄 넬소니 (Gymnodinium nelsoni), 하에마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis), 이소크리시스 갈바나 (Isochrysis galbana), 모노라피듐 미누툼 (Monoraphidium minutum), 모노라피듐 (Monoraphidium) 종, 네오클로리스 올레오아분단스 (Neochloris oleoabundans), 니츠쉬아 라에비스 (Nitzschia laevis), 오노라피듐 (Onoraphidium) 종, 파블로바 루테리 (Pavlova lutheri), 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum), 포르피리듐 크루엔툼 (Porphyridium cruentum), 스케네데스무스 (Scenedesmus) 종 (예를 들어, 스케네데스무스 오블리쿠스 (Scenedesmus obliquuus), 스케네데스무스 쿠아드리카울라울라 (Scenedesmus quadricaulaula), 스케네데스무스 (Scenedesmus) 종), 스티코코쿠스 바실라리스 (Stichococcus bacillaris), 스피룰리나 플라텐시스 (Spirulina platensis), 탈라시오시라 (Thalassiosira) 종으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 우선적으로는 필라 아시도박테리아 (phyla Acidobacteria), 악티노박테리아 (Actinobacteria), 아퀴피카에 (Aquificae), 박테리오이데테스 (Bacterioidetes), 클라미디아 (Chlamydia), 클로로비 (Chlorobi), 클로로플렉시 (Chloroflexi), 크리시오게네테스 (Chrysiogenetes), 시아노박테리아 (Cyanobacteria), 데페리박터 (Deferribacter), 데이노코쿠스-서무스 (Deinococcus-Thermus), 딕티오글로미 (Dictyoglomi), 피브로박터 (Fibrobacter), 피르미쿠테스 (Firmicutes), 푸소박테리아 (Fusobacteria), 겜마티모나데테스 (Gemmatimonadetes), 니트로스피라에 (Nitrospirae), 플란토마이세테스 (Planctomycetes), 프로테오박테리아 (Proteobacteria), 스피로샤에테스 (Spirochaetes), 서모데술포박테리아 (Thermodesulfobacteria), 서모미크로비아 (Thermomicrobia), 서모토가에 (Thermotogae) 또는 베루코미크로비아 (Verrucomicrobia)로부터 선택되는 박테리아이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 유전자 변형된 박테리아는 아카리오클로리스 (Acaryochloris), 아세토박터 (Acetobacter), 악티노바실루스 (Actinobacillus), 아그로박테리움, (Agrobacterium), 알리사이클로바실루스 (Alicyclobacillus), 아나바에나 (Anabaena), 아나시스티스 (Anacystis), 아나에어로비오스피릴룸 (Anaerobiospirillum), 아퀴펙스 (Aquifex), 아르트로박터 (Arthrobacter), 아르트로스피라 (Arthrospira), 아조박터 (Azobacter), 바실루스 (Bacillus), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 부르콜데리아 (Burkholderia), 클로로비움 (Chlorobium), 크로마티움 (Chromatium), 클로로바쿨룸 (Chlorobaculum), 클로스트리디움 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 쿠프리아비두스 (Cupriavidus), 시아노테세 (Cyanothece), 엔테로박터 (Enterobacter), 데이노코쿠스 (Deinococcus), 에르위니아 (Erwinia), 에세리키아 (Escherichia), 게오박터 (Geobacter), 글로에오박터 (Gloeobacter), 글루코노박터 (Gluconobacter), 하이드로제노박터 (Hydrogenobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 락토바실루스 (Lactobacillus), 락토코쿠스 (Lactococcus), 만헤이미아 (Mannheimia), 메소리조비움 (Mesorhizobium), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 마이크로시스티스 (Microcystis), 니트로박터 (Nitrobacter), 니트로소모나스 (Nitrosomonas), 니트로스피나 (Nitrospina), 니트로스피라 (Nitrospira), 노스톡 (Nostoc), 포르미디움 (Phormidium), 프로클로코쿠스 (Prochlorococcus), 세도모나스 (Pseudomonas), 랄스토니아 (Ralstonia), 리조비움 (Rhizobium), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코쿠스 (Rhodococcus), 로도세도모나스 (Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 살모넬라 (Salmonella), 세네데스문 (Scenedesmun), 세라티아 (Serratia), 쉬겔라 (Shigella), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 스트렙토마이세스, (Streptomyces), 시네코쿠스 (Synechoccus), 시네코시스티스 (Synechocystis), 서모시네코코쿠스 (Thermosynechococcus), 트리코데스미움 (Trichodesmium) 또는 지모모나스 (Zymomonas) 속에 속한다. 또한 바람직하게는, 본 발명에 따른 유전자 변형 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아나에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스 (Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실루스 숙시노제네스 (Actinobacillus succinogenes), 아퀴펙스 에어리쿠스 (Aquifex aeolicus), 아퀴펙스 피로필루스 (Aquifex pyrophilus), 바실루스 숩틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 아밀로리퀘파시네스 (Bacillus amyloliquefacines), 브레비박테리움 암모니아제네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 이마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum), 클로스트리디움 파스테리아눔 (Clostridium pasteurianum), 클로스트리디움 르중다리 (Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 베이게린키 (Clostridium beigerinckii), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 쿠프리아비두스 메탈리두란스 (Cupriavidus metallidurans), 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii), 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 하이드로제네박터 서모필루스 (Hydrogenobacter thermophilus), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 만헤이미아 숙시니시프로두센스 (Mannheimia succiniciproducens), 메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii), 슈도모나스 푸디카 (Pseudomonas pudica), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 리조비움 에틀리 (Rhizobium etli), 로도박터 캅술라투스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에어로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도스피릴룸 루브룸 (Rhodospirillum rubrum), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 쉬겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이 (Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 아카리오클로리스 마리나 (Acaryochloris marina), 아나바에나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis), 아르트로스피라 플란텐시스 (Arthrospira platensis), 아르트로스피라 막사 (Arthrospira maxa), 클로로비움 테피둠 (Chlorobium tepidum), 클로로바쿨룸 (Chlorobaculum) 종, 시아노테케 (Cyanothece) 종, 글로에오박터 비오라세우스 (Gloeobacter violaceus), 미크로시스티스 아에루기노사 (Microcystis aeruginosa), 노스톡 푼티포르메 (Nostoc punctiforme), 프로클로코쿠스 마리누스 (Prochlorococcus marinus), 시네코코쿠스 엘롱가투스 (Synechococcus elongatus), 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 서모시네코코쿠스 엘롱가투스 (Thermosynechococcus elongatus), 트리코데스미움 에리트라에움 (Trichodesmium erythraeum) 및 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 종으로부터 선택된다.
기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK의 발현
본 발명에 따르면, 미생물은 기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK를 자연적으로 발현할 수 있다. 이는 예를 들어, 미세조류 및 시아노박테리아와 같은 광합성 미생물의 경우이다.
자연계에 RuBisCO의 여러 형태가 존재한다 (문헌[Tabita et al., J Exp Bot. 2008;59(7):1515-24. doi: 10.1093/jxb/erm361]). Ⅰ형, II형 및 III형은 리불로스-1,5-바이포스페이트의 카복실화 및 산소화 반응을 촉매한다. I형은 진핵 생물 및 박테리아에 존재한다. 이는 큰 하위단위 (RbcL) 및 작은 하위단위 (RbcS)의 두 가지 유형의 하위단위로 구성된다. 기능적 효소 복합체는 8개의 L 하위단위 및 8개의 S 하위단위로 이루어진 16량체이다. 이러한 하위단위의 올바른 조립에는 또한 적어도 하나의 특이적 샤프론 (샤프론): RbcX의 개입이 필요하다 (문헌[Liu et al., Nature. 2010 Jan 14;463(7278):197-202. doi: 10.1038/nature08651]). II형은 주로 프로테오박테리아, 고세균 (아르카에아 (Archaea) 또는 원시세균) 및 와편모조류에서 발견된다. 그 구조는 훨씬 더 단순하다: 이는 동종이량체이다 (2개의 동일한 RbcL 하위단위에 의해 형성됨). 유기체에 따라 I형 RuBisCO를 인코딩하는 유전자는 rbcL/rbcS (예를 들어 시네코코쿠스 엘롱가투스), 또는 cbxLC/cbxSC, cfxLC/cfxSC, cbbL/cbbS (예를 들어 쿠프리아비두스 네카토르)로 지칭될 수 있다. 유기체에 따라, II형 RuBisCO를 인코딩하는 유전자는 일반적으로 cbbM (예를 들어 로도스피릴룸 루브룸)으로 지칭된다. III형은 고세균에 존재한다. 이는 일반적으로 RbcL 하위단위의 2량체 형태 또는 2량체의 5량체 형태로 발견된다. 유기체에 따라, III형 RuBisCO를 인코딩하는 유전자는 rbcL (예를 들어 서모코쿠스 코다카렌시스), cbbL (예를 들어 할로페락스 종)로 지칭될 수 있다.
PRK의 2가지 부류가 알려져 있다: 프로테아박테리아에서 발견되는 I 부류 효소는 8량체이며, 시아노박테리아 및 식물에서 발견되는 II 부류 효소는 4량체 또는 2량체이다. 유기체에 따라, PRK를 인코딩하는 유전자는 prk (예를 들어 시네코코쿠스 엘롱가투스), prkA (예를 들어 클라미도모나스 레인하르드티), prkB (예를 들어 에세리키아 콜라이), prk1, prk2 (예를 들어 렙톨링비아 종), cbbP (예를 들어 니트로박터 불가리스) 또는 cfxP (예를 들어 쿠프리아비두스 네카토르)로 지칭될 수 있다.
사용된 미생물이 기능적 RuBisCO 및 기능적 PRK를 자연적으로 발현하지 않는 경우, 상기 미생물을 이종의 RuBisCO 및 PRK를 발현하도록 유전자 변형시킨다. 유리하게는, 이러한 경우에, 상기 단백질을 인코딩하는 서열, 유리하게는 적절한 전사 인자를 혼입시키는 하나 이상의 발현 카세트를 미생물의 게놈에 혼입시켜, 미생물을 형질전환시킨다. 발현되는 RuBisCO의 유형에 따라, 이는 또한 RuBisCO를 형성하는 하위단위의 적절한 조립을 촉진하기 위해, 미생물에 의해 발현된 하나 이상의 샤프론 단백질을 가질 필요가 있을 수 있다. 이는 특히 기능성 RuBisCO를 획득하기 위해, 특이적 샤프론 (Rbcx) 및 전문 샤프론 (예를 들어, GroES 및 GroEL)을 인코딩하는 유전자의 도입 및 발현이 필요한 I형 RuBisCO의 경우이다. 출원 WO2015/107496은 기능성 I형 RuBisCO 및 PRK를 발현하도록 효모를 유전자 변형시키는 방법을 상세히 기개한다. 또한 문헌[GUADALUPE-MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013)]에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
일 실시형태에서, 미생물은 I형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 미생물은 II형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 미생물은 III형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형된다.
하기 표 1 및 표 2에는 예로서, 기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK를 발현하도록 미생물을 형질전환하는데 사용될 수 있는 RuBisCO 및 PRK를 인코딩하는 서열이 열거되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
해당과정의 억제
본 발명에 따르면, 해당과정 경로가 적어도 부분적으로 억제되어, 미생물은 이러한 대사 경로를 정상적으로는 더 이상 사용할 수 없다 (도 1 - 해당과정). 즉, 미생물은 (다른 유전자 변형과 무관하게) 해당과정 경로가 억제되지 않은 야생형 미생물과 유사한 방식으로 글루코스를 동화시키는 능력을 더 이상 갖지 않는다.
특정의 일 실시형태에서, 미생물은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3P)의 생성의 하류에서 해당과정이 전체적으로 또는 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다.
예를 들어, 해당과정은 1,3-바이포스포-D-글리세레이트 (1,3-BPG)의 생성의 상류 또는 3-포스포글리세레이트 (3PG)의 생성의 상류에서 억제된다.
미생물에 따라, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3P) 및 3-포스포글리세레이트 (3PG) 사이에 수반되는 반응은 (i) 동시에 작용하는 2개의 효소, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (EC 1.2.1.12, GAPDH 또는 더욱 드물게는 G3PDH로 약칭됨) 및 포스포글리세레이트 키나제 (E.C. 2.7.2.3, PGK로 약칭됨), 또는 (ii) 단일 비-인산화 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 (EC 1.2.1.9, GAPN으로 약칭됨)에 의해 조절될 수 있다.
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH)는 반응의 방향으로 전자 공여체/수용체로서 NAD+/NADH 쌍을 사용하여, G3P에서 1,3-바이포스포-D-글리세레이트 (1,3-BPG)로의 가역적 전환을 촉매한다. 유기체에 따라, GAPDH를 인코딩하는 유전자는 gapA, gapB, gapC (예를 들어 에세리키아 콜라이, 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), GAPDH, GAPD, G3PD, GAPDHS (예를 들어 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), TDH1, TDH2, TDH3 (예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에), gap, gap2, gap3 (예를 들어 미코박테리움 (Mycobacterium) 종, 노스톡 (Nostoc) 종)으로 지칭될 수 있다.
포스포글리세레이트 키나제 (PGK)는 보조인자로서 ATP/ADP 쌍을 사용하여, 1,3-BPG에서 3PG로의 가역적 전환을 촉매한다. 유기체에 따라, PGK를 인코딩하는 유전자는 PGK, PGK1, PGK1, PGK2, PGK3, pgkA, PGKB, PGKC, cbbK, cbbKC, cbbKP (예를 들어 쿠프리아비두스 네카토르)로 지칭될 수 있다.
비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPN)는 1,3-BPG를 통하여 진행되는 단계 없이 G3P에서 3PG로의 전환을 촉매한다. 이 반응은 전자 수용체로서 작용하는 보조인자 NADP+/NADPH 쌍의 존재하에 촉매된다. 유기체에 따라, GAPN을 인코딩하는 유전자는 GAPN (예를 들어 바실루스 (Bacillus) 종, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 종), GAPN1 (예를 들어 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 종)로 지칭될 수 있다.
특정의 일례에서, 미생물은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
대안적 또는 추가적으로, 포스포글리세레이트 키나제를 인코딩하는 유전자의 발현은 또한 적어도 부분적으로 억제될 수 있다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
대안적으로, 미생물은 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
하기 표 3, 표 4 및 표 5에는 예로서, 표적 미생물에 따라 억제될 수 있는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소, 포스포글리세레이트 키나제 및 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 서열이 열거되어 있다. 당업자는 미생물에 따라 어느 유전자가 억제될 대상 효소에 해당하는지를 인지하고 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
일반적으로, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물에서 3-포스포글리세레이트 (3PG)의 생성은 해당과정을 통해 더 이상 가능하지 않거나, 적어도 유의하게 감소된다.
특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 TDH1 (유전자 ID: 853395), TDH2 (유전자 ID: 853465) 및/또는 TDH3 유전자 (유전자 ID: 853106)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모이다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 PGK1 유전자 (유전자 ID: 5230)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모이다.
또 다른 예시적 실시형태에서, 미생물은 PGK1 유전자 (유전자 ID: 5230)의 발현, TDH1 유전자 (유전자 ID: 853395), TDH2 (유전자 ID: 853465)의 발현 및/또는 TDH3 유전자 (유전자 ID: 853106)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모이다.
특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 gapA 유전자 (유전자 ID: 947679)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 에세리키아 콜라이 박테리아이다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 pgk 유전자 (유전자 ID: 947414)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 에세리키아 콜라이 박테리아이다.
또 다른 예시적 실시형태에서, 미생물은 pgk 유전자 (유전자 ID: 947414)의 발현, 및/또는 gapA 유전자 (유전자 ID: 947679)의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 E. 콜라이 박테리아이다.
본 발명에 따르면, 기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK를 발현하는 유전자 변형 미생물은 다른 한편으로 5탄당 포스페이트 경로에 의해 생성된 리불로스-5-포스페이트로부터 CO2를 포획함으로써, 3PG를 생성할 수 있다 (도 2).
3PG에서 피루베이트로의 대사에 필요한 효소는 미생물 내에서 억제되지 않으므로, 그 후 상기 미생물은 3PG를 대사시켜, 피루베이트 및 ATP를 생성할 수 있다.
따라서, 유전자 변형 미생물은 보충 탄소원으로서 CO2를 사용하여 피루베이트 및 NADPH 보조인자를 생성할 수 있다.
본 발명과 관련하여, "보충" 탄소원은 미생물이 피루베이트 생성을 위한 다수 또는 주 탄소원을 구성하는 발효성 당류 (글루코스, 갈락토스, 수크로스, 프룩토스 등)에 의해 제공되는 탄소 원자 이외에 부분적 탄소원으로서 CO2를 사용함을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 피루베이트 (및 후속하여 대상 분자)의 생성을 위해, 5탄당 포스페이트 경로를 통해 글루코스 대사 동안 정상적으로 손실되는 CO2를 고정하여, 사용함으로써, 탄소 수율을 증가시킬 수 있도록 한다.
5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지의 억제
특정의 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 또한 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 또한 적어도 부분적으로 억제되는 방식으로 변형된다.
우선적으로는, 미생물은 리불로스-5-포스페이트 생성의 상류의 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 억제되도록 유전자 변형된다 (도 1 - 5탄당 포스페이트 경로).
리불로스-5-포스페이트 (Ru5P) 생성의 상류의 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지의 중단은 글루코스-6-포스페이트 (G6P)로부터의 Ru5P 합성 공정의 하나 이상의 반응을 특이적으로 표적화한다. 이러한 합성은 일반적으로 3개의 효소 (i) 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (EC. 1.1.1.49, G6PDH로 약칭됨), (ii) 6-포스포글루코노락토나제 (E.C. 3.1.1.31, PGL로 약칭됨), 및 (iii) 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 (EC 1.1.1.44, PGD로 약칭됨)의 연속 작용에 의해 촉매된다.
글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PDH)는 5탄당 포스페이트 경로의 첫 번째 반응, 즉, NADP+ 중 하나의 분자가 NADPH로 환원되면서 동시에 글루코스-6-포스페이트가 6-포스포글루코노락톤 (6PGL)으로 산화되는 반응을 촉매한다. 유기체에 따라, G6PDH를 인코딩하는 유전자는 G6PD (예를 들어 호모 사피엔스), G6pdx (예를 들어 무스쿨루스), gsdA (예를 들어 아스페르길루스 니둘란스), zwf (예를 들어 에세리키아 콜라이), 또는 ZWF1 (예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에)로 지칭될 수 있다.
6-포스포글루코노락토나제 (PGL)는 6PGL로부터 6-포스포글루코네이트 (6PGA)의 합성을 촉매하는 가수분해 효소이다. 유기체에 따라, PGL을 인코딩하는 유전자는 pgl (예를 들어 에세리키아 콜라이, 시네코시스티스 종) pgls (예를 들어 로도박테라세아에 박테리움), 또는 SOL (예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에)로 지칭될 수 있다.
6-포스포글루코네이트 탈수소효소 (PGD)는 NADP+ 분자가 NADPH로 환원되고, CO2 분자가 방출되면서 동시에 6PGA로부터 Ru5P가 합성되는 반응을 촉매하는 산화환원효소이다. 유기체에 따라, PGD를 인코딩하는 유전자는 gnd (예를 들어 에세리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비시아에), PGD (예를 들어 호모 사피엔스), gntZ (예를 들어 바실루스 수브틸리스), 또는 6-PGDH (예를 들어 락토바실루스 파라콜리노이데스)로 지칭될 수 있다.
