CN114181879B - 具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用 - Google Patents

具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用。该具有自养能力的底盘细胞，所述底盘细胞表达固碳途径，包括固碳酶和途径中其他酶，所述底盘细胞为化能异养菌，所述底盘细胞包括需钠弧菌。上述人工合成的固碳自养底盘细胞通过合成生物学的方法引入人工合成和天然的CO2固定途径，实现自身能量供给，成功从化能异养型进化成化能自养型细菌，不需要任何有机物做能源和碳源，有望作为微生物细胞工厂，实现工业化的固碳生物制造，在固碳减排的同时实验清洁生产。

Description

具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用。
背景技术
化石能源属于不可再生资源，其不断燃烧耗尽和过度排放CO2，加剧了温室效应的发生，导致全球气候变暖。这不仅会破坏自然生态系统的平衡，还严重威胁着人类的健康生存。针对不断恶化的温室效应危机，全球纷纷提出减少CO2排放举措，发展低能耗，低排放的低碳经济模式，实现碳中和目标。因此，发展可再生能源，将CO2转化成人类所需的各种化学品和燃料，是减少碳排放，缓解温室效应的有效途径。
目前，CO2转化途径主要有化学催化和生物合成，化学催化过程中会遇到热力学不稳定和动力学惰性等问题，CO2转化面临诸多困难。光合自养微生物如蓝细菌，微藻，存在天然固碳途径，可直接固定自然界中CO2，不仅可降低碳排放，还可实现绿色燃料，化学品的持续生产。以蓝细菌为例，研究者们通过遗传改造，已成功实现从CO2合成生物燃料和各种高附加值化学品。但天然的CO2固定利用途径，光合转化效率低，且所需能量供应并不高效，无法达到工业化生产的需求。蓝细菌基因组复杂，遗传改造操作困难，改造过程耗时长，成功率低，无法高效，快速地用于生产，不利于工业化生产。另外，自养菌可以直接利用光能固定CO2合成化学品，但仅能合成少量的简单小分子产物。工程改造的异养菌利用有机碳源作为能源和碳源，如葡萄糖等，实现生产多种复杂、高值产品，适用工业化生产。但异养菌无法直接固定CO2，维持细菌的生长和合成化学品。
发明内容
基于此，有必要提供一种具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用。
一种具有自养能力的底盘细胞，所述底盘细胞表达固碳途径，包括固碳酶和途径中其他酶，所述底盘细胞为化能异养菌，所述底盘细胞包括需钠弧菌。
本申请发现，需钠弧菌在其最佳培养条件下传代时间为10分钟，表达固碳途径，含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的需钠弧菌等化能异养菌作为底盘细胞，能够固定二氧化碳，实现自身能量供给，成功从化能异养型进化成化能自养型细菌，有望用于微生物细胞工厂，工业化生产各种化学品。
在其中一个实施例中，所述固碳酶基因为天然固碳酶的基因。
在其中一个实施例中，所述固碳酶基因为人工合成并外源导入的固定碳酶基因。
在其中一个实施例中，所述固碳途径中的酶基因，包括固碳酶基因和其他酶基因选自如下基因中的至少一种：脱氮硫杆菌中的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、深红红螺菌的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、蓝细菌中的磷酸核酮糖激酶基因、菠菜中的磷酸核酮糖激酶基因、深红红螺菌中的酸酐水解酶基因。
在其中一个实施例中，所述1.5-二磷酸核酮糖羧化酶为含有如SEQ ID No.1及SEQID No.2所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
在其中一个实施例中，所述磷酸核酮糖激酶例为含有如SEQ ID No.3及SEQ IDNo.4所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
在其中一个实施例中，所述酸酐水解酶为含有如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
一种具有自养能力的底盘细胞的构建方法，包括如下步骤：将含固碳酶基因和途径中其他酶基因载体导入宿主细胞中，得到具有自养能力的底盘细胞，所述底盘细胞为化能异养菌，所述底盘细胞包括需钠弧菌。
在其中一个实施例中，所述将含固碳酶基因和途径中其他酶基因导入宿主细胞中的步骤包括：
将含有所述含固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入宿主细胞中进行表达，所述宿主细胞为化能异养菌，所述宿主细胞包括需钠弧菌；
对能够表达活性所述固碳酶和途径中其他酶的所述宿主细胞进行人工进化，得到所述底盘细胞。
在其中一个实施例中，所述对能够表达活性所述固碳酶和途径中其他酶的所述宿主细胞进行人工进化的步骤包括：
将能够表达活性所述固碳酶和途径中其他酶的所述宿主细胞依次置于含有所述有机碳源浓度从4g/L梯度降低至0g/L的基本培养基中进行培养；分离含有0g/L所述有机碳源的所述基本培养基中生长的细胞，得到所述底盘细胞。
在其中一个实施例中，所述对能够表达活性所述固碳酶和途径中其他酶的所述宿主细胞进行人工进化的步骤包括：
采用含有4g/L所述有机碳源的所述基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养；每隔24h测定培养液的OD600，当OD600增长至不低于1时固液分离收集细胞，然后加入含有下一梯度浓度所述有机碳源的所述基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养，依次重复操作，直至在含有0g/L所述有机碳源的所述基本培养基中进行培养，OD600增长至不低于1时，分离含有0g/L所述有机碳源的所述基本培养基中生长的细胞，得到所述底盘细胞，其中，所述有机碳源包括葡萄糖。
在其中一个实施例中，所述基本培养基包括1g/L-10g/L硫酸铵、15g/L-30g/L氯化钠、1g/L-2g/L磷酸二氢钾、1g/L-2g/L磷酸氢二钾、0.1g/L-0.25g/L硫酸镁、0.01g/L-0.05g/L氯化钙、5mg/L-16.4mg/L七水硫酸亚铁、5mg/L-20mg/L一水硫酸锰、0.1mg/L-0.3mg/L无水硫酸铜、1mg/L-5mg/L七水硫酸锌、0.01mg/L-0.05mg/L六水氯化镍。
在其中一个实施例中，OD600为0.1的所述底盘细胞在基本培养基中能够持续生长至少48h。
一种重组载体，含有固碳酶基因和固碳途径中其他酶基因。
一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：将所述固碳酶基因和途径中其他酶基因通过基因合成技术导入载体中，获得重组载体。
上述具有自养能力的底盘细胞、或者上述具有自养能力的底盘细胞的构建方法构建得到的底盘细胞、或者上述重组载体在固定二氧化碳中的应用。
