EP3574083A1 - Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d'intérêt - Google Patents

Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d'intérêt

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EP3574083A1
EP3574083A1 EP18702647.1A EP18702647A EP3574083A1 EP 3574083 A1 EP3574083 A1 EP 3574083A1 EP 18702647 A EP18702647 A EP 18702647A EP 3574083 A1 EP3574083 A1 EP 3574083A1
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EP
European Patent Office
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microorganism
gene
genetically modified
interest
molecule
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Pending
Application number
EP18702647.1A
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German (de)
English (en)
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Cédric BOISART
Nicolas Morin
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EPPEN EUROPE
Original Assignee
Enobraq
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Publication date
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    • C12Y207/01019—Phosphoribulokinase (2.7.1.19)
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    • C12Y207/02003—Phosphoglycerate kinase (2.7.2.3)
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01031—6-Phosphogluconolactonase (3.1.1.31)
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01039—Ribulose-bisphosphate carboxylase (4.1.1.39)

Definitions

  • the invention relates to a genetically modified microorganism capable of using carbon dioxide as an at least partial carbon source for the production of molecules of interest. More particularly, the invention relates to a microorganism in which at least the glycolysis pathway is at least partially inhibited. The invention also relates to processes for the production of at least one molecule of interest using such a microorganism.
  • fermentation processes are used to cause molecules to be produced by a microorganism from a fermentable carbon source, such as glucose.
  • Bioconversion processes have also been developed, to allow a microorganism to convert a co-substrate, not assimilable by said microorganism, into a molecule of interest.
  • a source of carbon is necessary, not for the actual production of the molecule of interest, but for the production of cofactors, and more particularly of NADPH, which may be necessary for bioconversion.
  • the production yield by such microbiological processes is low mainly because of cofactor requirements and the difficulty of balancing the redox metabolic reactions.
  • a carbon source that can be assimilated by the microorganism is always necessary. In other words, currently to produce a molecule of interest with a microbiological process, it is necessary to provide a molecule (glucose, or other), certainly of less industrial value, but which is sufficient to make the production of certain molecules not economically attractive.
  • the inventors have discovered that it is possible to increase the production yield of molecules of interest by coupling part of the Calvin cycle (PRK / RuBisCO) to at least partial inhibition of glycolysis.
  • the inventors have also discovered that it is possible to increase the exogenous CO2 consumption during the production of molecules of interest, while also at least partially inhibiting the oxidative branch of the pentose phosphate pathway.
  • the microorganisms thus developed make it possible to produce on a large scale and with an industrially interesting yield a large number of molecules of interest, such as amino acids, organic acids, terpenes, terpenoids, peptides, fatty acids, polyols, etc.
  • the subject of the invention is therefore a genetically modified microorganism expressing a functional RuBisCO enzyme and a phosphoribulokinase (PRK), and in which the glycolysis pathway is at least partially inhibited, said microorganism being genetically modified so as to produce an exogenous molecule of interest and / or overproducing an endogenous molecule of interest, other than the enzyme RuBisCO or phosphoribulokinase.
  • PRK phosphoribulokinase
  • the genetically modified microorganism has an oxidative branch of the pentose phosphate pathway also at least partially inhibited.
  • the invention also relates to the use of a genetically modified microorganism according to the invention, for the production or overproduction of a molecule of interest, preferentially chosen from amino acids, peptides, proteins, vitamins, sterols, flavonoids, terpenes, terpenoids, fatty acids, polyols and organic acids.
  • the present invention also relates to a biotechnological process for producing or overproducing at least one molecule of interest, characterized in that it comprises a step of culturing a genetically modified microorganism according to the invention, under conditions allowing the synthesis or the bioconversion, by said microorganism, of said molecule of interest, and optionally a step of recovering and / or purifying said molecule of interest.
  • It also relates to a method for producing a molecule of interest comprising (i) the insertion of at least one sequence coding for an enzyme involved in the synthesis or bioconversion of said molecule of interest in a recombinant microorganism according to the invention (ii) culturing said microorganism under conditions permitting the expression of said enzyme and optionally (iii) recovering and / or purifying said molecule of interest.
  • Figure 1 General scheme of glycolysis, the pentose phosphate pathway and Entner-Doudoroff pathway;
  • FIG. 1 Schematic representation of the inhibition of the glycolysis pathway, according to the invention.
  • Figure 3 Schematic representation of the inhibition of the glycolysis pathway, combined with the inhibition of the oxidative branch of the pentose phosphate pathway, according to the invention.