특정의 일례에서, 미생물은 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
대안적 또는 추가적으로, 미생물은 6-포스포글루코노락토나제를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
대안적 또는 추가적으로, 미생물은 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다
하기 표 6, 표 7 및 표 8에는, 예로서, 표적 미생물에 따라 억제될 수 있는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 6-포스포글루코노락토나제 및 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 인코딩하는 서열이 열거된다. 당업자는 미생물에 따라 어느 유전자가 억제될 대상 효소에 해당하는지를 인지하고 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
일반적으로, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물에서 리불로스-5-포스페이트 (Ru5P)의 생성은 5탄당 포스페이트 경로를 통해 더 이상 가능하지 않거나, 적어도 유의하게 감소된다.
특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 ZWF1 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모이다.
특정의 일례에서, 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모는 TDH1, TDH2, TDH3 및/또는 PGK1 유전자의 발현, 및 ZWF1 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 zwf 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 에세리키아 콜라이 종의 박테리아이다.
특정의 일례에서, 에세리키아 콜라이 종의 박테리아는 gapA 및/또는 pgk 유전자의 발현, 및 zwf 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다.
또 다른 예로서, 미생물은 pgk 및 gsdA 유전자의 발현이 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된 아스페르길루스 종, 예컨대 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 테레우스의 사상균류이다.
본 발명에 따르면, 기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK를 발현하고, 해당과정 경로 및 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 적어도 부분적으로 억제된 유전자 변형 미생물은 더이상 해당과정 경로를 통해 3PG를 생성할 수 없거나, 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지를 통해 Ru5P를 생성할 수 없다. 다른 한편으로, 이는 해당과정의 개시 시점 (억제의 상류)에 생성되는 프룩토스-6-포스페이트 (F6P) 및/또는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3P)의 생성을 전용함으로써, Ru5P를 생성할 수 있다. 이러한 생성은 미생물에 자연적으로 존재하여, 작용하는 효소 케톨전이효소 (EC 2.2.1.1), 알돌전이효소 (EC 2.2.1.2), 리보스-5-포스페이트 이성질체화효소 (EC 5.3.1.6), 및 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 (EC 5.1.3.1)로 인해 가능하다 (도 3).
3PG에서 피루베이트로의 대사에 필요한 효소는 본 발명에 따른 미생물 내에서 억제되지 않으므로, 그 후 상기 미생물은 3PG를 대사시켜, 피루베이트 및 ATP를 생성할 수 있다.
따라서, 유전자 변형 미생물은 보충 탄소원으로서 외인성 CO2를 사용하여 피루베이트를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물은 피루베이트 (및 후속하여 대상 분자)의 생성을 위해 외인성 CO2를 고정하여, 사용함으로써, 탄소 수율을 증가시킬 수 있도록 한다. 여기서 다시, 탄소 수율이 증가한다.
엔트너-도우도로프 경로의 억제
특정의 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자 변형된 미생물은 엔트너-도우도로프 경로를 가지며, 이는 적어도 부분적으로 억제된다. 이 경로는 주로 박테리아 (특히 그람 음성 박테리아)에서 발견되며, 글루코스로부터 피루베이트의 생성을 위한 해당과정 및 5탄당 경로의 대안적 경로이다. 더욱 정확하게, 이 경로는 해당과정을 제공하기 위해, P-글루코네이트, 특히 피루베이트에서 5탄당 포스페이트 경로에 연결된다.
우선적으로는, 미생물을 6-포스포글루코네이트 생성의 하류의 엔트너-도우도로프 경로 반응이 억제되도록 유전자 변형시킨다. 이러한 억제는 가능한 경쟁 경로를 제거하여, PRK/RuBisCO 조작을 위한 기질로서 6-포스포글루코네이트의 이용 가능성을 보장한다.
6-포스포글루코네이트 생성의 하류의 엔트너-도우도로프 경로의 중단은 6-포스포글루코네이트로부터 피루베이트 합성 공정의 하나 이상의 반응을 특이적으로 표적화한다. 이러한 합성은 (i) 6-포스포글루코네이트 탈수 효소 ("EDD" - EC. 4.2.1.12) 및 (ii) 2-데하이드로-3-데옥시-포스포글루코네이트 알돌라제 ("EDA" - E.C. 4.1.2.14)의 2가지 효소의 연속 작용에 의해 개시된다.
6-포스포글루코네이트 탈수 효소는 6-포스포글루코네이트의 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트로의 탈수 반응을 촉매한다. 유기체에 따라, 6-포스포글루코네이트 탈수 효소를 인코딩하는 유전자는 edd (GenBank NP_416365, 예를 들어, 에세리키아 콜라이), 또는 ilvD (예를 들어, 미코박테리움 종)로 지칭될 수 있다.
2-데하이드로-3-데옥시-포스포글루코네이트 알돌라제는 6-포스포글루코네이트 탈수 효소에 의해 생성된 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트로부터 피루베이트 분자 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 분자의 합성을 촉매한다. 유기체에 따라, 2-데하이드로-3-데옥시-포스포글루코네이트 알돌라제를 인코딩하는 유전자는 eda (GenBank NP_416364, 예를 들어, 에세리키아 콜라이), 또는 kdgA (예를 들어 서모프로테우스 테낙스), 또는 dgaF (예를 들어 살모넬라 티피무리움)로 지칭될 수 있다.
특정의 일례에서, 미생물을 6-포스포글루코네이트 탈수 효소를 인코딩하는 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형시킨다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다.
대안적 또는 추가적으로, 미생물은 2-데하이드로-3-데옥시-포스포글루코네이트 알돌라제를 인코딩하는 유전자의 발현은 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된다. 우선적으로는, 유전자 발현은 완전히 억제된다.
하기 표 9 및 표 10에는 예로서, 표적 미생물에 따라 억제될 수 있는 6-포스포글루코네이트 탈수 효소 및 2-데하이드로-3-데옥시-포스포글루코네이트 알돌라제를 인코딩하는 서열이 열거된다. 당업자는 미생물에 따라 어느 유전자가 억제될 대상 효소에 해당하는지를 인지하고 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
일반적으로, 본 실시형태에서, 피루베이트 생성은 더이상 엔트너-도우도로프 경로를 통해 이루어질 수 없거나, 적어도 유의하게 감소한다.
특정의 예시적 실시형태에서, 미생물은 edd 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제된 에세리키아 콜라이 속의 박테리아이다.
특정의 일례에서, 에세리키아 콜라이 속의 박테리아를 gapA, 및 edd 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형시킨다.
본 발명에 따르면, 기능성 RuBisCO 및 기능성 PRK를 발현하고, 해당과정 경로 및 엔트너-도우도로프 경로가 적어도 부분적으로 억제된 유전자 변형 미생물은 더이상 해당과정에 의해 3PG를 생성할 수 없거나, 엔트너-도우도로프 경로에 의해 피루베이트를 생성할 수 없다. 따라서, 글루코스로부터의 탄소 흐름은 바람직하게는 PRK/RuBisCO 조작으로 유도된다.
대상 분자의 생성
본 발명에 따르면, 대상 외인성 분자를 생성하고/하거나, 대상 내인성 분자를 과생성하도록 유전자 변형 미생물을 형질전환시킨다.
본 발명과 관련하여, 대상 분자는 우선적으로 0.8 kDa 이하의 분자량을 갖는 소형 유기 분자를 지칭한다.
일반적으로, 상기에 기재된 바와 같이, 미생물에 대한 유전자 변형은 대상 분자의 합성 및/또는 생물전환 경로의 탄소 수율을 개선시킨다.
본 발명과 관련하여, "개선된" 수율은 최종 산물의 양을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명과 관련하여, 탄소 수율은 최종 산물의 양 대 발효 가능한 당의 양의 비율, 특히 중량비에 해당한다. 본 발명에 따르면, 동일한 배양 조건하에 적용된 야생형 미생물과 비교하여, 본 발명에 따른 유전자 변형된 미생물에서 탄소 수율이 증가한다. 유리하게는, 탄소 수율은 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20% 이상 증가한다. 본 발명에 따른 유전자 변형된 미생물은 유전자 변형된 미생물에 의해 생성된 이종 분자보다 더 많은 양의 대상 분자 (최종 산물)를 생성하여, 간단하게, 해당 분자를 생성하거나 과생성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 유전자 조작 미생물은 또한 야생형 미생물에 비해 내인성 분자를 과생성할 수 있다. 내인성 분자의 과생성은 주로 양적 용어로 이해된다. 유리하게는, 유전자 변형된 미생물은 야생형 미생물보다 적어도 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량% 이상의 내인성 분자를 생성한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 미생물을 아미노산, 테르페노이드, 테르펜, 비타민 및/또는 비타민 전구체, 스테롤, 플라보노이드, 유기산, 폴리올, 폴리아민, NADP 의존성 시토크롬 p450을 통한 입체 특이적 하이드록실화로부터의 방향족 분자 등 중 적어도 하나의 분자를 생성하거나, 과생성하도록 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 아르기닌, 리신, 메티오닌, 트레오닌, 프롤린, 글루타메이트, 호모세린, 이소류신, 발린 및 γ-아미노부티르산으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 파르네센과 같은 테르페노이드 경로 및 테르펜 경로로부터 분자를 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 판토에이트, 판토테네이트, 트랜스뉴로스포렌, 필로퀴논 및 토코페롤로부터 선택되는 비타민 또는 전구체를 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로 스쿠알렌, 콜레스테롤, 테스토스테론, 프로게스테론 및 코르티손으로부터 선택되는 스테롤을 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 프람비논 및 베스티논으로부터 선택된 플라보노이드를 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 쿠마르산, 3-하이드록시프로피온산, 시트르산, 옥살산, 숙신산 및 이타콘산으로부터 선택된 유기산을 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 소르비톨, 자일리톨 및 글리세롤로부터 선택된 폴리올을 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 폴리아민, 우선적으로는 스페르미딘을 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
특정의 일례에서, 우선적으로는 페닐프로파노이드, 테르펜, 지질, 탄닌, 향, 호르몬으로부터 선택된 NADP 의존성 시토크롬 p450을 통해 입체 특이적 하이드록실화로부터 방향족 분자를 생성하거나, 과생성하도록 미생물을 유전자 변형시킨다.
대상 분자가 생물전환에 의해 획득되는 경우에, 유리하게는, 전환될 기질을 포함하는 배양 배지에서 유전자 변형된 미생물을 배양시킨다. 일반적으로, 본 발명에 따른 유전자 변형된 미생물에 의한 대상 분자의 생성 또는 과생성은 당업자에게 공지된 적절한 배양 배지에서 상기 미생물을 배양함으로써 획득된다.
용어 "적절한 배양 배지"는 일반적으로 상기 미생물의 유지 및/또는 성장을 위한 필수 영양 물질 또는 유익한 영양 물질, 예컨대 탄소원; 황산암모늄과 같은 질소원; 제1인산칼륨과 같은 인의 공급원; 미량 원소, 예를 들면 구리, 요오드화물, 철, 마그네슘, 아연 또는 몰리브덴산의 염; 비타민 및 아미노산 또는 기타 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자를 제공하는 멸균 배양 배지를 지칭한다. 필요에 따라 소포제를 첨가할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 적절한 배양 배지는 화학적으로 규정되거나 복합적일 수 있다. 따라서 배양 배지는 문헌[Verduyn et al. (Yeast. 1992. 8:501-17)]에 규정되고, 문헌[Visser et al. (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81)]에 의해 채용된 바와 같은 합성 배지, 또는 시판 배지, 예컨대 효모 질소 염기 (YNB) 배지 (MP Biomedicals 또는 Sigma-Aldrich)와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.
특히, 배양 배지는 선택적으로 탄소 보조 기질로서 CO2가 보충된 글루코스, 갈락토스, 수크로스, 몰라세스 또는 이들 당류의 부산물과 같은 단순 탄소원을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 단순 탄소원은 대상 미생물의 정상적인 성장을 가능하게 해야한다. 일부 경우에는, 또한 리그노셀룰로스 바이오매스, 볏짚 또는 전분과 같은 복합 탄소원을 사용할 수 있다. 복합 탄소원을 사용하려면 일반적으로 사용하기 전에 전처리할 필요가 있다.
특정의 일 실시형태에서, 배양 배지는 처리되거나 또는 처리되지 않은 글리세롤, 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)의 상이한 종류를 촉진하기 위해, 글루코스, 자일로스 또는 아라비노스와 같은 단당류, 슈크로스와 같은 이당류, 아세테이트, 뷰티레이트, 프로피오네이트 또는 발레레이트와 같은 유기산 중 적어도 하나의 탄소원을 포함한다.
생성 및/또는 과생성되는 분자에 따라, 영양 인자 (N, O, P, S, K, Mg, Fe, Mn, Co, Cu, Ca, Sn; 문헌[Koller et al., Microbiology Monographs, G.-Q. Chen, 14: 85-119, (2010)])의 공급원을 사용할 수 있다. 이는 특히 폴리하이드록시부티레이트 (PHB)를 포함한 폴리하이드로알카노에이트 (PHA)의 합성 및 세포 내 축적을 촉진시키는 경우이다.
본 발명에 따르면, 대상 분자를 산업적 규모로 생성할 수 있는 임의의 배양 방법이 고려될 수 있다. 유리하게, 배양은 생물반응기에서, 특히 회분식, 유가식 및/또는 연속 배양 모드에서 수행된다. 우선적으로 대상 분자의 생성과 관련된 배양은, 예를 들어 200　g/L 내지 700　g/L의 농도일 수 있는 농축 글루코스 용액을 첨가함으로써, 하나 이상의 기질의 제어 공급에 해당하는 유가식 모드이다. 이 과정 중 비타민의 제어 공급이 또한 생성성에 유리할 수 있다 (문헌[Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60:67-72]). 또한 질소 공급을 제한하기 위해 암모늄염 용액을 첨가할 수 있다.
발효는 대상 분자의 생성에 필요한 최소한의 단순 탄소원 및/또는 외인성 CO2 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에 의해 삼각 플라스크에서 고체 및/또는 액체의 사전 배양의 가능한 단계에 의해 생물반응기에서 일반적으로 수행된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 미생물의 배양 조건은 미생물 및/또는 생성/과생성되는 분자에 따라 당업자가 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, S. 세레비시아에, 효모의 배양 온도는 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 35℃, 더욱 특히 약 30℃이다. 쿠프리아비두스 네카토르의 배양 온도는 25℃ 내지 35℃, 바람직하게는 30℃이다.
따라서 본 발명은 또한 우선적으로는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 폴리올 및 유기산으로부터 선택되는 대상 분자의 생성 또는 과생성을 위한 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 대상 분자를 생성하는 생명공학적 공정에 관한 것이며, 본 발명에 따른 유전자 변형 미생물을 상기 미생물에 의한 상기 대상 분자의 합성 또는 생물전환을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 선택적으로 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정의 일 실시형태에서, 미생물은 상기 대상 분자의 합성에 관여하는 적어도 하나의 효소를 발현하도록 유전자 변형된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 미생물은 상기 대상 분자의 생물전환에 관여하는 적어도 하나의 효소를 발현하도록 유전자 변형된다.
본 발명은 또한 대상 분자를 생성하는 공정에 관한 것이며, 이는 (i) 상기 대상 분자의 합성 또는 생물전환에 관여하는 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 서열을 본 발명에 따른 재조합 미생물에 삽입하는 단계, (ii) 상기 미생물을 상기 효소의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 선택적으로 (iii) 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형되고, pgk (유전자 ID: 4982539) 및 gsdA (유전자 ID: 497979751) 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 진균류, 특히 사상균류, 예컨대 아스페르길루스 니게르에 의해 시트레이트를 과생성할 수 있다.
또한 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형되고, pgk (유전자 ID: 4354973) 및 gsdA (유전자 ID: 4316232) 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 진균류, 특히 사상균류, 예컨대 아스페르길루스 테레우스 또는 아스페르길루스 니게르에 의해 이타콘산을 과생성할 수 있다.
유사하게, 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO의 파르네센 합성효소를 발현하도록 유전자 변형되고, PGK1 유전자 (유전자 ID: 5230)의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에 종의 효모에 의해 파르네센을 생성할 수 있다.
또한 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형되고, gapA 유전자 (유전자 ID: 947679)의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 박테리아, 예컨대 에세리키아 콜라이 종의 박테리아에 의해 글루타메이트를 과생성할 수 있다. 이러한 과생성은 또한 gapA 유전자의 적어도 부분적 억제가 zwf 유전자 (유전자 ID: 946370)의 적어도 부분적 억제와 조합된 균주에서 일어날 수 있다.
유사하게, 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO뿐만 아니라, 글루타메이트 탈탄산효소 gadB (유전자 ID: 946058)를 발현하도록 유전자 변형되고, gapA 유전자 (유전자 ID: 947679)의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 박테리아, 예컨대 에세리키아 콜라이 종의 박테리아에 의해 γ-아미노부티르산을 과생성할 수 있다. 이러한 과생성은 또한 gapA 유전자의 적어도 부분적 억제가 zwf 유전자 (유전자 ID: 946370)의 적어도 부분적 억제와 조합된 균주에서 일어날 수 있다.
유사하게, 글리옥실레이트가 옥살레이트로 산화되도록 할 수 있는 효소적 활성, 우선적으로는 글리옥실레이트 탈수소효소 FPGLOXDH1 (mRNA: BAH29964.1), 글리옥실레이트 산화효소 GLO (mRNA: AOW73106.1), 또는 락테이트 탈수소효소 LDHA (유전자 ID: 3939)뿐만 아니라, 기능성 PRK 및 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO를 발현하도록 유전자 변형되고, gapA (유전자 ID: 947679) 및 zwf (유전자 ID: 946370) 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 박테리아, 예컨대 에세리키아 콜라이 종의 박테리아에 의해 숙신산 및 옥살산을 과생성할 수 있다.
실시예
실시예 1: 생물정보학적 분석
a) 이론적 수율의 계산
i) 본 발명에 따른 변형 균주 및 5탄당 포스페이트 경로 및 해당과정을 사용한 야생형 균주 사이의 글루코스로부터의 탄소 고정 수율의 비교
본 발명에 따라 기재된 변형의 이점을 평가하기 위해, 관련된 반응의 화학량론을 기반으로 하여 이론적 수율 계산을 수행하였다.
2가지 시나리오를 분석하였다: (i) NADPH-의존성 생합성 경로 (예를 들어, 파르네센 합성)를 공급하기 위한 해당과정이 억제된 균주 및 (ii) 대상 생합성 경로 (예를 들어 시트레이트 합성)를 공급하기 위한 해당과정 및 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 억제된 균주에서 PRK-RuBisCO 조작에 의해 제공되는 개선.