本申请提供一种人工合成的固碳自养底盘细胞，该菌株通过合成生物学的方法引入人工合成和天然的CO2固定途径，实现自身能量供给，成功从化能异养型进化成化能自养型细菌，不需要任何有机物做能源和碳源，有望作为微生物细胞工厂，实现工业化的固碳生物制造，在固碳减排的同时实验清洁生产。
附图说明
图1为人工固碳自养需钠弧菌体内固碳关键酶的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图2为人工固碳自养需钠弧菌体内固碳关键酶的活性验证图；
图3为人工固碳自养需钠弧菌体的进化路线图；
图4为不添加葡萄糖条件下人工固碳自养需钠弧菌生长曲线；
图5为不添加葡萄糖条件下人工固碳自养需钠弧菌48小时的生长变化图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本申请一实施方式提供一种具有自养能力的底盘细胞，底盘细胞表达固碳途径，包括固碳酶和途径中其他酶，底盘细胞为化能异养菌，底盘细胞包括需钠弧菌。
本申请发现，需钠弧菌比传统模式生物大肠杆菌的生长速度快将近一倍，在最佳培养条件下传代时间为10分钟，而大肠杆菌需20分钟，含有固碳酶基因的需钠弧菌等作为底盘细胞，能够固定二氧化碳，实现自身能量供给，成功从化能异养型进化成化能自养型细菌，有望用于微生物细胞工厂，工业化生产各种化学品。在遗传改造方面，不同基因工具和基因编辑技术被开发利用，为促进该菌的宿主系统构建和改造提供了理论基础和技术支持。大肠杆菌现有的成熟的产品合成途径和发酵工艺在需钠弧菌中均可适用。需钠弧菌已快速发展成为新型快速生长底盘细胞，用于合成各种化学品。
固碳酶为固碳关键酶，即为固定二氧化碳的关键酶。
其中，固碳酶基因为天然固碳酶的基因。
其中，固碳酶基因为人工合成并外源导入的固定碳酶基因。
其中，固碳酶基因和途径中其他酶基因选自如下基因中的至少一种：脱氮硫杆菌中的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、深红红螺菌的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、蓝细菌中的磷酸核酮糖激酶基因、菠菜中的磷酸核酮糖激酶基因、深红红螺菌中的酸酐水解酶基因。其中，1.5-二磷酸核酮糖羧化酶是最常见的CO2固定酶。需要说明的是，固碳途径酶基因不限于为上述指出的基因，也可以为本领域中其他的CO2固定酶基因。
其中，1.5-二磷酸核酮糖羧化酶例如可以为含有如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为：
MDQSARYADLSLKEEDLIKGGRHILVAYKMKPKSGYGYLEAAAHFAAESSTGTNVEVSTTDDFTKGVDALVYYIDEASEDMRIAYPLELFDRNVTDGRFMLVSFLTLAIGNNQGMGDIEHAKMIDFYVPERCIQMFDGPATDISNLWRILGRPVVNGGYIAGTIIKPKLGLRPEPFAKAAYQFWLGGDFIKNDEPQGNQVFCPLKKVLPLVYDAMKRAQDDTGQAKLFSMNITADDHYEMCARADYALEVFGPDADKLAFLVDGYVGGPGMVTTARRQYPGQYLHYHRAGHGAVTSPSAKRGYTAFVLAKMSRLQGASGIHVGTMGYGKMEGEGDDKIIAYMIERDECQGPVYFQKWYGMKPTTPIISGGMNALRLPGFFENLGHGNVINTAGGGSYGHIDSPAAGAISLRQSYECWKQGADPIEFAKEHKEFARAFESFPKDADKLFPGWREKLGVHK*。
如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列为：
MHHHHHHMDQSSRYVNLALKEEDLIAGGEHVLCAYIMKPKAGYGYVATAAHFAAESSTGTNVEVCTTDDFTRGVDALVYEVDEARELTKIAYPVALFDRNITDGKAMIASFLTLTMGNNQGMGDVEYAKMHDFYVPEAYRALFDGPSVNISALWKVLGRPEVDGGLVVGTIIKPKLGLRPKPFAEACHAFWLGGDFIKNDEPQGNQPFAPLRDTIALVADAMRRAQDETGEAKLFSANITADDPFEIIARGEYVLETFGENASHVALLVDGYVAGAAAITTARRRFPDNFLHYHRAGHGAVTSPQSKRGYTAFVHCKMARLQGASGIHTGTMGFGKMEGESSDRAIAYMLTQDEAQGPFYRQSWGGMKACTPIISGGMNALRMPGFFENLGNANVILTAGGGAFGHIDGPVAGARSLRQAWQAWRDGVPVLDYAREHKELARAFESFPGDADQIYPGWRKALGVEDTRSALPA*。
其中，磷酸核酮糖激酶例如可以为含有如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列为：
MAVCTVYTTTTHGSSNNNKVNYKRSSSSNNTTTRSYVTCSTVGAADSGCGKSTMRRTSVGGAAKGGNDSNTSDTTTVCDDHSDRNGRKVKVTADKANDDMYVKAKGKAVDKYNHVSGDKVGHMYDARVRDSYDSNVKAWKRDMKRGHSSKASSRKDDAYDKHADVVVTDDDGKVRVRMKGVKNVYDGSTSWCGRKTCSYGKSYGDTYGNVTVVMDGMDRDYVSHSNSTKYGVTMKHNGSNNGTGTGKRDVASRSTATATAAKA*。
如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列为：
MHHHHHHSKPDRVVLIGVAGDSGCGKSTFLNRLADLFGTELMTVICLDDYHSLDRKGRKEAGVTALDPRANNFDLMYEQVKALKNGETIMKPIYNHETGLIDPPEKIEPNRIIVIEGLHPLYDERVRELLDFSVYLDIDDEVKIAWKIQRDMAERGHSYEDVLASIEARRPDFKAYIEPQRGHADIVIRVMPTQLIPNDTERKVLRVQLIQREGRDGFEPAYLFDEGSTIQWTPCGRKLTCSYPGIRLAYGPDTYYGHEVSVLEVDGQFENLEEMIYVEGHLSKTDTQYYGELTHLLLQHKDYPGSNNGTGLFQVLTGLKMRAAYERLTSQAAPVAASV*。
其中，酸酐水解酶例如可以为含有如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白。
如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列为：
MDIQDLITNNRKWAEERESALPGYFHILSEVQSPKFLWIGCSDSRVPANEIVGMQPGELFVHRNIANVVPHADANCHAVLEYAIDVLKVEHIMVVGHYGCGGVRAALNRLAMGPIDNWLSHIKDIARIFAAELEDLPDEESRVDRLCELNAMAQVMNVARTSMVQAAWRRGQPLAIHAWCYGLKTGLVNDLGRTLTRIADLPEPYRLIFPDQV*。