  • recombinant microorganism modified microorganism
  • recombinant host cell refers to microorganisms that have been genetically engineered to express or overexpress endogenous nucleotide sequences to express heterologous nucleotide sequences. or that have an alteration of the expression of an endogenous gene.
  • “Alteration” means that the expression of the gene, or level of an RNA molecule or equivalent RNA molecules encoding one or more polypeptides or polypeptide subunits, or the activity of one or more polypeptides or polypeptide subunits is regulated, such that the expression, level, or activity is greater or less than that observed in the absence of modification.
  • recombinant microorganism refers not only to the particular recombinant microorganism, but to the progeny or potential progeny of such a microorganism. As some changes may occur in subsequent generations because of mutation or environmental influences, this offspring may not be identical to the parent cell, but is still included in the term as used here.
  • an at least partially “inhibited” or “inactivated” metabolic pathway refers to an altered metabolic pathway, which can no longer proceed properly in the microorganism in question, compared to the same wild-type microorganism (not genetically modified to inhibit said metabolic pathway).
  • the metabolic pathway can be interrupted, resulting in the accumulation of an intermediate metabolite.
  • Such an interruption can be obtained for example by inhibition of the enzyme necessary for the degradation of an intermediate metabolite of the metabolic pathway in question and / or by inhibition of the expression of the gene coding for this enzyme.
  • the metabolic pathway can also be attenuated, that is, slowed down. Such attenuation can be obtained for example by partial inhibition of one or more enzymes involved in the metabolic pathway and / or by partial inhibition of the expression of a gene coding for at least one of these enzymes and / or by playing cofactors needed for some reactions.
  • the expression "at least partially inhibited metabolic pathway” means that the level of the metabolic pathway considered is reduced by at least 20%, more preferably at least 30%, 40%, 50%, or more, compared to the level in a wild microorganism.
  • the reduction can be greater, and in particular be at least greater than 60%, 70%, 80%, 90%.
  • the inhibition may be complete, in that the metabolic pathway considered is not used at all by the said microorganism. According to the invention, such an inhibition can be temporary or permanent.
  • the expression "inhibition of the expression of a gene” is understood to mean that said gene is no longer expressed in the microorganism in question or that its expression is reduced, compared with the wild-type microorganism (which is not genetically modified to inhibit the formation of a particular gene). expression of the gene), leading to the absence of production of the corresponding protein or to a significant decrease in its production, and in particular to a decrease of greater than 20%, more preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%.
  • the inhibition can be complete, that is to say that the protein encoded by said gene is no longer produced at all.
  • the inhibition of the expression of a gene can in particular be obtained by deletion, mutation, insertion and / or substitution of one or more nucleotides in the gene under consideration. Preferentially, the inhibition of the expression of the gene is obtained by total deletion of the corresponding nucleotide sequence.
  • any method of inhibition of a gene known per se by those skilled in the art and applicable to a microorganism may be used.
  • inhibition of gene expression can be achieved by homologous recombination (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci US A 2000; 97: 6640-5; Lodish et al., Molecular Cell Biology 4 th ed 2000.
  • the inhibition of the expression of the gene is obtained by knockout techniques. Inhibition of gene expression can also be achieved by gene silencing using interfering, ribozyme or antisense RNAs (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine).
  • interfering RNA or "RNAi” refers to any RNAi molecule (e.g. single-stranded RNA or double-stranded RNA) that can block expression of a target gene and / or facilitate degradation. corresponding mRNA.
  • Inhibition of the gene can also be achieved by genomic editing methods that allow direct genetic modifications to a given genome via the use of zinc finger nucleases (Kim et al., PNAS; 93: 1156). 1160), effector nucleases of the transcriptional activator type, called "TALEN” (Ousterout et al., Methods Mol Biol 2016, 1338: 27-42, doi: 10.1007 / 978-1-4939-2932-0_3), a system combining Cas9-like nucleases with short, regularly spaced, pooled palindromic repeats called CRISPR (Mali et al, Nat Methods, 2013 Oct; 10 (10): 957-63, doi: 10.1038 / nmeth.2649) or meganucleases (Daboussi et al., Nucleic Acids Res., 2012 40: 6367-79). Inhibition of gene expression can also be achieved by inactivation of the protein encoded by said gene.
  • TALEN effector nu
  • NADPH-dependent or “NADPH-consuming” biosynthesis or bioconversion is meant in the context of the invention all the biosynthetic or bioconversion pathways in which one or more enzymes require the concomitant addition of electrons obtained. by the oxidation of an NADPH cofactor.