NADPH-의존성 생합성 경로의 개선과 관련하여, 5탄당 포스페이트 경로를 통한 글루코스로부터 NADPH 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3-P)의 형성의 이론적 평형을 하기 식 (1)에 따라 계산하였다:
(1) 3 글루코스 + 5 ATP + 6 NADP+ + 3 H2O → 5 G3-P + 5 ADP+ 6 NADPH + 11 H+ + 3 CO2
G3P로부터 피루베이트가 형성되기까지, 하기 평형에 도달한다:
(2) 3 글루코스 + 5 ADP + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5 Pi → 5 피루베이트 + 5 ATP+ 6 NADPH + 5 NADH + 11 H+ + 3 CO2 + 2 H2O
글루코스 1 몰에 대한 평형을 정규화하여, 하기 수율이 획득된다:
(3) 글루코스 + 1.67 ADP + 2 NADP+ + 1.67 NAD+ + 1.67 Pi → 1.67 피루베이트 + 1.67 ATP+ 2 NADPH + 1.67 NADH + 3.67 H+ + CO2+ 0.67 H2O
따라서, 5탄당 포스페이트 경로를 사용함으로써, 1.67 몰의 피루베이트 및 2 몰의 NADPH가 1 몰의 글루코스로부터 생성된다. 그러나 6-포스포글루코네이트 탈수소 효소 (EC 1.1.1.44)에 의한 리불로스-5-포스페이트의 형성 동안 탈카복실화에 의해 1 몰의 탄소가 손실된다. 비교하기 위해, 해당과정 경로에 의한 피루베이트 형성은 하기 수율을 제공한다:
(4) 글루코스 + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi → 2 피루베이트 + 2 ATP+ 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
5탄당 포스페이트 경로에 의한 피루베이트 생성의 최대 이론적 수율은 0.82 g피루베이트/g글루코스 (소모된 글루코스의 g당 합성 피루베이트의 g)이며, 해당과정 경로에 의한 경우 이는 0.98 g피루베이트/g글루코스이다.
해당과정이 억제된 균주 (예를 들어 S. 세레비시아에 효모의 ΔPGK1)에 PRK/RuBisCO 조작을 혼입함으로써, 탄소 고정 흐름은 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지로 재유도된 후, PRK/RuBisCO 조작으로 재유도된다 (도 2 참조). 이러한 흐름은 3-포스포글리세레이트 (3PG) 형성 수준에서 해당과정 경로의 종결과 관련되며, 수율은 하기와 같다:
(5) 글루코스 + 2 ATP + 2 NADP+ + 2 H2O → 2 3PG + 2 ADP + 2 NADPH + 6 H+
3PG로부터 피루베이트가 형성되기까지, 하기의 평형에 도달한다:
(6) 글루코스 + 2 NADP+ → 2 피루베이트 + 2 NADPH + 4 H+
본 발명에 따른 변형을 미생물에 혼입시킴으로써, 그 외에 5탄당 경로에서 탈카복실화에 의해 손실된 탄소 분자를 회수할 수 있다. 따라서 최대 이론적 탄소 고정 수율은 0.98 g피루베이트/g글루코스이며, 이는 5탄당 포스페이트 경로에 의한 NADPH의 생성을 수반한 피루베이트의 생성에 의해 획득된 수율을 20.5% 개선한다.
두 번째 경우에서 (도 3 참조), 해당과정 (예를 들어 S. 세레비시아에 효모의 경우 ΔPGK1) 및 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지 (예를 들어 S. 세레비시아에 효모의 경우 ΔZWF1) 둘 모두가 억제된 균주에 PRK/RuBisCO 조작을 혼입시킨다. 그 후, 글루코스로부터 NADPH 및 3-포스포글리세레이트 (3PG)의 형성의 이론적 평형은 다음과 같다:
(7) 2.5 글루코스 + 6 ATP + 3 CO2 + 3 H2O → 6 3PG + 6 ADP + 12 H+
3PG로부터 피루베이트가 형성되기까지, 하기의 평형에 도달한다:
(8) 2.5 글루코스 + 3 CO2 → 6 피루베이트+ + 3 H2O + 6 H+
글루코스 1 몰에 대한 평형을 정규화하여, 하기 수율이 획득된다:
(9) 글루코스 + 1.2 CO2 → 2.4 피루베이트 + 1.2 H2O + 2.4 H+
본 발명에 따른 변형을 혼입시킴으로써, 소모된 글루코스 몰당 1.2개의 추가의 탄소 분자가 고정될 수 있다. 해당 최대 이론적 수율은 1.17 g피루베이트/g글루코스이며, 이는 해당과정의 탄소 고정 수율과 비교하여, 약 20% 개선된 것이다.
ii) 시트레이트 생성의 적용
두 번째 경우에, S. 세레비시아에 효모, 야생형 균주 및 PRK/RuBisCO 조작을 혼입시키고, 해당과정 경로를 억제하기 위해, PGK1 유전자를 결실시키고, 5탄당 경로의 산화성 분지를 억제하기 위해, ZWF1 유전자를 결실시켜, 본 발명에 따라 변형된 변형 균주에서 시트레이트 생성에 대해 계산한다.
피루베이트로부터 시트레이트의 생성은 다음 평형식에 의해 정리된다:
(11) 2 피루베이트 + ATP + NAD+ + 2 H2O → 시트레이트 + ADP + NADH + Pi + 3H+
이러한 합성에는 NADPH는 필요하지 않으나, 2몰의 피루베이트가 필요하다. 최선으로, 식 (4)에 따라, 야생형 균주는 해당과정에 의해 1몰의 글루코스로부터 2몰의 피루베이트를 획득하며, 평형은 다음과 같다:
(12) 글루코스 + ADP + 3 NAD+ + Pi → 시트레이트 + ATP+ 3 NADH + 5 H+
해당하는 g시트레이트/g글루코스 수율은 1.07이다.
해당과정 경로 및 5탄당 포스페이트 경로가 억제된 본 발명에 따른 변형 균주와 관련하여, 단지 0.83 몰의 글루코스에 의해 필요한 2개의 피루베이트가 획득되며 (식 9 참조), 평형은 다음과 같다:
(13) 0.83 글루코스 + CO2 + ATP + NAD+ + H2O → 시트레이트 + ADP+ NADH + Pi + 5 H+
해당하는 g시트레이트/g글루코스 수율은 1.28이며, 이는 야생형 균주의 수율과 비교하여, 약 20%의 최대 이론적 증가율이다.
b) 흐름 평형 분석에 의한 생합성 수율의 시뮬레이션
생물정보학적 접근법에서, 상이한 생합성 경로의 수율에 대한 본 발명에 따라 기재된 변형의 영향을 시뮬레이션하기 위해, 흐름 평형 분석 (FBA)을 또한 수행하였다.
FBA는 게놈 규모에서 대사 네트워크를 시뮬레이션하는 수학적 모델을 기반으로 한다 (문헌[Orth et al., Nat Biotechnol. 2010; 28: 245-248]). 재구성된 네트워크는 소정의 유기체의 공지된 대사 반응을 포함하고, 특히 세포 유지 또는 성장을 보장하기 위해 세포에 필요한 것을 혼입시킨다. FBA는 이러한 네트워크를 통해 대사산물의 흐름을 계산할 수 있도록 함으로써, 대사산물 생성 수율뿐만 아니라, 이론적 성장율의 예측을 가능하게 한다.
i) 절차
OptFlux 소프트웨어 (문헌[Rocha et al., BMC Syst Biol. 2010 Apr 19;4:45. doi: 10.1186/1752-0509-4-45]), 및 사카로마이세스 세레비시아에 대사 모델 iMM904 (문헌[Mo et al., BMC Syst Biol. 2009 Mar 25;3:37. doi: 10.1186/1752-0509-37])에 의해 FBA 시뮬레이션을 수행하였다. 이 모델을 (i) PRK-유형 반응의 첨가, (ii) RuBisCO-유형 반응의 첨가와 함께 이종의 CO2 고정 경로를 포함시켜, 본 발명에 따라 기재된 개선점을 포함하도록 변형시켰다.
특정의 예시적 실시형태에서, 이종 경로를 통한 분자 생성을 시뮬레이션하기 위해 필요한 반응을 또한 이 모델에 첨가하였다.
특정의 예시적 실시형태에서, 파르네센의 이종 생성을 위해 파르네센 합성효소 반응 (EC 4.2.3.46 또는 EC 4.2.3.47)을 첨가하였다.
제2의 특정의 예시적 실시형태에서, 폴리하이드록시부티레이트의 단량체인 β-하이드록시부티레이트의 이종 생성 경로를 자극하기 위해, 아세토아세틸-CoA 환원효소 (EC 1.1.1.36) 및 폴리-하이드록시부티레이트 합성효소 (EC 2.3.1.B2 또는 2.3.1.B5) 반응을 이 모델에 첨가하였다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 글루타메이트 탈탄산효소 반응 (EC 4.1.1.15)을 γ-아미노부티르산의 이종 생성을 위해 첨가하였다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 아코니테이트 탈탄산효소 반응 (EC 4.1.1.6)을 이타콘산의 이종 생성을 위해 첨가하였다.
또 다른 특정의 예시적 실시형태에서, 락테이트 탈수소효소 반응 (EC 1.1.1.27)을 옥살레이트의 이종 생성을 위해 첨가하였다.
본 발명에 따라 기재된 조건 (예를 들어, 배지 중 비제한 글루코스의 존재, 호기성 배양 조건)하에서 S. 세레비시아에의 균주의 생체내 배양 조건을 시뮬레이션하기 위해, 당업자에 의해 재현 가능한 제한 조건 세트를 모델에 적용함으로써 시뮬레이션을 수행하였다.
특정의 예시적 실시형태에서, 본 발명에 따라 기재된, 해당과정 활성 및 5탄당 포스페이트 경로의 저하를 시뮬레이션하기 위해, 효소 PGK1 (예를 들어 글루타메이트, β-하이드록시부티르산, 파르네센) 및 ZWF1 (예를 들어 시트레이트 생성)의 반응을 사실상 불활성화시킴으로써 시뮬레이션을 수행한다.
시험된 생합성 경로의 생성 수율에 대한 본 발명에 따라 기재된 개선의 영향을 평가하기 위해 변형되지 않은 "야생형 균주" 모델에 대해 병렬 방식으로 시뮬레이션을 수행한다.
ii) 결과
획득된 이론적 수율 및 본 발명에 의해 제공된 개선된 백분율이 하기 표 11에 기재되어 있다.
Figure pct00011
실시예 2: S. 세레비시아에에서의 이종 파르네센 생성의 개선
시판 균주 CEN.PK 113-7D (GenBank: JRIV00000000)로부터 유래한 사카로마이세스 세레비시아에 효모 균주, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c)를 CO2가 손실됨이 없이 NADPH를 생성함으로써, 글루코스로부터 알파-파르네센 생성이 개선되도록 조작한다.
a) 해당과정 경로의 불활성화
결과적으로, 해당과정 경로를 PGK1 유전자의 결실에 의해 불활성화시켰다. 해당과정이 억제되면, 생성된 효모 균주는 더 이상 탄소 및 에너지의 공급원으로서 글루코스를 사용할 수 없게 된다. 따라서 바이오매스 합성 경로에 글리세롤을, 에너지 경로에 에탄올을 공급할 필요가 있다. PGK1이 결실된 균주를 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) 배지에서 성장시킨다.
다음과 같이, PGK1 유전자의 결실을 획득한다:
플라스미드 pUG6 (P30114 - Euroscarf)에 포함된 KanMX 카세트로부터 유래한 G418 내성 유전자의 코딩 상을 올리고뉴클레오타이드 CB101 (서열번호　1) 및 CB102 (서열번호　2)에 의해 증폭시킨다:
Figure pct00012
올리고뉴클레오타이드의 밑줄 친 부분은 Kan 서열과 완전하게 상동성이며, 나머지 서열은 사카로마이세스 세레비시아에 게놈상의 PGK1 유전자 코딩 상에 인접한 영역에 상응하므로, 그 말단에 PGK1 유전자 좌위의 상동성 재조합 서열을 포함하는 PCR 앰플리콘이 생성된다.
당업자에 따른 형질전환 반응을 위해 (문헌[Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor lab course manual, 1997; Gietz and Schiest, 1995, Methods in Molecular and Cellular Biology 5[5]:225-269]), 균주 CEN.PK 1605를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스)에서, 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시켰다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁하였다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조하였다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 5 또는 10　μL의 정제된 PCR 반응 (결실 카세트) 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 세포를 2 mL의 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) 배지에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, 180　μg/mL YPGE+G418에 도포하였다.
획득된 콜로니를 PGK1 유전자의 결실을 검증하기 위해 유전자형을 분석하고, EQ-0134 (CEN.PK1605 △pgk1::kan)라는 참조번호를 붙였다.
b) PRK - RuBisCO - 알파-파르네센 합성 효소의 도입
해당과정에 대한 대안적 경로를 재구성하고, △pgk1 균주가 글루코스에서 성장할 수 있도록 하기 위해, 다음의 조합 발현이 가능하도록 하기 위해, 상기 균주를 변형시켰다:
· 리불로스-5P를 소모시키고, 리불로스-1.5비스P를 제공함으로써, 5탄당 포스페이트 경로에 관여하는 포스포리불로키나제 PRK를 인코딩하는 유전자 및
· I형 RuBisCO (구조 유전자 RbcL 및 RbcS 및 샤프론 RbcX, GroES 및 GroEL). RuBisCO는 해당과정 경로의 PGK1 결실의 하류에서 리불로스-1.5비스P 및 1 몰의 CO2를 소모하여, 3-포스포글리세레이트를 형성시킨다.
이러한 대안적 경로는 다시 한번 균주가 탄소 및 에너지의 주요 공급원으로서 글루코스를 소모할 수 있도록 한다.
알파-파르네센을 생성하기 위해, 효모는 알파-파르네센 합성효소 유전자 (AFS1; 서열번호　71; GenBank 수탁번호 AY182241)가 부재한다.
또한, 자가 복제가 가능하고, 적합한 복제 기점을 가지며, 각각 상이한 영양 요구 또는 항생제 내성의 보충을 위한 유전자를 보유함으로써, 3 또는 4개의 플라스미드 작제물을 포함하는 균주의 선택이 가능한 4개의 플라스미드 벡터에 PRK-RuBisCO 조작에 필요한 7개의 유전자 (표 12)를 클로닝하였다.
이들 플라즈미드 중 2개는 단일 카피이고, Ars/CEN 복제 기점을 가지며, 세 번째는 2 μ 복제 기점을 갖는 다중 카피이다.
Figure pct00013
rbcL, rbcS, rbcX 및 prk와 같은 시네코코쿠스 엘롱가투스로부터의 유전자 (WO 2015107496 A1에 기재된 바와 같음) 및 말루스 도메스티카 알파-파르네센 합성효소 (문헌[Tippmann et al., Biotechnol Bioeng. 2016 Jan; 113(1):72-81])를 사카로마이세스 세레비시아에 효모에서 코돈을 사용하기 위해 최적화하였다.
효모 형질전환에 대해 이전에 기재된 프로토콜에 따라, 균주 EQ-0134를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올)에서 성장시켰다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁하였다. 동시에, 다음의 형질전환 혼합물을 제조하였다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL (3　μg의 다음 조합, pFPP45+pFPP56+pFPP20 또는 pL4+pFPP45+pFPP56+pFPP20 중 하나) 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 글리세롤 및 에탄올을 포함하는 2　mL YNB (황산암모늄을 포함하는 효모 질소성 염기)에 세포를 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 10% CO2가 농축된 대기하에 인큐베이션하였다. 가능한 경우, 탄소원으로서 글리세롤 및 에탄올을 포함하고, 황산암모늄 + CSM (LUW (류신 우라실, 트립토판) 무함유) + 노우르세오트리신 (nourseothricin)을 포함하는 YNB 한천 배지에 최종 혼합물을 도포하였다.
이전에 기재된 프로토콜에 따라, 균주 CEN.PK 1605를 다음 플라스미드 조합: pL4+pFL36+pCM185+pV51TEF로 형질전환시킨다.
획득된 클론을 모든 조작 유전자에 대해 유전자형을 분석한 후, 액체 배지 YNB 황산암모늄 및 글루코스에 적용하였다.
·EQ-0153 (CEN.PK1605 △pgk1::kan) (pFPP45+pFPP56+pFPP20)
·EQ-0253 (CEN.PK1605 △pgk1::kan) (pL4+pFPP56+pFPP20+pFPP45)
·EQ-0353 (CEN.PK1605) (pL4+ pFL36+ pCM185+pV51TEF)
c) 글루코스 및 CO 2 를 포함하는 액체 배지 중 성장에의 균주 EQ-0153 및 EQ-0253의 적용
진탕 인큐베이터 (120　rpm, 30℃)에서 적절한 배양 배지 및 외인성 10% CO2 공급원을 포함하는 삼각 플라스크에서의 회분식 배양을, EON 분광분석기 (BioTek Instruments)를 사용하여 측정된 0.05 OD 600nm에서 접종하여, 수행한다. 적절한 경우, 노우르세오트리신의 존재하에 PRK 발현이 유도되지 않는 조건하에 10　g/L 글리세롤 및 7.5　g/L 에탄올을 포함하는 YNB+CSM-LUW 배지에서 대상 균주를 성장시킨다. 이러한 조건하에, PGK1 유전자의 결실 전 및 후에 균주를 공급하여야 한다.
충분한 양의 바이오매스를 획득한 후, 적어도 250 mL의 삼각 플라스크에서 50 mL 이상의 용적의 배양물을 접종하여 PRK/RuBisCO 조작 사용에 균주를 적용시킨다. 상기 기재된 바와 같이, 필요한 경우, 노우르세오트리신의 존재하에 외인성 CO2 공급원 및 20　g/L 글루코스를 포함하는 YNB+CSM-LUW 배양 배지에서 상기 적용 단계를 수행한다.
유의한 성장이 개시된 것을 관찰한 후, 상기 기재된 바와 같이, CSM-LUW에 포함된 아미노산 및 질소성 염기 무함유 최소 미네랄 배지, 즉, 20　g/L 글루코스, 필요한 경우, 노우르세오트리신 및 외인성 CO2 공급원을 포함하는 YNB 단독에 균주를 적용시킨다.
d) 삼각 플라스크에서의 파르네센의 생성
해당과정 경로에서 PGK1 유전자가 결실된 사카로마이세스 세레비시아에 균주 EQ-0253을 성장시켜, PRK 및 RuBisCO를 사용하여, CO2 손실 없이 NADPH를 과생성시키고, 파르네센을 생성시킨다.
PRK 및 RuBisCO가 첨가되거나, PGK1이 결실되지 않은 이종 알파 파르네센 합성효소를 도입시킨 후, 파르네센을 생성하는 참조 균주 EQ-0353과 이러한 대상 균주를 비교한다.
