CN112481187B - 一种食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种食甲酸和co2自养的重组大肠杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌及其构建方法，属于微生物代谢工程领域和合成生物学领域。本发明以最常用的大肠杆菌为出发菌，通过导入甲酸同化的模块化质粒和CO2同化的模块化质粒，构建了一株以甲酸和CO2为唯一碳源进行快速生长的大肠杆菌；整个构建过程简单、周期短、通用性高；该重组菌可借助甲酸脱氢酶突变体来提升胞内还原型辅因子NAD(P)H水平，让重组菌具有“食用”甲酸来促进丙酮酸从头合成的能力，最终获得食甲酸和CO2自养的大肠杆菌；接种至甲酸和CO2为唯一碳源的培养基发酵培养，重组菌56小时内最高可获得0.9个OD600生物量，而原始菌几乎没有生长；这也是目前在没有基因敲除和长期驯化等手段辅助下，生长速度最快的食甲酸和CO2自养的大肠杆菌。

Description

一种食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌及其构建方法
技术领域
本发明公开了一种食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌及其构建方法，属于微生物代谢工程领域和合成生物学领域。
背景技术
随着社会经济的快速发展和化石能源的过度开发利用，温室气体的大量排放给环境生态、全球气候、人类生产生活带了巨大威胁。二氧化碳就是其中排放量最大的代表性温室气体，尤其是化石燃料与工业排放的二氧化碳已接近400亿吨每年。如何有效治理和利用二氧化碳已成为当今世界最关注的科学问题之一。
CO2作为一种最基本的碳资源，是合成其他碳中性化合物（例如植物光合作用产葡萄糖）的重要前体。因此，将CO2转化为化工原料或燃料，既能解决温室气体排放治理的问题，也能解决人类长期依赖化石能源导致资源匮乏的问题。那么，如何高效、环保地转化CO2为化工原料呢，目前，植物和藻类的光合作用是全球分布最广、应用最为普遍的CO2生物固定与转化方式。然而，光合作用仅局限于含有叶绿体的真核细胞中，不但生长速度慢、季节性影响大，而且大部分植物光能利用率不超过1%，限制了这种CO2转化方式在工业水平的应用。近年来，随着电催化技术和光催化技术的迅速发展，可以充分利用清洁廉价的太阳能和电能来还原转化CO2。比如利用贵重金属纳米材料负载的电极可以在一定负电压下还原CO2到CO、甲酸、甚至甲醇等简单的一碳化合物。甲酸作为二氧化碳还原的产物之一，是最容易制备的水溶性一碳化合物，也是大多数微生物可直接利用转化并且毒性最低的、最简单的有机碳源。因此，为弥补电催化或者光催化还原二氧化碳产物简单的问题，可以配合具有下游转化路径的微生物，利用合成代谢的优势来实现还原产物附加值的升级。同时，微生物（例如大肠杆菌）生长速度快、基因编辑便捷、具有工业应用背景，若配合甲酸代谢和CO2固定转化，将有望真正实现二氧化碳的高效循环利用。
大肠杆菌是工业发酵和产物升级的模式菌株，开发其CO2生物固定具有重要研究意义。目前，针对大肠杆菌甲酸和CO2同化利用的还原甘氨酸途径，往往采用辅助碳源（例如葡萄糖）来帮助大肠杆菌获取足够的电子和能量来还原CO2，从而获得能够转化CO2为生物质并且增加细胞生物量的大肠杆菌。显然，该方式导致了高级有机碳源的浪费，是一种不经济的生物固碳方式。近来，也有以色列研究团队采用300多天的长期实验室驯化方式，获得能够适应甲酸和CO2为唯一碳源进行生长的大肠杆菌。同时，也有韩国团队通过大肠杆菌的多组学分析、大量基因敲除、代谢通路精确调节、电子传递优化等系统生物学手段，最终获得最佳重组菌。虽然以上方式获得了一些食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌，但是仍然存在操作周期长、投入成本高、通用性能差的问题。因此，开发一种简单通用的生物固碳模块，并以此获得一种食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌，对生物固碳的工业应用具有重要指导意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明以实验室最常用的大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌，通过导入含有杨氏梭菌的甲酸同化酶基因簇的模块化质粒，初步构建具有C1-丙酮酸合成途径的重组大肠杆菌。接着，导入博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶突变体和大肠杆菌的甘氨酸裂解酶复合体的模块化质粒，改善胞内还原型辅因子不平衡的缺点，从而提升大肠杆菌对甲酸和CO2同化为丙酮酸的效率。最终，获得一株以甲酸和CO2为唯一碳源进行快速生长的大肠杆菌。
本发明的首先提供一种具有食甲酸和CO2自养能力的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌导入了外源的甲酸同化酶基因簇(fhs-fchA-folD)和甲酸脱氢酶基因(CbFDH1)，并过表达了内源的甘氨酸裂解酶复合体(EcgcvTHP)。
在本发明的一种实施方式中，所述的甲酸同化酶基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述的甲酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述的甘氨酸裂解酶复合体基因簇序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供了所述具有食甲酸和CO2自养能力的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD：
(1)以质粒pETDuet-1为基本骨架，替换T7启动子为tac启动子，并在所述tac启动子前面引入酶切位点AvrII，在T7终止子前后分别引入酶切位点SpeI和NheI，得到模块化质粒的底盘pM6tac；
所述底盘质粒pM6tac基因序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)分别克隆甲酸同化酶基因簇的基因组序列中的fhs、fchA、folD基因片段，酶切后分别连接至pM6tac质粒，得到3个重组质粒；
(3)通过不同酶切位点的互补与消除，通过对所述得到的3个重组质粒酶切、连接，将三个携带tac启动子的甲酸同化酶基因fhs、fchA、folD连续堆砌在底盘质粒pM6tac上，从而获得具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD。
构建具有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1：
以质粒pACYCDuet-1为底盘质粒，在所述质粒其中一个多克隆位点插入EcgcvTHP基因序列，得到质粒pACYC-EcgcvTHP；在所述质粒另一个多克隆位点插入CbFDH1基因序列，得到质粒pACYC-CbFHD1；分别对质粒pACYC-EcgcvTHP和质粒pACYC-CbFHD1进行双酶切，回收线性质粒片段pACYC-CbFHD1和基因片段EcgcvTHP，连接、转化、抗性平板筛选得到含有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1。
构建具有食甲酸和CO2自养能力的重组大肠杆菌：
将构建的具有甲酸同化功能的模块化质粒和具有CO2同化功能的模块化质粒，逐步（先转入甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD，再转入CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1）或同步电击转化导入大肠杆菌，氨苄霉素和氯霉素双抗性平板培养获得重组大肠杆菌。
本发明还提供所制备的一种具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD，所述模块化质
粒的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供所制备的一种具有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1，所述模块化质粒的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的还提供所述食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌的培养方法，所述方法是将上述的甲酸和CO2同化的两种模块化质粒电击转化导入大肠杆菌，在双抗性平板培养获得重组菌单克隆。随后，将上述重组菌单克隆接种至液体种子培养基，培养至一定细胞量来获得重组菌的种子液。收集种子液菌体细胞并生理盐水清洗，接种到甲酸和CO2为唯一碳源的发酵培养基，最终获得食甲酸和CO2自养的大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的双抗性平板配方为：15 g/L 琼脂粉，10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl，80 mg/L ampicillin，25 mg/L chloramphenicol。
在本发明的一种实施方式中，所述的液体种子培养基配方为：10 g/L 蛋白胨，5g/L 酵母膏，10 g/L NaCl，80 mg/L ampicillin，25 mg/L chloramphenicol，0.5 mmol/LIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。