  • Routes of biosynthesis or bioconversion "NADPH-dependent” relate in particular to the synthesis of amino acids (eg arginine, lysine, methionine, threonine, proline, glutamate, homoserine, isoleucine, valine) ⁇ -aminobutyric acid, terpenoids and terpenes (eg farnesene), vitamins and precursors (eg pantoate, pantothenate, transneurosporene, phylloquinone, tocopherols), sterols (eg squalene, cholesterol, testosterone, progesterone, cortisone), flavonoids (eg frambinone, vestinone), organic acids (eg citric acid, succinic acid) oxalic acid, itaconic acid, coumaric acid, 3-hydroxypropionic acid), polyols (eg sorbitol, xylitol, glycerol), polyamines (eg sper
  • exogenous refers to molecules that are not normally or naturally found in and / or produced by the microorganism of interest.
  • endogenous or “native” in reference to various molecules refers to molecules that are normally or naturally found in and / or produced by the microorganism under consideration.
  • the invention provides genetically modified microorganisms for the production of a molecule of interest, endogenous or exogenous.
  • genetically modified microorganism is meant that the genome of the microorganism has been modified so as to integrate a nucleic sequence encoding an enzyme involved in the biosynthetic pathway or bioconversion of a molecule of interest, or encoding a biologically active fragment of it.
  • Said nucleic sequence may have been introduced into the genome of said microorganism or one of its ascendants, by means of any suitable molecular cloning method.
  • the genome of the microorganism refers to all the genetic material contained in said microorganism, including the extrachromosomal genetic material contained for example in plasmids, episomes, synthetic chromosomes, etc.
  • the nucleic acid sequence introduced may be a heterologous sequence, that is to say one that does not exist in the natural state in said microorganism, or a homologous sequence.
  • a transcriptional unit containing the nucleic sequence of interest placed under the control of one or more promoter (s) is introduced into the genome of the microorganism.
  • Such a transcriptional unit also advantageously comprises the usual sequences such as transcriptional terminators and, if appropriate, other transcriptional regulation elements.
  • Promoters useful in the context of the present invention include constitutive promoters, i.e., promoters that are active in most cellular states and environmental conditions, as well as inducible promoters that are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli. thus inducing a variable level of expression depending on the presence or absence of these stimuli.
  • constitutive promoters i.e., promoters that are active in most cellular states and environmental conditions
  • inducible promoters that are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli. thus inducing a variable level of expression depending on the presence or absence of these stimuli.
  • the microorganism is a yeast
  • inducible promoters that can be used in yeast are the tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1 and PHO5 promoters.
  • the genetically modified microorganism according to the invention has the following characteristics:
  • the microorganism is a eukaryotic cell, preferably chosen from yeasts, fungi, microalgae or a prokaryotic cell, preferably a bacterium or cyanobacterium.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is a yeast, preferably chosen from ascomycete yeasts (Spermophthomceae and Saccharomycetaceae), basidiomycete yeasts (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, and Filobasidiella) and deuteromycete yeasts belonging to the yeast.
  • the genetically modified yeast according to the invention belongs to the genus Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, or Debaryomyces.
  • the genetically modified yeast according to the invention is chosen from among Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii and Lipomyces starkeyi.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is a fungus, and more particularly a "filamentous" fungus.
  • “filamentous fungi” refers to all filamentous forms of the Eumycotina subdivision.
  • the genetically modified fungus according to the invention belongs to the genus Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus or Pyricularia.
  • the genetically modified fungus according to the invention is chosen from Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, and Trichoderma viride.
  • the microorganism genetically modified according to the invention is a microalgae.
  • microalgae refers to all eukaryotic-type microscopic algae, preferentially belonging to the classes or superclasses of Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomaceous or Bacillariophyta, Euglenophyceae, Rhodophyceae, or Trebouxiophyceae.
  • the microalgae genetically modified according to the invention are chosen from Nannochloropsis sp. (eg Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina), Tetraselmis sp.
  • Chlorella sp (eg Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. (eg Chlorella salina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (eg Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp.
  • Chlorella salina Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris
  • Chlamydomonas sp (eg Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is a bacterium, preferentially chosen from phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteria , Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, or Verrucomicrobia.
  • the bacterium genetically modified according to the invention belongs to the genus Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc,
  • the bacterium genetically modified according to the invention is selected from the species Agwbacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium Ijungdahlii , Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, E.
  • the microorganism can naturally express functional RuBisCO and PRK. This is the case, for example, with photosynthetic microorganisms, such as microalgae or cyanobacteria.