균주 EQ-0253 (CEN.PK1605 △pgk1::kan) (pL4+pFPP56+pFPP20+pFPP45) 및 EQ-0353 (CEN.PK1605) (pL4+ pFL36+ pCM185+pV51TEF)을 100　μg/L 노우르세오트리신이 첨가되고, 20　g/L D-글루코스를 포함하는 YNB 배지 중에 성장시켰다. 20　mL의 배양 배지를 포함하는 사전 배양물을 0.05 OD600nm에서 250　mL 베플 삼각 플라스크에 접종시키고, 10% CO2로 조절된 대기의 Minitron 인큐베이터에서 30℃에서 120　rpm으로 24 h 동안 진탕시켰다. 첫 번째 사전 배양물로부터 50　mL의 배지를 0.05 OD600nm에서 250　mL 삼각 플라스크에 접종하고, 30℃, 10% CO2에서 120　rpm으로 24 h 동안 진탕시켰다. 또한 두 번째 사전 배양물로부터 삼각 플라스크 (500　mL, 베플)에서 수행된 배양물을 50　μg/mL 암피실린, 10　μL 소포제 (소포제 204, Sigma, A6426) 및 10% (v/v) 도데칸이 첨가된 동일한 배양 배지 100　mL에 0.05 OD600nm에서 접종하였다 (문헌[Tippman et al., Talanta (2016), 146: 100-106]). 배양물을 10% CO2의 존재하에 30℃에서 120　rpm으로 진탕시켰다. 600　nm에서 혼탁도를 측정함으로써, 성장을 모니터링하였다.
파르네센을 추출하기 위해, 500　μL의 유기 상을 수집하고, 5분 동안 5,000 g에서 원심분리하여, 2개의 상을 완전히 분리시켰다. 유기상을 GC-MS 분석시까지 4℃에 저장하였다. α-파르네센의 검출 및 정량화를 단일 4극자 질량 분광분석에 의해 수행하였다. Zebron ZB-FFAP 컬럼을 2.95 mL/분의 고정 속도로 운반 기체로서 수소와 함께 사용하였다. 유입구 온도는 260℃였고, 비 분할 방식으로 1　μL의 샘플을 주입하였다. 초기 오븐 온도는 70℃ (4분)였고, 그 후 점차적으로 160℃ (7℃/분)로 증가시킨 후, 240℃ (40℃/분)로 상승시켜, 이를 1.05분 동안 유지시켰다. 질량 분광분석 검출의 경우, 전달 라인 및 공급원 온도는 각각 250℃ 및 200℃였다. t=10분에서 t=20분 사이에 질량을 획득하였다. 균주에 의해 생성된 α-파르네센의 정량화를 위해 파르네센 이성질체 혼합물 (Sigma, W383902)을 사용하여 7 포인트를 포함하는 외부 보정을 수행하였다.
균주가 소모하는 글루코스를 정량화하기 위해, 배양 배지 500 μL를 동일한 파르네센 추출 OD에서 수집하고, 5,000 g, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 여과하고 (Minicart RC4, Sartorius 0.45 μm), -20℃의 플라스크에 저장하였다. 이 샘플에 포함된 글루코스를 펌프, 8℃ 저온 자동 샘플러 및 굴절률 (RI) 검출기 (Precision Instruments IOTA 2)가 장착된 UltiMate 3000 HPLC-UV (Thermo Scientific)에 의해 정량화하였다. Carbo-H 사전 컬럼 4 x 3.0 mm가 장착된 Rezex ROA-유기산 H+ 컬럼 (8%) 150 x 7.8 mm, 8 μm 입자 크기 (Phenomenex, 00H-0138-KO)를 사용하였다. 컬럼의 온도는 35℃이고, 유속은 0.5 mL/분으로 설정하였다. 등용매 용리를 5 mM H2SO4에서 수성 이동상으로 수행하였고, 이를 30분간 지속하였다. 20 μL의 용적을 각 샘플에 주입하였다. 표준과의 보유 시간 비교를 기반으로 화합물을 확인하였다. 외부 보정에는 10 포인트의 가변 글루코스 농도 (0 내지 20 g/L)가 포함된다.
균주 EQ-0253 및 EQ-0353 둘 모두에 대해 소모된 글루코스의 그램당 생성된 파르네센의 그램으로 탄소 수율 Yα-파르네센/Glc를 계산한다:
Figure pct00014
.
Figure pct00015
대조군 균주 EQ-0353과 비교하여, 균주 EQ-0253에서 관찰된 α-파르네센 대 D-글루코스의 질량 수율의 증가율은 9.6%이었다.
실시예 3: S. 세레비시아에에서의 시트레이트 생성의 개선
a) 접합 유형 MAT의 반수체 균주에서 ZWF1 유전자 및 IDH1 유전자의 불활성화
· ZWF1 유전자의 불활성화
hphMX 카세트 (loxP-pAgTEF1-hph-tAgTEF1-loxP)로부터 유래하고, 플라스미드 pUG75 (P30671) - Euroscarf)에 포함된 하이그로마이신 B 내성 유전자의 코딩 상을 올리고뉴클레오타이드 Sdzwf1 및 Rdzwf1로 증폭시킨다 (표 14). 이는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 ZWF1 유전자 좌위의 상동성 재조합 서열을 그 말단에 포함하는 △zwf1 PCR 앰플리콘을 생성한다.
Figure pct00016
올리고뉴클레오타이드의 밑줄 친 부분은 선택 유전자의 서열에 완전히 상동성인 부분에 해당하고, 서열의 나머지는 사카로마이세스 세레비시아에 게놈상에서 제거될 표적 유전자의 코딩 상에 인접한 영역에 해당한다.
이전에 기재된 시판 균주 CEN.PK 113-7D (GenBank: JRIV00000000)로부터 유래한 균주 CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c)를 상기에 기재된 △zwf1 PCR 단편으로 형질전환시킨다.
형질전환 반응을 위해, 균주 CEN.PK 1605를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스, 20　g/L 글루코스)에서, 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시킨다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁한다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조한다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL의 정제된 PCR 반응 (결실 카세트) 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라낸다. 세포를 2 mL의 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스) 배지에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, YPD + 하이그로마이신B (200　μg/mL)에 도포한다.
획득된 콜로니를 ZWF1 유전자의 결실을 검증하기 위해 유전자형을 분석하고, EQSC-002 (CEN.PK 1605 △zwf1::hph)라는 참조번호를 붙였다.
· IDH1 유전자의 불활성화
이러한 유전자의 불활성화는 시트레이트가 축적될 수 있도록 한다 (문헌[Rodriguez et al., Microb Cell Fact. 2016 Mar 3;15:48]).
natMX 카세트 (loxP-pAgTEF1-nat-tAgTEF1-loxP)로부터 유래하고, 플라스미드 (pUG74 (P30670) - Euroscarf)에 포함된 노우르세오트리신 내성 유전자의 코딩 상을 올리고뉴클레오타이드 Sdidh1 및 Rdidh1로 증폭시킨다 (표 13). 이는 이소시트레이트 탈수소효소 IDH1 하위단위 유전자 좌위의 상동성 재조합 서열을 그 말단에 포함하는 △idh1 PCR 앰플리콘을 생성한다.
이전에 기재된 시판 균주 CEN.PK 113-7D (GenBank: JRIV00000000)로부터 유래한 균주 EQSC-002 (CEN.PK 1605 △zwf1::hph) 및 CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c)를 IDH1 유전자의 불활성화를 위한 PCR 단편으로 형질전환시킨다.
형질전환 반응을 위해, 균주 EQSC-002 및 CEN.PK1605를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스, 20　g/L 글루코스)에서, 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시킨다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁한다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조한다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL의 정제된 PCR 반응 (결실 카세트) 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라낸다. 세포를 2 mL의 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스) 배지에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, YPD + 하이그로마이신B 200　μg/mL, 50　μg/mL 노우르세오트리신에 도포한다.
획득된 콜로니를 IDH1 유전자의 결실을 검증하기 위해 유전자형을 분석하고, EQSC-003 (CEN.PK 1605 △zwf1::hph, △idh1::nat) 및 EQSC-005 (CEN.PK 1605 △idh1::nat)로 칭한다.
b) 접합 유형 MAT 알파의 반수체 균주에서 PGK1 유전자의 불활성화
플라스미드 pUG6 (P30114) - Euroscarf에 포함된 KanMX 카세트 (loxP-pAgTEF1-kanMX-tAgTEF1-loxP)로부터의 G418 내성 유전자의 코딩 상을 올리고뉴클레오타이드 Sdpgk1 및 Rdpgk1로 증폭시켜 (표 13), 3-포스포글리세레이트 키나제 PGK1 유전자 좌위의 상동성 재조합 서열을 그 말단에 포함하는 △pgk1 PCR 앰플리콘을 생성한다.
시판 균주 CEN.PK 113-7D (GenBank: JRIV00000000)로부터 유래한 균주 CEN.PK 1606 (Mat 알파 HIS3 leu2-3.112 trp1-289 ura3-52 MAL.28c)를 PGK1 유전자의 불활성화를 위한 PCR 단편으로 형질전환시킨다.
형질전환 반응을 위해, 균주 CEN.PK 1606를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스, 20　g/L 글루코스)에서, 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시킨다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁한다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조한다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL의 정제된 PCR 반응 (결실 카세트) 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라낸다. 세포를 2 mL의 YPGE (효모 추출물 펩톤 20　g/L 글리세롤, 30　g/L 에탄올)에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, YPGE + 150　μg/mL G418에 도포한다.
획득된 콜로니를 PGK1 유전자의 결실을 검증하기 위해 유전자형을 분석하고, EQSC-008 (CEN.PK 1605, △pgk1::kan)라는 참조번호를 붙였다.
c) IDH1, ZWF1 및 PGK1을 교배에 의해 불활성화시킨 균주의 작제
반대 접합 유형 EQSC-003 (CEN.PK 1605 △zwf1::hph, △idh1::nat) 및 EQSC-008 (CEN.PK 1606 △pgk1::kan)의 반수체 균주를 균주 EQSC-008의 경우 한천 배지:YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스)에서, 균주 EQSC003의 경우 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올)에서 30℃에서 밤새 성장시킨다. 그 후, 2개의 균주를 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) 한천 배지 + 150　μg/mL G418 + 200　μg/mL 하이그로마이신 B에서 직접 접촉시킴으로써, 교배시킨다. G418 및 하이그로마이신 B 이중 선택에 의해 2개의 모체 균주를 제거하고, MAT a/MAT 알파, ZWF1/ △zwf1::hph, IDH1/△idh1::nat, PGK1/△pgk1::kan 이배체 균주만을 이 배지에서 성장시킨다. 이 교배로부터의 단리된 이배체 클론을 수집한다. 3개의 카세트 △zwf1::hph, △idh1::nat, △pgk1::kan의 존재를 150　μg/mL G418 또는 200　μg/mL 하이그로마이신 B 또는 50　μg/mL 노우르세오트리신이 보충된 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) 한천 배지에서의 성장 시험에 의해 검증한다. 획득된 균주를 EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT a/MAT 알파, ZWF1/△zwf1:: hph, IDH1/△idh1::nat, PGK1/△pgk1::kan)라는 참조번호를 붙였다.
이전에 기재된 균주 EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT a/MAT 알파, ZWF1/ △zwf1::hph, IDH1/△idh1::nat, PGK1/△pgk1::kan)를 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) 한천 배지에서 30℃에서 밤새 성장시킨다. 그 후 세포를 결핍 배지 (포자 형성 배지, 1% 아세트산칼륨 + 류신 + 우라실 + 트립토판)에서 액체 배양에 배치하여, 이배체 세포의 감수분열을 유도함으로써, 4개의 반수체 포자를 포함하는 4분자를 형성시킨다. 4분자를 YNB.GE 배지 (효모 질소성 염기, 글리세롤, 에탄올) + 류신 + 우라실 + 트립토판 + 1　g/L 글루탐산 + 20　mg/L 메티오닌 + 40　mg/L 시스테인)에 도포하고, (마이크로다이섹터 (microdissector)를 사용하여) 즉시 박리하여, 동일한 배지 상의 포자를 단리한다. 포자를 수 일 동안 30℃에서 발아시킨다. 이렇게 획득된 반수체 세포의 유전자 함량을 선택 배지 150　μg/mL G418 또는 200　μg/mL 하이그로마이신 B 또는 50　μg/mL 노우르세오트리신이 보충된 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올)에서 성장시켜 시험하고, 교배 유형 MAT a 또는 MAT 알파의 2개의 텍트릭스 (tectrix) 균주와 교배시켜 시험한다. 획득된 콜로니의 유전자형을 분석하여, PGK1, IDH1, ZWF1 유전자의 결실을 검증하고, 리보핵산의 역방향 전사 후 실시간 PCR에 의해 이들 유전자에 해당하는 전사체의 부재를 검증한다. 획득된 균주 중 하나에 EQSC-004 (CEN.PK 1606 MAT 알파 △zwf1::hph, △idh1::nat, △pgk1::kan)라는 참조번호를 붙였다.
d) PRK-RuBisCO 효소의 도입
자가 복제가 가능하고, 적합한 복제 기점을 가지며, 각각 상이한 영양 요구 보충 유전자를 보유함으로써, 3개의 플라스미드 작제물을 포함하는 균주의 선택이 가능한 3개의 플라스미드 벡터에 PRK-RuBisCO 조작에 필요한 6개의 유전자 (하기 표 15)를 클로닝하였다 (WO 2015107496 참조). 이들 플라스미드 중 2개는 단일 카피이고, ARS/CEN 복제 기점을 가지며, 세 번째는 2 μ 복제 기점을 갖는 다중 카피이다.
Figure pct00017
이전에 기재된 형질전환 프로토콜에 따라, 균주 EQSC-004 (CEN.PK 1606 △zwf1 :: hph , △idh1 :: nat , △pgk1 :: kan )를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올)에서 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시켰다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁한다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조한다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL (3　μg)의 pFPP45+pFPP56+pFPP20의 조합 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라낸다. 세포를 2 mL의 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올) + 2　mg/L 독시사이클린에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, YNB.GE (효모 질소성 염기, 글리세롤, 에탄올) + 1　g/L 글루탐산 + 20 mg/L 메티오닌 + 40 mg/L 시스테인 + 2　mg/L 독시사이클린에 도포한다. 획득된 균주는 EQSC-006 (CEN.PK 1606 △zwf1 :: hph , △idh1 :: nat , △pgk1 :: kan ) (pFPP45+pFPP56+pFPP20)라는 참조번호를 붙였다.
이전에 기재된 형질전환 프로토콜에 따라, 균주 EQSC-005 (CEN.PK 1605 △idh1 :: nat )를 30℃에서 50　mL의 용적의 복합 고 영양 배지 YPGE (효모 추출물 펩톤 글리세롤 에탄올)에서 600　nm에서의 광학 밀도가 0.8이 될 때까지 성장시켰다. 세포를 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 25 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 실온에서 2,500 rpm으로 5분간 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 세포를 100 mM 멸균 아세트산리튬 400 μL에 재현탁한다.
동시에, 형질전환 혼합물을 하기와 같이 2 mL 튜브에 제조한다: 250　μL의 50% PEG, 5　mg/mL의 "담체" DNA 10　μL, 36　μL의 1　M 아세트산리튬, 10　μL (3　μg)의 pV51TEF+pFL36+pCM185의 조합 및 350　μL의 물.
재현탁된 세포 (50 μL)를 형질전환 혼합물에 첨가하고, 수조에서 42℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리하고, 상청액을 따라낸다. 세포를 2 mL의 YPD (효모 추출물 펩톤 덱스트로스)에 재현탁하고, 14 mL 튜브에 옮기고, 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 인큐베이션한다. 그 후, 세포를 실온에서 5,000 rpm으로 1분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 mL의 멸균 수에 재현탁하고, 다시 1분간 원심분리하고, 100 μL의 멸균 수에 재현탁하고, YNBD (효모 질소성 염기 덱스트로스) + 2　mg/L 독시사이클린에 도포한다. 획득된 균주는 EQSC-007 (CEN.PK 1605 △idh1 :: nat ) (pV51TEF+pFL36+pCM185)라는 참조번호를 붙였다.
d) 균주 EQSC-006 및 EQSC-007의 적용 및 생장 단계
글루코스 및 CO2를 포함하는 YNB (효모 질소성 염기) 액체 배지에서의 균주 EQSC-006 및 EQSC-007의 성장에의 적용.
진탕 인큐베이터 (120　rpm, 30℃)에서 적절한 배양 배지 및 외인성 10% CO2 공급원을 포함하는 삼각 플라스크에서의 회분식 배양을, EON 분광분석기 (BioTek Instruments)를 사용하여 측정된 0.05 OD 600nm에서 접종하여, 수행한다. PRK 발현이 유도되지 않는 조건하에 10　g/L 글리세롤 및 7.5　g/L 에탄올, + 50 mg/L 글루타메이트를 포함하는 YNB+CSM-LUW 배지에서 대상 균주를 성장시킨다.
충분한 양의 바이오매스를 획득한 후, 적어도 250 mL의 삼각 플라스크에서 50 mL 이상의 용적의 배양물을 접종하여 PRK/RuBisCO 조작 사용에 균주를 적용시킨다. 상기 기재된 바와 같이, 20　g/L 글루코스, 50 mg/L 글루타메이트 및 외인성 CO2 공급원을 포함하는 YNB+CSM-LUW 배양 배지에서 상기 적용 단계를 수행한다.
유의한 성장이 개시된 것을 관찰한 후, 상기 기재된 바와 같이, CSM-LUW에 포함된 질소성 염기 및 하기에 기재된 것을 제외한 전 아미노산을 무함유하는 최소 미네랄 배지, 즉, 최종 농도로, 20　g/L 글루코스, 1　g/L 글루타메이트, 40 mg/L L-시스테인 및 20 mg/L L-메티오닌 및 외인성 CO2 공급원을 포함하는 YNB 단독에 균주를 적용시킨다.
e) 삼각 플라스크에서의 시트레이트의 생성
PGK1 유전자가 해당과정 경로, 5탄당 포스페이트 경로의 산화 부분 및 캘빈 회로에서 결실된 사카로마이세스 세레비시아에 균주 EQSC-006을 성장시켜, PRK 및 RuBisCO를 사용하여, CO2 손실 없이, 시트레이트를 생성시킨다. PRK 및 RuBisCO가 첨가되거나, PGK1 또는 ZWF1이 결실되지 않은 IDH1 유전자를 불활성화시킨 후, 시트레이트를 생성하는 참조 균주 EQSC-007과 이러한 대상 균주를 비교한다.
균주 EQSC-006 (CEN.PK 1605 △zwf1::hph, △idh1::nat, △pgk1::kan, pFPP45+pFPP56+pFPP20) 및 EQSC-007 (CEN.PK 1605 △idh1::nat, pV51TEF+pFL36+pCM185)을 20　g/L D-글루코스 (YNB D20)가 보충된 효모 질소성 염기 (YNB) 배지에서 배양하였다.
시트레이트 대 글루코스 질량 수율을 확립하기 위해, 20　mL의 배양 배지를 포함하는 사전 배양물을 0.05 OD600nm에서 250　mL 베플 삼각 플라스크에 접종시키고, 30℃에서 120　rpm으로 진탕시켰다. 첫 번째 사전 배양물로부터 50　mL의 배지를 0.05 OD600nm에서 250　mL 삼각 플라스크에 접종하고, 30℃에서 120　rpm으로 진탕시켰다. 두 번째 사전 배양물로부터 삼각 플라스크 (500　mL, 베플)에서 수행된 배양물을 30℃, 120　rpm에서 동일한 배지 100　mL에 0.05 OD600nm에서 접종하였다. 600　nm에서 혼탁도를 측정함으로써, 성장을 모니터링하였다.