如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列为：
MHHHHHHDIQDLITNNRKWAEERESALPGYFHILSEVQSPKFLWIGCSDSRVPANEIVGMQPGELFVHRNIANVVPHADANCHAVLEYAIDVLKVEHIMVVGHYGCGGVRAALNRLAMGPIDNWLSHIKDIARIFAAELEDLPDEESRVDRLCELNAMAQVMNVARTSMVQAAWRRGQPLAIHAWCYGLKTGLVNDLGRTLTRIADLPEPYRLIFPDQV*。
由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性。
因此，1.5-二磷酸核酮糖羧化酶不限于可以为含有如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白，在上述氨基酸序列的基础上发生氨基酸的简单替换、缺失、增加或者同源性修改等得到的蛋白，如果其与1.5-二磷酸核酮糖羧化酶没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。磷酸核酮糖激酶不限于可以为含有如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白，在上述氨基酸序列的基础上发生氨基酸的简单替换、缺失、增加或者同源性修改等得到的蛋白，如果其与磷酸核酮糖激酶没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。酸酐水解酶不限于可以为含有如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白，在上述氨基酸序列的基础上发生氨基酸的简单替换、缺失、增加或者同源性修改等得到的蛋白，如果其与酸酐水解酶没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。
底盘细胞为需钠弧菌。其中，需钠弧菌例如为需钠弧菌CICC10908。需要说明的是，需钠弧菌不限于为需钠弧菌CICC10908，也可以为其他需钠弧菌，可以根据需要进行选择。
需要说明的是，底盘细胞不限于为需钠弧菌，也可以将本申请的人工合成和天然的CO2固定途径导入不同菌属，重新进化，获得新的人工固碳自养底盘细胞。
需要说明的是，利用合成生物学技术将不同来源的关键固碳酶重新设计构建一条人工合成和天然的CO2固定途径，再导入细菌中，得到底盘细胞。
本申请一实施方式还提供一种具有自养能力的底盘细胞的构建方法，包括如下步骤：将固碳酶基因和途径中其他酶基因导入宿主细胞中，得到具有自养能力的底盘细胞，底盘细胞为化能异养菌，底盘细胞包括需钠弧菌。
固碳酶即为固定二氧化碳的关键酶。
其中，固碳酶基因为天然固碳酶的基因。
其中，固碳酶基因为人工合成并外源导入的固定碳酶基因。
其中，固碳酶基因和途径中其他酶基因选自如下基因中的至少一种：脱氮硫杆菌中的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、深红红螺菌的1.5-二磷酸核酮糖羧化酶基因、蓝细菌中的磷酸核酮糖激酶基因、菠菜中的磷酸核酮糖激酶基因、深红红螺菌中的酸酐水解酶基因。其中1.5-二磷酸核酮糖羧化酶是最常见的CO2固定酶。
在其中一个实施例中，将固碳酶基因和途径中其他酶基因导入宿主细胞中的步骤包括S110-S120：
S110、将含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入宿主细胞中进行表达，宿主细胞为化能异养菌，宿主细胞包括需钠弧菌。
具体地，将含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入宿主细胞中进行表达的步骤包括：将携带有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入感受态宿主细胞中进行表达。
将含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入宿主细胞中进行表达的步骤之前，还包括构建含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体的步骤。具体地，将固碳酶基因和途径中其他酶基因通过基因合成技术导入基因工程载体中，获得含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体。更具体地，设计一条人工合成和天然的CO2固定途径，通过基因合成将所需固碳酶合成，获得表达CO2固定途径的质粒。其中，基因工程载体例如可以为pACYCDuet，pTrc99a或pET21a。
将含有固碳酶基因和途径中其他酶基因的载体导入宿主细胞中进行表达的步骤之后，还包括如下步骤：验证固碳酶和途径中其他酶是否已经在宿主细胞内成功表达；验证宿主细胞内表达的固碳酶和途径中其他酶是否有活性。其中，采用SDS-PAGE凝胶电泳验证固碳酶是否已经在宿主细胞内成功表达。验证宿主细胞内表达的固碳酶和途径中其他酶是否有活性的方法为：检测粗酶液在340nm处NADH的吸光值变化，随时间变化，吸光值逐渐下降，说明在宿主细胞内表达的固碳酶和途径中其他酶有活性。
其中，需钠弧菌例如为需钠弧菌CICC10908。需要说明的是，需钠弧菌不限于为需钠弧菌CICC10908，也可以为其他需钠弧菌，可以根据需要进行选择。
S120、对能够表达活性固碳酶和途径中其他酶的宿主细胞进行人工进化，得到底盘细胞。
其中，能够表达活性固碳酶和途径中其他酶的宿主细胞是指宿主细胞能够成功表达固碳酶和途径中其他酶且表达的固碳酶和途径中其他酶具有活性。
具体地，对能够表达活性固碳酶和途径中其他酶的宿主细胞进行人工进化的步骤包括：将能够表达活性固碳酶和途径中其他酶的宿主细胞依次置于含有有机碳源浓度从4g/L梯度降低至0g/L的基本培养基中进行培养；分离含有0g/L有机碳源的基本培养基中生长的细胞，得到底盘细胞。其中，有机碳源例如可以为葡萄糖。需要说明的是，有机碳源不限于为葡萄糖，也可以为本领域中其他常见的有机碳源。
更具体地，有机碳源为葡萄糖，对能够表达活性固碳酶和途径中其他酶的宿主细胞进行人工进化的步骤包括：采用含有4g/L葡萄糖的基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养；每隔24h测定培养液的OD600，当OD600长至或超过1时固液分离收集细胞，然后加入含有下一梯度浓度葡萄糖的基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养，依次重复操作，直至在含有0g/L葡萄糖的基本培养基中进行培养，OD600长至或超过1时，分离含有0g/L葡萄糖的基本培养基中生长的细胞，得到底盘细胞。