  • RuBisCO there are several forms of RuBisCO in nature (Tabita et al, J Exp Bot 2008; 59 (7): 1515-24. Doi: 10.1093 / jxb / erm361).
  • Forms I, II and III catalyze the carboxylation and oxygenation reactions of ribulose-1,5-bisphosphate.
  • Form I is present in eukaryotes and bacteria. It consists of two types of subunits: large subunits (RbcL) and small subunits (RbcS).
  • the functional enzymatic complex is a hexadecamer consisting of eight L subunits and eight S subunits.
  • RbcX (Liu et al. , Nature, 2010 Jan 14, 463 (7278): 197-202, doi: 10.1038 / nature08651).
  • Form II is mainly found in proteobacteria, archaea (Archaea or archaebacteria) and dinoflagellate algae. Its structure is much simpler: it is a homodimer (consisting of two identical RbcL subunits).
  • the genes encoding type I RuBisCO may be called rbcLIrbcS (eg, Synechococcus elongatus), or cbxLC / cbxSC, cfxLC / cfxSC, cbbLIcbbS (eg, Cupriavidus necator).
  • the genes encoding type II RuBisCO are generally called cbbM (eg, Rhodospirillum rubrum).
  • Form III is present in archaea. It is generally found in the form of RbcL subunit dimers, or dimer pentamers.
  • RuBisCO may be called rbcL (for example, Thermococcus kodakarensis), cbbL (for example, Haloferax sp.).
  • PRK Two classes of PRKs are known: Class I enzymes found in proteobacteria are octamers, while Class II enzymes in cyanobacteria and plants are tetramers or dimers.
  • the genes encoding PRK may be called prk (eg, Synechococcus elongatus), prkA (eg, Chlamydomonas reinhardtii), prkB (eg, Escherichia coli), prkl, prk2 (eg, Leptolyngbya).
  • prk eg, Synechococcus elongatus
  • prkA eg, Chlamydomonas reinhardtii
  • prkB eg, Escherichia coli
  • prkl prk2 (eg, Leptolyngbya).
  • cbbP eg, Nitrobacter vulgaris
  • cfxP eg, Cupriavidus necator
  • the microorganism used does not naturally express functional RuBisCO and PRK
  • said microorganism is genetically modified to express a heterologous RuBisCO and PRK.
  • the microorganism is transformed so as to integrate into its genome one or more expression cassettes integrating the sequences coding for said proteins, and advantageously the appropriate transcriptional factors.
  • RuBisCO type I where the introduction and expression of genes encoding a specific chaperone (Rbcx) and general chaperones (GroES and GroEL, for example) are necessary to obtain a Functional RuBisCO.
  • the application WO2015 / 107496 describes in detail how to genetically modify a yeast so that it expresses a RuBisCO of type I and a functional PRK. It is also possible to refer to the method described in GUADALUPE-MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013).
  • the microorganism is genetically engineered to express type I RuBisCO. In another embodiment, the microorganism is genetically engineered to express an IL-type RuBisCO. In another embodiment, the microorganism is genetically modified. to express a RuBisCO type III.
  • the glycolysis pathway is at least partially inhibited, so that the microorganism is no longer able to normally use this pathway ( Figure 1 - glycolysis).
  • the microorganism no longer has the ability to assimilate glucose in a manner similar to a wild-type microorganism, in which the glycolysis pathway has not been inhibited (independently of any other genetic modification).
  • the microorganism is genetically modified so as to inhibit, in whole or in part, the glycolysis downstream of the production of glyceraldehyde-3-phosphate (G3P).
  • G3P glyceraldehyde-3-phosphate
  • glycolysis is inhibited upstream of the production of 1,3-bisphospho-D-glycerate (1,3-BPG) or upstream of the production of 3-phosphoglycerate (3PG).
  • glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) and 3-phosphoglycerate (3PG) can be managed by (i) two concomitantly acting enzymes, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (EC). 1.2.1.12, abbreviated GAPDH or more rarely G3PDH) and phosphoglycerate kinase (EC 2.7.2.3, abbreviated PGK), or (ii) by a single non-phosphorylating glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase enzyme (EC 1.2.1.9, abbreviated GAPN).
  • EC glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • GAPN non-phosphorylating glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase enzyme
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase catalyzes the reversible conversion of G3P to 1,3-bisphospho-D-glycerate (1,3-BPG), using the NADVNADH pair as the electron donor / acceptor in the sense of the reaction.
