CN114426976A

CN114426976A - 一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法

Info

Publication number: CN114426976A
Application number: CN202111665619.0A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 范立强
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-05-03
Also published as: WO2023124062A1

Abstract

本发明涉及一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ‑PGA制备方法，具体为以谷氨酸或谷氨酸钠为底物，酶法制备聚谷氨酸(γ‑PGA)的方法，属于生物工程技术领域。该方法包括联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的表达载体或克隆载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；优选联用聚谷氨酸合成酶PgsB和多聚磷酸激酶PPK。与现有技术相比，本发明方法技术路线简洁，方法所涉及的底物来源充足，反应专一性高、速率快，底物转化效率高，体系中杂质少易于下游分离纯化，γ‑PGA生产成本与现有发酵制备法相当，具有较大的工业应用潜力。

Description

一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是在微生物体内由谷氨酸单体通过γ-酰胺键缩合形成的天然聚合物，具有极好的成膜性、成纤维性、可塑性、保湿性、可生物降解性等优点，可作为水凝胶、保湿剂、成膜剂、增稠剂、分散剂、药物控释载体、基因载体、纳米创伤敷料等应用于化妆品、食品添加剂、环境治理、生物医学等领域，具有极好的商业价值。

微生物发酵法是目前制备γ-PGA的主要方法。但发酵法制备聚γ-谷氨酸生产周期长(一般在70小时以上)，底物谷氨酸转化率低(30-50％)，且随菌种和发酵工艺不同，γ-PGA产量(10g/L-120g/L)和分子量(10kDa-1000kDa)差异很大。开发高效、低成本、高产量的γ-PGA生产工艺具有重要意义。

静息细胞(或酶)转化法以微生物整体细胞(或酶)作为反应催化剂，在保持发酵法条件温和、成本低等的基础上，比发酵法生产周期短、底物转化率高、反应体系简单、副产物较少，更易于后期产物提取与纯化，更利于工业化生产。然而迄今静息细胞(或酶)转化法制备γ-PGA相关研究几乎未见报道。

随着γ-PGA代谢途径的研究深入，人们发现γ-PGA合成至少涉及pgs基因簇中3-4个基因(pgsBCA或pgsBCAE)。将该基因簇导入宿主细胞可大大增强宿主细胞产γ-PGA的能力。发明人前期研究发现仅表达pgsB一个基因的工程菌或其酶能转化谷氨酸制备γ-PGA，反应6h底物谷氨酸转化率超过70％，但制备过程中必须添加三磷酸腺苷(ATP)。ATP是生物体内最重要的高能磷酸化合物。工业上谷胱甘肽、茶氨酸、7-氨基头孢烷酸、谷氨酰-牛磺酸等多种重要生物活性物质或生化药物的酶促合成过程都需要ATP的参与。ATP价格昂贵，大量添加必然增加产品的生产成本，ATP循环再生是酶工程发展的重要问题，也是制约工业生产是否经济的关键因素。

发明内容

本发明的目的就是提供一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，酶反应和ATP再生耦合，有效增加了γ-PGA的产量，反应速率快、转化效率高，γ-PGA生产成本与现有发酵制备法相当，为γ-PGA的合成提供了新路径。具体为：先构建过表达聚谷氨酸合成酶的pgsB基因的一号重组菌、过表达多聚磷酸激酶的ppk2基因的二号重组菌；再将两种重组菌单独诱导培养后以一定比例混合获得混合菌；利用混合菌和优化的反应体系制备γ-聚谷氨酸。

本发明中，采用pgsB表示基因，其中“pgs”为斜体，采用PgsB表示蛋白，其他蛋白或基因采用同样的表达方式。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，以谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺为底物，酶法制备γ-聚谷氨酸，

所述酶法制备γ-聚谷氨酸的方式包括：联用生物酶，或者表达所述联用生物酶的重组载体、或者表达所述联用生物酶的转基因细胞系、或者表达所述联用生物酶的基因工程菌；

所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或者，

2)在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化谷氨酸或谷氨酸钠通过γ-酰胺键聚合成γ-PGA活性的聚谷氨酸合成酶的氨基酸序列；或者谷氨酰胺转移酶的氨基酸序列；或者，

3)在SEQ ID NO.2限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化ATP再生活力的多聚磷酸激酶PPK；或者，

4)能用于催化ATP再生的乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶的氨基酸序列其中，乙酸激酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，肌酸激酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一个实施方式中，所述方法合成γ-PGA的底物为谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺；

所述方法利用的生物酶为如下(1)至(8)中任意一组或多组的生物酶：

(1)聚谷氨酸合成酶和多聚磷酸激酶PPK；

(2)聚谷氨酸合成酶和乙酸激酶；

(3)聚谷氨酸合成酶和丙酮酸激酶；

(4)聚谷氨酸合成酶和肌酸激酶；

(5)谷氨酰胺转移酶和多聚磷酸激酶PPK；

(6)谷氨酰胺转移酶和乙酸激酶；

(7)谷氨酰胺转移酶和丙酮酸激酶；

(8)谷氨酰胺转移酶和肌酸激酶。

在本发明的一个实施方式中，所述制备方法中的酶存在、利用形式包括如下(1)至(6)中任意一种：

(1)所述生物酶的任何一种组合；

(2)编码以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(3)含有以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(4)含有以下生物酶的基因的表达载体或克隆载体：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(5)含有以下生物酶的基因的转基因细胞系：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(6)含有以下生物酶的基因的基因工程菌：(聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶。

在本发明的一个实施方式中，所述联用生物酶选择为聚谷氨酸合成酶PgsB和多聚磷酸激酶PPK，其中，聚谷氨酸合成酶PgsB具有如SEQ ID No.1所示的蛋白质序列，多聚磷酸激酶PPK2具有如SEQ ID No.2所示的蛋白质序列。

在本发明的一个实施方式中，耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，具体包括以下步骤：

(a)获得过表达pgsB基因的一号重组菌，所述pgsB基因表达聚谷氨酸合成酶PgsB，该聚谷氨酸合成酶PgsB具有如SEQ ID No.1所示的蛋白质序列；

(b)获得过表达ppk2基因的二号重组菌，所述ppk2基因表达多聚磷酸激酶PPK2，该多聚磷酸激酶为ATP再生酶，该多聚磷酸激酶PPK2具有如SEQ ID No.2所示的蛋白质序列；

(c)将步骤(a)得到的一号重组菌和步骤(b)得到的二号重组菌混合，获得混菌细胞，再催化含谷氨酸和/或谷氨酸盐的底物合成γ-聚谷氨酸。基因和蛋白的名称采用大小写进行区分。