在本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基每升配方为：4 g 甲酸钠，8 gNaHCO3, 6.8 g Na2HPO4·7H2O, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 1 g NH4Cl, 0.8 g MgSO4·7H2O, 0.24 g IPTG, 0.05 g 乙二胺四乙酸，2 mg 硫胺素，10 mL 维生素混合液(每升含有2 mg biotin（生物素）, 2 mg folic acid（叶酸）, 10 mg pyridoxine·HCl（盐酸吡哆辛、维生素B6），5 mg riboflavin（核黄素、维生素B2）, 5 mg nicotinic acid（烟酸）, 5mg calcium D-(+)-pantothenate（D-泛酸钙）, 0.1 mg vitamin B12（维生素B12）, 5 mgp-aminobenzoic acid（对氨基苯酸）, 5 mg thioctic acid（硫辛酸）)，10 mL 微量元素混合液(每升含有0.5 g MnSO4·H2O, 0.2 g ZnSO4, 0.1 g CaCl2, 0.1 g CoCl2·6H2O, 0.1g FeSO4·7H2O, 20 mg CuCl2·2H2O, 10 mg Na2SeO3, 10 mg NiCl2·6H2O, 10 mgNa2WO4·2H2O, )，80 mg/L ampicillin（氨苄），25 mg/L chloramphenicol（氯霉素）。采用HCl或NaOH调节最终pH 7.2。
本发明还提供所述重组大肠杆菌在化工、制药或环境领域中实现二氧化碳的高效循环利用的应用。
本发明的有益效果：
本发明以大肠杆菌BL21(DE3)为案例，通过模块化质粒的快速构建与导入，获得拥有完整的C1-丙酮酸合成途径的重组大肠杆菌。整个构建过程简单(外源基因在相同酶切位点上进行连续性堆砌组装，无需繁杂的基因组敲除过程)、周期短(重组菌获得时间不超过4天，无需长周期驯化)，通用性高(模块化质粒可适用于其他种类大肠杆菌)。
另外，该重组菌可借助甲酸脱氢酶突变体来提升胞内还原型辅因子NAD(P)H水平，让重组菌具有“食用”甲酸来促进丙酮酸从头合成的能力，最终获得食甲酸和CO2自养的大肠杆菌。以最初0.05个OD600生物量接种至甲酸和CO2为唯一碳源的培养基发酵56小时，重组菌最高可获得0.9个OD600生物量，而原始菌几乎没有生长。这也是目前在没有基因敲除和长期驯化等手段辅助下，生长速度最快的食甲酸和CO2自养的大肠杆菌。
附图说明
图1是大肠杆菌利用甲酸和CO2进行自养的C1-丙酮酸合成途径。
图2是甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD图谱和构建示意图。
图3是CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1图谱和构建示意图。
图4是食甲酸和CO2自养大肠杆菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中以大肠杆菌JM109为质粒克隆扩增的主要载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为食甲酸和CO2自养的底盘菌；所使用的骨架型质粒pETDuet-1和pACYCDuet-1均为Novagen公司的商业化产品，所采用质粒提取试剂盒为上海生工公司商业化产品；基因与引物的合成都由上海生工公司完成；大肠杆菌生物量即为细胞浓度，采用分光光度计于1 cm光程测定600 nm处的吸光度差值。
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规分子生物学实验方法完成，所采用酶相关试剂盒均在大连宝生物公司购买。
实施例中所涉及PCR、酶切、连接、密码子优化等过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
实施例1：甲酸同化功能的模块化质粒构建
根据商业化质粒pETDuet-1的基因序列和图谱，分别设计携带SalI酶切位点的上游引物pEM6-F和携带AvrII酶切位点的下游引物pEM6-R，通过PCR扩增得到pETDuet-1质粒的线性化片段；随后通过SalI/AvrII双酶切所得到的质粒线性化片段和tac基因合成片段(序列为SEQ ID NO.4所示的AvrII和SalI酶切位点之间序列)，通过T4 DNA连接酶16℃连接酶切后的质粒线性化片段和tac基因片段1小时，即可转化大肠杆菌JM109感受态；最后，通过含有氨苄抗性的LB培养基固体平板筛选，获得含有pEM6tac质粒（SEQ ID NO.4即为该质粒序列）的克隆，并扩增提取后备用。根据杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的甲酸同化酶基因簇的基因组序列片段(如SEQ ID NO.1所示)，分别设计引物fhs-F/fhs-R、fchA-F/fchA -R以及folD-F/folD-R，通过PCR克隆得到甲酸同化的三个关键酶Fhs、FchA以及FolD的基因片段；随后，将上述三个片段和pEM6tac分别进行NdeI/XhoI双酶切，通过T4 DNA连接酶连接，分别转化大肠杆菌JM109感受态；最后，通过含有氨苄抗性的LB培养基固体平板筛选，分别获得携带pEM6tac-fhs、pEM6tac-fchA、pEM6tac-folD质粒的正确克隆（如图2所示）。
以上述质粒pEM6tac-fhs为底盘质粒，采用NheI/SalI进行双酶切，获得具有与AvrII酶切相同的粘性末端；随后，对质粒pEM6tac-fchA进行AvrII/SalI双酶切，获得携带Ptac启动子的fchA重组片段，并与NheI/SalI双酶切后的线性质粒pEM6tac-fhs连接；接着，将连接后得到的片段通过转化大肠杆菌JM109感受态和单克隆筛选，获得pEM6tac-fchA-fhs质粒，粘合处NheI酶切位点得到消除，并在下游引入新的NheI酶切位点，可继续组装新的基因片段。
在此基础上，继续采用NheI/SalI双酶切pEM6tac-fchA-fhs质粒，AvrII/SalI双酶切pEM6tac-folD质粒，将携带Ptac启动子的folD重组片段与线性质粒pEM6tac-fchA-fhs连接，转化大肠杆菌后即可得到完整的甲酸同化质粒pEM6tac-fchA-fhs-folD（如图2所示）。上述质粒构建方式采用灵巧的设计来进行酶切位点的互补与消除，可以实现多种基因片段的模块化组装，并且每种基因都具有独立的强启动子Ptac，可以大大增强C1-丙酮酸合成途径（如图1所示）中的甲酸同化速率。
实施例2：CO2同化功能的模块化质粒构建
甘氨酸裂解酶复合体在具有充足的还原性辅因子NAD(P)H条件下，通常被认为具有反向催化功能，也就是具有将CO2、NH4 +以及甲酸同化产物CH2-THF (亚甲基四氢叶酸)转化为甘氨酸的能力。因此，甘氨酸裂解酶复合体对CO2同化起着关键作用，也是实现大肠杆菌依赖C1-丙酮酸合成途径自养的限速步骤。
根据大肠杆菌BL21(DE3)自身的甘氨酸裂解酶EcgcvTHP基因簇序列(如SEQ IDNO.3所示)，分别设计携带NcoI/BamHI酶切位点的gcvT-F和gcvP-R 引物（见表1），对上述序列进行PCR扩增获得4500 bp左右的基因片段；采用限制性内切酶NcoI/BamHI分别对所得到的PCR产物和pACYCDuet-1质粒进行双酶切，酶切产物回收后进行T4 DNA酶连接和感受态转化，氯霉素抗性平板(10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L琼脂粉，25mg/L chloramphenicol)筛选得到含有正确质粒pACYC-EcgcvTHP的单克隆。
甘氨酸裂解酶将CO2、NH4 +以及甲酸同化产物CH2-THF转化为甘氨酸需要还原型辅因子NADH的参与，然而重组大肠杆菌在仅含甲酸和CO2为碳源的培养条件下胞内极度缺乏还原型辅因子。来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶在经过定点突变之后，可以直接氧化甲酸来促进胞内NAD(P)H再生，同时产生为CO2供应细胞自养。
根据上述原理和博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因序列(GenBank:AF004096.1)，进行密码子优化和基因人工合成（合成后的序列如SEQ ID NO.2所示），再采用携带NdeI/XhoI酶切位点的CbFDH-F/CbFDH-R引物(见表1)进行PCR扩增；随后采用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR产物和pACYCDuet-1质粒分别进行酶切，再经过连接和感受态转化，获得模块化质粒pACYC-FHD；接着，采用突变引物FDH1-F/FDH1-R (见表1)对该质粒进行滚环PCR，使用限制性内切酶DpnI对PCR产物酶切后转化到大肠杆菌JM109感受态，经氯霉素抗性平板筛选得到含有模块化质粒pACYC-CbFHD1的正确单克隆；最后，采用限制性内切酶NcoI/BamHI分别对pACYC-CbFHD1质粒和pACYC-EcgcvTHP质粒进行双酶切，分别回收线性质粒片段pACYC-CbFHD1和基因片段EcgcvTHP (如图3所示)，连接后进行感受态转化，从氯霉素抗性平板筛选含有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1的正确单克隆，从而抽提质粒备用。
实施例3：重组大肠杆菌BL21(DE3)的构建
以大肠杆菌BL21(DE3)为底盘菌，作为甲酸同化质粒和CO2同化质粒的转化对象。大肠杆菌感受态制备方式参考常规分子生物学操作步骤：首先，采用LB培养基在37℃下培养细胞至浓度0.4 OD600；其次，在4℃和4000 rpm离心条件下收集细胞，后采用去冷却的无菌离子水清洗2遍；最后，采用冷却的无菌去离子水按照1000:1的稀释大肠杆菌，获得可用于转化模块化质粒的感受态细胞。
分别取100 ng的pEM6tac-fchA-fhs-folD和pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1质粒，加入到含有100 µL新鲜制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)的电击杯中，温和混匀后，冰上孵育15分钟；随后，采用Bio-Rad公司生产的高压电击仪，调节参数为25 µF、200 OHMs、2.0 kV；将含有大肠杆菌和质粒的预冷电击杯擦干，迅速放入电击槽并启动电击；电击完成后，迅速取出电击杯并加入1 mL无抗生素LB液体培养基，并全部转移到2 mL无菌试管中；在30℃和150rpm摇床培养1小时后，4000 rpm离心30 s收集菌泥，全部涂布在含有氨苄和氯霉素的双抗性平板，30℃培养18-22小时，即可得含有甲酸和CO2同化功能的模块化质粒的重组大肠杆菌单克隆。
实施例4：食甲酸和CO2自养大肠杆菌的培养方法
食甲酸和CO2自养是指重组大肠杆菌利用人工导入的C1-丙酮酸合成途径，以一碳化合物(甲酸和CO2)为唯一碳源，以甲酸代谢来再生还原型辅因子NAD(P)H，以大肠杆菌自身氧化磷酸化系统提供能量ATP，从头合成细胞中心代谢产物丙酮酸，为生物质合成和细胞增殖提供了前体基础。