  • the genes coding for GAPDH may be called gapA, gapB, gapC (eg Escherichia coli, Arabidopsis thaliana), GAPDH, GAPD, G3PD, GAPDHS (eg Homo sapiens), TDH1, TDH2, TDH3 (eg Saccharomyces cerevisiae).
  • Phosphoglycerate kinase catalyzes the reversible conversion of 1,3-BPG to 3PG, using the ATP / ADP pair as a cofactor.
  • the genes encoding PGK may be called PGK, PGK1, PGK2, PGK3, pgkA, PGKB, PGKC, cbbK, cbbKC, cbbKP (eg Cupriavidus necator).
  • Non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase catalyzes the conversion of G3P to 3PG without passing through 1,3-BPG. This reaction is catalyzed in the presence of the cofactor couple NADPVNADPH which plays the role of electron acceptor.
  • the genes encoding GAPN may be called GAPN (eg Bacillus sp., Streptococcus sp.), GAPN1 (eg Chlamydomonas sp.).
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the expression of the gene encoding phosphoglycerate kinase may also be at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene coding for non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • Tables 3, 4 and 5 below list, by way of example, the sequences encoding a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, a phosphoglycerate kinase and a non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase which can be inhibited depending on the microorganism. target. The person skilled in the art knows which gene corresponds to the enzyme of interest to be inhibited as a function of the microorganism. Table 3: Examples of sequences coding for a GAPDH
  • Table 5 Examples of sequences coding for a GAPN
  • the production of 3-phosphoglycerate (3PG) is no longer possible through glycolysis, or at least greatly reduced, in the genetically modified microorganism according to the invention.
  • the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae in which the expression of the gene TDH1 (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID: 853465) and / or TDH3 (Gene ID: 853106) is less partially inhibited.
  • the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae in which the expression of the PGK1 gene (Gene ID: 5230) is at least partially inhibited.
  • the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae in which the expression of the PGK1 gene (Gene ID: 5230), the expression of the TDH1 gene (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID: 853465 ) and / or the expression of the TDH3 gene (Gene ID: 853106) are at least partially inhibited.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the gapA gene (Gene ID: 947679) is at least partially inhibited.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the pgk gene (Gene ID: 947414) is at least partially inhibited.
  • the microorganism is an E. coli bacterium in which the expression of the pgk gene (Gene ID: 947414), and / or the expression of the gapA gene (Gene ID: 947679) are at least partially inhibited.
  • the genetically modified microorganism which expresses a functional RuBisCO and PRK, is on the other hand able to produce 3PG by capturing C0 2 , from the ribulo se-5-phosphate produced by the pentose phosphate pathway ( Figure 2).
  • the enzymes necessary for the metabolism of 3PG pyruvate are not inhibited in the microorganism, said microorganism can then metabolize the 3PG to produce pyruvate and ⁇ .
  • the genetically modified microorganism is able to produce pyruvate and NADPH cofactors by using CO2 as a complementary carbon source.
  • the term "complementary" carbon source means that the microorganism uses CO2 as a partial carbon source, in addition to the carbon atoms provided by fermentable sugars (glucose, galactose, sucrose, fructose, etc.), which constitutes the majority or main source of carbon for the production of pyruvate.
  • the genetically modified microorganism according to the invention makes it possible to increase the carbon yield by fixing and using the CO2 normally lost during glucose metabolism by means of pentose phosphates, for the production of pyruvate (and subsequently molecules of interest).
  • the genetically modified microorganism according to the invention is also modified so that the oxidative branch of the pentose phosphate pathway is also at least partially inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so as to inhibit the oxidative branch of the pentose phosphate pathway upstream of the ribulose-5-phosphate production (FIG. 1 - pentose phosphate pathway).
  • the interruption of the oxidative branch of the pentose phosphate pathway upstream of the production of ribulose-5-phosphate (Ru5P) specifically targets one or more reactions in the process of synthesizing Ru5P from glucose-6-phosphate (G6P ).
  • This synthesis is generally catalyzed by the successive actions of three enzymes: (i) glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49, abbreviated G6PDH), (ii) 6-phosphogluconolactonase (EC 3.1.1.31, abbreviated PGL) , and (iii) 6-phosphogluconate dehydrogenase (EC 1.1.1.44, abbreviated PGD).
  • G6PDH Glucose-6-phosphate dehydrogenase catalyzes the first reaction of the pentose phosphate pathway, that is, the oxidation of glucose-6-phosphate to 6-phosphogluconolactone (6PGL), with concomitant reduction of a molecule of NADP + in NADPH.