步骤(a)中，过表达pgsB基因的一号重组菌的制备步骤为：

构建表达聚谷氨酸合成酶的pgsB基因的一号重组质粒，再将一号重组质粒转化入微生物上获得一号重组菌；

或利用基因组编辑技术将表达聚谷氨酸合成酶的pgsB基因整合到微生物的基因组上获得一号重组菌。

优选地，所述pgsB基因来源于枯草杆菌属中具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或具有同源性与该序列在90％以上的氨基酸序列的pgsB基因。

步骤(a)中，将活化后的一号重组菌单独诱导培养至对数中期及以上收集得到一号菌体，具体诱导过程为：将一号重组菌置于摇床的活化培养基中活化过夜得到一号液体种子，摇床转速为200rpm，温度为37℃，活化培养基的配方是NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L；

将活化的一号液体种子移至摇瓶增殖培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm的摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4-0.8mM的异丙基硫代半乳糖苷及0.5-5mM的硫酸镁，在25℃下诱导表达14-16h，离心收集得到一号菌体。

步骤(b)中，过表达ppk2基因的二号重组菌的制备步骤为：

构建表达多聚磷酸激酶的ppk2基因的二号重组质粒，再将二号重组质粒转化入微生物上获得二号重组菌；

或利用基因组编辑技术将表达多聚磷酸激酶的ppk2基因整合到微生物的基因组上获得二号重组菌。

优选地，所述ppk2基因来源于红假单胞菌属或异常球菌属中具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或具有同源性与该序列在90％以上的氨基酸序列的ppk2基因。

步骤(b)中，将活化后的二号重组菌单独诱导培养至对数中期及以上收集菌体得到二号菌体，具体诱导过程为：将二号重组菌置于摇床的活化培养基中活化过夜得到二号液体种子，摇床转速为200rpm，温度为37℃，活化培养基的配方是NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L；

将活化的二号液体种子移至摇瓶增殖培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm的摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4-0.8mM的异丙基硫代半乳糖苷及0.5-5mM的硫酸镁，在25℃下诱导表达14-16h，离心收集得到二号菌体。

步骤(a)和步骤(b)中，微生物为大肠杆菌。

步骤(c)中，一号重组菌和二号重组菌可以是先混合后再培养一段时间，也可以先培养至所需的程度再混合。

步骤(c)中，一号重组菌和二号重组菌的重量比为8：1～2：1，优选为3：1～2：1。

步骤(c)中，混菌细胞在16-37℃，pH为6-8的条件下，孵育3-12h直接催化合成γ-聚谷氨酸。

步骤(c)中，所述催化合成的底物为谷氨酸和/或谷氨酸盐、镁离子(镁离子是两种酶的辅因子)、单磷酸腺苷和多聚磷酸盐的混合物。在二号重组菌、单磷酸腺苷和多聚磷酸盐的配合可使单磷酸腺苷转化成三磷酸腺苷，三磷酸腺苷又为一号重组菌产γ-PGA提供能量并转化成单磷酸腺苷，使整个混合菌体系能够在谷氨酸或谷氨酸钠持续加入的情况下持续产γ-PGA，并且该种体系对谷氨酸/谷氨酸钠的催化转化率远远大于含有一号重组菌和ATP的体系对谷氨酸/谷氨酸钠的催化转化率。

优选地，镁离子、单磷酸腺苷、多聚磷酸盐的浓度比为1:1:0.5。这些底物溶解在磷酸盐溶液中，以便进行催化反应。

优选地，所述多聚磷酸盐包括六偏磷酸盐。

优选地，所述镁离子由七水合硫酸镁来提供。

本方法将目的基因整合到大肠杆菌等宿主细胞的基因组上，解决了重组菌培养过程中质粒易丢失的问题，并节省了培养菌体过程中抗生素的使用以及含抗生素废水的后续处理。本发明利用优化后的体系，在25℃下反应12h，50g/L谷氨酸钠转化获得44.25g/Lγ-PGA，谷氨酸钠的转化率为88.5％，时空转化速率最高达到4.34g/L/h。该时空转化速率(通过产量和发酵时间相除得到)较单菌(酶)静息转化法和目前所报道的枯草杆菌发酵法制备γ-PGA提高了2.2-2.5倍。γ-PGA生产成本与现有发酵制备法相当。总之，本发明为低成本、快速、高效制备γ-PGA提供了一条新路径。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)酶制备方法节能、环保。

2)多酶体系协同制备γ-聚谷氨酸，得到产物γ-聚谷氨酸同时原位再生ATP，ATP的消耗与再生同时进行，使反应体系中仅初期需要投入浓度极低的ATP，避免了大量ATP的投入。

3)优化了γ-聚谷氨酸生产的反应条件，反应速度快，底物转化率高。

4)最大程度节约了原料、设备以及合成反应过程的成本。

附图说明

图1为pgsB基因的PCR扩增；

图2为重组质粒pET-22b-pgsB的酶切鉴定图；

图3为SDS-PAGE分析重组PgsB的表达，方框内粗的条带为目标重组蛋白所在位置。

图4为SDS-PAGE分析重组PPK2的表达，方框内粗的条带为目标重组蛋白所在位置；

图5为单重组菌与耦合双重组菌产γ-PGA能力比较；

图6为PgsB与PPK2的重量比对谷氨酸转化率的影响；

图7为实施例11中耦合双重组菌放大体系并补料下产γ-PGA情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明(一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法)进行详细说明。

一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：

(a)构建表达聚谷氨酸合成酶的pgsB基因的一号重组质粒，再将一号重组质粒转化入微生物上获得过表达pgsB基因的一号重组菌，或利用基因组编辑技术将表达聚谷氨酸合成酶的pgsB基因整合到微生物的基因组上获得过表达pgsB基因的一号重组菌，之后将活化后的一号重组菌单独诱导培养至对数中期及以上收集得到一号菌体，具体诱导过程为：将一号重组菌置于摇床的活化培养基中活化过夜得到一号液体种子，摇床转速为200rpm，温度为37℃，活化培养基的配方是NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L，然后将活化的一号液体种子移至摇瓶增殖培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm的摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4-0.8mM的异丙基硫代半乳糖苷及0.5-5mM的硫酸镁，在25℃下诱导表达14-16h，离心收集得到一号菌体。所述pgsB基因表达聚谷氨酸合成酶，该聚谷氨酸合成酶PgsB具有如SEQ ID No.1所示的蛋白质序列，其中，pgsB基因来源于枯草杆菌属中具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或具有同源性与该序列在90％以上的氨基酸序列的pgsB基因。

