CN112941061B - 一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种Tk‑Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用，涉及蛋白酶技术领域。本发明所述突变体3Y‑R的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还以所述突变体3Y‑R为基础制备得到了3Y‑R线性组装材料，所述3Y‑R线性材料与野生型的Tk‑Rubisco相比酶活性提高了1.4倍，所述线性材料能够适应较高的温度环境，还可以通过离心将酶和底物、产物分离，实现酶的重复利用，使得Rubisco能够适应工业应用，满足大批量转化CO2产生糖类物质的需求，从而应用于环境工业，食品工业、药品工业、合成和转化以及发酵工业中。

Description

一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白酶技术领域，具体涉及一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用。
背景技术
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是外界CO2进入生物体后转化为有机碳的重要媒介，是卡尔文循环转化CO2第一步反应中的关键酶和限速酶，它可以将1分子的1,5-二磷酸核酮糖和1分子的CO2转化成两分子的3-磷酸甘油酸，从而合成葡萄糖，为生命活动提供能量。但Rubisco的催化效率非常低，虽然它的数量众多，分布广泛，但对大气中CO2的转化也非常有限，导致农业生产力受到严重限制，要想提高粮食生产，最根本的解决方案就是提高Rubisco的羧化能力。存在于极端嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis KOD1中的Ⅲ型Rubisco(Tk-Rubisco)已经可以成功地在体外进行克隆表达，它是由10个相同亚基组装形成的10聚体蛋白，呈现出具有C5对称的五角形环形结构。Tk-Rubisco具有极高的耐热稳定性，而且相比于其他Rubisco，它具有较高的CO2的转化效率，但它并不参与卡尔文循环产生为生命活动提供能量的糖类物质，这对于Tk-Rubisco的高催化能力是一种浪费。目前，利用Tk-Rubisco作为构建模块在体外以自组装的方式制备成能适应工业应用的材料在国内外还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用，所述突变体及线性组装材料能够体外参与卡尔文循环，可在体外大规模转化CO2，降低环境中CO2的含量并产生糖类物质的前体物，可广泛的应用于环境保护领域以及糖类物质、功能性氨基酸等物质的生产领域上。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种能够体外参与卡尔文循环的Tk-Rubisco突变体3Y-R，所述3Y-R的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种包含上述3Y-R的3Y-R线性组装材料，所述3Y-R线性组装材料的制备原料包括3Y-R和盐溶液；
在所述3Y-R线性组装材料中，3Y-R和盐溶液的浓度比为(1～5)μM：(0～0.5)M。
优选的，所述盐溶液包括NaCl溶液。
本发明还提供了上述3Y-R线性组装材料的制备方法，包括以下步骤：将所述3Y-R的溶液中与所述盐溶液混合，4℃静置12～24h，得所述3Y-R线性组装材料。
优选的，所述混合后形成的混合溶液的pH值为7.5～8.5。
本发明还提供了上述3Y-R或上述3Y-R线性组装材料在体外转化CO2为有机物中的应用。
优选的，所述有机物包括葡萄糖合成前体物质。
优选的，所述葡萄糖合成前体物质包括3-磷酸甘油酸。
本发明还提供了上述3Y-R或上述3Y-R线性组装材料在缓解温室效应中的应用。