시트레이트 정량화를 위해, 500　μL의 배양 배지를 수집하고, 4℃에서 5분 동안 5,000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 여과하고 (Minicart RC4, Sartorius 0.45　μm), 단일 4극자 질량 분광분석과 연계된 HPLC 분석 (Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC) 전에 -20℃의 플라스크에 저장하였다. 각 샘플 (20　μL)을 Aminex HPX-87H H+ 컬럼, 300　mm x 7.8　mm (Bio-Rad, 125-0140)에 주입하였다. 0.5 mL/분의 유속에서의 등용매 용리를 수산화암모늄에 의해 pH를 4.5로 조절한 0.037% 포름산 수용액 (v/v)으로 수행하였다. 컬럼 오븐 온도는 65℃였다. 질량 분광분석 조건은 다음과 같다: 음의 전기분무 모드, 공급원 온도 450℃, 바늘 전압 3 kV, 콘 전압 50 V. 7 포인트 외부 보정을 시판 시트르산나트륨 용액을 사용하여 수행하였다.
균주가 소모하는 글루코스를 정량화하기 위해, 배양 배지 500 μL를 시트레이트 정량화와 동일한 배양 OD600　nm에서 수집하고, 5,000 g, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 여과하고 (Minicart RC4, Sartorius 0.45 μm), -20℃의 플라스크에 저장하였다. 이 샘플에 포함된 글루코스를 펌프, 8℃ 저온 자동 샘플러 및 굴절률 (RI) 검출기 (Precision Instruments IOTA 2)가 장착된 HPLC-RI UltiMate 3000 (Thermo Scientific)에 의해 정량화하였다. Carbo-H 4 x 3.0　mm 사전 컬럼이 장착된 Rezex ROA-유기산 H+ 컬럼 (8%) 150 x 7.8 mm, 8 μm 입자 크기 (Phenomenex, 00H-0138-KO)를 사용하였다. 컬럼 오븐 온도는 35℃이고, 유속은 0.5 mL/분으로 설정하였다. 30분간의 등용매 용리를 5 mM H2SO4에서 수성 이동상으로 수행하였다. 20 μL의 용적을 각 샘플에 주입하였다. 표준과의 보유 시간 비교를 기반으로 화합물을 확인하였다. 외부 보정에는 10 포인트의 가변 글루코스 농도 (0 내지 20 g/L)가 포함된다.
균주 EQSC-006 및 EQSC-007 둘 모두에 대해 소모된 글루코스의 그램당 생성된 시트레이트의 그램으로 Y시트레이트/Glc 질량 수율을 계산하였다:
Figure pct00018
.
Figure pct00019
대조군 균주 EQSC-007과 비교하여, 균주 EQSC-006에서 관찰된 시트레이트 대 D-글루코스의 질량 수율의 증가율은 19.5%이었다.
실시예 4: E. 콜라이에서의 글루타메이트 생성의 개선
알파-케토글루타레이트 탈수소효소 유전자를 결실시키면, 글루타메이트 생성이 증가한다 (문헌[Usuda et al. J Biotechnol. 2010 May 3;147(1):17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018]).
본 실시예에서, sucA 유전자가 결실된 에세리키아 콜라이 균주 K12 MG1655를 사용하였다. 이 균주는 에세리키아 콜라이에서 유전자 결실 은행 (문헌[Baba et al., Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0008])으로부터 유래되었으며, 콜라이 유전자 스톡 센터 (Coli Genetic Stock Center)로부터 JW0715-2 및 참조 번호 8786. (JW0715-2: MG1655 △sucA::Kan)으로 공급되었다.
4A] 해당과정의 불활성화에 의한 글루타메이트 생성의 개선
a) Flp 재조합 효소에 의한 FTR 영역의 특이적 재조합에 의한 선택 카세트의 제거
상기 균주 JW0715-2를 작제하는데 사용된 것과 동일한 결실 전략을 재사용할 수 있도록 하기 위해 (문헌[Rodriguez et al., 2016]), 재조합 효소를 사용하여 선택 카세트를 결실시켰다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에 제공됨)에 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충되고, 0.3% L-아라비노스가 첨가된 LB 한천에서 세포를 선택한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 상기 세포가 더이상 성장할 수 없음을 확인함으로써 획득된 클론의 역 선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC002: MG1655 △suc 라 칭한다.
b) 엔트너-도우도로프 대사 경로를 인코딩하는 edd-eda 오페론의 결실
상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, edd-eda 오페론의 결실을 수행한다.
1. FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 염색체 상에 결실 좌위, 즉, 위치 1932065 내지 1932115 및 1934604 내지 1934654의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열을 가짐으로써, 전체 오페론의 어느 한쪽에 박테리아 게놈 상 카세트의 재조합 아암(arm)을 생성시키는 올리고뉴클레오타이드.
2. 에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC002를 키트 프로토콜에 따라 전기천공에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린을 함유하는 고 영양 복합 배지 LB 한천에서 획득된 콜로니를 선택하였다.
3. 1시간 동안 액체 LB 중의 0.3% 아라비노스에 의해 유도된, RedET 재조합 효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 그 결과, 결실 카세트에 의한 RedET를 발현하는 세포의 제2 전기천공을 수행하고, 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충되고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신이 첨가된 LB 한천에서 콜로니를 선택한다.
4. 플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에 제공됨)를 키트 프로토콜에 따라 전기천공에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코오스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충되고, 0.3% L-아라비노스가 첨가된 LB 한천에서 세포를 선택한다. 세포가 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 더 이상 성장할 수 없음을 확인함으로써 획득된 클론의 역 선택을 수행한다.
5. 획득된 균주는 EQ.EC003: MG1655 △sucA △edd-eda 로 칭한다.
c) gapA 유전자의 결실
상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, gapA 유전자의 결실을 수행한다.
1. FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 유전자 (gapA) (GenBank: X02662.1)의 코딩 상, 즉, 결실 좌위의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열을 가짐으로써, 박테리아 게놈 상 카세트의 재조합 아암을 생성시키는 올리고뉴클레오타이드.
2. 에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC003를 키트 프로토콜에 따라 전기천공에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린을 포함하는 고 영양 복합 배지 LB 한천에서 획득된 콜로니를 선택하였다.
3. 1시간 동안 액체 LB에서 0.3% 아라비노스에 의해 유도된 RedET 재조합 효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 마지막으로, 결실 카세트에 의해 RedET를 발현하는 세포의 제2 전기천공을 수행하고, 0.2% 글리세롤 및 0.3% 피루베이트, 0.0003% 테트라사이클린이 보충되고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신이 첨가된 LB 한천에서 콜로니를 선택한다.
유전자형 분석 및 시퀀싱에 의해 결실을 확인하고, 획득된 균주의 명칭은 다음과 같다:
·EQ.EC002: MG1655 △sucA
·EQ.EC003: MG1655 △sucA △edd-eda
·EQ.EC004: MG1655 △sucA △edd-eda △gapA::kan
d) CO 2 고정에 필요한 조작의 삽입
E. 콜라이에서 I형 RuBisCO의 상이한 성분의 재조합 발현을 위해, 하기 표 18에 기재된 유전자를 포함하는 합성 오페론으로서 하기 표 17에 기재된 유전자를 클로닝한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
이들 유전자의 발현 수준을 제어하기 위해, 다양한 번역 효율을 갖고, 하기 표 19에 제시된 리보솜 결합 서열 (RBS) (문헌[Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21; 2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98])을 각 유전자의 코딩 상 사이에 삽입한다. PLtetO-1 프로모터, p15A 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pZA11 벡터 (Expressys) 내로의 연속 삽입에 의해 RBS 서열에 의해 산재된 각 코딩 상의 연결체를 작제한다.
Figure pct00022
상기 계획에 따라 제시된 상이한 벡터를 전기천공하여 수 종의 균주를 생성한다:
EQ.EC　005　→　(EQ.EC　003+ pZA11): MG1655 △sucA △edd-eda
EQ.EC　006　→　(EQ.EC　004+ pEQEC005): MG1655 △sucA △edd-eda △gapA::kan (RuBisCO)
EQ.EC　007　→　(EQ.EC　004+ pEQEC006): MG1655 △sucA △edd-eda △gapA::kan (RuBisCO+PRK)
EQ.EC　009　→　(EQ.EC　004+ pEQEC008): MG1655 △sucA △edd-eda △gapA::kan (PRK)
2　g/L 글리세롤 및 5　g/L 피루베이트 및 100 mg/L 암피실린이 보충된 LB 배지에서 클론을 선택한다. 충분한 양의 바이오매스를 획득한 후, 최소 250 mL의 삼각 플라스크에서 50 mL 이상의 용적의 배양물을 접종하여, PRK/RuBisCO 조작 사용에 균주를 적용한다. 상기에 기재된 바와 같이, 37℃에서 2　g/L 글루코스, 및 외인성 CO2 공급원을 포함하는 LB 배양 배지에서 이러한 적용 단계를 수행한다.
e) 글루타메이트 생성
글루타메이트 생성을 위해, 500 mL의 LB 배양물로부터의 세포를 0.1 기압의 CO2의 압력에서 20 mL의 MS 배지 (40　g/L 글루코스, 1　g/L MgSO4-.7H2O, 20　g/L (NH4)2SO4, 1　g/L KH2PO4, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2　g/L 효모 추출물, 30　g/L CaCO3, 100 mg/L 암피실린)에 접종한다.
잔류 글루타메이트 및 글루코스를 생물분석기 (Sakura Seiki)로 측정한다. 탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스 그램당 생성된 글루타메이트의 그램으로 계산한다.
이 수율은 대조군 균주 EQ.EC　005 (무), EQ.EC　006 (RuBisCO 단독)과 비교하여 균주 EQ.EC　007 (RuBisCO+PRK)에서 10%만큼 유의하게 증가한다. 대조군 균주 EQ.EC　009 (PRK 단독)는 생존하지 못한다.
4B] 해당과정 및 5탄당 포스페이트 산화 경로의 불활성화에 의한 생성의 개선
a) Flp 재조합 효소에 의한 FTR 영역의 특이적 재조합에 의한 선택 카세트의 제거
이 단계는 상기 실시예 4A]와 동일한 방식으로 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC002: MG1655 △sucA 로 칭한다.
b) zwf 유전자의 결실
실시예 4A]에 상세히 기재된 바와 같이, 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, zwf 유전자 (유전자 ID: 946370)의 결실을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC010: MG1655 △sucA △zwf 로 칭한다.
c) gapA 유전자의 결실
실시예 4A]에 상세히 기재된 바와 같이, 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, 에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC010에서의 gapA 유전자의 결실을 수행한다.
유전자형 분석 및 시퀀싱에 의해 결실을 검증하며, 획득된 균주의 명칭은 다음과 같다:
·EQ.EC002: MG1655 △sucA
·EQ.EC010: MG1655 △sucA △zwf
·EQ.EC011: MG1655 △sucA △zwf △gapA
d) CO 2 고정에 필요한 조작의 삽입
E. 콜라이에서 기능성 PRK/RuBisCO 시스템의 상이한 성분의 재조합 발현을 위해, 표 20에 기재되고, I형 RuBisCO, 포스포리불로키나제, 샤프론 및 탄산무수화효소를 인코딩하는 유전자를 상기에 기재된 유전자 (표 21)를 포함하는 합성 오페론으로서 클로닝한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
이들 유전자의 발현 수준을 제어하기 위해, 다양한 번역 효율을 갖고, 표 17에 제시된 리보솜 결합 서열 (RBS) (실시예 4a] 참조) (문헌[Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21; 2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98])을 각 유전자의 코딩 상 사이에 삽입한다. PLtetO-1 프로모터, p15A 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pZA11 벡터 (Expressys) 내로의 연속 삽입에 의해 RBS 서열에 의해 산재된 각 코딩 상의 연결체를 작제한다. 또한, 탄산무수화효소 (icfA)를 첨가함으로써, 가능한 CO2 분자로의 중탄산염 이온의 상호 전환이 가능하고, RuBisCO의 효율이 개선된다.
하기 계획에 따라 제시된 상이한 벡터를 전기천공하여 수 종의 균주를 생성한다:
EQ.EC　012　→　(EQ.EC　002+ pZA11): MG1655 △sucA
EQ.EC　014　→　(EQ.EC　011+ pEQEC006): MG1655 △sucA △zwf △gapA (RuBisCO+PRK)
EQ.EC　015　→　(EQ.EC　011+ pEQEC007): MG1655 △sucA △zwf △gapA (RuBisCO+PRK+ 탄산무수화효소)
형질전환 후, 100 mg/L 암피실린이 보충된 피루베이트 배지인 LB 글리세롤에서 클론을 선택한다. PRK 및 RuBisCO 조작에 의한 균주의 적용 및 생장 단계를 실시예 4A]에 기재된 바와 같이 수행한다.
e) 글루타메이트 생성
글루타메이트 생성을 위해, 500　mL의 LB 배양물로부터의 세포를 0.1 기압의 CO2의 압력하에 20　mL의 MS 배지 (40　g/L 글루코스, 1　g/L MgSO4.7H2O, 20　g/L (NH4)2SO4, 1　g/L KH2PO4, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2　g/L 효모 추출물, 30　g/L CaCO3, 100 mg/L 암피실린)에 접종한다.
잔여 글루타메이트 및 글루코스를 생물분석기 (YSI Inc.)로 측정한다. 탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스의 그램당 생성된 글루타메이트의 그램으로 계산한다.
이 수율은 대조군 균주 EQ.EC　012 (무)와 비교하여, 균주 EQ.EC　014 (RuBisCO+PRK) 및 EQ.EC　015 (RuBisCO+PRK+탄산무수화효소)에서 15%만큼 유의하게 증가한다.
4C] 해당과정 및 산화성 5탄당 포스페이트 경로의 불활성화 , 및 피루베이트 탈탄산효소 및 글루타메이트 탈수소효소의 과발현에 의한 생성의 개선.
a) Flp 재조합효소에 의한 FTR 영역의 특이적 재조합에 의한 선택 카세트의 제거
이 단계는 상기 실시예 4A]와 동일한 방식으로 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC002: MG1655 △sucA 로 칭한다.
b) zwf 유전자의 결실
zwf 유전자 (GeneID: 946370)의 결실을 실시예 4A]에 상세히 기재된 바와 같이, 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, 수행한다. 획득된 균주는 EQ.EC010: MG1655 △sucA △zwf 로 칭한다.
c) gapA 유전자의 결실
에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC010에서 gapA 유전자의 결실을 실시예 4A]에 상세히 기재된 바와 같이, 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, 수행한다. 유전자형 분석 및 시퀀싱에 의해 결실을 검증하며, 획득된 균주의 명칭은 다음과 같다:
·EQ.EC002: MG1655 △sucA
·EQ.EC010: MG1655 △sucA △zwf
·EQ.EC011: MG1655 △sucA △zwf △gapA
d) CO 2 고정에 필요한 조작의 삽입
E. 콜라이에서 기능성 PRK/RuBisCO 시스템의 상이한 성분의 재조합 발현을 위해, 표 22에 기재되고, II형 RuBisCO, 포스포리불로키나제 및 탄산무수화효소를 인코딩하는 유전자를 상기 기재된 유전자를 포함하는 합성 오페론으로서 클로닝한다 (표 23).
Figure pct00025
Figure pct00026
이들 유전자의 발현 수준을 제어하기 위해, 다양한 번역 효율을 갖고, 표 17에 제시된 리보솜 결합 서열 (RBS) (실시예 4A] 참조)을 각 유전자의 코딩 상 사이에 삽입한다. PLtetO-1 프로모터, p15A 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pZA11 벡터 (Expressys) 내로의 연속 삽입에 의해 RBS 서열에 의해 산재된 각 코딩 상의 연결체를 작제한다. 글루타메이트 탈수소효소 (gdhA) 및 피루베이트 카복실라제 (pycA)의 첨가는 더 우수한 글루탐산 생성을 가능하게 한다. 탄산무수화효소 (CA)의 첨가는 또한 가능한 CO2 분자로의 중탄산염 이온의 상호전환을 가능하게 하고, RuBisCO의 효율을 개선한다.
하기 계획에 따라 제시된 상이한 벡터를 전기천공하여 수 종의 균주를 생성한다:
EQ.EC　016　→　(EQ.EC　002+ pEQEC011): MG1655 △sucA (글루타메이트 탈수소효소+피루베이트 카복실라제)
EQ.EC　017　→　(EQ.EC　011+ pEQEC009): MG1655 △sucA △zwf △gapA (RuBisCO+PRK+글루타메이트 탈수소효소+피루베이트 카복실라제)
EQ.EC　018　→　(EQ.EC　011+ pEQEC010): MG1655 △sucA △zwf △gapA (RuBisCO+PRK+ 탄산무수화효소+글루타메이트 탈수소효소+피루베이트 카복실라제+탄산무수화효소)
형질전환 후, 100 mg/L 암피실린이 보충된 피루베이트 배지인 LB 글리세롤에서 클론을 선택한다. PRK 및 RuBisCO 조작에 의한 균주의 적용 및 생장 단계를 실시예 4A]에 기재된 바와 같이 수행한다.
e) 글루타메이트 생성
글루타메이트 생성을 위해, 500　mL의 LB 배양물로부터의 세포를 0.1 기압의 CO2의 압력하에 20　mL의 MS 배지 (40　g/L 글루코스, 1　g/L MgSO4.7H2O, 20　g/L (NH4)2SO4, 1　g/L KH2PO4, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2　g/L 효모 추출물, 30　g/L CaCO3, 100 mg/L 암피실린)에 접종한다.
잔여 글루타메이트 및 글루코스를 생물분석기 (YSI Inc.)로 측정한다. 탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스의 그램당 생성된 글루타메이트의 그램으로 계산한다.
이 수율은 대조군 균주 EQ.EC　016과 비교하여, 균주 EQ.EC　017 및 EQ.EC　018에서 15%만큼 유의하게 증가한다.
실시예 5: C. 네카토르에서의 폴리하이드록시부티레이트 생성의 개선
또한 본 발명에 따라 제안된 유전자 변형을 통해 획득된 환원력의 증가는 기존 대사 경로와 근사한 수율을 가질 수 있다.
이는 폴리하이드록시부티레이트 (PHB)를 자연적으로 생성하는 박테리아 균주 쿠프리아비두스 네카토르 ATCC 17699의 경우이다. 이 박테리아는 독립 영양 및 종속 영양 조건하에서 생장할 수 있다. gapA 유전자 (글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 NC_008313.1)의 결실은 5탄당 포스페이트 경로의 대사 흐름을 전용하고, 환원된 뉴클레오타이드인 NADPH의 풀을 증가시킴으로써, PHB 생성 수율을 증가시킨다.
이러한 C. 네카토르 H16 균주는 메가플라스미드 pHG1 및 2개의 염색체를 갖는다. gapA 유전자의 결실은 그람 음성 박테리아의 경우 바실루스 수브틸리스 자살 유전자 sacB를 포함하는 벡터를 생성함으로써 달성된다 (문헌[Quandt et al., Gene. 1993 May 15;127(1):15-21; Lindenkamp et al., Appl Environ Microbiol. 2010 Aug;76(16):5373-82 및 Appl Environ Microbiol. 2012 Aug;78(15):5375-83]).
a) 엔트너-도우도로프 대사 경로의 불활성화
edd 및 eda 유전자의 인접 영역 (edd의 상류 및 eda의 하류)에 해당하는 2개의 PCR 앰플리콘을 문헌[Srinivasan et al. (Appl Environ Microbiol. 2002 Dec;68(12):5925-32)]에 기재된 절차에 따라 제한하여, 플라스미드 pJQ200mp18Cm에 클로닝한다.