其中，基本培养基包括1g/L-10g/L硫酸铵、15g/L-30g/L氯化钠、1g/L-2g/L磷酸二氢钾、1g/L-2g/L磷酸氢二钾、0.1g/L-0.25g/L硫酸镁、0.01g/L-0.05g/L氯化钙、5mg/L-16.4mg/L七水硫酸亚铁、5mg/L-20mg/L一水硫酸锰、0.1mg/L-0.3mg/L无水硫酸铜、1mg/L-5mg/L七水硫酸锌、0.01mg/L-0.05mg/L六水氯化镍。此种设置的基本培养基既能够满足能够表达活性固碳酶的宿主细胞的基本生长所需，又不会对能够表达活性固碳酶的宿主细胞的人工进化产生干扰。具体地，基本培养基包括5g/L硫酸铵、15g/L氯化钠、1g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、0.25g/L硫酸镁、0.01g/L氯化钙、16.4mg/L七水硫酸亚铁、10mg/L一水硫酸锰、0.3mg/L无水硫酸铜、1mg/L七水硫酸锌、0.02mg/L六水氯化镍。
需要说明的是，基本培养基不限于为上述指出的培养基，也可以为其他基本培养基，不需要额外添加有机碳源且能够满足细胞基本生长需求的培养基即可。
其中，OD600为0.1的底盘细胞在基本培养基中能够持续生长至少48h。
其中，有机碳源为葡萄糖。葡萄糖浓度梯度为：葡萄糖浓度按照4g/L，2g/L，1g/L，0.5g/L，0.25g/L，0.125g/L，0.0625g/L……1.906μg/L，0g/L逐渐减少。
其中，固液分离的方式不限，例如可以为离心，也可以为其他常见的细胞固液分离方式。
上述具有自养能力的底盘细胞、或者上述具有自养能力的底盘细胞的构建方法构建得到的底盘细胞、或者上述重组载体在固定二氧化碳中的应用。
需要说明的是，底盘细胞不限于为需钠弧菌，也可以将本申请的人工合成和天然的CO2固定途径导入不同菌属，重新进化，获得新的人工固碳自养底盘细胞。
需要说明的是，利用合成生物学技术将不同来源的关键固碳酶重新设计构建一条人工合成和天然的CO2固定途径，再导入细菌中。
经过实验进化，本申请的底盘细胞在没有额外添加有机碳源条件下也能持续生长。本申请的人工合成的固碳自养底盘细胞通过合成生物学的方法引入人工合成和天然的CO2固定途径，包括固碳酶和途径中其他酶，可成功表达并保持活性，通过实验室进化方式，在无额外添加有机碳源条件下，菌株通过固定空气中CO2，实现自身能量供给且持续生长，成功从化能异养型进化成化能自养型菌株，有望作为微生物细胞工厂，实现工业化的固碳生物制造，在固碳减排的同时实验清洁生产。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1：人工合成固碳自养底盘细胞的构建
(1)参考现有文献(The industrial yeast Pichia pastoris is convertedfrom aheterotroph into an autotroph capable of growth on CO2.Naturebiotechnology,38(2),210-216.Conversion of Escherichia coli to generate allbiomass carbon from CO2.Cell,179(6),1255-1263.)，设计一条人工合成和天然的CO2固定途径，将固碳途径关键酶包括1.5-二磷酸核酮糖羧化酶，磷酸核酮糖激酶，酸酐水解酶优化组合，通过基因合成将所需固碳途径酶合成并导入质粒载体中，获得携带有包括固碳关键酶和途径中其他酶的质粒。其中，质粒已经过密码子优化，质粒载体可以为pACYCDuet，pTrc99a等。其中，实施例1中1.5-二磷酸核酮糖羧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2，实施例1中磷酸核酮糖激酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4，实施例1中酸酐水解酶的氨基酸序列为SEQ ID No.6。
(2)将携带有固碳关键酶和途径中其他酶的质粒通过电转化方式导入需钠弧菌CICC10908感受态细胞中，涂板，挑单克隆，37℃过夜培养。其中，培养所用培养基为丰富培养基，组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，21.9g/L氯化钠，0.313g/L氯化钾，2.2g/L氯化镁。
(3)然后过夜培养的细胞按照1：100接种比例进行扩大培养，OD600值长至0.4-0.6，加入0.3mM IPTG诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，24h后离心(4℃，12000rpm，10min)收集细胞，然后用20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液重悬菌体，超声破碎细胞(功率100w，操作5s，暂停5s，总时间8min)，离心(4℃，12000rpm，10min)收集上清，得到粗酶液。加入5×loading buffer后煮沸，SDS-PAGE凝胶电泳验证需钠弧菌是否成功表达固碳关键酶。测定结果详见图1。图1为人工固碳自养需钠弧菌体内固碳关键酶的SDS-PAGE凝胶电泳图。从图1可以看出，加入IPTG诱导剂诱导培养后可检测到固碳酶条带，说明需钠弧菌成功表达固碳关键酶。
(4)酶标仪检测粗酶液在340nm处NADH的吸光值变化。测定结果详见图2。图2为人工固碳自养需钠弧菌体内固碳关键酶的活性验证图。从图2可以看出，随时间变化，吸光值逐渐下降，说明在需钠弧菌体内表达的固碳酶有活性。
(5)将能够表达活性固碳途径关键酶的菌株进化以起始OD600为0.5的菌量，基本培养基中添加4g/L葡萄糖。人工固碳自养需钠弧菌体的进化路线图如图3所示，每隔24h测量其OD600值，当OD600长至1，将菌体离心收集，再次用新鲜的基本培养基重悬菌体至OD600为0.5，葡萄糖浓度按照4g/L，2g/L，1g/L，0.5g/L，0.25g/L，0.125g/L，0.0625g/L……1.906μg/L，0g/L逐渐减少，最终在没有葡萄糖的基本培养基能够生长的菌株即为人工固碳自养需钠弧菌。测定不添加葡萄糖条件下人工固碳自养需钠弧菌生长曲线，测定结果如图4所示，在没有额外添加葡萄糖条件下，人工合成需钠弧菌也能持续生长，最终进化成化能自养型细菌。测定不添加葡萄糖条件下人工固碳自养需钠弧菌48小时的生长变化，如图5所示，进化后菌株在基本培养基中起始OD600降至0.1，48h内也可持续生长。
经过实验进化，本申请的需钠弧菌菌株在没有额外添加有机碳源葡萄糖条件下，也能持续生长，结果如图4。将进化后菌株在基本培养基中起始OD600降至0.1，48h内也可持续生长，结果如图5。根据实验结果可以看出，本申请的需钠弧菌导入人工合成和自然固碳途径后，固碳途径关键酶可成功表达并保持活性，通过实验室进化方式，在无额外添加有机碳源葡萄糖条件下，菌株通过固定空气中CO2，实现自身能量供给且持续生长，成功从化能异养型进化成化能自养型菌株。