根据上述设计原理，以具有甲酸和CO2同化功能的模块化质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)为案例，按照一定的培养方法获得以甲酸和CO2为唯一碳源进行生长的重组菌，即食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌；同时，将不携带fhs-fchA-folD、CbFDH1以及EcgcvTHP基因的模块化质粒pEM6tac和pACYCDuet-1共同电击转化进入大肠杆菌(具体步骤参考实施例3)，获得不具有即食甲酸和CO2自养能力的原始大肠杆菌作为对比。具体步骤如下：
首先，在双抗性LB平板(15 g/L 琼脂粉，10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/LNaCl，80 mg/L ampicillin，25 mg/L chloramphenicol)上挑取重组菌单克隆，接种至含有5 mL种子培养基(10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl，80 mg/L ampicillin，25mg/L chloramphenicol，0.5 mmol/L IPTG)的试管中，在30℃和200 rpm恒温摇床中培养8小时，获得重组大肠杆菌初步活化的种子液；
其次，在常温离心机转速8000 rpm条件下，离心4分钟来收集种子液中初步活化的重组大肠杆菌，采用无菌生理盐水清洗并重悬菌体，再次离心收集菌泥，重复3次或以上步骤，去除种子培养基中除甲酸和CO2以外的其他碳源的影响；将上述多次清洗的菌泥按照最终OD600=1的细胞浓度进行稀释和标定，以备发酵液接种使用；
最后，取上述OD600=1的重组大肠杆菌细胞100 µL，接种至含有100 mL发酵培养基(0.4 g 甲酸钠，0.8 g NaHCO3, 0.68 g Na2HPO4·7H2O, 0.3 g KH2PO4, 0.05 g NaCl,0.1 g NH4Cl, 0.08 g MgSO4·7H2O, 0.024 g IPTG, 0.005 g 乙二胺四乙酸，0.2 mg 硫胺素，1 mL 维生素混合液，1 mL 微量元素混合液，8 mg ampicillin，2.5 mgchloramphenicol)的摇瓶中，在30℃和200 rpm恒温摇床中培养4天，期间间隔8-12小时取样测定细胞浓度。
如图4所示，在以甲酸和CO2为唯一碳源的发酵培养基中，不具有食甲酸和CO2自养能力的原始大肠杆菌在培养78小时后，细胞浓度从OD600=0.04只增加到0.08，没有明显的生长现象；相反，重组大肠杆菌即食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌在相同条件下，发酵培养56个小时，即可得细胞浓度OD600=0.9，相比于原始大肠杆菌具有明显的生长优势。
*引物序列中小写字母指示引入的酶切位点。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌及其构建方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4030
<212> DNA
<213> 杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)
<400> 1
cctaggatcg agatcgatga gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtggggaa 60
ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata 120
tacatatgac ttataaatca gacatcgaaa tagctcaaga atgcacaatg aaggacatta 180
aggaaattgc aaagaaatta aatatttccg aagatgatat tgaattgtat ggtaaataca 240
aagcaaaggt aaattacaac ttgttaaaga ctacacctgg taagaatgga aaacttatat 300
tatgtacagc tataaaccca acacctgctg gagaaggaaa aactactaca gcaataggtg 360
tagcagatgc attaaataga atgggaaaat ctgttgttgt tgcacttaga gaaccatcta 420
tggggcctgt atttggtata aaaggtggag ctgccggagg tggatatgct caagtagtac 480
ctatggaaga cataaaccta cactttacag gtgatataca tgcactcact gctgctaaca 540
atttacttgc agcaatgata gataatcata tatatcaagg caataaactt aacatagacc 600
caagaagaat tgcttggaga agatgtgtag acatgaacga cagacagctc aggtttgtag 660
tcgatggatt aggtggaaaa gccaatggta cacctagaga agatggattt gatataacag 720
ttgcttcaga aataatggct atattctgtt tatcaagtga cataattgat ttaaagaaca 780
gaattgctaa aatagttgta ggatacacta gagatggcaa gcctgtaaca gctcatgatt 840
taaaagctga aggagctatg gcagcacttc ttaaagatgc attaaaacca aatctagtac 900
aaactcttga aggaacacca gcatttgtac acggcggacc atttgcaaat atagctcatg 960
gttgtaactc aataatggct actagaatgg ctcttcactt tggtgattat gtagttacgg 1020
aggcaggttt cggtgctgac ctaggtgctg aaaaattctt agatatcaag tgcagaatgg 1080
caggattaaa accagatgca gtaataatag ttgctacagt tagagcattg aaatataatg 1140
gcggagttcc aaaggctgat ttaaataatg aaaacttagg agctcttgaa aaaggacttc 1200
caaatttatt aaagcatgta gagaatataa ctaaggtata taaattacca gcagtagttg 1260
cattaaatgc attccctaca gatacacagg cagaattaaa attagtagaa gataaatgta 1320
aagaattagg tgtaaatgta aaattatcag aagtttgggc taaaggcggc gaaggtggaa 1380
tagaagttgc caaagaagtg cttagactta taaaagaaga gaaaaatgac ttccagtttg 1440
cttatgatga aaaattacca atcagagata aaataagagc agtagctcaa aagatatatg 1500
gtgctgatga tgttactttt acaaatcagg cagacaaaga aattgatgag cttgaaaaat 1560
taggatttgg taaaacacca gtatgtatag caaagaccca atactcctta actgatgacc 1620
aaactaaact tggaagacca acaggattta atattacagt aagacaggtt acaatttctg 1680
ctggagcagg ttttgtagtt gcagtaactg gttcaataat gaagatgcca ggtcttggaa 1740
aagttccatc tgctgaaaaa atagatgtag atgaaaatgg agtaataagc ggattattct 1800
aactcgagtc tggtaaagaa accgctgctg cgaaatttga acgccagcac atggactcgt 1860
ctactagtcg cagcttaatt aacctaaact gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 1920
ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc taggatcgag atcgatgagc 1980
tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtggggaatt gtgagcggat aacaattccc 2040
ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgaaat tagcagataa 2100
aagttgcaca gattttatag aagttcttgc atctaaagct gcaactcctg gtggaggcgg 2160
aggatcagct attacaggtg ctataggaat ggcacttgga ggcatggtat gtaaccttac 2220
aataggaaag aaaaagtatg cacagtatga tgaaaaggta aaaggcatac ttaaaagatc 2280
tgatgagctt caagcagagc ttttaaagat gatggatgca gatgcagaat gttttctgcc 2340
tctttcaaag gcttatggaa tgccaaaaga cactgaagag cagaaaaaaa taaaagaaga 2400
aactctagaa aagtgtctaa aacaagcatg tagtgttcca gtaagtattg ttaaacaagc 2460
ttatgaagca ataaaactcc atgaggcact tgtagataac tgctccaaac ttgcaataag 2520
tgatgttggt gtaggagttc agtgtctaag agctgctatt attggagcac agcttaatgt 2580