이어서, 변형된 플라스미드 pJQ200mp18Cm::△edd-eda를 염화칼슘 형질전환 방법에 의해 E. 콜라이 균주 S17-1에 형질전환시킨다. 그리고 S17-1 박테리아의 세포 단층을 포함하는 접시에 C. 네카토르 배양의 스팟을 한천에 장착시킴으로써, C. 네카토르로의 유전 물질의 전달을 접합에 의해 수행한다. 선택을 위해, 10% 수크로스의 존재하에 30℃의 영양 브로스 (NT) 배지에서 선택을 수행하고 (문헌[Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr;158(1):43-8]), 50 μg/mL의 클로람페니콜을 포함하는 미네랄 배지에서 검증한다.
결실을 유전자형 분석 및 시퀀싱에 의해 검증한다. 따라서, 생성된 균주 EQCN_002는 엔트너-도우도로프 대사 경로 edd-eda의 유전자가 결실되어 있다. EQCN_002: H16 △edd-eda.
b) 해당과정 경로의 불활성화
gapA 유전자의 인접한 영역에 해당하는 2개의 PCR 앰플리콘을 문헌[Lindenkamp et al. 2012]에 기재된 절차에 따라 제한하여, 플라스미드 pjQ200mp18Tc에 클로닝한다.
이어서, 변형된 플라스미드 pjQ200mp18Tc::△gapA를 염화칼슘 형질전환 방법에 의해 E. 콜라이 균주 S17-1에 형질전환시킨다. S17-1 박테리아의 세포 단층을 포함하는 접시에 C. 네카토르 배양의 스팟을 한천에 장착시킴으로써, 유전 물질의 전달을 접합에 의해 수행한다. 선택을 위해, 10% 수크로스의 존재하에 30℃의 영양 브로스 (NT) 배지에서 선택을 수행하고 (문헌[Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr;158(1):43-8.]), 25 μg/mL의 테트라사이클린을 포함하는 미네랄 배지에서 검증한다.
결실을 유전자형 분석 및 시퀀싱에 의해 검증한다. 따라서, 생성된 균주 EQCN_003은 gapA 유전자가 결실되어 있다. EQCN_003: H16 △edd-eda △gapA.
gapA 유전자에서 해당과정 경로가 결실되고, edd-eda 유전자에서 엔트너-도우도로프 경로가 결실되어, PRK 및 RuBisCO 효소의 사용을 통해, 외인성 CO2를 고정시킴으로써, PHB 생성 수율이 개선된 균주 EQCN_003을 성장시킨다.
b) 생물반응기에서 PHB의 생성
동결 스톡으로부터의 접종물을 프룩토스의 존재하에 30℃에서 48시간 내지 96시간 동안 인큐베이션한 동결 튜브로부터 50 내지 100 μL의 속도로 고체 배지 상에 도포한다. RuBisCO 및 PRK를 인코딩하는 유전자의 발현을 종속 영양 호기성 조건하에서 C. 네카토르에서 유지시킨다 (문헌[Rie Shimizu et al., Sci Rep. 2015; 5: 11617], 2015년 7월 1일 온라인 공개됨).
진탕 인큐베이터 (100 내지 200　rpm, 30℃)에서 20　g/L 프룩토스 중 적절한 배양 배지 및 외인성 10% CO2 공급원을 포함하는 삼각 플라스크에서의 회분식 배양 (50　mL 중 10　mL, 그 후 250　mL 중 50　mL)을 0.01의 최소 접종에 의해 수행한다.
PHB 생성 수율을 개선시키는 대상 균주 EQCN_003을 영양 제한 조건하의 종속 영양 조건하에서 PHB를 자연적으로 축적하는 참조 균주 H16과 비교한다.
균주의 생성성을 생물반응기에서 비교한다. 생물반응기에서 수행된 배양에 상기에 기재된 조건하에 삼각 플라스크에서 고체 및/또는 액체 증폭 연쇄 단계로부터 시딩한다. My-control (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) 750　mL 또는 Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) 2.5 L 유형의 생물반응기에 0.01 OD620nm에 해당하는 밀도로 시딩한다.
PHB의 축적은 성장과 분리된다. 배양을 30℃로 조절하고, 최소 용존 산소 농도를 20%를 초과하여 유지하기 위해 (30℃, 1 bar), 공기 유입량을 0.1 VVM (기체 부피/액체 부피/분) 내지 1 VVM으로 유지하고, 사용된 생물반응기의 규모에 따라 진탕을 적용한다. 유입구 기체 유량은 선택적으로 CO2가 보충된 공기로 구성된다. CO2 보충은 1% 내지 10%에서 이루어진다. 14% 또는 7% 암모니아 용액을 첨가하여 pH를 7로 조정한다. 유가식 배양 배양 방법은 일정한 탄소/인 또는 탄소/질소 비율을 유지하면서, 인 또는 질소의 제한과 조합하여, 비 제한적 탄소 기질을 공급하는 것을 가능하게 한다. PHB 추출 및 정량화를 문헌[Brandl et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9)]의 방법에 따라 수행한다. 프로토콜은 10 mg의 동결건조된 세포에 1 mL의 클로로포름을 첨가한 후, 850 μL의 메탄올 및 150 μL의 황산을 첨가하는 단계로 이루어진다. 혼합물을 100℃에서 2.5시간 동안 가열하고, 냉각시켜, 500 μL의 물을 첨가한다. 2개의 상을 원심분리에 의해 분리하고, 황산나트륨을 첨가하여 유기상을 건조한다. 샘플을 여과하고, 문헌[Mueller et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9)]에 기재된 바와 같이 분석한다.
야생형 C. 네카토르 H16 배양 및 균주 EQCN_003: H16 △edd-eda △ gapA 를 비교하면, 소모된 프룩토스의 그램당 PHB의 그램 비율에 해당하는 탄소 수율이 5% 증가한 것으로 나타난다.
실시예 6: E. 콜라이에서의 GABA 생성의 개선
실시예 4B]에 따라 그의 글루타메이트 생성 수율이 증가되도록 유전자 변형된 에세리키아 콜라이 K-12 균주를 또한 글루타메이트 탈탄산효소 gadB (유전자 ID: 946058)의 항시적 발현이 가능함으로써, γ-아미노부티르산의 생성 수율이 증가되도록 변형시킬 수 있다.
알파-케토글루타레이트 탈수소효소 유전자의 결실은 또한 글루타메이트 생성을 증가시킨다 (문헌[Usuda et al. J Biotechnol. 2010 May 3;147(1):17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018]).
본 실시예에서, 실시예 4B]로부터 획득된 하기 균주를 사용한다:
·EQ.EC002: MG1655 △sucA
·EQ.EC010: MG1655 △sucA △zwf
·EQ.EC011: MG1655 △sucA △zwf △gapA
a) gadB 유전자의 항시적 과발현
gadB 유전자의 과발현을 박테리아 발현 벡터 pZE21MCS (EXPRESSYS)에 서브클로닝한다. 이 벡터는 ColE1 복제 기점 및 카나마이신 항생제 내성 유전자를 갖는다.
신속하게, 위치 1570595 내지 1570645 및 1572095 내지 1572045를 포괄하는 에세리키아 콜라이 K-12 게놈에 상동성인 프라이머에 의해 균주 MG1655 △sucA의 게놈으로부터 gadB 유전자 (유전자 ID: 946058)의 코딩 상을 증폭시킨다. 이러한 프라이머 각각을 다수의 클로닝 부위가 제외된 벡터 pZE21MCS의 증폭에 의해 획득된 단편의 말단의 18개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 부유 서열에 연결시킨다. 2개의 앰플리콘을 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 조합하여, gadB 유전자의 항시적 과발현이 가능한 플라스미드 pEQEC030을 형성시킨다.
b) CO 2 고정에 필요한 조작의 삽입
E. 콜라이에서 기능성 I형 RuBisCO의 상이한 성분의 재조합 발현을 위해, 표 17에 기재된 유전자(실시예 4A])를 표 22에 기재된 작제물 구조에 따른 합성 오페론으로서 클로닝한다.
상이한 벡터의 조립
표 24에 기재된 유전자의 코딩 서열 (CDS)을 증폭시키고, NEBuilder® HiFi DNA 조립 마스터 믹스 키트 (E2321)에 의해 제공된 프로토콜에 따라 블록으로 조립하여, 표 24에 기재된 3개의 혼입 블록을 획득한다. 그 후, 각 블록을 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 증폭시켜, 하기 표 24에 기재된 플라스미드를 형성시킨다.
Figure pct00027
이들 유전자의 발현 수준을 제어하기 위해, 다양한 번역 효율을 갖고, 표 19에 제시된 리보솜 결합 서열 (RBS) (실시예 4B]) (문헌[Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98])을 각 유전자의 코딩 상 사이에 삽입한다. PLtetO-1 프로모터, p15A 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pZA11 벡터 (Expressys) 내로의 연속 삽입에 의해 RBS 서열에 의해 산재된 각 코딩 상의 연결체를 작제한다. 글루타메이트 탈탄산효소 (gadB)의 첨가는 또한 글루타메이트에서 감마 아미노부티레이트 (GABA)로의 전환을 가능하게 한다.
하기 계획에 따라 제시된 상이한 벡터를 전기천공하여 수 종의 균주를 생성한다:
EQ.EC　013 → (EQ.EC　002+ pZA11+pEQ030): MG1655 △sucA + (gadB)
EQ.EC　020 → (EQ.EC　011+pEQ030+pEQEC006): MG1655 △sucA △zwf △gapA + (gadB) + (RuBisCO+PRK)
형질전환 후, 100 mg/L 암피실린 및 30 mg/L 카나마이신이 보충된 피루베이트 배지인 LB 글리세롤에서 클론을 선택한다. PRK 및 RuBisCO 조작에 의한 균주의 적용 및 생장 단계를 실시예 4A]에 기재된 바와 같이 수행한다.
c) GABA 생성
GABA 생성을 위해, 500　mL의 LB 배양물로부터의 세포를 30℃, pH 3.5에서 0.1 기압의 CO2의 압력하에 20　mL의 MS 배지 (40　g/L 글루코스, 1　g/L MgSO4.7H2O, 20　g/L (NH4)2SO4, 1　g/L KH2PO4, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2　g/L 효모 추출물, 30　g/L CaCO3, 100 mg/L 암피실린 및 30　mg/L 카나마이신)에 접종한다.
GABA 농도를 OptimaPak C18 컬럼 (4.6 x 150　mm, RS Tech Corporation, Daejeon, Korea)을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 측정한다. 이 샘플을 12,000　rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 100　μL의 상청액을 삼각 튜브에 옮긴다. 다음 시약을 이 튜브에 첨가한다: 200　μL의 1　M 중탄산나트륨 완충액 (pH 9.8), 80　g/L 아세토니트릴 중 염화단실 100　μL 및 600　μL의 이중 증류수. 혼합물을 80℃에서 40분 동안 인큐베이션한다. 2% 아세트산 100 μL를 첨가하여 반응을 종결시킨다. 혼합물을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 0.2 μm Millipore 필터를 통해 여과하고, UV 검출기를 사용하여 Agilent 시스템에서 HPLC로 분석한다. 용리액 A [테트라하이드로푸란/메탄올/아세트산나트륨 50　mM, pH 6.2 (5: 75: 420, 부피] 및 용리액 B (메탄올)를 사용하여, 이원 비선형 구배를 사용하여 유도체화된 샘플을 분리한다. 잔류 글루코스를 생물분석기 (YSI Inc.)에 의해 측정한다.
탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스 그램당 생성된 GABA의 그램으로 계산한다.
이 수율은 대조군 균주 EQ.EC　013 △sucA (GadB)과 비교하여, 균주 EQ.EC　020 △sucA △zwf △gapA (RuBisCO+PRK)+(GadB)에서 15%만큼 유의하게 증가한다.
실시예 7: E. 콜라이에서의 숙시네이트 및 옥살레이트 생성의 개선
포미톱시스 팔루스트리스로부터의 글리옥실레이트 탈수소효소 FPGLOXDH1 (유전자 ID: 946058)의 항시적 발현이 가능함으로써, icd 유전자 (유전자 ID: 945702)의 발현이 감소하고, aceB (GeneID 948512) 및 sdhA (유전자 ID: 945402) 유전자가 불활성화되도록 유전자 변형된 에세리키아 콜라이 K-12 균주는 숙시네이트 및 옥살산 생성 수율을 증가시킬 것이다.
이소시트레이트 탈수소효소 (icd) 발현의 감소는 대사 흐름이 글리옥실산 분로로 재유도되도록 한다. 말레이트 합성효소 (aceB) 및 숙시네이트 탈수소효소 (sdhA)의 불활성화는 각각 생성된 글리옥실레이트 및 숙시네이트가 재사용되는 것을 방지한다. 숙시네이트 탈수소효소 유전자의 결실은 호기성 조건 하에서 숙시네이트 생산을 증가시킨다 (문헌[Yang et al., Microbiol res. 2014 May-Jun; 169(5-6):432-40]). 말레이트 합성효소 유전자의 결실은 글리옥실레이트의 축적을 가능하게 하며, 이는 글리옥실레이트 탈수소효소의 항시적 발현에 의해 옥살레이트로 전환될 것이다.
이 실시예에서, sdhA 유전자가 결실된 에세리키아 콜라이 K-12 균주 MG1655를 사용한다. 이 균주는 에세리키아 콜라이 K-12에서 유전자 결실 은행 (문헌[Baba et al., Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0008])으로부터 유래되었으며, 콜라이 유전자 스톡 센터로부터 JW0715-2 및 참조 번호 8302. (JW0713-1: MG1655 △sdhA :: Kan )으로 공급되었다.
a) Flp 재조합효소에 의한 FTR 영역의 특이적 재조합에 의한 선택 카세트의 제거
상기 균주 JW0715-2를 작제하는데 사용된 것과 동일한 결실 전략 (Rodriguez et al., 2016)을 재사용할 수 있도록 하기 위해, 선택 카세트를 재조합효소를 사용하여 결실시킨다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에서 제공됨)을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 세포를 선택하고, 0.3% L-아라비노스를 첨가한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 클론이 더 이상 성장할 수 없음을 검증함으로써, 획득된 클론의 역선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC040: MG1655 △sdhA 로 칭한다.
b) aceB 유전자의 결실
aceB 유전자 (GeneID 948512)의 결실을 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여 수행한다.
FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 염색체 상에 결실 좌위, 즉, 위치 4215428 내지 4215478 및 4217129 내지 4217079의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열을 가짐으로써, aceB 유전자 코딩 서열의 어느 한쪽에 박테리아 게놈 상 카세트의 재조합 아암을 생성시키는 올리고뉴클레오타이드;
에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC040을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 고 영양 복합 LB 한천에서 획득된 클론을 선택한다.
액체 LB 중 0.3% 아라비노스에 의해 1시간 동안 유도된 RedET 재조합효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 마지막으로, RedET를 발현하는 세포에서 전기천공법에 의해 결실 카세트의 제2 형질전환을 수행하고, 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LG 한천에서 콜로니를 선택하고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신을 첨가한다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에서 제공됨)을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 세포를 선택하고, 0.3% L-아라비노스를 첨가한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 클론이 더 이상 성장할 수 없음을 검증함으로써, 획득된 클론의 역선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC041: MG1655 △sdhA △aceB 로 칭한다.
c) icd 유전자 프로모터의 변화
i. 전략
상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여, icd 유전자 (유전자 ID: 945702)의 천연 프로모터를 더 약한 프로모터로 대체시킨다.
ii. 약한 프로모터 P oxb1의 도입
항생제 내성 유전자를 갖는 Poxb1 카세트의 삽입의 선택을 가능하게 하기 위해, 항생제 내성 유전자 카세트 및 약한 것을 특징으로 하는 프로모터 Poxb1을 연결시킨 카세트에 의해 icd 유전자 프로모터를 대체시킨다.
FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 게놈상의 센스 올리고의 Picd 프로모터 좌위 (게놈 표적화 LA), 즉, 위치 1194911 내지 1194961의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열 및 역방향 올리고의 스페이서 R 서열 (표 23)을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 단편 증폭 후, Poxb1 단편의 조립을 가능하게 한다.
플라스미드 PSF-OXB1 (Sigma #OGS553)로부터 Poxb1 프로모터를 증폭시키기 위해 설계되고, 게놈상의 역방향 올리고의 Picd 프로모터 좌위 (게놈 표적화 LA), 즉, 위치 1195173 내지 1195123의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열 및 올리고의 스페이서 S 서열 (표 25)을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 Poxb1 단편의 증폭을 유발시킨다.
NEBuilder® HiFi DNA 조립 마스터 믹스 키트 (E2321)를 사용한 융합 단편의 증폭은 항생제 선택 카세트와 대체 프로모터의 조합을 가능하게 한다.
Figure pct00028
에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC041을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 고 영양 복합 배지 LB 한천에서 획득된 콜로니를 선택한다.
액체 LB 중 0.3% 아라비노스에 의해 1시간 동안 유도된 RedET 재조합효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 마지막으로, RedET를 발현하는 세포에서 전기천공법에 의해 결실 카세트의 제2 형질전환을 수행하고, 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 콜로니를 선택하고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신을 첨가한다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에서 제공됨)을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 세포를 선택하고, 0.3% L-아라비노스를 첨가한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 클론이 더 이상 성장할 수 없음을 검증함으로써, 획득된 클론의 역선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC042: MG1655 △sdhA △aceB P icd :: P oxb1 로 칭한다.
d) zwf 유전자의 결실
zwf 유전자 (GeneID: 946370)의 결실을 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여 수행한다.
FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 염색체 상에 결실 좌위, 즉, 위치 1934789 내지 1934839 및 1936364 내지 1936314의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열을 가짐으로써, 전체 오페론의 어느 한쪽에 박테리아 게놈 상 카세트의 재조합 아암을 생성시키는 올리고뉴클레오타이드.
에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC042를 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 고 영양 복합 배지 LB 한천에서 획득된 콜로니를 선택한다.
액체 LB 중 0.3% 아라비노스에 의해 1시간 동안 유도된 RedET 재조합효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 마지막으로, RedET를 발현하는 세포에서 전기천공법에 의해 결실 카세트의 제2 형질전환을 수행하고, 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 콜로니를 선택하고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신을 첨가한다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에서 제공됨)을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 세포를 선택하고, 0.3% L-아라비노스를 첨가한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 클론이 더 이상 성장할 수 없음을 검증함으로써, 획득된 클론의 역선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC043: MG1655 △sdhA △aceB P icd :: P oxb1 △zwf 로 칭한다.
e) gapA 유전자의 결실
gapA 유전자의 결실을 상동성 재조합에 의해, 제조사의 프로토콜에 따라 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트 (Gene Bridges)를 사용하여 수행한다.