本申请的人工合成的固碳自养底盘细胞通过合成生物学的方法引入人工合成和天然的CO2固定途径，固碳途径关键酶，包括固碳酶和途径中其他酶可成功表达并保持活性，通过实验室进化方式，在无额外添加有机碳源条件下，菌株通过直接利用大气CO2，实现自身能量供给且持续生长，成功从化能异养型进化成化能自养型菌株，本申请的菌株可固定自然界中CO2，减少碳排放，缓解温室效应，有望作为微生物细胞工厂，用于工业合成生物燃料和各种化学品，实现工业化的固碳生物制造，在固碳减排的同时实验清洁生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Gln Ser Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Ser Leu Lys Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Lys Gly Gly Arg His Ile Leu Val Ala Tyr Lys Met Lys Pro
20 25 30
Lys Ser Gly Tyr Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Ala His Phe Ala Ala Glu
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Thr Asn Val Glu Val Ser Thr Thr Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Lys Gly Val Asp Ala Leu Val Tyr Tyr Ile Asp Glu Ala Ser Glu Asp
65 70 75 80
Met Arg Ile Ala Tyr Pro Leu Glu Leu Phe Asp Arg Asn Val Thr Asp
85 90 95
Gly Arg Phe Met Leu Val Ser Phe Leu Thr Leu Ala Ile Gly Asn Asn
100 105 110
Gln Gly Met Gly Asp Ile Glu His Ala Lys Met Ile Asp Phe Tyr Val
115 120 125
Pro Glu Arg Cys Ile Gln Met Phe Asp Gly Pro Ala Thr Asp Ile Ser
130 135 140
Asn Leu Trp Arg Ile Leu Gly Arg Pro Val Val Asn Gly Gly Tyr Ile
145 150 155 160
Ala Gly Thr Ile Ile Lys Pro Lys Leu Gly Leu Arg Pro Glu Pro Phe
165 170 175
Ala Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Trp Leu Gly Gly Asp Phe Ile Lys Asn
180 185 190
Asp Glu Pro Gln Gly Asn Gln Val Phe Cys Pro Leu Lys Lys Val Leu
195 200 205
Pro Leu Val Tyr Asp Ala Met Lys Arg Ala Gln Asp Asp Thr Gly Gln
210 215 220
Ala Lys Leu Phe Ser Met Asn Ile Thr Ala Asp Asp His Tyr Glu Met
225 230 235 240
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Ala Leu Glu Val Phe Gly Pro Asp Ala Asp
245 250 255
Lys Leu Ala Phe Leu Val Asp Gly Tyr Val Gly Gly Pro Gly Met Val
260 265 270
Thr Thr Ala Arg Arg Gln Tyr Pro Gly Gln Tyr Leu His Tyr His Arg
275 280 285
Ala Gly His Gly Ala Val Thr Ser Pro Ser Ala Lys Arg Gly Tyr Thr
290 295 300
Ala Phe Val Leu Ala Lys Met Ser Arg Leu Gln Gly Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
His Val Gly Thr Met Gly Tyr Gly Lys Met Glu Gly Glu Gly Asp Asp
325 330 335
Lys Ile Ile Ala Tyr Met Ile Glu Arg Asp Glu Cys Gln Gly Pro Val
340 345 350
Tyr Phe Gln Lys Trp Tyr Gly Met Lys Pro Thr Thr Pro Ile Ile Ser
355 360 365
Gly Gly Met Asn Ala Leu Arg Leu Pro Gly Phe Phe Glu Asn Leu Gly
370 375 380
His Gly Asn Val Ile Asn Thr Ala Gly Gly Gly Ser Tyr Gly His Ile
385 390 395 400
Asp Ser Pro Ala Ala Gly Ala Ile Ser Leu Arg Gln Ser Tyr Glu Cys
405 410 415
Trp Lys Gln Gly Ala Asp Pro Ile Glu Phe Ala Lys Glu His Lys Glu
420 425 430
Phe Ala Arg Ala Phe Glu Ser Phe Pro Lys Asp Ala Asp Lys Leu Phe
435 440 445
Pro Gly Trp Arg Glu Lys Leu Gly Val His Lys
450 455
<210> 2
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Met Asp Gln Ser Ser Arg Tyr Val Asn
1 5 10 15
Leu Ala Leu Lys Glu Glu Asp Leu Ile Ala Gly Gly Glu His Val Leu
20 25 30
Cys Ala Tyr Ile Met Lys Pro Lys Ala Gly Tyr Gly Tyr Val Ala Thr
35 40 45
Ala Ala His Phe Ala Ala Glu Ser Ser Thr Gly Thr Asn Val Glu Val
50 55 60
Cys Thr Thr Asp Asp Phe Thr Arg Gly Val Asp Ala Leu Val Tyr Glu
65 70 75 80
Val Asp Glu Ala Arg Glu Leu Thr Lys Ile Ala Tyr Pro Val Ala Leu
85 90 95
Phe Asp Arg Asn Ile Thr Asp Gly Lys Ala Met Ile Ala Ser Phe Leu
100 105 110
Thr Leu Thr Met Gly Asn Asn Gln Gly Met Gly Asp Val Glu Tyr Ala
115 120 125
Lys Met His Asp Phe Tyr Val Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Leu Phe Asp