本发明提供了一种能够体外参与卡尔文循环的Tk-Rubisco突变体3Y-R，所述3Y-R的氨基酸序列中包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明利用了Tk-Rubisco的结构对称性，在其外表面引入能够形成π-π相互作用的酪氨酸，使其能在含有盐离子的弱碱性水溶液条件下头尾相连形成长达微米级的线性材料。本发明还以所述突变体3Y-R为基础制备得到了3Y-R线性组装材料，所述3Y-R线性材料与野生型的Tk-Rubisco相比酶活性提高了1.4倍，在75℃下加热半小时后，3Y-R线性材料仍然保持了比野生型Tk-Rubisco的酶活性高1.25倍，所述线性材料能够适应较高的温度环境，还可以通过离心将酶和底物、产物分离，实现酶的重复利用，使得Rubisco能够适应工业应用，满足大批量转化CO2产生糖类物质的需求。
本发明所述3Y-R线性材料可在体外大规模转化CO2，降低环境中CO2的含量并产生糖类物质的前体物，可广泛应用于环境工业，食品工业、药品工业、合成和转化以及发酵工业中，具有很高的实际应用和推广价值。
附图说明
图1为3Y-R线性组装材料与CO2的固定关系图，其中A表示不同体系在离心后NADH在340nm处的吸收峰，△3y-r表示3Y-R与0.3M NaCl的线性组合；B表示紫外-可见分光光度计标准NADH量的校正曲线
图2为3Y-R线性组装材料的稳定性和重复性，其中A表示不同酶在不同温度下的活性，B表示3Y-R线性组装材料重复使用的酶活性。
具体实施方式
本发明提供了一种能够体外参与卡尔文循环的Tk-Rubisco突变体3Y-R，所述3Y-R的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：MVEKFDTIYDYYVDKGYEPSKKRDIIAVFRVTPAEGYTIEQAAGAVAAESSTGTWTTLYPWYEQERWADLSAKAYDFHDMGDGSWIVRIAYPFHAFEEANLPGLLASIAGNIFGMKRVKGLRLEDLYFPEKLIREFDGPAFGIEGVRKMLEIKDRPIYGVVPKPKVGYSPEEFEKLAYDLLSNGADYMKDDENLTSPWYNRFEERAEIMAKIIDKVENETGEKKTWFANITADLLEMEQRLEVLADLGLKHAMVDVVITGWGALRYIRDLAADYGLAIHGHRAMHAAFTRNPYHGISMFVLAKLYRLIGIDQLHVGTAGAGKLEGGKWDVIQNARILRESHYKPDENDVFHLEQKFYSIKAAFPTSSGGLHPGNIQPVIEALGTDIVLQLGGGTLGHPDGPAAGARAVRQAIDAIMYYIPLDEYAYTHKELARALEKWGHVTPV。
本发明优选以来源于极端嗜热古细菌(Thermococcus kodakaraensis)KOD1中的Ⅲ型Rubisco(Tk-Rubisco，GeneID:18159024，PDB Code：1GEH)作为模板，所述Rubisco为具有一个C5对称轴的环形五边形蛋白，为线性组装提供了良好的结构基础。本发明所述Tk-Rubisco的晶体结构中Tk-Rubisco分子间通过位于外表面415-430位氨基酸形成的氢键和疏水作用头尾相连形成管状堆积。本发明对所述Tk-Rubisco进行改造，将Tk-Rubisco外表面415-430位具有相互作用的氨基酸全部替换成酪氨酸，从而加强氢键和疏水作用，形成较强但又可逆的非共价相互作用—π-π相互作用，从而得到Tk-Rubisco突变体3Y-R。
本发明利用Tk-Rubisco的结构对称性，在其外表面引入能够形成π-π相互作用的酪氨酸，使其能在含有盐离子的弱碱性水溶液条件下头尾相连形成长达微米级的线性材料。
本发明还提供了一种包含上述3Y-R的3Y-R线性组装材料，所述3Y-R线性组装材料的制备原料包括3Y-R和盐溶液；
在所述3Y-R线性组装材料中，3Y-R和盐溶液的浓度比为(1～5)μM：(0～0.5)M。
本发明所述盐溶液优选包括NaCl溶液。
本发明还提供了上述3Y-R线性组装材料的制备方法，包括以下步骤：将所述3Y-R的溶液中与所述盐溶液混合，4℃静置12～24h，得所述3Y-R线性组装材料。
本发明所述制备方法优选在弱碱性条件下进行，所述混合后形成的混合溶液的pH值优选为7.5～8.5。在本发明实施例中，优选调整3Y-R蛋白的浓度为3μM，在蛋白溶液中滴加浓度为5M的NaCl，使得溶液的盐离子终浓度在0.1～0.3M，并在4℃条件下静置12～24h，得到3Y-R线性组装材料。