cataatcaac ataaattcta ttaaagatca ggaatatgtt aaaaaggtaa aagcagagac 2640
ggaaccttta gttgaagaag gcattaagat tgcagataag gtatatgaaa aagtagttag 2700
tgcactttcc aaataactcg agtctggtaa agaaaccgct gctgcgaaat ttgaacgcca 2760
gcacatggac tcgtctacta gtcgcagctt aattaaccta aactgctgcc accgctgagc 2820
aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctaggat 2880
cgagatcgat gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgggg aattgtgagc 2940
ggataacaat tcccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg 3000
ggtcaaataa ttaaaggtaa accagtggca gatgctataa gtgaggcttt aactaaagaa 3060
gttaatgatt taaaggtaaa gggtattact ccaaagctta cattagtaag agttggagca 3120
aacggaagtg accttgctta tgaaaaagga gctctaaaaa agtgcgaaaa aattggaata 3180
gaggcagtcg ttaaagagct accagcagat atatcacagg acaagtttat tgaagaattg 3240
aaaaaaataa atgcggacaa gactgtaaat gcaataatgg tattcagacc atttcctaag 3300
cagttagatg aaagtgttat aaaatatata atcgcccctg agaaagatgt agattgcttt 3360
agtcctgtaa atgttgctaa attaatggaa aaagatatga caggatttgc accttgtaca 3420
ccatctgcgg ttatagaaat ccttaagcat tataaagttc ctatgaaggg aaaaaatgca 3480
gttatagtag gaagatctat ggtagttgga aaaccagcgt gcatgctgct tttaaatgaa 3540
aatgctacag ttaccgtatg ccattcaaaa actactgata tgccaaaggt ttgttcccag 3600
gcagacatac tggtagtagg cataggaaaa gctaaaatga tagattcaaa atatgtaaaa 3660
gatggtgccg tagttataga tgtaggcata aatgtagatg aaagtggaaa gttatgtgga 3720
gatgtagata cagaagactg tgaagcaaaa gcttcaatga taacgccagt tcctggagga 3780
gtaggttcag ttacgtcatc tatacttgca cagcatattg taaaagcatg taaattacaa 3840
aataacctat aactcgagtc tggtaaagaa accgctgctg cgaaatttga acgccagcac 3900
atggactcgt ctactagtcg cagcttaatt aacctaaact gctgccaccg ctgagcaata 3960
actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tagcgaaagg 4020
aggagtcgac 4030
<210> 2
<211> 1097
<212> DNA
<213> 博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)
<400> 2
tatgaagatc gttttagtct tatatgatgc tggtaagcac gctgctgatg aagaaaaatt 60
atatggttgt actgaaaata aattaggtat tgctaattgg ttaaaagatc aaggtcatga 120
actaattact acttctgata aagaaggtga aacaagtgaa ttggataaac atatcccaga 180
tgctgatatt atcatcacca ctcctttcca tcctgcttat atcactaagg aaagacttga 240
caaggctaag aacttaaaat tagtcgttgt cgctggtgtt ggttctgatc acattgattt 300
agattatatt aatcaaacag gtaagaaaat ctcagtcttg gaagttacag gttctaatgt 360
tgtctctgtt gctgaacacg ttgtcatgac catgcttgtc taggttagaa atttcgttcc 420
agcacatgaa caaattatta accacgattg ggaggttgct gctatcgcta aggatgctta 480
cgatatggaa ggtaaaacta ttgctaccat tggtgctggt agaattggtt acagagtctt 540
ggaaagatta ctccctttta atccaaaaga attattatac tacgattatc aagctttacc 600
aaaagaagct gaagaaaaag ttggtgctag aagagttgaa aatattgaag aattagttgc 660
tcaagctgat atcgttacag ttaatgctcc attacacgga ggtacaaaag gtttaattaa 720
taaggaatta ttatctaaat ttaaaaaagg tgcttggtta gtcaataccg caagaggtgc 780
tatttgtgtt gctgaagatg ttgcagcagc tttagaatct ggtcaattaa gaggttacgg 840
tggtgatgtt tggttcccac aaccagctcc aaaggatcac ccttggagag atatgagaaa 900
taaatatggt gctggtaatg ccatgactcc tcactactct ggtactactt tagatgctca 960
aacaagatac gctgaaggta ctaaaaatat cttggaatca ttctttactg gtaaatttga 1020
ttacagacca caagatatta tcttattaaa tggtgaatac gttactaaag cttacggtaa 1080
acacgataag aaataac 1097
<210> 3
<211> 4500
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
atggcacaac agactccttt gtacgaacaa cacacgcttt gcggcgctcg catggtggat 60
ttccacggct ggatgatgcc gctgcattac ggttcgcaaa tcgacgaaca tcatgcggta 120
cgtaccgatg ccggaatgtt tgatgtgtca catatgacca tcgtcgatct tcgcggcagc 180
cgcacccggg agtttctgcg ttatctgctg gcgaacgatg tggcgaagct caccaaaagc 240
ggcaaagccc tttactcggg gatgttgaat gcctctggcg gtgtgataga tgacctcatc 300
gtctactact ttactgaaga tttcttccgc ctcgttgtta actccgccac ccgcgaaaaa 360
gacctctcct ggattaccca acacgctgaa cctttcggca tcgaaattac cgttcgtgat 420
gacctttcca tgattgccgt gcaagggccg aatgcgcagg caaaagctgc cacactgttt 480
aatgacgccc agcgtcaggc ggtggaaggg atgaaaccgt tctttggcgt gcaggcgggc 540
gatctgttta ttgccaccac tggttatacc ggtgaagcgg gctatgaaat tgcgctgccc 600
aatgaaaaag cggccgattt ctggcgtgcg ctggtggaag cgggtgttaa gccatgtggc 660
ttgggcgcgc gtgacacgct gcgtctggaa gcgggcatga atctttatgg tcaggagatg 720
gacgaaacca tctctccttt agccgccaac atgggctgga ctatcgcctg ggaaccggca 780
gatcgtgact ttatcggtcg tgaagccctg gaagtgcagc gtgagcatgg tacagaaaaa 840
ctggttggtc tggtgatgac cgaaaaaggc gtgctgcgta atgaactgcc ggtacgcttt 900
accgatgcgc agggcaacca gcatgaaggc attatcacca gcggtacttt ctccccgacg 960
ctgggttaca gcattgcgct ggcgcgcgtg ccggaaggta ttggcgaaac ggcgattgtg 1020
caaattcgca accgtgaaat gccggttaaa gtgacaaaac ctgtttttgt gcgtaacggc 1080
aaagccgtcg cgtgatttac ttttttggag attgattgat gagcaacgta ccagcagaac 1140
tgaaatacag caaagaacac gaatggctgc gtaaagaagc cgacggcact tacaccgttg 1200
gtattaccga acatgctcag gagctgttag gcgatatggt gtttgttgac ctgccggaag 1260