130 135 140
Gly Pro Ser Val Asn Ile Ser Ala Leu Trp Lys Val Leu Gly Arg Pro
145 150 155 160
Glu Val Asp Gly Gly Leu Val Val Gly Thr Ile Ile Lys Pro Lys Leu
165 170 175
Gly Leu Arg Pro Lys Pro Phe Ala Glu Ala Cys His Ala Phe Trp Leu
180 185 190
Gly Gly Asp Phe Ile Lys Asn Asp Glu Pro Gln Gly Asn Gln Pro Phe
195 200 205
Ala Pro Leu Arg Asp Thr Ile Ala Leu Val Ala Asp Ala Met Arg Arg
210 215 220
Ala Gln Asp Glu Thr Gly Glu Ala Lys Leu Phe Ser Ala Asn Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asp Asp Pro Phe Glu Ile Ile Ala Arg Gly Glu Tyr Val Leu Glu
245 250 255
Thr Phe Gly Glu Asn Ala Ser His Val Ala Leu Leu Val Asp Gly Tyr
260 265 270
Val Ala Gly Ala Ala Ala Ile Thr Thr Ala Arg Arg Arg Phe Pro Asp
275 280 285
Asn Phe Leu His Tyr His Arg Ala Gly His Gly Ala Val Thr Ser Pro
290 295 300
Gln Ser Lys Arg Gly Tyr Thr Ala Phe Val His Cys Lys Met Ala Arg
305 310 315 320
Leu Gln Gly Ala Ser Gly Ile His Thr Gly Thr Met Gly Phe Gly Lys
325 330 335
Met Glu Gly Glu Ser Ser Asp Arg Ala Ile Ala Tyr Met Leu Thr Gln
340 345 350
Asp Glu Ala Gln Gly Pro Phe Tyr Arg Gln Ser Trp Gly Gly Met Lys
355 360 365
Ala Cys Thr Pro Ile Ile Ser Gly Gly Met Asn Ala Leu Arg Met Pro
370 375 380
Gly Phe Phe Glu Asn Leu Gly Asn Ala Asn Val Ile Leu Thr Ala Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ala Phe Gly His Ile Asp Gly Pro Val Ala Gly Ala Arg Ser
405 410 415
Leu Arg Gln Ala Trp Gln Ala Trp Arg Asp Gly Val Pro Val Leu Asp
420 425 430
Tyr Ala Arg Glu His Lys Glu Leu Ala Arg Ala Phe Glu Ser Phe Pro
435 440 445
Gly Asp Ala Asp Gln Ile Tyr Pro Gly Trp Arg Lys Ala Leu Gly Val
450 455 460
Glu Asp Thr Arg Ser Ala Leu Pro Ala
465 470
<210> 3
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Val Cys Thr Val Tyr Thr Thr Thr Thr His Gly Ser Ser Asn
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Asn Tyr Lys Arg Ser Ser Ser Ser Asn Asn Thr Thr
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Thr Arg Ser Tyr Val Thr Cys Ser Thr Val Gly Ala Ala Asp Ser Gly
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Cys Gly Lys Ser Thr Met Arg Arg Thr Ser Val Gly Gly Ala Ala Lys
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Gly Gly Asn Asp Ser Asn Thr Ser Asp Thr Thr Thr Val Cys Asp Asp
65 70 75 80
His Ser Asp Arg Asn Gly Arg Lys Val Lys Val Thr Ala Asp Lys Ala
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Asn Asp Asp Met Tyr Val Lys Ala Lys Gly Lys Ala Val Asp Lys Tyr
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Asn His Val Ser Gly Asp Lys Val Gly His Met Tyr Asp Ala Arg Val
115 120 125
Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Asn Val Lys Ala Trp Lys Arg Asp Met Lys
130 135 140
Arg Gly His Ser Ser Lys Ala Ser Ser Arg Lys Asp Asp Ala Tyr Asp
145 150 155 160
Lys His Ala Asp Val Val Val Thr Asp Asp Asp Gly Lys Val Arg Val
165 170 175
Arg Met Lys Gly Val Lys Asn Val Tyr Asp Gly Ser Thr Ser Trp Cys
180 185 190
Gly Arg Lys Thr Cys Ser Tyr Gly Lys Ser Tyr Gly Asp Thr Tyr Gly
195 200 205
Asn Val Thr Val Val Met Asp Gly Met Asp Arg Asp Tyr Val Ser His
210 215 220
Ser Asn Ser Thr Lys Tyr Gly Val Thr Met Lys His Asn Gly Ser Asn