FRT-PKG-gb2-neo-FRT 내성 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 설계되고, 결실 좌위, 즉, 유전자 (gapA) (GenBank: X02662.1)의 코딩 상의 인접 영역에 50개 초과의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 5' 서열을 가짐으로써, 박테리아 게놈 상 카세트의 재조합 아암을 생성시키는 올리고뉴클레오타이드.
에세리키아 콜라이 K-12 균주 EQ.EC043을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 플라스미드 pRedET로 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 고 영양 복합 배지 LB 한천에서 획득된 콜로니를 선택한다.
액체 LB 중 0.3% 아라비노스에 의해 1시간 동안 유도된 RedET 재조합효소의 존재하에 제1 단계에서 획득된 앰플리콘의 형질전환. 마지막으로, RedET를 발현하는 세포에서 전기천공법에 의해 결실 카세트의 제2 형질전환을 수행하고, 0.2% 글루코스, 및 0.3% 피루베이트, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 콜로니를 선택하고, 0.3% L-아라비노스 및 0.0015% 카나마이신을 첨가한다.
플라스미드 p707-Flpe (Gene Bridges에 의한 Quick & Easy E. 콜라이 유전자 결실 Red®/ET® 재조합 키트에서 제공됨)을 키트 프로토콜에 따라 전기천공법에 의해 형질전환시킨다. 0.2% 글루코스, 0.0003% 테트라사이클린이 보충된 LB 한천에서 세포를 선택하고, 0.3% L-아라비노스를 첨가한다. 0.0015% 카나마이신이 보충된 동일한 배지에서 클론이 더 이상 성장할 수 없음을 검증함으로써, 획득된 클론의 역선택을 수행한다.
획득된 균주는 EQ.EC044: MG1655 △sdhA △aceB P icd :: P oxb1 △zwf △gapA 로 칭한다.
f) FPGLOXDH1 및 aceA 유전자의 항시적 과발현
표 24에 기재된 구조에 따른 합성 오페론으로서 박테리아 발현 벡터 pZE21MCS (EXPRESSYS)에 서브클로닝된 FPGLOXDH1 (유전자 ID: 946058) 및 aceA (유전자 ID: 948517)의 코딩 서열 (CDS). 이 벡터는 ColE1 복제 기점 및 카나마이신 항생제 내성 유전자를 갖는다.
이러한 프라이머 각각을 다수의 클로닝 부위가 제외된 벡터 pZE21MCS의 증폭에 의해 획득된 단편의 말단의 18개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 상동성인 부유 서열에 연결시킨다. 2개의 앰플리콘을 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 조합하여, FPGLOXDH1 및 aceA 유전자의 항시적 과발현이 가능한 플라스미드 pEQEC035를 형성시킨다.
g) CO 2 고정에 필요한 조작의 삽입
E. 콜라이에서 기능성 I형 RuBisCO의 상이한 성분의 재조합 발현을 위해, 표 17에 기재된 유전자 (실시예 4A])를 합성 오페론의 형태로 클로닝한다.
표 2에 기재된 유전자의 코딩 서열 (CDS)을 증폭시키고, NEBuilder® HiFi DNA 조립 마스터 믹스 키트 (E2321)에 의해 제공된 프로토콜에 따라 블록으로 조립하여, 표 26에 기재된 3개의 혼입 블록을 획득한다. 그 후, 각 블록을 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 증폭시켜, 하기 표 24에 기재된 플라스미드를 형성시킨다.
Figure pct00029
이들 유전자의 발현 수준을 제어하기 위해, 다양한 번역 효율을 갖고, 하기 표 19에 제시된 리보솜 결합 서열 (RBS) (실시예 4B]) (문헌[Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98])을 각 유전자의 코딩 상 사이에 삽입한다. PLtetO-1 프로모터, p15A 복제 기점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 pZA11 벡터 (Expressys) 내로의 연속 삽입에 의해 RBS 서열에 의해 산재된 각 코딩 상의 연결체를 작제한다.
하기 계획에 따라 제시된 상이한 벡터를 전기천공하여 수 종의 균주를 생성한다:
EQ.EC045　→ (EQ.EC042+ pZA11+ pZE21MCS): MG1655 △sdhA △aceB P icd :: P oxb1
EQ.EC046 → (EQ.EC045 + pEQEC006+ pEQEC035): MG1655 △sdhA △aceB P icd :: P oxb1 △zwf △gapA + ( FPGLOXDH1+ aceA ) + (RuBisCO+PRK)
형질전환 후, 100 mg/L 암피실린 및 30 mg/L 카나마이신이 보충된 피루베이트 배지인 LB 글리세롤에서 클론을 선택한다. PRK 및 RuBisCO 조작에 의한 균주의 적용 및 생장 단계를 실시예 4A]에 기재된 바와 같이 수행한다.
h) 숙시네이트 및 옥살레이트의 생성
숙시네이트 및 옥살레이트의 생성을 위해, 500　mL의 LB 배양물로부터의 세포를 30℃, pH 3.5에서 0.1 기압의 CO2의 압력하에 20　mL의 MS 배지 (40　g/L 글루코스, 1　g/L MgSO4.7H2O, 20　g/L (NH4)2SO4, 1　g/L KH2PO4, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2　g/L 효모 추출물, 30　g/L CaCO3, 100 mg/L 암피실린 및 30 mg/L 카나마이신)에 접종한다.
숙시네이트 농도를 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 측정하고, 배양 샘플을 12,000　rpm으로 5분 동안 원심분리한다.
i. 숙시네이트 측정
배양 상청액을 0.2 μm Millipore 필터를 통해 여과하고, 양이온 교환 컬럼 (Aminex HPX87-H, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), UV 흡광도 검출기 (Agilent Technologies, G1315D) 및 굴절률 (RI) 검출기 (Agilent Technologies, HP1047A)가 장착된 Agilent HPLC 시스템 (시리즈 1100)에서 분석한다. 샘플을 5　mM H2S04 이동상에서 0.4　mL/분의 유속으로 분리한다. 컬럼 오븐 온도는 65℃이다.
잔여 글루코스를 생물분석기 (Ysi Inc.) 또는 Aminex HPX87-H 컬럼이 장착된 HPLC-굴절률계측기에 의해 측정하였다.
탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스의 그램당 생성된 숙시네이트의 그램으로 계산한다.
이 수율은 대조군 균주 EQ.EC045 (무)와 비교하여, 조작 균주 EQ.EC046에서 6%만큼 유의하게 증가한다.
ii) 옥살레이트 측정
펠렛을 2 mM EDTA를 포함하는 10 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.5)으로 2회 세척하고, -20℃에서 저장한다. 샘플 (1 mL)을 0.75 g의 유리 비드 (425 내지 600 μm)로 사전 냉각한 튜브에 옮기고, Fast Prep 균질화기 (Thermo Scientific, Erembodegem, Netherlands)에 도입시키고, 속도 제어 6에서 20 s의 4회 파열에 적용시킨다. 용해물을 4℃ 및 36,000 g에서 20분간 원심분리한다. 총 단백질 측정을 Lowry 방법 (문헌[Lowry et al., 1951])에 따라 수행한다. 옥살로아세테이트 아세틸 가수분해 효소 (EC 3.7.1.1.1) 활성을 문헌[Lenz et al., 1976]에 기재된 바와 같이 255 nm에서 옥살로아세테이트 (OAA)의 직접 광학 측정의 변형 예를 사용하여 측정한다. 석영 큐벳을 사용하여 Hitachi 모델 100-60 분광광도계 (Hitachi, Tokyo, Japan)에서 25℃에서 255 nm에서 OAA 에놀 호변이성질체의 소실 여부를 확인한다. 1 mL 반응 혼합물은 100　mM 이미다졸-HCl (pH 7.5), 0.9　mM MnCl2.2H2O, 1　mM OAA, 20　μL 세포 추출물을 포함한다 (세포 추출물의 부피가 상이한 대조군은 효소 활성과 세포 추출물의 양 간의 선형 관계를 확인시킴). 세포 추출물을 첨가함으로써 반응을 개시시킨다.
탄소 수율 Yp/s를 소모된 글루코스의 그램당 생성된 독살레이트의 그램으로 계산한다.
이 효율은 대조군 균주 EQ.EC045 (무)와 비교하여, 조작 균주 EQ.EC046에서 3%만큼 유의하게 증가한다.
실시예 8: 아스페르길루스 니게르에서의 시트레이트 생성의 개선
a) 전략
해당과정 경로의 비 기능성을 유도하는 pgkA 유전자 (좌위 태그 An08g02260)의 불활성화 및 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 부분을 억제하는 gsdA 유전자 (좌위 태그 An02g12140)의 불활성화를 사용하여, CO2 고정을 위한 PRK 및 RuBisCO 효소의 기능성 발현의 6개의 유전자, 즉, RbcS, RbcL, RbcX, GroES, GroEL 및 PRK를 혼입시킨다.
b) DNA 작제물
i) 불활성화시킬 유전자의 표적화를 위한 가이드 RNA 서열
이들 2개의 유전자 각각에서, NGG 모티프가 삽입된 20개의 뉴클레오타이드의 서열 (CRISPR 표적 서열에 밑줄침)을 측정하였다 (표 27). 두 경우 모두, 이 서열은 표적화된 유전자에 특이적이지만, 또한 아스페르길루스 니게르 게놈에서 고유하다. 이 서열을 사용하여, 아스페르길루스 니게르 게놈의 상동성 영역과 헤테로이중가닥을 형성함으로써, 특이적으로 선택된 좌위 상에 이중 가닥 파손을 유도하는 CAS9 엔도뉴클레아제의 작용을 유도하는 가이드 RNA (gRNA)를 발현시킨다.
Figure pct00030
문헌[Sarkari et al. (Bioresour Technol. 2017 Dec;245(Pt B):1327-1333)]에 기재된 플라스미드 pFC332 (Addgene #87845)은 Cas9 엔도뉴클레아제의 기능성 발현을 가능하게 하는 카세트인 gRNA 발현 카세트 및 이 플라스미드의 선택을 가능하게 하는 Hph 카세트를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 플라스미드의 일시적 증식을 가능하게 하는 단편 AMA1_2.8을 포함한다. 마지막으로, E. 콜라이의 복제 기점이 또한 존재한다.
또 다른 유전자를 표적화하기 위해, FS A와 FS B 사이의 gRNA 카세트를 용이하게 교환할 수 있다. 이 플라스미드의 상이한 부분을 증폭시킴으로써 이 플라스미드를 변형시켜, 항생제 선택 카세트를 제거하고, 표 27에 기재된 서열에 대한 gRNA의 특이성을 가능하게 하는 20개의 뉴클레오타이드를 변형시켜, pgkA를 표적화하는 플라스미드 pEQ0610을 형성시키고, gsdA를 표적화하는 pEQ0611을 형성시킨다.
공여체 플라스미드
게놈과의 상동성 영역
공여체 플라스미드는 혼입을 위해 선택된 좌위에 상동성인 각각 대략 1500 bp의 게놈 표적화 서열 (LA 및 RA) 및 플라스미드 pUC19 (GenBank: M77789.2) 사이의 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech 조립으로 구성된다. LA 및 RA 서열은 각각 가이드 RNA에 의해 표적화되는 좌위 서열에 5' 및 3'에서 인접해 있다. 게놈 DNA/가이드 RNA 이종이량체는 이중 가닥 절단을 위해 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식된다 (좌위 1: pgkA; 좌위 2: gsdA) (표 28). RA 및 LA 단편을 pgkA 유전자 및 gsdA 유전자에 대한 프라이머로 증폭시킨다 (표 29). 증폭 서열은 서열 목록 (서열번호　55 내지 서열번호　58)에 제공되어 있다. 플라스미드 (pEQ0600 또는 pEQ0601)의 기능적 조립 및 대형 비대칭 인식 부위 (12 내지 40개의 염기쌍)를 갖는 II형 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소 I-CeuI 및 I-Sce)I에 대한 2개의 제한 부위의 도입을 가능하게 하기 위해, In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 3개의 단편의 모든 정방향 프라이머에서 18개의 뉴클레오타이드의 연장을 첨가한다. 이는 18개의 염기쌍의 인식 서열이므로 매우 드물다. 식별 부위에서 절단이 비대칭이라는 사실은 박테리아 벡터 pUC19로부터 서열이 부재하는 단편의 방출을 가능하게 한다. 이 2개의 효소에 의해 E. 콜라이에서의 클로닝에 의한 증폭 후 제한하여 혼입 블록을 추출할 수 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
조작 발현 카세트
프로모터 및 종결인자를 GenBank 데이터를 기반으로 하여 확인한다. 선택된 프로모터는 +1 전사 지점으로부터 결정되며, 관련된 프로모터의 최적 기능을 가능하게하는 트랜스 활성화 서열 및 "코어" 서열 (TATA 박스) 둘 모두를 포괄하기 위해 1.4 kb 상류까지 진행한다.
종결인자는 유전자의 종결 코돈 후 500 bp를 절단한다.
4개의 발현 카세트의 각각의 혼입 블록의 구조는 다음과 같이 규정된다: 제1 수준은 단순 요소, 즉 프로모터, 코딩 서열 (CDS) 및 종결인자로 구성된다. 서열 목록 (서열번호 59 내지 62)에 서열이 제공되는 프로모터 (표 30) 및 종결인자 (표 31) 요소를 증폭시키고, 표 32에 따른 조작 CDS로 조립한다. 서열 목록 (서열번호 63 내지 66)에 서열이 제공된 CDS를 NEBuilder® HiFi DNA 조립 마스터 믹스 키트 (E2321)에 제공된 프로토콜에 따라 증폭시켜, 표에 수록된 기능성 발현 카세트를 획득한다. 4개의 유전자의 각각의 혼입 블록은 트랜스 간섭을 제한하기 위해 4개의 다른 쌍 (프로모터/종결인자)을 포함하도록 구성된다. 6개의 유전자의 각각의 혼입 블록은 전사 간섭을 제한하기 위해 6개의 다른 쌍 (프로모터/종결인자)을 포함하도록 구성된다.
게놈의 표적 좌위로 삽입하기 위한 공여체 단편
In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라, 상이한 다중 발현 카세트 (RbcS, RbcL 및 RbcX) 또는 (GroES, GroEL 및 PRK)를 항생제 선택 카세트 (표) 주위에서 증폭시키고, 조립하여, 공여체 플라스미드 (pEQ0602 또는 pEQ0603)를 형성한다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
c) 아스페르길루스 니게르의 형질전환
아스페르길루스 니게르에서 DNA의 형질전환은 진균류 세포벽의 존재에 의해 제한되며, 효모 또는 에세리키아 콜라이와 비교하여 극히 비효율적이다. 그럼에도 불구하고, 진균류 균사 또는 분생자를 트리코데르마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum)으로부터의 용해 효소®, 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus)로부터의 키틴분해효소 및 헬릭스 포마티아 (Helix pomatia)로부터의 β-글루쿠로니다제로 구성된 칼테일과 같은 세포벽 분해 효소 (문헌[de Bekker et al., J Microbiol Methods. 2009 Mar;76(3):305-6])로 처리함으로써, 발아하도록 형질전환시켜 형질전환체를 생성시킬 수 있다.
A. 니게르 균주 CBS 513-88을 30℃에서 250　mL의 형질전환 배지가 포함된 1　L 삼각 플라스크에서 성장시킨다 (문헌[Kusters-van Someren et al., Curr Genet. 1991 Sep;20(4):293-9]). 250　rpm에서 16시간 동안 성장시킨 후, 균사체를 Miracloth (Calbiochem)에서의 여과에 의해 수집하고, 탈이온수로 세척한다. KMC (0.7 M KCl, 50　mM CaCl2, 20　mM Mes/NaOH, pH 5.8) 중 트리코데르마 하르지아눔으로부터의 5　g/L 용해 효소 (Sigma Saint Louis, MO, USA), 스트렙토마이세스 그리세우스로부터의 0.075 Uml-1 키틴분해효소 (Sigma) 및 헬릭스 포마티아로부터의 460 Uml-1 글루쿠로니다제 (Sigma)의 존재하에 원형질체를 37℃, 120　rpm에서 2시간 동안 제조한다. 원형질체화를 현미경으로 30분마다 모니터링한다. 원형질체를 Miracloth 필터를 통해 여과하고, 2000 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집한다. 원형질체를 저온의 STC (1.2 M 소르비톨, 10 mM 트리스/HCl, 50mM CaCl2, pH 7.5)로 세척한 다음, 100 pi의 STC에 재현탁시키고, 형질전환에 직접 사용한다.
대사 경로를 A. 니제르 게놈에 혼입시키기 위해서는, 플라스미드 및 선형 단편의 공동-형질전환이 필요하다. pgkA 유전자를 불활성화시키면서 조작의 일부를 게놈에 혼입시키기 위해 플라스미드 pEQ0610을 공여체 단편과 공동-형질전환시킨다. 유사하게, gsdA 유전자를 불활성화시키면서 조작의 다른 일부를 게놈에 혼입시키기 위해 플라스미드 pEQ0611을 공여체 단편과 공동-형질전환시킨다. 이들 서열은 항생제 내성 유전자 Hph 또는 Ble의 기능성 발현의 혼입 동안 선택 마커 및 상동성 재조합의 매트릭스 둘 모두로서 작용한다. 혼입 상황에서 직접 선택을 가능하게 하는 하이그로마이신 B 또는 블레오마이신을 첨가함으로써, 최소 배지 플레이트에서 균주를 직접 선택한다. 복제 기점 AMA1_2.8의 존재로 인해, 플라스미드 pCAS_pyrG2는 쉽게 손실되어, Cas9 단백질의 일시적 발현만을 유발함으로써, 비 표적화된 부작용의 위험을 감소시킨다.
선형 카세트 (10 μg) 및 플라스미드 (5 μg)를 적어도 107개의 원형질체를 포함하는 100　μL의 STC 및 330 μL의 새로 제조된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (25% PEG 6000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris/HCl, pH 7.5)과 혼합하여, 20분 동안 얼음 위에 유지시킨다. 추가의 2 mL PEG 용액과 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 원형질체 혼합물을 4 mL의 STC로 희석시킨다.
150　μg/mL 하이그로마이신 B이 첨가된 MM 플레이트 또는　 50　μg/mL 블레오마이신이 첨가된 MM 플레이트에서 형질전환체의 선택을 수행한다. 선택 배지로부터 단일 콜로니를 적어도 두 번 단리함으로써 모든 형질전환체를 정제한다. 적절한 제어 프라이머로 표적 유전자좌를 시퀀싱함으로써 단편의 삽입을 확인한다.
진균류 세포로부터의 게놈 DNA를 Wizard® 게놈 DNA 정제 키트 (Promega, Wisconsin, USA)를 사용하여 변형 프로토콜에 의해 단리한다. 세포벽을 제거하기 위해 균사체를 10 pi의 라이티카제 (lyticase) (10 mg/mL) 및 290 pi의 50 mM EDTA 용액 중 CM (30℃, 150　rpm)에서 밤새 배양한다. 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 현탁액을 원심분리하고 상청액을 따라낸다. 균사체 펠릿을 300 μL의 핵 용해 용액 및 100 μL의 단백질 침전 용액에 재현탁한다. 샘플을 얼음상에서 5분 동안 인큐베이션하고 원심분리한다. DNA를 이소프로판올로 침전시키고, 70% 에탄올로 세척한다. RNase (100 μg/mL)를 포함하는 DNA 재수화 용액으로 DNA 펠릿을 재수화한다. 발현 카세트의 형질전환 및 혼입의 성공을 PCR에 의해 확인하였다.