(b)构建表达多聚磷酸激酶的ppk2基因的二号重组质粒，再将二号重组质粒转化入微生物上获得过表达ppk2基因的二号重组菌，或利用基因组编辑技术将表达多聚磷酸激酶的ppk2基因整合到微生物的基因组上获得过表达ppk2基因的二号重组菌，之后将活化后的二号重组菌单独诱导培养至对数中期及以上收集菌体得到二号菌体，具体诱导过程为：将二号重组菌置于摇床的活化培养基中活化过夜得到二号液体种子，摇床转速为200rpm，温度为37℃，活化培养基的配方是NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L，然后将活化的二号液体种子移至摇瓶增殖培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm的摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.4-0.8mM的异丙基硫代半乳糖苷及0.5-5mM的硫酸镁，在25℃下诱导表达14-16h，离心收集得到二号菌体。所述ppk2基因表达多聚磷酸激酶PPK2，该多聚磷酸激酶PPK2具有如SEQ ID No.2所示的蛋白质序列，其中，ppk2基因来源于红假单胞菌属或异常球菌属中具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或具有同源性与该序列在90％以上的氨基酸序列的ppk2基因。

(c)将步骤(a)得到的一号重组菌和步骤(b)得到的二号重组菌以8：1～2：1的重量比混合，获得混菌细胞，再在16-37℃，pH为6-8的条件下催化含谷氨酸和/或谷氨酸盐的底物合成γ-聚谷氨酸，该底物为谷氨酸和/或谷氨酸盐、镁离子、单磷酸腺苷和多聚磷酸盐的混合物。

实施例1：重组菌株的建立

根据NCBI数据库中Bacillus licheniformis ATCC 14580,complete genome(NC_006270.3)，用SnapGene设计引物pgsB-F和pgsB-R(如表1所示)，以本实验室筛选的非谷氨酸依赖性枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，PCR扩增pgsB基因(如图1所示，序列见SEQ IDNo 3)，M泳道为DNA marker，各条带的大小自下而上依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp，1泳道为pgsB PCR产物。用限制性内切酶BamH1和Nco1分别对目的基因pgsB和质粒载体pET-22b进行双酶切，电泳分离，割胶回收，获得含有相同粘性末端的基因片段和线性化质粒片段，将两者用T4-DNA连接酶连接，得到一号重组质粒，将该质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞(为大肠杆菌)中，筛选阳性单克隆(如图2所示)，获得重组菌株pET-22b-pgsB-BL21，即一号重组菌，置于50％甘油中保存，图2中M泳道为DNAmarker，各条带的大小自下而上依次为100、250、500、750、1000、1500、2000bp，1泳道、2泳道、3泳道和4泳道为挑取四个单克隆的质粒的BamH1和Nco1双酶切结果，由图可见，3泳道和4泳道的单克隆为阳性克隆。

根据NCBI数据库中Deinococcus proteolyticus polyphosphate kinase的蛋白序列(WP_013615652，SEQ ID No 2)，按照大肠杆菌密码子偏爱性合成其ppk2基因，设计引物PPK2-F和PPK2-R(如表1所示)，以合成的ppk2基因为模板(序列见SEQ ID No 4)，扩增Deipr-ppk2基因，用切、接、转、增、检的方式构建重组质粒pET-Duet-Deipr-ppk2，即二号重组质粒，将该质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞(为大肠杆菌)中，获得重组菌株pETDuet-Deipr-ppk2-BL21，即二号重组菌，置于50％甘油中保存。

实施例2：重组游离细胞的制备

将50％甘油保存的大肠菌株pET-22b-pgsB-BL21和pET-Duet-Deipr-ppk2-BL21分别按照1％体积比(体积比为加入的菌液体积占新培养液的体积比)的接种量放置于摇床的活化培养基中活化过夜，摇床转速为200rpm，温度为37℃，活化培养基的配方是NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L。

将上述活化的种子(即上文在摇床中活化培养后得到的)按照2％体积比的接种量移至摇瓶增殖培养基(该增殖培养基的配方是K₂HPO₄ 9.4g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L，酵母提取物23.6g/L，胰蛋白胨11.8g/L，甘油4mL/L)，在37℃，200rpm的摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.6左右时，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷及0.5mM的硫酸镁，在25℃下诱导表达14h，离心收集菌体，包括pET-22b-pgsB-BL21重组游离细胞和pET-Duet-Deipr-ppk2-BL21重组游离细胞，采用SDS-PAGE分析(图3为SDS-PAGE分析重组PgsB的表达，图4为SDS-PAGE分析重组PPK2的表达)，之后在-20℃下保存，图3与图4中(两个图中方框指出的是目标蛋白表达位置)，M泳道为蛋白marker，1泳道为诱导前，2泳道为诱导后，3泳道为诱导后上清，4泳道为诱导后沉淀；蛋白marker泳道中各标准蛋白条带的大小自小而大依次为14.4、18.4、25、35、45、66.2、116kDa。

实施例3：一号重组菌静息细胞制备γ-PGA实例1

采用实施例1所述方法依次构建一号重组质粒和一号重组菌；采用实施例2所述方法培养、诱导表达获得一号重组菌的静息细胞。

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液重悬一号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞单独加入到含有1.7g/L谷氨酸，1mM ATP，1mM MgSO₄的0.1mol/L pH为8的磷酸盐反应液中(磷酸盐起缓冲作用)；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图5所示(转化率公式为转化率＝(初始谷氨酸/谷氨酸盐的浓度-某个时间点谷氨酸/谷氨酸盐的浓度)/初始谷氨酸/谷氨酸盐的浓度，某个时间点谷氨酸/谷氨酸盐的浓度可由γ-PGA的产量计算得到)。可见，反应前2h內，随时间的延长，γ-PGA含量和谷氨酸转化率逐渐上升；2h后，谷氨酸转化率在30％左右趋于稳定状态，几乎不再增加。说明单独一号重组菌在ATP的协同作用下，可以转化谷氨酸制备γ-PGA。

实施例4：一号重组菌静息细胞制备γ-PGA实例2

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液重悬一号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞单独加入到含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄的0.1mol/L的pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图5所示。可见，整个测定的反应时间范围内，几乎没有γ-PGA产生或谷氨酸转化。说明体系中有一号重组菌而缺乏ATP时，虽有PPK2再生用底物AMP，而没有ATP再生酶PPK2情况下，一号重组菌不能合成γ-PGA。