225 230 235 240
Asn Gly Thr Gly Thr Gly Lys Arg Asp Val Ala Ser Arg Ser Thr Ala
245 250 255
Thr Ala Thr Ala Ala Lys Ala
260
<210> 4
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met His His His His His His Ser Lys Pro Asp Arg Val Val Leu Ile
1 5 10 15
Gly Val Ala Gly Asp Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Phe Leu Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Asp Leu Phe Gly Thr Glu Leu Met Thr Val Ile Cys Leu Asp
35 40 45
Asp Tyr His Ser Leu Asp Arg Lys Gly Arg Lys Glu Ala Gly Val Thr
50 55 60
Ala Leu Asp Pro Arg Ala Asn Asn Phe Asp Leu Met Tyr Glu Gln Val
65 70 75 80
Lys Ala Leu Lys Asn Gly Glu Thr Ile Met Lys Pro Ile Tyr Asn His
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Glu Thr Gly Leu Ile Asp Pro Pro Glu Lys Ile Glu Pro Asn Arg Ile
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Leu Leu Asp Phe Ser Val Tyr Leu Asp Ile Asp Asp Glu Val Lys Ile
130 135 140
Ala Trp Lys Ile Gln Arg Asp Met Ala Glu Arg Gly His Ser Tyr Glu
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Asp Val Leu Ala Ser Ile Glu Ala Arg Arg Pro Asp Phe Lys Ala Tyr
165 170 175
Ile Glu Pro Gln Arg Gly His Ala Asp Ile Val Ile Arg Val Met Pro
180 185 190
Thr Gln Leu Ile Pro Asn Asp Thr Glu Arg Lys Val Leu Arg Val Gln
195 200 205
Leu Ile Gln Arg Glu Gly Arg Asp Gly Phe Glu Pro Ala Tyr Leu Phe
210 215 220
Asp Glu Gly Ser Thr Ile Gln Trp Thr Pro Cys Gly Arg Lys Leu Thr
225 230 235 240
Cys Ser Tyr Pro Gly Ile Arg Leu Ala Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Tyr
245 250 255
Gly His Glu Val Ser Val Leu Glu Val Asp Gly Gln Phe Glu Asn Leu
260 265 270
Glu Glu Met Ile Tyr Val Glu Gly His Leu Ser Lys Thr Asp Thr Gln
275 280 285
Tyr Tyr Gly Glu Leu Thr His Leu Leu Leu Gln His Lys Asp Tyr Pro
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Gly Ser Asn Asn Gly Thr Gly Leu Phe Gln Val Leu Thr Gly Leu Lys
305 310 315 320
Met Arg Ala Ala Tyr Glu Arg Leu Thr Ser Gln Ala Ala Pro Val Ala
325 330 335
Ala Ser Val
<210> 5
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asp Ile Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asn Arg Lys Trp Ala Glu Glu
1 5 10 15
Arg Glu Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Phe His Ile Leu Ser Glu Val Gln
20 25 30
Ser Pro Lys Phe Leu Trp Ile Gly Cys Ser Asp Ser Arg Val Pro Ala
35 40 45
Asn Glu Ile Val Gly Met Gln Pro Gly Glu Leu Phe Val His Arg Asn
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Gly Pro Ile Asp Asn Trp Leu Ser His Ile Lys Asp Ile Ala Arg Ile
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Phe Ala Ala Glu Leu Glu Asp Leu Pro Asp Glu Glu Ser Arg Val Asp
130 135 140
Arg Leu Cys Glu Leu Asn Ala Met Ala Gln Val Met Asn Val Ala Arg
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Thr Ser Met Val Gln Ala Ala Trp Arg Arg Gly Gln Pro Leu Ala Ile
165 170 175
His Ala Trp Cys Tyr Gly Leu Lys Thr Gly Leu Val Asn Asp Leu Gly
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Arg Thr Leu Thr Arg Ile Ala Asp Leu Pro Glu Pro Tyr Arg Leu Ile
195 200 205
Phe Pro Asp Gln Val
210
<210> 6
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met His His His His His His Asp Ile Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asn