本发明所述3Y-R线性组装材料可在体外大规模转化CO2，降低环境中CO2的含量并产生糖类物质的前体物，可广泛的应用于环境保护领域以及糖类物质、功能性氨基酸等物质的生产领域上，如(1)3Y-R线性材料能转化CO2，因此可以捕获大气中的CO2，降低环境中CO2含量，缓解温室效应，用作环保材料。(2)3Y-R线性材料大量转化CO2，并通过离心将其回收，连续生产合成糖类的前体物质3-磷酸甘油酸。(3)转化所得到的3-磷酸甘油酸可以连续的合成葡萄糖，而葡萄糖作为人体的基本元素和基本的医药原料，可用在发酵工业上生产抗生素、维生素酶制剂等。也可用于食品中传统糖果业、新兴的蔬菜加工业等作为营养剂和保鲜剂。(4)葡萄糖可以氢化、氧化、异构、碱性降解、酯化、乙缩醛化反应等，合成或转化为其他产品。因此，Rubisco线性材料可以直接以CO2作为原料，氢化制山梨醇，氧化制葡萄糖醛酸等物质。由于3Y-R线性材料一方面能吸收环境中的CO2，降低大气碳含量，另一方面又可以转化CO2生成葡萄糖前体物质，其应用领域非常广泛。
本发明还提供了上述3Y-R或上述3Y-R线性组装材料在体外转化CO2为有机物中的应用。
本发明利用所述3Y-R线性组装材料固定CO2的反应式优选包括：
1,5-二磷酸核酮糖酶(Rubisco)(3Y-R线性组装材料)：
6CO2+6H2O+6RuBP＝123-PGA；
反应体系中总体发生的反应为：
CO2+H2O+RuBP+2ATP+2NADH＝2NAD++2G3P+2ADP+2Pi；
即固定一分子CO2需要消耗2分子的NADH，通过NADH的消耗量得到CO2的固定量。
本发明所述有机物包括葡萄糖合成前体物质，更优选包括3-磷酸甘油酸。
本发明还提供了上述3Y-R或上述3Y-R线性组装材料在缓解温室效应中的应用。本发明基于所述3Y-R或上述3Y-R线性组装材料在体外转化CO2为有机物的特性，可用来缓解温室效应。本发明所述体外转化CO2为有机物的反应式优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、3Y-R线性组装材料的制备
(1)将野生型的Tk-Rubisco(GeneID:18159024，PDB Code：1GEH)的第417位，418位和426位氨基酸突变为酪氨酸。
(2)分离纯化Tk-Rubisco突变体3Y-R。
(3)调整3Y-R蛋白的浓度为3μM，在蛋白溶液中滴加浓度为5M的NaCl，使得溶液的盐离子终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5M，并在4℃条件下静置12h，得到3Y-R线性组装材料。
2、3Y-R线性组装材料的酶活性、耐热稳定性以及重复使用率的测定
准备酶反应速率测定试剂：
1)BufferA：6.0mL 333mM Tris-HCl，pH 8.3，1.0mL 100mM MgCl2，1.0mL 1.32MKHCO3，1.0mL 100mM还原型谷胱甘肽，55mgATP；
2)2.0mM NADH水溶液；
3)100mM 1,5-二磷酸核酮糖水溶液；
4)酶偶联试剂：562.5U/ml 3-磷酸甘油酸磷酸激酶，125U/ml甘油醛-3-磷酸脱氢酶，260U/mL丙糖-磷酸异构酶，22.5U/mL甘油磷酸脱氢酶。
所有溶液在25℃孵育3分钟，以平衡溶液温度。
配置1ml的反应体系：500μLBuffer-A，100μLNADH水溶液，100μL酶偶联反应液，200μL 1,5-二磷酸核酮糖以及100μL待测酶反应溶液。均匀混合上述溶液，开始反应，反应5分钟后加入无水乙醇终止反应，检测溶液在340nm处吸光值下降，根据吸光值的下降计算得到NADH的消耗量并推算出CO2的固定量(图1)。