  • the genes coding for G6PDH may be called G6PD (for example in Homo sapiens), G6pdx (for example in Mus musculus), gsdA (for example in Aspergillus nidulans), zwf (for example in Escherichia coli), or ZWF1 (for example in Saccharomyces cerevisiae).
  • 6-Phosphogluconolactonase is a hydrolase catalyzing the synthesis of 6-phosphogluconate (6PGA) from 6PGL.
  • the genes coding for PGL may be called pgl (for example in Escherichia coli, Synechocystis sp.) Pgls (for example in Rhodobacteraceae bacterium), or SOL (for example in Saccharomyces cerevisiae).
  • 6-Phosphogluconate dehydrogenase is an oxidoreductase catalyzing the synthesis of Ru5P from 6PGA, with concomitant reduction of a NADP + molecule to NADPH and emission of a CO 2 molecule.
  • the genes coding for PGD may be called gnd (for example in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae), PGD (for example in Homo sapiens), gntZ (for example in Bacillus subtilis), or 6-PGDH. (for example, Lactobacillus paracollinoides).
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding 6-phosphogluconolactonase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • Tables 6, 7 and 8 below list, by way of example, the sequences encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconolactonase and 6-phosphogluconate dehydrogenase which can be inhibited depending on the target microorganism.
  • the person skilled in the art knows which gene corresponds to the enzyme of interest to be inhibited as a function of the microorganism.
  • ribulo se-5-phosphate (Ru5P) is no longer possible via pentose phosphates, or at least greatly reduced, in the genetically modified microorganism according to the invention.
  • the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae in which the expression of the ZWF1 gene is at least partially inhibited.
  • the yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae is genetically modified so that the expression of the TDH1, TDH2, TDH3 and / or PGK1 genes, and the expression of the ZWF1 gene are at least partially inhibited.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the zw / gene is at least partially inhibited.
  • the bacterium of the genus Escherichia coli is genetically modified so that the expression of the gapA and / or pgk genes and the expression of the zwf gene are at least partially inhibited.
  • the microorganism is a filamentous fungus of the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger or Aspergillus terreus, genetically modified so that the expression of the pgk and gsdA genes is partially inhibited.
  • the genetically modified microorganism which expresses a functional RuBisCO and PRK, and whose glycolysis pathway and the oxidative branch of the pentose phosphate pathway are at least partially inhibited, is no longer capable of producing 3PG by way of glycolysis or Ru5P by the oxidative branch of the pentose phosphate pathway. It is however able to produce Ru5P by deflecting the production of fructose-6-phosphate (F6P) and / or glyceraldehyde-3-phosphate (G3P), produced at the beginning of glycolysis (upstream of the inhibition).
  • F6P fructose-6-phosphate
  • G3P glyceraldehyde-3-phosphate
  • transketolase EC 2.2.1.1
  • transaldolase EC 2.2.1.2
  • ribose-5-phosphate isomerase EC 5.3.1.6
  • ribulose-5-phosphate epimerase EC 5.1.3.1
  • microorganism Since the enzymes necessary for the metabolism of 3PG to pyruvate are not inhibited in the microorganism according to the invention, said microorganism can then metabolize 3PG so as to produce pyruvate and ⁇ .
  • the genetically modified microorganism is able to produce pyruvate using exogenous C0 2 as a complementary carbon source.
  • the genetically modified microorganism according to the invention makes it possible to increase the carbon yield, by fixing and using exogenous CO2, for the production of pyruvate (and subsequently of molecules of interest). Again, there is an increase in carbon yield.
  • the genetically modified microorganism according to the invention has an Entner-Doudoroff pathway, and this pathway is at least partially inhibited.
  • This pathway mainly found in bacteria (especially Gram-type), is an alternative to glycolysis and the pentose pathway for the production of pyruvate from glucose. More precisely, this pathway is connected to the pentose phosphate pathway at the ⁇ -gluconate level to supply glycolysis at the level of pyruvate in particular.
  • the microorganism is genetically modified so as to inhibit the reactions of the Entner-Doudoroff pathway downstream of the production of 6-phosphogluconate.
  • This Inhibition eliminates a possible competitive pathway, and ensures the availability of 6-phosphogluconate as a substrate for PRK / RuBisCO engineering.
  • 6-Phosphogluconate dehydratase catalyzes the dehydration of 6-phosphogluconate to 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate.
  • the genes encoding 6-phosphogluconate dehydratase may be called edd (GenBank NP_416365, for example, in Escherichia coli), or ilvD (for example, in Mycobacterium sp.).