实施例5：一号重组菌静息细胞制备γ-PGA实例3

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液重悬一号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞单独加入到含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄，0.5mM多聚磷酸盐(polyP)的0.1mol/L的pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图5所示。可见，整个测定的反应时间范围内，几乎没有γ-PGA产生或谷氨酸转化。说明体系中有一号重组菌而缺乏ATP时，虽有PPK2再生用底物AMP和多聚磷酸盐，而没有ATP再生酶PPK2情况下，一号重组菌不能合成γ-PGA。

实施例6一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例1

采用实施例1所述方法依次构建一号重组质粒和二号重组质粒，一号重组菌和二号重组菌；采用实施例2所述方法培养、诱导表达获得一号重组菌和二号重组菌的静息细胞。

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按3：1的质量比加入含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄的0.1mol/L pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图5所示。可见，整个测定的反应时间范围内，几乎没有γ-PGA产生或谷氨酸转化(即图5中实施例4、5、6的曲线基本重合)。说明有重组PgsB和PPK2而缺乏ATP时，仅有PPK2再生用底物AMP和多聚磷酸盐，因无法再生ATP，重组静息细胞不能合成γ-PGA。

实施例7：一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例2

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按3：1的质量比加入到含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄，0.5mM多聚磷酸盐(polyP)的0.1mol/L的pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图5所示。可见，整个测定的反应时间范围内，随反应时间的延长，γ-PGA产生量或谷氨酸转化率前3h先快速上升，接着趋于平缓，随后几乎不再变化，最终谷氨酸转化率达30％。说明体系中有重组PgsB和PPK2而缺乏ATP时，PPK2能利用底物AMP和多聚磷酸盐再生出ATP，恢复一号重组菌产γ-PGA能力。由图5还可以看出，与在ATP存在时单独一号重组菌的产γ-PGA能力相比，混合菌产γ-PGA能力前3.5h不如一号重组菌，3.5h后逐渐超过前者，8h底物谷氨酸转化率(51％)比前者(30％)增加了70％。

实施例8：一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例3

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按8：1的质量比加入到pH为8且含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄，0.5mM polyP的0.1mol/L的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图6所示。可见，整个测定的反应时间范围内，随反应时间的延长，γ-PGA产生量或谷氨酸转化率前4h先快速上升，接着趋于平缓，随后几乎不再变化，最终谷氨酸转化率达16％。与一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞质量比为3：1的情况相比，后者(即实施例7)产γ-PGA能力较强，说明重组PgsB和PPK2细胞比例会影响混合细胞产γ-PGA水平。

实施例9：一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例4

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按4：1的质量比加入到含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄，0.5mM polyP的0.1mol/L的pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图6所示。可见，整个测定的反应时间范围内，随反应时间的延长，γ-PGA产生量或谷氨酸转化率前4h先快速上升，接着趋于平缓，随后几乎不再变化，最终谷氨酸转化率达37％。该情况下，混合菌产γ-PGA能力优于一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞质量比为8：1的情况，但低于一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞质量比为3：1的情况，说明重组PgsB和PPK2细胞比例会影响混合细胞产γ-PGA水平。

实施例10：一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例5

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按2：1的质量比加入到含有1.7g/L谷氨酸钠，1mM AMP，1mM MgSO₄，0.5mM polyP的0.1mol/L的pH为8的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应8h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量，转化率如图6所示。可见，整个测定的反应时间范围内，随反应时间的延长，γ-PGA产生量或谷氨酸转化率前4h先快速上升，接着趋于平缓，随后几乎不再变化，最终谷氨酸转化率达65.4％。该情况下混合菌产γ-PGA能力优于一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞质量比为8：1～3：1的情况，说明重组PgsB和PPK2细胞比例会影响混合细胞产γ-PGA水平，且重组PPK2的量在转化谷氨酸制备γ-PGA过程占有主导地位。

实施例11：一号重组菌与二号重组菌的混合静息细胞制备γ-PGA实例6

用浓度为0.1mol/L、pH为8的磷酸盐缓冲液分别重悬一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞；将一号重组菌的静息细胞和二号重组菌的静息细胞按2：1的质量比加入到pH为8且含有30g/L谷氨酸钠，30mM AMP，30mM MgSO₄，15mM polyP的0.1mol/L的磷酸盐反应液中；在25℃、200rpm的摇床中恒温振荡反应12h，每隔1-2h取一次样；12000rpm的转速和4℃的温度下离心取上清，获得含有γ-PGA的反应液；采用CTAB法测定γ-PGA的产量。因反应4h和8h时均出现产物γ-PGA生成量趋平现象，为验证反应趋平是底物耗尽引起的，反应6h时补加了15g/L的谷氨酸钠和10mM polyP，反应到10h时再次添加5g/L谷氨酸钠和5mM polyP。γ-PGA产生量随时间情况如图7所示。可见，底物补加后，γ-PGA产生量进一步升高。反应的前6h，30g/L底物谷氨酸钠被高效转化生成26.02g/L产物γ-PGA，谷氨酸转化率为86.7％，转化速率4.34g/L/h；整个12h转化过程，50g/L谷氨酸钠转化生成44.25g/L产物γ-PGA，谷氨酸的转化率达88.5％，转化速率为3.69g/L/h。

实施例12：采用基因编辑技术构建一号重组菌

本实施例采用CRISPR基因编辑技术实现pgsB基因敲入。下面详细阐述基因编辑的步骤。

1)根据目的基因pgsB序列的插入位置及周围的序列特点，设计并制备gRNA，将gRNA以及Donor序列克隆至基因编辑载体Donor质粒，并通过测序验证确保构建的载体中gRNA以及Donor序列均与目标序列一致；

2)制备大肠杆菌BL21(DE3)电转感受态，Cas9质粒转化至BL21(DE3)感受态中，挑单克隆制备BL21(DE3)Cas9电转感受态，Donor质粒转化至BL21(DE3)Cas9电转感受态，加入阿拉伯糖诱导后涂板，进行基因编辑菌株筛选实验；

3)PCR扩增验证编辑后的BL21(DE3)单克隆，pgsB基因敲入成功的条带大小1193bp，未敲入成功无条带，琼脂糖凝胶电泳结果显示，成功筛选到pgsB基因敲入的单克隆pETDuet-1-pgsB-BL21(DE3)，即一号重组菌，置于50％甘油中保存。

实施例13：采用基因编辑技术构建二号重组菌

本实施例采用CRISPER基因编辑技术实现ppk2基因敲入。下面详细阐述基因编辑的步骤。

1)根据目的基因ppk2序列的插入位置及周围的序列特点，设计并制备gRNA，将gRNA以及Donor序列克隆至基因编辑载体Donor质粒，并通过测序验证确保构建的载体中gRNA以及Donor序列均与目标序列一致；