反应体系中NADH的初始浓度为0.2mM，反应一开始后，3Y-R线性组装材料不断消耗体系中的HCO3 -生成3-磷酸甘油酸，并在偶联酶的作用下继续转化3-磷酸甘油酸生成磷酸2-羟基丙酮，在这个转化过程中需要消耗NADH作为氢供体，随着反应的进行，体系中的NADH的量逐渐下降，而NDAH在340nm处有最大紫外吸收，通过检测反应溶液在340nm处的紫外吸光值的连续变化，通过NADH的吸光值与浓度的标准曲线得到NADH的减少量。由于3Y-R线性组装材料是固体，为了避免因离心除去3Y-R线性组装材料时会带走溶液中的NADH对实验结果造成影响，对NADH在三种情况下的吸光值进行了比较，发现离心并不会对NADH的吸光值造成影响，因此本实验方法用于检测3Y-R线性组装材料对CO2的固定是真实可信的。
3Y-R线性组装材料固定CO2的反应式：
1,5-二磷酸核酮糖酶(Rubisco)(3Y-R线性组装材料)：
6CO2+6H2O+6RuBP＝123-PGA；
反应体系中总体发生的反应为：
CO2+H2O+RuBP+2ATP+2NADH＝2NAD++2G3P+2ADP+2Pi；
即固定一分子CO2需要消耗2分子的NADH，通过NADH的消耗量得到CO2的固定量。
NADH吸光值与浓度之间的关系为：A＝5.4387c-0.0057，R2＝0.9998，c为反应溶液中剩余的NADH的含量。
将3Y-R线性组装材料在45℃、55℃、65℃、75℃、85℃和95℃温度下加热30min，加热后重复上述酶活性反应测定步骤，测定3Y-R组装材料的耐热稳定性。在重复使用率的测定中，吸取新鲜的含有3Y-R组装材料的反应液进行初始酶活性测定，将反应后的溶液离心，收集沉淀，用含有0.3M NaCl的Tris-HCl缓冲液将沉淀轻轻吹起，保证蛋白浓度与前一次测定时相同，重复上述酶活性反应测定步骤，测定3Y-R线性组装材料可重复使用率。最后通过计算得出3Y-R线性组装材料的酶活性比野生型Rubisco提高1.4倍，在75℃时还能比野生型Rubisco活性高1.25倍，而且线性组装材料在重复使用16次后还可以保持82％的初始酶活性(表1和图2)。
表1不同酶的酶活性值大小(用平均反应速率表示)
Figure BDA0002983843840000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种Tk-Rubisco突变体、线性组装材料及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Met Val Glu Lys Phe Asp Thr Ile Tyr Asp Tyr Tyr Val Asp Lys Gly
1 5 10 15
Tyr Glu Pro Ser Lys Lys Arg Asp Ile Ile Ala Val Phe Arg Val Thr
20 25 30
Pro Ala Glu Gly Tyr Thr Ile Glu Gln Ala Ala Gly Ala Val Ala Ala
35 40 45
Glu Ser Ser Thr Gly Thr Trp Thr Thr Leu Tyr Pro Trp Tyr Glu Gln
50 55 60
Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ser Ala Lys Ala Tyr Asp Phe His Asp Met
65 70 75 80
Gly Asp Gly Ser Trp Ile Val Arg Ile Ala Tyr Pro Phe His Ala Phe
85 90 95
Glu Glu Ala Asn Leu Pro Gly Leu Leu Ala Ser Ile Ala Gly Asn Ile
100 105 110
Phe Gly Met Lys Arg Val Lys Gly Leu Arg Leu Glu Asp Leu Tyr Phe
115 120 125
Pro Glu Lys Leu Ile Arg Glu Phe Asp Gly Pro Ala Phe Gly Ile Glu
130 135 140
Gly Val Arg Lys Met Leu Glu Ile Lys Asp Arg Pro Ile Tyr Gly Val
145 150 155 160
Val Pro Lys Pro Lys Val Gly Tyr Ser Pro Glu Glu Phe Glu Lys Leu
165 170 175
Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Asn Gly Ala Asp Tyr Met Lys Asp Asp Glu