Figure pct00037
10% CO2 및 0.2%의 총 질소 함량 및 15%의 총 글루코스 함량을 갖고, MnSO4를 무함유하는 Vogel 배지를 포함하는 진탕 플라스크 내의 회전 진탕기 (180rpm)에서 30℃에서 균주 EQ1500 및 EQ1502로부터의 분생포자 (108/L)를 접종 및 배양한다. Aminex HPX-87 H 컬럼 (300 x 7.8　mm, Bio-Rad, Hercules, CA)이 장착된 HPLC (Shimadzu, Kyoto; Japan)에서 상기 기재된 바와 같이 글루코스 및 유기산의 측정을 수행하였다 (문헌[Blumhoff et al., 2013; Steiger et al., 2016]). 글루코스 및 시트르산의 검출에는 굴절률 검출기 (RID-10 A, Shimadzu)를 사용하고, 시스-아코니트산 및 트랜스-아코니트산의 검출에는 300 nm의 PDA 검출기 (SPD-M20A, Shimadzu)를 사용한다. 이동상으로서 0.004　M H2SO4 수용액을 사용한 60℃, 0.6 mL/분의 유속의 컬럼을 사용한다. 3개의 생물학적 복제물로 배양을 수행하였다.
d) 분석 방법
세포외 대사물의 정량화를 위해, 배양 샘플을 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 0.45 pm 기공 크기의 필터를 통해 여과한다. 여과액을 분석시까지 -20℃에 유지한다. 시트레이트 및 옥살레이트의 농도를 Amethyst C18-H 컬럼 (250 x 4.6　mm, Sepax Technologies, Newark, DE, USA)을 사용하여 210 nm에서 자외선으로 검출 및 정량화한다. 30℃, 0.8 mL/분의 유속에서 0.03% H3P04로 용리를 수행한다. 3,5-디니트로살리실산 방법에 의해 환원당을 검출한다. 바이오매스 측정: 5 mL의 샘플을 Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 통해 여과하여, 균사를 수집하고, 증류수로 세척한다. 균사를 "Miracloth"에서 105℃로 가열한다. 건조 셀 중량 (DCW)의 계산을 위해, 미리 Miracloth의 중량을 측정하고, 총 중량에서 빼서, 순 중량을 얻은 다음, 단위 부피당 순 중량을 DCW로 계산한다.
완전한 분석 후, 글루코스 소모의 함수로서 시트르산 생산 수율의 비교는 야생형 균주 EQ1500보다 조작된 균주 EQ1502에서 18% 더 높다.
실시예 9: 아스페르길루스 테레우스에서의 이타코네이트 생성의 개선
a) 전략
해당과정 경로의 비 기능성을 야기하는 pgkA 유전자 (좌위 태그 (ATEG_00224)의 불활성화 및 포스페이트 5탄당 경로의 산화성 부분을 억제하는 gsdA 유전자 (좌위 태그 ATEG_01623)의 불활성화를 사용하여, PRK 및 RuBisCO 효소, 즉 rbcS, rbcL, rbcX, groES, groEL 및 prk의 기능성 발현을 가능하게 함으로써, CO2 고정할 수 있도록 하는 6개의 유전자를 혼입시킨다.
b) DNA 작제물
i) 불활성화될 유전자를 표적화하는 RNA 가이드 서열
이들 2개의 유전자 각각에서, NGG 모티프 (CRISPR 표적 서열에 밑줄침)에 의해 천공된 20개의 뉴클레오타이드의 서열을 측정하였다 (표 35). 두 경우 모두에서, 이 서열은 표적화된 유전자에 특이적이지만, 아스페르길루스 테레우스 게놈에서도 고유하다. 아스페르길루스 테레우스 게놈의 상동성 영역과 이종 이중가닥을 형성함으로써, 선택된 좌위에 특이적으로 이중 가닥 파손을 유도하는 CAS9 엔도뉴클레아제의 작용을 유도하는 가이드 RNA (gRNA)를 발현시키기 위해, 이들 서열을 사용한다. pgkA의 경우, 제2 인트론에서 확인된 서열에서, 처음 20개의 뉴클레오타이드는 게놈에서 고유한 패턴을 가지며, 심지어 2개의 미스매치가 허용된다. gsdA의 경우, 제4 인트론에서 확인된 서열에서, 처음 20개의 뉴클레오타이드는 게놈에서 고유한 패턴을 가지며, 심지어 2개의 미스매치가 허용된다.
Figure pct00038
문헌[Sakari et al. (Bioresour technol. 2017; 245(Pt B):1327-1333)]에 기재된 플라스미드 pFC332 (Addgene #87845)는 Cas9 엔도뉴클레아제의 기능성 발현을 위한 카세트인 gRNA 발현 카세트 및 이 플라스미드의 선택을 위한 Hph 카세트를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 이 플라스미드의 일시적 증식을 가능하게 하는 단편 AMA1_2.8을 포함한다. 마지막으로 E. 콜라이의 복제 기점이 또한 존재한다.
또 다른 유전자를 표적화하기 위해, FS A와 FS B 사이의 gRNA 카세트를 용이하게 교환할 수 있다. 따라서, 이 플라스미드의 상이한 부분을 증폭시킴으로써 이 플라스미드를 변형시켜, 항생제 선택 카세트를 제거하고, 표 35에 기재된 서열에 대한 gRNA의 특이성을 가능하게 하는 20개의 뉴클레오타이드를 변형시켜, 아스페르길루스 테레우스 게놈에서 pgkA를 표적화하는 플라스미드 pEQ0615를 형성시키고, gsdA를 표적화하는 pEQ0616을 형성시킨다.
ii) 공여체 플라스미드
게놈과의 상동성 영역
공여체 플라스미드는 혼입을 위해 선택된 좌위에 상동성인 각각 대략 1500 bp의 게놈 표적화 서열 (LA 및 RA) 및 플라스미드 pUC19 (GenBank: M77789.2) 사이의 In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech 조립으로 구성된다. LA 및 RA 서열은 각각 가이드 RNA에 의해 표적화되는 좌위에 5' 및 3'에서 인접해 있다. 게놈 DNA/가이드 RNA 이종이량체는 이중 가닥 절단을 위해 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식된다 (좌위 1: pgkA; 좌위 2: gsdA) (표 35). RA 및 LA 단편을 pgkA 유전자의 경우 표 36에 기재된 프라이머로 증폭시키고, gsdA 유전자의 경우 표 37에 기재된 프라이머로 증폭시킨다. 증폭 서열은 서열 목록 (서열번호　67 내지 70)에 제공되어 있다.
플라스미드 (pEQ0604 또는 pEQ0605) (33)의 기능적 조립 및 대형 비대칭 인식 부위 (12 내지 40개의 염기쌍)를 갖는 II형 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소 I-CeuI 및 I-SceI)에 대한 2개의 제한 부위의 도입을 가능하게 하기 위해, In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라 3개의 단편의 모든 정방향 프라이머에서 18개의 뉴클레오타이드의 연장을 첨가한다. 이는 18개의 염기쌍의 인식 서열이므로 매우 드물며, 적절한 조립시 존재하지 않는다. 식별 부위에서 절단이 비대칭이라는 사실은 박테리아 벡터 pUC19로부터 서열이 부재하는 단편의 방출을 가능하게 한다. 이 2개의 효소에 의해 E. 콜라이에서의 클로닝에 의한 증폭 후 제한하여 혼입 블록을 추출할 수 있다.
Figure pct00039
Figure pct00040
조작 발현 카세트
프로모터 및 종결인자를 GenBank 데이터를 기반으로 하여 확인한다. 선택된 프로모터는 +1 전사 지점으로부터 결정되며, 관련된 프로모터의 최적 기능을 가능하게하는 트랜스 활성화 서열 및 "코어" 서열 (TATA 박스) 둘 모두를 포괄하기 위해 1.4 kb 상류까지 진행한다.
종결인자는 유전자의 종결 코돈 후 500 bp를 절단한다.
4개의 발현 카세트의 각각의 혼입 블록의 구조는 다음과 같이 규정된다: 제1 수준은 단순 요소, 즉 프로모터, 코딩 서열 (CDS) 및 종결인자로 구성된다. 프로모터 (표 30) 및 종결인자 (표 31) 요소를 증폭시키고, 표 32에 따른 조작 CDS로 조립한다. CDS를 NEBuilder® HiFi DNA 조립 마스터 믹스 키트 (E2321)에 제공된 프로토콜에 따라 증폭시켜, 표에 수록된 기능성 발현 카세트를 획득한다. 4개의 유전자의 각각의 혼입 블록은 트랜스 간섭을 제한하기 위해 4개의 상이한 종결인자 프로모터 쌍을 포함하도록 구성된다. 6개의 유전자의 각각의 혼입 블록은 전사 간섭을 제한하기 위해 6개의 상이한 종결인자 프로모터 쌍을 포함하도록 구성된다.
게놈의 표적 좌위로 삽입하기 위한 공여체 단편
In-Fusion® HD 클로닝 키트 사용자 매뉴얼 - Clontech의 프로토콜에 따라, 상이한 다중 발현 카세트 (RbcS, RbcL 및 RbcX 또는 GroES, GroEL 및 PRK를 항생제 선택 카세트 (표 38) 주위에서 증폭시키고, 조립하여, 공여체 플라스미드 (pEQ0606 또는 pEQ0607)를 형성한다.
Figure pct00041
c) 아스페르길루스 테레우스의 형질전환
A. 테레우스 균주 NIH262를 사용하여, 아스페르길루스 니게르에 적용된 전략 (실시예 8)에 따라 아스페르길루스 테레우스 DNA의 형질전환을 수행한다.
Figure pct00042
3% 글루코스에서의 A. 테레우스 균주 EQ1600 및 EQ1602의 배양.
문헌[Hevekerl et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98:6983-6989)]에 기재된 최적화 배지 조성물을 사용한다. 이는 리터당 0.8 g KH2P04, 3 g NH4N03, 1 g MgSO4.7H20, 5 g CaCl2.2 H20, 1.67 mg FeCl3.6H2O, 8 mg ZnSO4.7H2O 및 15 mg CuSO4.7H2O를 포함한다. 희석된 산 (0.75% v/v, 160℃, 10분)으로 전처리하고, 효소적으로 당화 (pH 5.0, 45℃, 72 h)시킨 밀짚 가수 분해물 (150 g/L)로부터 획득된 통상적인 당 농도를 모방하기 위해, 적절한 양의 최대 30　g/L의 글루코스를 사용한다. 당류 및 기타 모든 성분을 멸균 스톡 용액으로부터 첨가한다. 균주 EQ1600 및 EQ1602에 대한 포자 제조물을 접종하기 전에, CaCl2를 무함유하는 배지의 pH를 0.5　M H2SO4로 3.1로 조절한다. 10% CO2의 환경에서 7 내지 10일 동안 200 rpm의 회전 진탕기에서 33℃에서 125 mL 삼각 플라스크 내의 25 mL의 배지로 진탕하면서 배양을 수행한다. 발효 중에는 pH를 확인하지 않는다. 지속적인 산소 공급을 보장하기 위해, 시간 연구를 위한 샘플링 동안 플라스크를 진탕 유지시킨다. 모든 실험은 3회 중복 수행한다. 모든 배지 성분은 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical로부터 입수된 것이다. 이들 실험을 위해, 각각의 당을 탈이온수에 용해시키고, 필요한 경우, Dowex 50-X8 (100/200 메쉬) 양이온 교환 수지 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)의 컬럼 (440 x 45 mm)을 통과시켜 망간을 제거한다.
d) 분석 절차
세포 질량의 농도를 건조 세포 중량으로부터 측정한다. 발효액에 존재하는 세포 덩어리를 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 수집하고, 탈이온수로 3회 주의하여 세정한다. 세정된 세포 덩어리를 일정한 중량이 확보될 때까지 80℃에서 완전히 건조하였다. 원심분리 (10,000 g, 10분) 후 발효액을 -20℃에 저장한 후, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여, 글루코스, 이타콘산 및 부산물 (숙신산, α-케토글루타르산, 말산, 시스-아코니트산 및 트랜스-아코니트산)에 대해 분석한다. Shimadzu Prominence HPLC 시스템 (Shimadzu America, Inc., Columbia, MD)을 사용한다. 2개의 컬럼 (Aminex HPX-87P 컬럼, 300 x 7.8　mm, 애시 제거 카트리지 및 Carbo-P 보호 카트리지 장착, 및 하나의 Aminex HPX 87H 컬럼, 300 x 7.8　mm, Microguard 양이온 H 카트리지 장착 (Bio-Rad))을 각각 당 및 유기산의 분석에 사용한다. Aminex HPX 87P 컬럼을 85℃로 유지하고, 글루코스를 0.6 mL/분의 유속으로 Milli-Q 산성화된 탈이온수 (Millipore, Bedford, MA)로 용리시킨다.
Aminex HPX 87H 컬럼을 65℃로 유지하고, 당 및 유기산을 0.5 mL/분의 유속으로 Milli-Q 탈이온 여과수를 사용하여 제조된 5　mM H2SO4로 용리시킨다. 당의 경우 굴절률 검출기를 사용하고, 유기산의 경우 210 nm UV 검출기를 사용하여 검출을 수행한다. 10% CO2 하에서 33℃에서 7 내지 10일 동안 호기성 발효 중 손실된 액체를 추정하기 위한 내부 표준으로 프로피온산 (1%, 중량/부피)을 사용한다. 유기산을 포함하는 모든 HPLC 표준은 Sigma로부터 입수한 것이다. 문헌[Bakota et al. (Eur J Lipid Sci Technol. 2015;117:1452-1462]에 기재된 절차에 의해 Optima 7000DV (Perkin-Elmer, Waltham, MA) 유도 결합 플라스마 발광 분광분석기 (ICP-OES)를 사용하여, 망간 농도 (ppb 수준)를 측정한다.
글루코스로부터 이타콘산의 생성 결과를 기반으로 하여, 조작된 균주 EQ1602에서 참조 균주 EQ1600과 비교하여, 15%의 글루코스로부터 이타콘산의 질량 수율 증가가 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> ENOBRAQ <120> GENETICALLY OPTIMISED MICROORGANISM FOR PRODUCING MOLECULES OF INTEREST <130> IPA190922-FR <150> FR 1750694 <151> 2017-01-27 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> oligonucleotide CB101 (forward) <400> 1 acagatcatc aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca atgggtaagg 60 aaaagactca cgtttc 76 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> oligonucleotide CB102 (reverse) <400> 2 gggaaagaga aaagaaaaaa attgatctat cgatttcaat tcaattcaat ttagaaaaac 60 tcatcgagca tcaaatgaaa c 81 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sdzwf1 <400> 3 aagagtaaat ccaatagaat agaaaaccac ataaggcaag atgggtaaaa agcctgaact 60 caccg 65 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Rdzwf1 <400> 4 atttcagtga cttagccgat aaatgaatgt gcttgcattt ttttattcct ttgccctcgg 60 acg 63 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sdpgk1 <400> 5 acagatcatc 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Claims (23)

  1. 기능성 RuBisCO 효소 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하고, 해당과정의 경로가 1,3-바이포스포-D-글리세레이트 (1,3-BPG)의 생성의 상류 또는 3-포스포글리세레이트 (3PG)의 생성의 상류, 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (G3P)의 생성의 하류에서 적어도 부분적으로 억제되는 유전자 변형된 미생물로서, 상기 미생물은 RuBisCO 또는 포스포리불로키나제 효소 이외에 대상 외인성 분자를 생성하고/하거나 대상 내인성 분자를 과생성하도록 유전자 변형된, 유전자 변형 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지(oxidative branch)가 또한 적어도 부분적으로 억제된, 유전자 변형 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 재조합 RuBisCO 효소 및/또는 PRK를 발현하도록 유전자 변형된, 유전자 변형 미생물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 미생물은 리불로스-5-포스페이트 생성의 상류의 5탄당 포스페이트 경로의 산화성 분지가 억제되도록 유전자 변형된, 유전자 변형 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 외인성 분자 및/또는 내인성 분자는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 폴리올 및 유기산으로부터 선택되는, 유전자 변형 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 우선적으로는 효모, 진균류, 미세조류로부터 선택되는 진핵 세포, 또는 원핵 세포, 우선적으로는 박테리아인, 유전자 변형 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 적어도 부분적으로 억제된, 유전자 변형 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포글리세레이트 키나제를 인코딩하는 유전자의 발현은 적어도 부분적으로 억제된, 유전자 변형 미생물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 6-포스포글루코노락토나제 또는 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 적어도 부분적으로 억제된, 유전자 변형 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하도록 유전자 변형되고, TDH1, TDH2 및/또는 TDH3 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 속의 효모인, 유전자 변형 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하도록 유전자 변형되고, PGK1 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 사카로마이세스 세레비시아에 효모인, 유전자 변형 미생물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, ZWF1 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제된, 유전자 변형 미생물.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하도록 유전자 변형되고, pgk 및 gsdA 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 아스페르길루스 속의 사상균류인, 유전자 변형 미생물.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 기능성 I형 또는 II형 RuBisCO 및 기능성 포스포리불로키나제 (PRK)를 발현하도록 유전자 변형되고, gapA 및/또는 pgk 유전자, 및 선택적으로 zwf 유전자의 발현이 적어도 부분적으로 억제되는 E. 콜라이 박테리아인, 유전자 변형 미생물.
  15. 우선적으로는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 폴리올 및 유기산으로부터 선택되는 대상 분자의 생성 또는 과생성을 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형 미생물의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 글루타메이트, 시트레이트, 이타코네이트 또는 GABA의 생성 또는 과생성을 위한 용도.
  17. 적어도 하나의 대상 분자를 생성하는 생명공학적 공정으로서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형 미생물을 상기 미생물에 의한 상기 대상 분자의 합성 또는 생물전환을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 선택적으로 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생명공학적 공정.
  18. 제17항에 있어서, 대상 분자는 아미노산, 펩타이드, 단백질, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 폴리올 및 유기산으로부터 선택되는, 생명공학적 공정.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 대상 분자는 글루타메이트, 시트레이트, 이타코네이트 또는 GABA로부터 선택되는, 생명공학적 공정.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 상기 대상 분자의 생물전환 또는 합성에 관여하는 적어도 하나의 효소를 발현하도록 유전자 변형된, 생명공학적 공정.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 상기 대상 분자의 분해에 관여하는 효소가 적어도 부분적으로 억제되도록 유전자 변형된, 생명공학적 공정.
  22. 대상 분자를 생성하는 공정으로서, (i) 상기 분자의 합성 또는 생물전환에 관여하는 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 서열을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물에 삽입하는 단계, (ii) 상기 효소의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계 및 선택적으로 (iii) 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함하는 공정.
  23. 대상 분자를 생성하는 공정으로서, (i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물에서 상기 대상 분자의 분해에 관여하는 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 억제하는 단계, (ii) 상기 효소의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 미생물을 배양하는 단계 및 선택적으로 (iii) 상기 대상 분자를 회수하고/하거나, 정제하는 단계를 포함하는 공정.
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