3)PCR扩增验证编辑后的BL21(DE3)单克隆，ppk2基因敲入成功的条带大小858bp，未敲入成功无条带，琼脂糖凝胶电泳结果显示，成功筛选到ppk2基因敲入的单克隆pETDuet-1-Deipr-ppk2-BL21(DE3)，即二号重组菌，置于50％甘油中保存。

表1引物名称及序列

SEQ ID No.1PgsB蛋白序列

MWLLIIACAVILVIGILEKRRHQKNIDALPVRVNINGIRGKSTVTRLTTGILIEAGYKTVGKTTGTDARMIYWDTPEEKPIKRKPQGPNIGEQKEVMRETVERGANAIVSECMAVNPDYQIIFQEELLQANIGVIVNVLEDHMDVMGPTLDEIAEAFTATIPYNGHLVITDSEYTEFFKQKAKERNTKVIIADNSKITDEYLRKFEYMVFPDNASLALGVAQALGIDEETAFKGMLNAPPDPGAMRILPLISPSEPGHFVNGFAANDASSTLNIWKRVKEIGYPTDDPIIIMNCRADRVDRTQQFANDVLPYIEASELILIGETTEPIVKAYEEGKIPADKLHDLEYKSTDEIMELLKKRMHNRVIYGVGNIHGAAEPLIEKIHEYKVKQLVS

SEQ ID No.2PPK2蛋白序列：

MNSKASQQLQVPPGQKVRLADYSTDTFEGSAALDKEQVKQATEQLQQRLSELQEKLYAEGKQSLLIILQARDGGGKDSTVSRVMGAFNPNGVHVANFKAPTDLELQHDFLWRIHQQVPSHGMIAVFNRSHYEDVLVTRVHGLIDDARAQQNLEHIVNFEKLLSDAGTRIVKFYLHLSPEEQKARMEDRLNDPAKHWKFNPSDLKDRALWHEYTAAYEDALATSRSYAPWYIIPADRKWLRDYLISEILVQTLEEMNPQFPTAHFEAAYYLIEDIPSR

SEQ ID No.3pgsB的核酸序列

ATGTGGTTACTCATTATAGCCTGTGCTGTCATACTGGTCATCGGAATATTAGAAAAACGACGACATCAGAAAAACATTGATGCCCTCCCTGTTCGGGTGAATATTAACGGCATCCGCGGAAAATCGACTGTGACAAGGCTGACAACCGGAATATTAATAGAAGCCGGTTACAAGACTGTTGGAAAAACAACAGGAACAGATGCAAGAATGATTTACTGGGACACACCGGAGGAAAAGCCGATTAAACGGAAACCTCAGGGGCCGAATATCGGAGAGCAAAAAGAAGTCATGAGAGAAACAGTAGAAAGAGGGGCTAACGCGATTGTCAGTGAATGCATGGCTGTTAACCCAGATTATCAAATCATCTTTCAGGAAGAACTTCTGCAGGCCAATATCGGCGTCATTGTGAATGTTTTAGAAGACCATATGGATGTCATGGGGCCGACGCTTGATGAAATTGCAGAAGCGTTTACCGCTACAATTCCTTATAATGGCCATCTTGTCATTACAGATAGTGAATATACCGAGTTCTTTAAACAAAAAGCAAAAGAACGAAACACAAAAGTCATCATTGCTGATAACTCAAAAATTACAGATGAGTATTTACGTAAATTTGAATACATGGTATTCCCTGATAACGCTTCTCTGGCGCTGGGTGTGGCTCAAGCACTCGGCATTGACGAAGAAACAGCATTTAAGGGAATGCTGAATGCGCCGCCAGATCCGGGAGCAATGAGAATTCTTCCGCTGATCAGTCCGAGCGAGCCTGGGCACTTTGTTAATGGGTTTGCCGCAAACGACGCTTCTTCTACTTTGAATATATGGAAACGTGTAAAAGAAATCGGTTACCCGACCGATGATCCGATCATCATCATGAACTGCCGCGCAGACCGTGTCGATCGGACACAGCAATTCGCAAATGACGTATTGCCTTATATTGAAGCAAGTGAACTGATCTTAATCGGTGAAACAACAGAACCGATCGTAAAAGCCTATGAAGAAGGCAAAATTCCTGCAGACAAACTGCATGATCTAGAGTATAAGTCAACAGATGAAATTATGGAATTGTTAAAGAAAAGAATGCACAACCGTGTCATATATGGCGTCGGCAATATTCATGGTGCCGCAGAGCCTTTAATTGAAAAAATCCACGAATACAAGGTTAAGCAGCTCGTAAGC

SEQ ID No.4ppk2的核酸序列

ATGAACAGCAAAGCATCTCAACAACTGCAAGTTCCGCCGGGCCAAAAAGTACGCCTGGCAGACTACTCCACCGACACCTTTGAAGGCTCCGCAGCTCTGGATAAGGAGCAGGTGAAACAGGCGACGGAACAGCTGCAACAACGTCTGTCTGAGCTGCAAGAAAAACTGTACGCAGAAGGTAAACAGTCTCTGCTGATTATTCTGCAAGCTCGTGATGGCGGTGGTAAAGATTCCACTGTGAGCCGCGTGATGGGCGCGTTCAATCCGAACGGTGTGCACGTGGCAAATTTTAAAGCACCGACCGACCTGGAACTGCAACACGACTTTCTGTGGCGTATCCACCAGCAGGTGCCGTCTCACGGTATGATTGCGGTGTTCAATCGTAGCCACTACGAAGATGTGCTGGTTACCCGTGTTCACGGTCTGATTGACGACGCACGTGCGCAGCAGAACCTGGAACACATTGTTAACTTCGAAAAACTGCTGAGCGACGCTGGTACTCGCATTGTAAAATTCTATCTGCACCTGAGCCCAGAGGAACAGAAAGCTCGTATGGAGGACCGTCTGAACGACCCGGCGAAACACTGGAAGTTCAATCCGTCTGACCTGAAAGACCGTGCACTGTGGCACGAATATACCGCAGCTTACGAAGATGCACTGGCAACCTCTCGTTCTTACGCCCCGTGGTACATCATTCCGGCGGACCGTAAATGGCTGCGCGACTACCTGATTAGCGAAATCCTGGTTCAGACTCTGGAAGAAATGAACCCGCAGTTTCCAACCGCGCATTTCGAAGCTGCTTACTATCTGATTGAAGACATCCCGTCCCGT