180 185 190
Asn Leu Thr Ser Pro Trp Tyr Asn Arg Phe Glu Glu Arg Ala Glu Ile
195 200 205
Met Ala Lys Ile Ile Asp Lys Val Glu Asn Glu Thr Gly Glu Lys Lys
210 215 220
Thr Trp Phe Ala Asn Ile Thr Ala Asp Leu Leu Glu Met Glu Gln Arg
225 230 235 240
Leu Glu Val Leu Ala Asp Leu Gly Leu Lys His Ala Met Val Asp Val
245 250 255
Val Ile Thr Gly Trp Gly Ala Leu Arg Tyr Ile Arg Asp Leu Ala Ala
260 265 270
Asp Tyr Gly Leu Ala Ile His Gly His Arg Ala Met His Ala Ala Phe
275 280 285
Thr Arg Asn Pro Tyr His Gly Ile Ser Met Phe Val Leu Ala Lys Leu
290 295 300
Tyr Arg Leu Ile Gly Ile Asp Gln Leu His Val Gly Thr Ala Gly Ala
305 310 315 320
Gly Lys Leu Glu Gly Gly Lys Trp Asp Val Ile Gln Asn Ala Arg Ile
325 330 335
Leu Arg Glu Ser His Tyr Lys Pro Asp Glu Asn Asp Val Phe His Leu
340 345 350
Glu Gln Lys Phe Tyr Ser Ile Lys Ala Ala Phe Pro Thr Ser Ser Gly
355 360 365
Gly Leu His Pro Gly Asn Ile Gln Pro Val Ile Glu Ala Leu Gly Thr
370 375 380
Asp Ile Val Leu Gln Leu Gly Gly Gly Thr Leu Gly His Pro Asp Gly
385 390 395 400
Pro Ala Ala Gly Ala Arg Ala Val Arg Gln Ala Ile Asp Ala Ile Met
405 410 415
Tyr Tyr Ile Pro Leu Asp Glu Tyr Ala Tyr Thr His Lys Glu Leu Ala
420 425 430
Arg Ala Leu Glu Lys Trp Gly His Val Thr Pro Val
435 440

Claims (5)

1.一种能够体外参与卡尔文循环的Tk-Rubisco突变体3Y-R，其特征在于，所述3Y-R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种包含权利要求1所述3Y-R的3Y-R线性组装材料，其特征在于，所述3Y-R线性组装材料的制备原料包括3Y-R和盐溶液；
在所述3Y-R线性组装材料中，3Y-R和盐溶液的浓度比为(1～5)μM：(0～0.5)M；
所述盐溶液为NaCl溶液。
3.权利要求2所述3Y-R线性组装材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述3Y-R的溶液中与所述盐溶液混合，4℃静置12～24h，得所述3Y-R线性组装材料；
所述混合后形成的混合溶液的pH值为7.5～8.5。
4.权利要求1所述3Y-R或权利要求2所述3Y-R线性组装材料在体外转化CO2为有机物中的应用；所述体外转化的底物为1,5-二磷酸核酮糖和CO2；
所述有机物为3-磷酸甘油酸和磷酸2-羟基丙酮。
5.权利要求1所述3Y-R或权利要求2所述3Y-R线性组装材料在缓解温室效应中的应用。
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