tgggcgcaac ggttagcgcg ggcgatgact gcgcggttgc cgaatcagta aaagcggcgt 1320
cagacattta tgcgccagta agcggtgaaa tcgtggcggt aaacgacgca ctgagcgatt 1380
ccccggaact ggtgaacagc gaaccgtatg caggtggctg gatctttaaa atcaaagcca 1440
gcgatgaaag cgaactggaa tcactgctgg atgcgaccgc atacgaagca ttgttagaag 1500
acgagtaacg gctttattcc tcttctgcgg gagaggatca gggtgaggaa aatttatgcc 1560
tcaccctcac tctcttcgta aggagagagg ttcacaattc actgcacgtt tcaggaacca 1620
tcgctcatga cacagacgtt aagccagctt gaaaacagcg gcgcttttat tgaacgccat 1680
atcggaccgg acgccgcgca acagcaagaa atgctgaatg ccgttggcgc acaatcgtta 1740
aacgcgctga ccggccagat tgtaccgaaa gatattcagc ttgcgacccc gccgcaggtt 1800
ggcgcaccgg cgaccgaata cgccgcactg gcagaactca aggctattgc cagtcgcaat 1860
aaacgcttca cgtcttacat cggcatgggt tacaccgccg tgcagctacc gccggttatc 1920
ctgcgtaaca tgctggaaaa tccgggctgg tataccgcgt acactccgta tcaacctgaa 1980
gtctcccagg gccgccttga agcattgctc aacttccagc aggtaacgct ggatttgact 2040
ggactggata tggcctctgc ttctcttctg gacgaggcca ccgctgccgc cgaagcaatg 2100
gcgatggcga aacgcgtcag caaactgaaa aatgccaacc gcttcttcgt ggcttccgat 2160
gtgcatccgc aaactctgga tgtggtccgt actcgtgccg aaacctttgg ttttgaagtg 2220
attgtcgatg acgcgcaaaa agtgctcgac catcaggacg tcttcggcgt gctgttacag 2280
caggtaggca ctaccggtga aattcacgac tacactgcgc ttattagcga actgaaatca 2340
cgcaaaattg tggtcagcgt tgccgccgat attatggcgc tggtgctgtt aactgcgccg 2400
ggtaaacagg gcgcggatat tgtttttggt tcggcgcaac gcttcggcgt gccgatgggc 2460
tacggtggcc cacacgcggc attctttgcg gcgaaagatg aatacaaacg ctcaatgccg 2520
ggccgtatta tcggtgtatc gaaagatgca gctggcaata ccgcgctgcg catggcgatg 2580
cagactcgcg agcaacatat ccgccgtgag aaagcgaact ccaacatttg tacttcccag 2640
gtactgctgg caaacatcgc cagcctgtat gccgtttatc acggcccggt tggcctgaaa 2700
cgtatcgcta accgcattca ccgtctgacc gatatcctgg cggcgggcct gcaacaaaaa 2760
ggtctgaaac tgcgccatgc gcactatttc gacaccttgt gtgtggaagt ggccgacaaa 2820
gcgggcgtac tgacgcgtgc cgaagcggct gaaatcaacc tgcgtagcga tattctgaac 2880
gcggttggga tcacccttga tgaaacaacc acgcgtgaaa acgtaatgca gcttttcaac 2940
gtgctgctgg gcgataacca cggcctggac atcgacacgc tggacaaaga cgtggctcac 3000
gacagccgct ctatccagcc tgcgatgctg cgcgacgacg aaatcctcac ccatccggtg 3060
tttaatcgct accacagcga aaccgaaatg atgcgctata tgcactcgct ggagcgtaaa 3120
gatctggcgc tgaatcaggc gatgatcccg ctgggttcct gcaccatgaa actgaacgcc 3180
gccgccgaga tgatcccaat cacctggccg gaatttgccg aactgcaccc gttttgtccg 3240
ccggaacagg ctgaaggtta tcagcagatg attgcgcagc tggctgactg gctggtgaaa 3300
ctgaccggtt acgacgccgt ttgtatgcag ccgaactccg gcgcacaggg cgaatacgcg 3360
ggcctgctgg cgattcgtca ttatcatgaa agccgcaatg aagggcatcg cgatatctgc 3420
ctgatcccgg cttctgcgca cggaactaac cccgcttctg cacatatggc aggaatgcag 3480
gtggtggttg tggcgtgtga taaaaacggc aacatcgatc tgactgatct gcgcgcgaaa 3540
gcggaacagg cgggcgataa cctctcctgt atcatggtga cttatccttc tacccacggc 3600
gtgtatgaag aaacgatccg tgaagtgtgt gaagtcgtgc atcagttcgg cggtcaggtt 3660
taccttgatg gcgcgaacat gaacgcccag gttggcatca cctcgccggg ctttattggc 3720
gcggacgttt cgcacctcaa cctgcataaa actttctgca ttccgcacgg cggtggtggt 3780
ccgggtatgg gaccgatcgg tgtgaaagcg catctggcac cgtttgtacc gggtcatagc 3840
gtggtgcaaa tcgaaggcat gttaacccgt cagggcgcag tttctgcggc accgttcggt 3900
agcgcctcta tcctgccaat cagctggatg tacatccgca tgatgggcgc agaagggctg 3960
aaaaaagcaa gccaggtggc aatcctcaac gccaactata ttgccagccg cctgcaggat 4020
gccttcccgg tgctgtatac cggtcgcgac ggtcgcgtgg cgcacgaatg tattctcgat 4080
attcgcccgc tgaaagaaga aaccggcatc agcgagctgg atattgccaa gcgcctgatc 4140
gactacggtt tccacgcgcc aacgatgtcg ttcccggtgg cgggtacgct gatggttgaa 4200
ccgactgaat ctgaaagcaa agtggaactg gatcgcttta tcgacgcgat gctggctatc 4260
cgcgcagaaa tcgaccaggt taaagccggt gtctggccgc tggaagataa cccgctggtg 4320
aacgcgccgc acattcagaa cgaactggtc gccgagtggg cgcatccgta cagccgtgaa 4380
gttgcagtat tcccggcagg tgtggcagac aaatactggc cgacggtgaa acgtctggat 4440
gatgtttacg gtgaccgtaa cctgttctgc tcctgcgtac cgattagcga ataccagtaa 4500
<210> 4
<211> 5206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctagcga aaggaggagt 60
cgactatatc cggattggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 120
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 180
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 240
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 300
ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 360
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 420
tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 480
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 540
ttctggcggc acgatggcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 600
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 660
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 720