SEQ ID No.5乙酸激酶蛋白序列

MKVLVLNAGSSSQKSCLYDLDSRGKKPNFVSPIWEATIDWTLNLGHTLLKVKSNGQEYSTYLSDHNRLESIKTMLKTMVEGETKVLEHLSDIDVVGHRVVHGGTKYSQATLINSEVKATIEKLIPLAPNHNPAHLEGIESVENILGDIPQVAVFDTAFHTNIPLYAKIYPLNHEFYKRGIQRYGFHGISHEYVSQRTSEILQQPLKNLNLVTCHLGNGCSITAVKNGQSVNTTMGFTPLEGVMMGTRCGSIDPAIVIHLMTEYGYDGEKINHILNKESGLWGMSEISSDLRTILKAKSENNPKAILAIEMYIFRLQEAIASMLPSLGSLDALVFTAGVGENSAFIREKVCQGLGFLGLKLDLEKNSQSLFNENIATADSNSKILIIPTKEDWAIASQCFQLMESKN

SEQ ID No.6肌酸激酶蛋白序列

MLLHKHLTPELKSRLERLTTRNGWTLRKTIQSGLDHGDSQMGVYAGDSESYALFSPLLHPIIRDHSGHDLSGHTSDFSLDGLPQGDLDPTGEFILSTRVRVGRNLARYAFPPAIGARDRAALEAEVVQVLSGLRGHLAGKYHPLASLSEAERLELVHHHVLFQQSDRFLDSAGVNRDWPRNRGIFHSADMRFIVWVGEEDALRIISMQPGSGLAQTYLRLQTALEQFDGQLDFAQDSRLGFLTACPTNLGTAMRASVLIRLPHLSRRPDFRARCARLGLAVRGLHGEHSEARDGIHDVSNATRLGVTERDIYEQLRTGIHALMEMESAARKRGHPKVAPGN

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Leu Leu Ile Ile Ala Cys Ala Val Ile Leu Val Ile Gly Ile

1 5 10 15

Leu Glu Lys Arg Arg His Gln Lys Asn Ile Asp Ala Leu Pro Val Arg

20 25 30

Val Asn Ile Asn Gly Ile Arg Gly Lys Ser Thr Val Thr Arg Leu Thr

35 40 45

Thr Gly Ile Leu Ile Glu Ala Gly Tyr Lys Thr Val Gly Lys Thr Thr

50 55 60

Gly Thr Asp Ala Arg Met Ile Tyr Trp Asp Thr Pro Glu Glu Lys Pro

65 70 75 80

Ile Lys Arg Lys Pro Gln Gly Pro Asn Ile Gly Glu Gln Lys Glu Val

85 90 95

Met Arg Glu Thr Val Glu Arg Gly Ala Asn Ala Ile Val Ser Glu Cys

100 105 110

Met Ala Val Asn Pro Asp Tyr Gln Ile Ile Phe Gln Glu Glu Leu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Ile Gly Val Ile Val Asn Val Leu Glu Asp His Met Asp

130 135 140

Val Met Gly Pro Thr Leu Asp Glu Ile Ala Glu Ala Phe Thr Ala Thr

145 150 155 160

Ile Pro Tyr Asn Gly His Leu Val Ile Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Glu

165 170 175

Phe Phe Lys Gln Lys Ala Lys Glu Arg Asn Thr Lys Val Ile Ile Ala

180 185 190

Asp Asn Ser Lys Ile Thr Asp Glu Tyr Leu Arg Lys Phe Glu Tyr Met

195 200 205

Val Phe Pro Asp Asn Ala Ser Leu Ala Leu Gly Val Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Ile Asp Glu Glu Thr Ala Phe Lys Gly Met Leu Asn Ala Pro Pro

225 230 235 240

Asp Pro Gly Ala Met Arg Ile Leu Pro Leu Ile Ser Pro Ser Glu Pro

245 250 255

Gly His Phe Val Asn Gly Phe Ala Ala Asn Asp Ala Ser Ser Thr Leu

260 265 270

Asn Ile Trp Lys Arg Val Lys Glu Ile Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Pro

275 280 285

Ile Ile Ile Met Asn Cys Arg Ala Asp Arg Val Asp Arg Thr Gln Gln

290 295 300

Phe Ala Asn Asp Val Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Ser Glu Leu Ile Leu

305 310 315 320

Ile Gly Glu Thr Thr Glu Pro Ile Val Lys Ala Tyr Glu Glu Gly Lys

325 330 335

Ile Pro Ala Asp Lys Leu His Asp Leu Glu Tyr Lys Ser Thr Asp Glu

340 345 350

Ile Met Glu Leu Leu Lys Lys Arg Met His Asn Arg Val Ile Tyr Gly

355 360 365

Val Gly Asn Ile His Gly Ala Ala Glu Pro Leu Ile Glu Lys Ile His

370 375 380

Glu Tyr Lys Val Lys Gln Leu Val Ser

385 390

<210> 2

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Ser Lys Ala Ser Gln Gln Leu Gln Val Pro Pro Gly Gln Lys

1 5 10 15

Val Arg Leu Ala Asp Tyr Ser Thr Asp Thr Phe Glu Gly Ser Ala Ala

20 25 30

Leu Asp Lys Glu Gln Val Lys Gln Ala Thr Glu Gln Leu Gln Gln Arg

35 40 45

Leu Ser Glu Leu Gln Glu Lys Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Gln Ser Leu

50 55 60

Leu Ile Ile Leu Gln Ala Arg Asp Gly Gly Gly Lys Asp Ser Thr Val

65 70 75 80

Ser Arg Val Met Gly Ala Phe Asn Pro Asn Gly Val His Val Ala Asn

85 90 95

Phe Lys Ala Pro Thr Asp Leu Glu Leu Gln His Asp Phe Leu Trp Arg

100 105 110

Ile His Gln Gln Val Pro Ser His Gly Met Ile Ala Val Phe Asn Arg

115 120 125

Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Thr Arg Val His Gly Leu Ile Asp

130 135 140

Asp Ala Arg Ala Gln Gln Asn Leu Glu His Ile Val Asn Phe Glu Lys

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asp Ala Gly Thr Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Leu

165 170 175

Ser Pro Glu Glu Gln Lys Ala Arg Met Glu Asp Arg Leu Asn Asp Pro

180 185 190

Ala Lys His Trp Lys Phe Asn Pro Ser Asp Leu Lys Asp Arg Ala Leu

195 200 205

Trp His Glu Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Asp Ala Leu Ala Thr Ser Arg

210 215 220

Ser Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile Ile Pro Ala Asp Arg Lys Trp Leu Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Leu Ile Ser Glu Ile Leu Val Gln Thr Leu Glu Glu Met Asn