  • 2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase catalyzes the synthesis of a pyruvate molecule and a glyceraldehyde-3-phosphate molecule from the 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate produced by the 6- phosphogluconate dehydratase.
  • the genes coding for 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase may be called eda (GenBank NP_416364, for example, in Escherichia coli), or kdgA (for example in Thermoproteus tenax), or dgaF ( for example in Salmonella typhimurium).
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding 6-phosphogluconate dehydratase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene coding for 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • Tables 9 and 10 below list, by way of example, the sequences encoding a 6-phosphogluconate dehydratase and a 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase which can be inhibited depending on the target microorganism. The person skilled in the art knows which gene corresponds to the enzyme of interest to be inhibited as a function of the microorganism. Table 9: Examples of sequences coding for an EDD
  • the production of pyruvate is no longer possible via the Entner-Doudoroff pathway, or at least greatly reduced.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the edd gene is at least partially inhibited.
  • the bacterium of the genus Escherichia coli is genetically modified so that the expression of gapA, and edd genes are at least partially inhibited.
  • the genetically modified microorganism which expresses a functional RuBisCO and PRK, and whose pathway of glycolysis and the Entner-Doudoroff pathway are at least partially inhibited, is no longer capable of producing 3PG by the route of glycolysis or pyruvate by the Entner-Doudoroff pathway.
  • the carbon flux from glucose is therefore oriented preferentially towards PRK / RuBisCO engineering.
  • the genetically modified microorganism is transformed so as to produce an exogenous molecule of interest and / or to overproduce an endogenous molecule of interest.
  • a molecule of interest is preferably a small organic molecule of molecular mass less than or equal to 0.8 kDa.
  • the genetic modifications made to the microorganism make it possible to improve the carbon yield of the synthesis and / or bioconversion pathways of molecules of interest.
  • an "improved" yield is understood in terms of the amount of finished product.
  • the carbon yield corresponds in the context of the invention to the ratio of the amount of finished product / amount of fermentable sugar, especially by weight.
  • the carbon yield is increased in the genetically modified microorganisms according to the invention, compared with wild microorganisms, placed under identical culture conditions.
  • the carbon yield is increased by 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, or more.
  • the genetically modified microorganism according to the invention can produce a larger quantity of the molecules of interest (finished product) compared to the heterologous molecules produced by a microorganism genetically modified simply to produce or overproduce this molecule.
  • the microorganism genetically can also overproduce an endogenous molecule compared to the wild-type microorganism.
  • the overproduction of an endogenous molecule is mainly understood in terms of quantities.
  • the genetically modified microorganism produces at least 20%, 30%, 40%, 50%, or more by weight of the endogenous molecule than the wild-type microorganism.
  • the microorganism according to the invention is genetically modified so as to produce or overproduce at least one molecule among amino acids, terpenoids, terpenes, vitamins and / or precursors of vitamins, sterols, flavonoids, organic acids. polyols, polyamines, aromatic molecules obtained from stereospecific hydroxylation, via NADP-dependent cytochrome p450, etc.
  • the microorganism is genetically modified to overproduce at least one amino acid, preferentially chosen from arginine, lysine, methionine, threonine, proline, glutamate, homoserine, isoleucine, valine and ⁇ -aminobutyric acid.
  • the microorganism is genetically engineered to produce or overproduce terpenoid pathway molecules, such as farnesene, and the terpenes pathway.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a vitamin or a precursor, preferentially chosen from pantoate, pantothenate, transneurosporene, phylloquinone and tocopherols.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a sterol, preferably selected from squalene, cholesterol, testosterone, progesterone and cortisone.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a flavonoid, preferably selected from rambinone and vestinone.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce an organic acid, preferably chosen from coumaric acid, 3-hydroxypropionic acid, citric acid, oxalic acid, succinic acid, and itaconic acid.
  • an organic acid preferably chosen from coumaric acid, 3-hydroxypropionic acid, citric acid, oxalic acid, succinic acid, and itaconic acid.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a polyol, preferably selected from sorbitol, xylitol and glycerol.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a polyamine, preferentially spermidine.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce an aromatic molecule from a stereospecific hydroxylation, via a NADP-dependent cytochrome p450, preferentially chosen from phenylpropanoids, terpenes, lipids, tannins, flavors, hormones.
  • the genetically modified microorganism is advantageously cultured in a culture medium comprising the substrate to be converted.