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 780
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 840
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 900
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 960
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 1020
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 1080
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 1140
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 1200
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 1260
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 1320
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 1380
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 1440
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 1500
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatcatgat tgaagcattt atcagggtta 1560
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggtcatga 1620
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 1680
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 1740
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 1800
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 1860
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 1920
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 1980
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 2040
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 2100
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 2160
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 2220
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 2280
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 2340
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 2400
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 2460
agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg 2520
gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 2580
tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2640
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2700
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catggcgatg cagactcgcg agcaacatat ccgccgtgag aaagcgaact ccaacatttg 2700
tacttcccag gtactgctgg caaacatcgc cagcctgtat gccgtttatc acggcccggt 2760
tggcctgaaa cgtatcgcta accgcattca ccgtctgacc gatatcctgg cggcgggcct 2820
gcaacaaaaa ggtctgaaac tgcgccatgc gcactatttc gacaccttgt gtgtggaagt 2880
ggccgacaaa gcgggcgtac tgacgcgtgc cgaagcggct gaaatcaacc tgcgtagcga 2940
tattctgaac gcggttggga tcacccttga tgaaacaacc acgcgtgaaa acgtaatgca 3000
gcttttcaac gtgctgctgg gcgataacca cggcctggac atcgacacgc tggacaaaga 3060
cgtggctcac gacagccgct ctatccagcc tgcgatgctg cgcgacgacg aaatcctcac 3120
ccatccggtg tttaatcgct accacagcga aaccgaaatg atgcgctata tgcactcgct 3180
ggagcgtaaa gatctggcgc tgaatcaggc gatgatcccg ctgggttcct gcaccatgaa 3240
actgaacgcc gccgccgaga tgatcccaat cacctggccg gaatttgccg aactgcaccc 3300
gttttgtccg ccggaacagg ctgaaggtta tcagcagatg attgcgcagc tggctgactg 3360
gctggtgaaa ctgaccggtt acgacgccgt ttgtatgcag ccgaactccg gcgcacaggg 3420
cgaatacgcg ggcctgctgg cgattcgtca ttatcatgaa agccgcaatg aagggcatcg 3480
cgatatctgc ctgatcccgg cttctgcgca cggaactaac cccgcttctg cacatatggc 3540
aggaatgcag gtggtggttg tggcgtgtga taaaaacggc aacatcgatc tgactgatct 3600
gcgcgcgaaa gcggaacagg cgggcgataa cctctcctgt atcatggtga cttatccttc 3660
tacccacggc gtgtatgaag aaacgatccg tgaagtgtgt gaagtcgtgc atcagttcgg 3720
cggtcaggtt taccttgatg gcgcgaacat gaacgcccag gttggcatca cctcgccggg 3780
ctttattggc gcggacgttt cgcacctcaa cctgcataaa actttctgca ttccgcacgg 3840
cggtggtggt ccgggtatgg gaccgatcgg tgtgaaagcg catctggcac cgtttgtacc 3900
gggtcatagc gtggtgcaaa tcgaaggcat gttaacccgt cagggcgcag tttctgcggc 3960
accgttcggt agcgcctcta tcctgccaat cagctggatg tacatccgca tgatgggcgc 4020
agaagggctg aaaaaagcaa gccaggtggc aatcctcaac gccaactata ttgccagccg 4080
cctgcaggat gccttcccgg tgctgtatac cggtcgcgac ggtcgcgtgg cgcacgaatg 4140
tattctcgat attcgcccgc tgaaagaaga aaccggcatc agcgagctgg atattgccaa 4200
gcgcctgatc gactacggtt tccacgcgcc aacgatgtcg ttcccggtgg cgggtacgct 4260
gatggttgaa ccgactgaat ctgaaagcaa agtggaactg gatcgcttta tcgacgcgat 4320
gctggctatc cgcgcagaaa tcgaccaggt taaagccggt gtctggccgc tggaagataa 4380
cccgctggtg aacgcgccgc acattcagaa cgaactggtc gccgagtggg cgcatccgta 4440
cagccgtgaa gttgcagtat tcccggcagg tgtggcagac aaatactggc cgacggtgaa 4500
acgtctggat gatgtttacg gtgaccgtaa cctgttctgc tcctgcgtac cgattagcga 4560
ataccagtaa ggatccgaat tcgagctcgg cgcgcctgca ggtcgacaag cttgcggccg 4620
cataatgctt aagtcgaaca gaaagtaatc gtattgtaca cggccgcata atcgaaatta 4680
atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccccatctta gtatattagt 4740
taagtataag aaggagatat acatatgaag atcgttttag tcttatatga tgctggtaag 4800
cacgctgctg atgaagaaaa attatatggt tgtactgaaa ataaattagg tattgctaat 4860