245 250 255

Pro Gln Phe Pro Thr Ala His Phe Glu Ala Ala Tyr Tyr Leu Ile Glu

260 265 270

Asp Ile Pro Ser Arg

275

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtggttac tcattatagc ctgtgctgtc atactggtca tcggaatatt agaaaaacga 60

cgacatcaga aaaacattga tgccctccct gttcgggtga atattaacgg catccgcgga 120

aaatcgactg tgacaaggct gacaaccgga atattaatag aagccggtta caagactgtt 180

ggaaaaacaa caggaacaga tgcaagaatg atttactggg acacaccgga ggaaaagccg 240

attaaacgga aacctcaggg gccgaatatc ggagagcaaa aagaagtcat gagagaaaca 300

gtagaaagag gggctaacgc gattgtcagt gaatgcatgg ctgttaaccc agattatcaa 360

atcatctttc aggaagaact tctgcaggcc aatatcggcg tcattgtgaa tgttttagaa 420

gaccatatgg atgtcatggg gccgacgctt gatgaaattg cagaagcgtt taccgctaca 480

attccttata atggccatct tgtcattaca gatagtgaat ataccgagtt ctttaaacaa 540

aaagcaaaag aacgaaacac aaaagtcatc attgctgata actcaaaaat tacagatgag 600

tatttacgta aatttgaata catggtattc cctgataacg cttctctggc gctgggtgtg 660

gctcaagcac tcggcattga cgaagaaaca gcatttaagg gaatgctgaa tgcgccgcca 720

gatccgggag caatgagaat tcttccgctg atcagtccga gcgagcctgg gcactttgtt 780

aatgggtttg ccgcaaacga cgcttcttct actttgaata tatggaaacg tgtaaaagaa 840

atcggttacc cgaccgatga tccgatcatc atcatgaact gccgcgcaga ccgtgtcgat 900

cggacacagc aattcgcaaa tgacgtattg ccttatattg aagcaagtga actgatctta 960

atcggtgaaa caacagaacc gatcgtaaaa gcctatgaag aaggcaaaat tcctgcagac 1020

aaactgcatg atctagagta taagtcaaca gatgaaatta tggaattgtt aaagaaaaga 1080

atgcacaacc gtgtcatata tggcgtcggc aatattcatg gtgccgcaga gcctttaatt 1140

gaaaaaatcc acgaatacaa ggttaagcag ctcgtaagc 1179

<210> 4

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacagca aagcatctca acaactgcaa gttccgccgg gccaaaaagt acgcctggca 60

gactactcca ccgacacctt tgaaggctcc gcagctctgg ataaggagca ggtgaaacag 120

gcgacggaac agctgcaaca acgtctgtct gagctgcaag aaaaactgta cgcagaaggt 180

aaacagtctc tgctgattat tctgcaagct cgtgatggcg gtggtaaaga ttccactgtg 240

agccgcgtga tgggcgcgtt caatccgaac ggtgtgcacg tggcaaattt taaagcaccg 300

accgacctgg aactgcaaca cgactttctg tggcgtatcc accagcaggt gccgtctcac 360

ggtatgattg cggtgttcaa tcgtagccac tacgaagatg tgctggttac ccgtgttcac 420

ggtctgattg acgacgcacg tgcgcagcag aacctggaac acattgttaa cttcgaaaaa 480

ctgctgagcg acgctggtac tcgcattgta aaattctatc tgcacctgag cccagaggaa 540

cagaaagctc gtatggagga ccgtctgaac gacccggcga aacactggaa gttcaatccg 600

tctgacctga aagaccgtgc actgtggcac gaatataccg cagcttacga agatgcactg 660

gcaacctctc gttcttacgc cccgtggtac atcattccgg cggaccgtaa atggctgcgc 720

gactacctga ttagcgaaat cctggttcag actctggaag aaatgaaccc gcagtttcca 780

accgcgcatt tcgaagctgc ttactatctg attgaagaca tcccgtcccg t 831

<210> 5

<211> 406

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Val Leu Val Leu Asn Ala Gly Ser Ser Ser Gln Lys Ser Cys

1 5 10 15

Leu Tyr Asp Leu Asp Ser Arg Gly Lys Lys Pro Asn Phe Val Ser Pro

20 25 30

Ile Trp Glu Ala Thr Ile Asp Trp Thr Leu Asn Leu Gly His Thr Leu

35 40 45

Leu Lys Val Lys Ser Asn Gly Gln Glu Tyr Ser Thr Tyr Leu Ser Asp

50 55 60

His Asn Arg Leu Glu Ser Ile Lys Thr Met Leu Lys Thr Met Val Glu

65 70 75 80

Gly Glu Thr Lys Val Leu Glu His Leu Ser Asp Ile Asp Val Val Gly

85 90 95

His Arg Val Val His Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Gln Ala Thr Leu Ile

100 105 110

Asn Ser Glu Val Lys Ala Thr Ile Glu Lys Leu Ile Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Asn His Asn Pro Ala His Leu Glu Gly Ile Glu Ser Val Glu Asn Ile

130 135 140

Leu Gly Asp Ile Pro Gln Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Thr

145 150 155 160

Asn Ile Pro Leu Tyr Ala Lys Ile Tyr Pro Leu Asn His Glu Phe Tyr

165 170 175

Lys Arg Gly Ile Gln Arg Tyr Gly Phe His Gly Ile Ser His Glu Tyr

180 185 190

Val Ser Gln Arg Thr Ser Glu Ile Leu Gln Gln Pro Leu Lys Asn Leu

195 200 205

Asn Leu Val Thr Cys His Leu Gly Asn Gly Cys Ser Ile Thr Ala Val

210 215 220

Lys Asn Gly Gln Ser Val Asn Thr Thr Met Gly Phe Thr Pro Leu Glu

225 230 235 240

Gly Val Met Met Gly Thr Arg Cys Gly Ser Ile Asp Pro Ala Ile Val

245 250 255

Ile His Leu Met Thr Glu Tyr Gly Tyr Asp Gly Glu Lys Ile Asn His

260 265 270

Ile Leu Asn Lys Glu Ser Gly Leu Trp Gly Met Ser Glu Ile Ser Ser

275 280 285

Asp Leu Arg Thr Ile Leu Lys Ala Lys Ser Glu Asn Asn Pro Lys Ala

290 295 300

Ile Leu Ala Ile Glu Met Tyr Ile Phe Arg Leu Gln Glu Ala Ile Ala

305 310 315 320

Ser Met Leu Pro Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ala Leu Val Phe Thr Ala