1 5 10 15
Arg Lys Trp Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Phe His
20 25 30
Ile Leu Ser Glu Val Gln Ser Pro Lys Phe Leu Trp Ile Gly Cys Ser
35 40 45
Asp Ser Arg Val Pro Ala Asn Glu Ile Val Gly Met Gln Pro Gly Glu
50 55 60
Leu Phe Val His Arg Asn Ile Ala Asn Val Val Pro His Ala Asp Ala
65 70 75 80
Asn Cys His Ala Val Leu Glu Tyr Ala Ile Asp Val Leu Lys Val Glu
85 90 95
His Ile Met Val Val Gly His Tyr Gly Cys Gly Gly Val Arg Ala Ala
100 105 110
Leu Asn Arg Leu Ala Met Gly Pro Ile Asp Asn Trp Leu Ser His Ile
115 120 125
Lys Asp Ile Ala Arg Ile Phe Ala Ala Glu Leu Glu Asp Leu Pro Asp
130 135 140
Glu Glu Ser Arg Val Asp Arg Leu Cys Glu Leu Asn Ala Met Ala Gln
145 150 155 160
Val Met Asn Val Ala Arg Thr Ser Met Val Gln Ala Ala Trp Arg Arg
165 170 175
Gly Gln Pro Leu Ala Ile His Ala Trp Cys Tyr Gly Leu Lys Thr Gly
180 185 190
Leu Val Asn Asp Leu Gly Arg Thr Leu Thr Arg Ile Ala Asp Leu Pro
195 200 205
Glu Pro Tyr Arg Leu Ile Phe Pro Asp Gln Val
210 215

Claims (7)

1.一种具有自养能力的底盘细胞，其特征在于，所述底盘细胞表达固碳途径，所述底盘细胞由能够表达所述固碳途径的需钠弧菌经基本培养基进化得到，所述底盘细胞能够在所述基本培养基中生长；
其中，所述固碳途径的酶包括1.5-二磷酸核酮糖羧化酶，磷酸核酮糖激酶，酸酐水解酶，所述1.5-二磷酸核酮糖羧化酶为含有氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白；所述磷酸核酮糖激酶为含有如SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白；所述酸酐水解酶为含有如SEQID No.5及SEQ ID No.6所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白；
所述基本培养基由如下组分构成：1 g/L-10 g/L硫酸铵、15 g/L-30 g/L氯化钠、1 g/L-2 g/L磷酸二氢钾、1 g/L-2 g/L磷酸氢二钾、0.1 g/L-0.25 g/L硫酸镁、0.01 g/L-0.05g/L氯化钙、5 mg/L-16.4 mg/L七水硫酸亚铁、5 mg/L-20 mg/L 一水硫酸锰、0.1 mg/L-0.3mg/L无水硫酸铜、1 mg/L-5 mg/L七水硫酸锌、0.01 mg/L-0.05 mg/L六水氯化镍。
2.一种具有自养能力的底盘细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将固碳途径的酶基因的载体导入宿主细胞中，所述宿主细胞为需钠弧菌，所述固碳途径的酶包括1.5-二磷酸核酮糖羧化酶，磷酸核酮糖激酶，酸酐水解酶，所述1.5-二磷酸核酮糖羧化酶为含有氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白；所述磷酸核酮糖激酶为含有如SEQID No.4所示氨基酸序列的蛋白；所述酸酐水解酶为含有如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示氨基酸序列中的至少一种的蛋白；
采用基本培养基对能够表达所述固碳途径的酶基因的所述宿主细胞进行人工进化，得到能够在所述基本培养基中生长的底盘细胞，所述基本培养基由如下组分构成：1 g/L-10g/L硫酸铵、15 g/L-30 g/L氯化钠、1 g/L-2 g/L磷酸二氢钾、1 g/L-2 g/L磷酸氢二钾、0.1g/L-0.25 g/L硫酸镁、0.01 g/L-0.05 g/L氯化钙、5 mg/L-16.4 mg/L七水硫酸亚铁、5 mg/L-20 mg/L 一水硫酸锰、0.1 mg/L-0.3 mg/L无水硫酸铜、1 mg/L-5 mg/L七水硫酸锌、0.01mg/L-0.05 mg/L六水氯化镍。
3.根据权利要求2所述的具有自养能力的底盘细胞的构建方法，其特征在于，所述采用基本培养基对能够表达所述固碳途径的酶的所述宿主细胞进行人工进化的步骤包括：
将能够表达活性所述固碳途径的酶的所述宿主细胞依次置于含有有机碳源浓度从4g/L梯度降低至0 g/L的所述基本培养基中进行培养；分离含有0 g/L所述有机碳源的所述基本培养基中生长的细胞，得到所述底盘细胞。
4.根据权利要求3所述的具有自养能力的底盘细胞的构建方法，其特征在于，所述对能够表达活性所述固碳途径的酶的所述宿主细胞进行人工进化的步骤包括：
采用含有4 g/L所述有机碳源的所述基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养；每隔24 h测定培养液的OD600，当OD600增长至不低于1时固液分离收集细胞，然后加入含有下一梯度浓度所述有机碳源的所述基本培养基将细胞悬浮至OD600为0.5后进行培养，依次重复操作，直至在含有0 g/L所述有机碳源的所述基本培养基中进行培养，OD600增长至不低于1时，分离含有0 g/L所述有机碳源的所述基本培养基中生长的细胞，得到所述底盘细胞，其中，所述有机碳源包括葡萄糖。
5.根据权利要求2所述的具有自养能力的底盘细胞的构建方法，其特征在于，所述基本培养基由如下组分构成：5 g/L硫酸铵、15 g/L氯化钠、1g/L磷酸二氢钾、1 g/L磷酸氢二钾、0.25 g/L硫酸镁、0.01 g/L氯化钙、16.4 mg/L七水硫酸亚铁、10 mg/L 一水硫酸锰、0.3mg/L无水硫酸铜、1 mg/L七水硫酸锌、0.02 mg/L六水氯化镍。
6.根据权利要求2-5任一项所述的具有自养能力的底盘细胞的构建方法，其特征在于，OD600为0.1的所述底盘细胞在基本培养基中能够持续生长至少48 h。
7.权利要求1所述的具有自养能力的底盘细胞、或者权利要求2-6任一项所述具有自养能力的底盘细胞的构建方法构建得到的底盘细胞在固定二氧化碳中的应用。
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