tggttaaaag atcaaggtca tgaactaatt actacttctg ataaagaagg tgaaacaagt 4920
gaattggata aacatatccc agatgctgat attatcatca ccactccttt ccatcctgct 4980
tatatcacta aggaaagact tgacaaggct aagaacttaa aattagtcgt tgtcgctggt 5040
gttggttctg atcacattga tttagattat attaatcaaa caggtaagaa aatctcagtc 5100
ttggaagtta caggttctaa tgttgtctct gttgctgaac acgttgtcat gaccatgctt 5160
gtcttggtta gaaatttcgt tccagcacat gaacaaatta ttaaccacga ttgggaggtt 5220
gctgctatcg ctaaggatgc ttacgatatc gaaggtaaaa ctattgctac cattggtgct 5280
ggtagaattg gttacagagt cttggaaaga ttactccctt ttaatccaaa agaattatta 5340
tactacgatt atcaagcttt accaaaagaa gctgaagaaa aagttggtgc tagaagagtt 5400
gaaaatattg aagaattagt tgctcaagct gatatcgtta cagttaatgc tccattacac 5460
gcaggtacaa aaggtttaat taataaggaa ttattatcta aatttaaaaa aggtgcttgg 5520
ttagtcaata ccgcaagagg tgctatttgt gttgctgaag atgttgcagc agctttagaa 5580
tctggtcaat taagaggtta cggtggtgat gtttggttcc cacaaccagc tccaaaggat 5640
cacccttgga gagatatgag aaataaatat ggtgctggta atgccatgac tcctcactac 5700
tctggtacta ctttagatgc tcaaacaaga tacgctgaag gtactaaaaa tatcttggaa 5760
tcattcttta ctggtaaatt tgattacaga ccacaagata ttatcttatt aaatggtgaa 5820
tacgttacta aagcttacgg taaacacgat aagaaataac tcgagtctgg taaagaaacc 5880
gctgctgcga aatttgaacg ccagcacatg gactcgtcta ctagcgcagc ttaattaacc 5940
taggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 6000
ttgaggggtt ttttgctgaa acctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg 6060
gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct 6120
gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac 6180
ttattcaggc gtagcaccag gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc 6240
cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa 6300
gccatcacag acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg 6360
cgtataatat ttgcccatag tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt 6420
taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat 6480
aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat 6540
gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt 6600
ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc 6660
tttcattgcc atacggaact ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa 6720
ggccggataa aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag 6780
ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt 6840
acgatgccat tgggatatat caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc 6900
ttccttagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 6960
attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt 7020
ggcccagggc ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc 7080
ttccgtcaca ggtatttatt cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat 7140
ttagtgtatg atggtgtttt tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctgtccct 7200
cctgttcagc tactgacggg gtggtgcgta acggcaaaag caccgccgga catcagcgct 7260
agcggagtgt atactggctt actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg aagtgcttca 7320
tgtggcagga gaaaaaaggc tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat 7380
tccgcttcct cgctcactga ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg 7440
gcttacgaac ggggcggaga tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg 7500
agagggccgc ggcaaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa 7560
tctgacgctc aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 7620
ccctggcggc tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc 7680
gctgttatgg ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc 7740
gctccaagct ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg 7800
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca 7860
ctggtaattg atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa 7920
aggacaagtt ttggtgactg cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta 7980
gctcagagaa ccttcgaaaa accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag 8040
attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc 8100
tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacctg aagtcagccc catacgatat 8160
aagttgtaat tctcatgtta gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga 8220
aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg gtgcctaatg agtgagctaa cttacattaa 8280
ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 8340
gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgccagggt ggtttttctt 8400
ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg agagagttgc 8460
agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat ggtggttaac 8520
ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga gatgtccgca 8580
ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc ccagcgccat ctgatcgttg 8640
gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt ttgttgaaaa 8700
ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg gctgaatttg attgcgagtg 8760
agatatttat gccagccagc cagacgcaga cgcgccgaga cagaacttaa tgggcccgct 8820
aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct ccacgcccag tcgcgtaccg 8880
tcttcatggg agaaaataat actgttgatg ggtgtctggt cagagacatc aagaaataac 8940
gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca gcaatggcat cctggtcatc cagcggatag 9000
ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg agaagattgt gcaccgccgc tttacaggct 9060
tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc accacgctgg cacccagttg atcggcgcga 9120
gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg ccagactgga ggtggcaacg 9180
ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt tgttgtgcca cgcggttggg aatgtaattc 9240
agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg cagaaacgtg gctggcctgg 9300
ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac atcgtataac 9360
gttactggtt tcacattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata 9420
ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg tccgggatct cgacgctctc ccttatgcga 9480
ctcctgcatt aggaaattaa tacgactcac tata 9514
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcggtcgac actatatccg gattggcgaa tgg 33
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgcctagg ctacgccgga cgcatcg 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcgcatatg acttataaat cagacatcga 30
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atatctcgag ttagaataat ccgcttatta ctcc 34
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcgcatatg aaattagcag ataaaagttg c 31
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atatctcgag ttatttggaa agtgcactaa ctac 34
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcgcatatg ggtcaaataa ttaaaggtaa ac 32
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atatctcgag ttataggtta ttttgtaatt tacatgct 38
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atatccatgg cacaacagac tcctttgtac g 31
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atatggatcc ttactggtat tcgctaatcg gtac 34
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcgcatatg aagatcgttt tagtcttata tgatg 35
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atatctcgag ttatttctta tcgtgtttac cgtaag 36
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcacccttg gagagatatg ag 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccaagggtg atcctttgga g 21

Claims (8)

1.一种具有食甲酸和CO2自养能力的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌导入了外源的甲酸同化酶基因簇fhs-fchA-folD和甲酸脱氢酶基因CbFDH1，并过表达了内源的甘氨酸裂解酶复合体EcgcvTHP；
所述的甲酸同化酶基因簇fhs-fchA-folD序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的甲酸脱氢酶基因CbFDH1序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的甘氨酸裂解酶复合体基因EcgcvTHP序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD；
构建具有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1；
构建具有食甲酸和CO2自养能力的重组大肠杆菌：
将构建的具有甲酸同化功能的模块化质粒和具有CO2同化功能的模块化质粒，电击转化导入大肠杆菌，氨苄霉素和氯霉素双抗性平板培养获得重组大肠杆菌；
所述构建具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD的方法如下：
(1)以质粒pETDuet-1为基本骨架，替换T7启动子为tac启动子，并在所述tac启动子前面引入酶切位点AvrII，在T7终止子前后分别引入酶切位点SpeI和NheI，得到模块化质粒的底盘pM6tac；
(2)分别克隆甲酸同化酶基因簇的基因组序列中的fhs、fchA、folD基因片段，酶切后分别连接至pM6tac质粒，得到3个重组质粒；
(3)通过不同酶切位点的互补与消除，通过对所述得到的3个重组质粒酶切、连接，将三个携带tac启动子的甲酸同化酶基因fhs、fchA、folD连续堆砌在底盘质粒pM6tac上，从而获得具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述底盘质粒pM6tac基因序列如SEQID NO.4所示。
4. 权利要求2所述方法得到的具有甲酸同化功能的模块化质粒pM6tac-fhs-fchA-folD，所述模块化质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建具有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1的方法如下：
以质粒pACYCDuet-1为底盘质粒，在所述质粒其中一个多克隆位点插入EcgcvTHP基因序列，得到质粒pACYC-EcgcvTHP；在所述质粒另一个多克隆位点插入CbFDH1基因序列，得到质粒pACYC-CbFHD1；分别对质粒pACYC-EcgcvTHP和质粒pACYC-CbFHD1进行双酶切，回收线性质粒片段pACYC-CbFHD1和基因片段EcgcvTHP，连接、转化、抗性平板筛选得到含有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1。
6. 权利要求5所述方法得到的具有CO2同化功能的模块化质粒pACYC-EcgcvTHP-CbFDH1，所述模块化质粒的序列如SEQ ID NO.6所示。
7.权利要求1所述重组大肠杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将构建的重组大肠杆菌单克隆接种至液体种子培养基，培养至一定细胞量来获得重组菌的种子液；收集种子液菌体细胞并生理盐水清洗，接种到甲酸和CO2为唯一碳源的发酵培养基，培养食甲酸和CO2自养的重组大肠杆菌；
所述的发酵培养基每升配方为：4 g 甲酸钠，8 g NaHCO3，6.8 g Na2HPO4•7H2O，3 gKH2PO4，0.5 g NaCl，1 g NH4Cl，0.8 g MgSO4•7H2O，0.24 g IPTG，0.05 g 乙二胺四乙酸，2mg 硫胺素，10 mL 维生素混合液，10 mL 微量元素混合液，80 mg/L ampicillin，25 mg/Lchloramphenicol，培养基pH值为 7.2；
其中所述的维生素混合液中含有biotin、folic acid、pyridoxine•HCl、riboflavin、nicotinic acid、calcium D-(+)-pantothenate、vitamin B12、p-aminobenzoic acid 和thioctic acid；
所述的微量元素混合液中含有MnSO4•H2O、ZnSO4、CaCl2、CoCl2•6H2O、FeSO4•7H2O、CuCl2•2H2O、Na2SeO3、NiCl2•6H2O 和 Na2WO4•2H2O。
8.权利要求1所述重组大肠杆菌在化工、制药或环境领域中实现二氧化碳的高效循环利用的应用。
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