325 330 335

Gly Val Gly Glu Asn Ser Ala Phe Ile Arg Glu Lys Val Cys Gln Gly

340 345 350

Leu Gly Phe Leu Gly Leu Lys Leu Asp Leu Glu Lys Asn Ser Gln Ser

355 360 365

Leu Phe Asn Glu Asn Ile Ala Thr Ala Asp Ser Asn Ser Lys Ile Leu

370 375 380

Ile Ile Pro Thr Lys Glu Asp Trp Ala Ile Ala Ser Gln Cys Phe Gln

385 390 395 400

Leu Met Glu Ser Lys Asn

405

<210> 6

<211> 341

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu His Lys His Leu Thr Pro Glu Leu Lys Ser Arg Leu Glu

1 5 10 15

Arg Leu Thr Thr Arg Asn Gly Trp Thr Leu Arg Lys Thr Ile Gln Ser

20 25 30

Gly Leu Asp His Gly Asp Ser Gln Met Gly Val Tyr Ala Gly Asp Ser

35 40 45

Glu Ser Tyr Ala Leu Phe Ser Pro Leu Leu His Pro Ile Ile Arg Asp

50 55 60

His Ser Gly His Asp Leu Ser Gly His Thr Ser Asp Phe Ser Leu Asp

65 70 75 80

Gly Leu Pro Gln Gly Asp Leu Asp Pro Thr Gly Glu Phe Ile Leu Ser

85 90 95

Thr Arg Val Arg Val Gly Arg Asn Leu Ala Arg Tyr Ala Phe Pro Pro

100 105 110

Ala Ile Gly Ala Arg Asp Arg Ala Ala Leu Glu Ala Glu Val Val Gln

115 120 125

Val Leu Ser Gly Leu Arg Gly His Leu Ala Gly Lys Tyr His Pro Leu

130 135 140

Ala Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Leu Glu Leu Val His His His Val

145 150 155 160

Leu Phe Gln Gln Ser Asp Arg Phe Leu Asp Ser Ala Gly Val Asn Arg

165 170 175

Asp Trp Pro Arg Asn Arg Gly Ile Phe His Ser Ala Asp Met Arg Phe

180 185 190

Ile Val Trp Val Gly Glu Glu Asp Ala Leu Arg Ile Ile Ser Met Gln

195 200 205

Pro Gly Ser Gly Leu Ala Gln Thr Tyr Leu Arg Leu Gln Thr Ala Leu

210 215 220

Glu Gln Phe Asp Gly Gln Leu Asp Phe Ala Gln Asp Ser Arg Leu Gly

225 230 235 240

Phe Leu Thr Ala Cys Pro Thr Asn Leu Gly Thr Ala Met Arg Ala Ser

245 250 255

Val Leu Ile Arg Leu Pro His Leu Ser Arg Arg Pro Asp Phe Arg Ala

260 265 270

Arg Cys Ala Arg Leu Gly Leu Ala Val Arg Gly Leu His Gly Glu His

275 280 285

Ser Glu Ala Arg Asp Gly Ile His Asp Val Ser Asn Ala Thr Arg Leu

290 295 300

Gly Val Thr Glu Arg Asp Ile Tyr Glu Gln Leu Arg Thr Gly Ile His

305 310 315 320

Ala Leu Met Glu Met Glu Ser Ala Ala Arg Lys Arg Gly His Pro Lys

325 330 335

Val Ala Pro Gly Asn

340

Claims

1.一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，

以谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺为底物，酶法制备γ-聚谷氨酸，

所述联用生物酶的氨基酸序列含有：

1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或者，

4)能用于催化ATP再生的乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶的氨基酸序列，其中，乙酸激酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，肌酸激酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，所述方法合成γ-PGA的底物为谷氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺；

(1)聚谷氨酸合成酶和多聚磷酸激酶PPK；

(2)聚谷氨酸合成酶和乙酸激酶；

(3)聚谷氨酸合成酶和丙酮酸激酶；

(4)聚谷氨酸合成酶和肌酸激酶；

(5)谷氨酰胺转移酶和多聚磷酸激酶PPK；

(6)谷氨酰胺转移酶和乙酸激酶；

(7)谷氨酰胺转移酶和丙酮酸激酶；

(8)谷氨酰胺转移酶和肌酸激酶。

3.根据权利要求1或2所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，所述制备方法中的酶存在、利用形式包括如下(1)至(6)中任意一种：

(1)权利要求2中所述生物酶的任何一种组合；

(2)编码权利要求2中以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(3)含有权利要求2中以下生物酶的基因：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(4)含有权利要求2中以下生物酶的基因的表达载体或克隆载体：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(5)含有权利要求2中以下生物酶的基因的转基因细胞系：聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶；

(6)含有权利要求2中以下生物酶的基因的基因工程菌：(聚谷氨酸合成酶、多聚磷酸激酶、乙酸激酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶。

4.根据权利要求1所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，所述联用生物酶选择为聚谷氨酸合成酶PgsB和多聚磷酸激酶PPK，其中，聚谷氨酸合成酶PgsB具有如SEQ ID No.1所示的蛋白质序列，多聚磷酸激酶PPK2具有如SEQ IDNo.2所示的蛋白质序列。

5.根据权利要求1所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

(a)获得过表达pgsB基因的一号重组菌，所述pgsB基因表达聚谷氨酸合成酶；

(b)获得过表达ppk2基因的二号重组菌，所述ppk2基因表达多聚磷酸激酶；

(c)将步骤(a)得到的一号重组菌和步骤(b)得到的二号重组菌混合，获得混菌细胞，再催化含谷氨酸和/或谷氨酸盐的底物合成γ-聚谷氨酸。

6.根据权利要求5所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述聚谷氨酸合成酶的基因pgsB来源于枯草杆菌属，其氨基酸序列为：

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或，

在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化谷氨酸或谷氨酸钠通过γ-酰胺键聚合成γ-PGA活性的聚谷氨酸合成酶的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，步骤(b)中编码聚磷酸激酶的ppk2基因来源于红假单胞菌属或异常球菌属；

其氨基酸序列为：

如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或，

在SEQ ID NO.2限定的氨基酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成，且具有催化ATP再生活力的多聚磷酸激酶PPK。

8.根据权利要求5所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，步骤(c)中，一号重组菌和二号重组菌的重量比为8：1～2：1。

9.根据权利要求5所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，步骤(c)中，混菌细胞在16-37℃，pH为6-8的条件下，孵育3-12h直接催化合成γ-聚谷氨酸。

10.根据权利要求5所述的一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述催化合成的底物为谷氨酸和/或谷氨酸盐、镁离子、单磷酸腺苷和多聚磷酸盐的混合物。