  • the production or overproduction of a molecule of interest by a genetically modified microorganism according to the invention is obtained by culturing said microorganism in an appropriate culture medium known to those skilled in the art.
  • appropriate culture medium generally refers to a sterile culture medium providing nutrients essential or beneficial to the maintenance and / or growth of said microorganism, such as carbon sources; nitrogen sources such as ammonium sulphate; sources of phosphorus, for example, potassium phosphate monobasic; trace elements, for example, salts of copper, iodide, iron, magnesium, zinc or molybdate; vitamins and other growth factors such as amino acids or other growth promoters.
  • Antifoam can be added as needed.
  • this appropriate culture medium can be chemically defined or complex.
  • the culture medium can thus be of identical or similar composition to a synthetic medium, as defined by Verduyn et al., (Yeast, 1992.
  • the culture medium may comprise a simple carbon source, such as glucose, galactose, sucrose, molasses, or the by-products of these sugars, optionally supplemented with C0 2 as a carbon co-substrate.
  • a simple carbon source such as glucose, galactose, sucrose, molasses, or the by-products of these sugars, optionally supplemented with C0 2 as a carbon co-substrate.
  • the single carbon source must allow normal growth of the microorganism of interest. It is also possible in some cases to use a complex carbon source, such as lignocellulosic biomass, rice straw, or starch. The use of a complex carbon source generally requires pretreatment before use.
  • the culture medium contains at least one carbon source among monosaccharides such as glucose, xylose or arabinose, disaccharides such as sucrose, organic acids such as acetate, butyrate, propionate or valerate to promote different kinds of polyhydroxyalkanoate (PHA), treated or untreated glycerol.
  • monosaccharides such as glucose, xylose or arabinose
  • disaccharides such as sucrose
  • organic acids such as acetate, butyrate, propionate or valerate to promote different kinds of polyhydroxyalkanoate (PHA), treated or untreated glycerol.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • any culture method allowing the production on an industrial scale of molecules of interest can be envisaged.
  • the culture is done in bioreactors, especially in batch mode, fed-batch and / or continuous culture.
  • the culture line associated with the production of the molecule of interest is fed-batch mode corresponding to a controlled feed into one or more substrates, for example via the addition of a concentrated solution of glucose, the concentration of which can to be between 200 gL "1 and 700 gL 1.
  • a controlled vitamin supply during the process may also be beneficial to productivity (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2002. 60: 67-72).
  • the fermentation is generally conducted in bioreactors, with possible stages of solid and / or liquid precultures in Erlenmeyer flasks, with a suitable culture medium containing less a single carbon source and / or an exogenous CO2 input, necessary for the production of the molecule of interest.
  • the culture conditions of the microorganisms according to the invention are easily adaptable by those skilled in the art, depending on the microorganism and / or the molecule to be produced / overproduced.
  • the culture temperature is especially for yeasts between 20 ° C and 40 ° C, preferably between 28 ° C and 35 ° C, and more particularly about 30 ° C for S. cerevisiae.
  • the culture temperature is in particular between 25 ° C and 35 ° C, preferably 30 ° C for Cupriavidus necator.
  • the subject of the invention is therefore also the use of a genetically modified microorganism according to the invention, for the production or overproduction of a molecule of interest, preferentially chosen from amino acids, peptides, proteins, proteins, vitamins, sterols, flavonoids, terpenes, terpenoids, fatty acids, polyols and organic acids.
  • the subject of the invention is also a biotechnological process for producing at least one molecule of interest, characterized in that it comprises a step of culturing a genetically modified microorganism according to the invention, under conditions allowing synthesis or the bioconversion, by said microorganism, of said molecule of interest, and optionally a step of recovering and / or purifying said molecule of interest.
  • the microorganism is genetically modified to express at least one enzyme involved in the synthesis of said molecule of interest.
  • the microorganism is genetically modified to express at least one enzyme involved in the bioconversion of said molecule of interest.
  • the invention also relates to a method for producing a molecule of interest comprising (i) the insertion of at least one sequence encoding an enzyme involved in the synthesis or bioconversion of said molecule of interest in a microorganism recombinant according to the invention, (ii) the culture of said microorganism under conditions allowing the expression of said enzyme and optionally (iii) the recovery and / or purification of said molecule of interest.
  • a fungus especially a filamentous fungus, such as Aspergillus niger, genetically engineered to express functional PRK and RuBisCO type I or II, and in which gene expression pgk (Gene ID: 4982539) and gsdA (Gene ID: 4979751) is at least partially inhibited.
  • fungus in particular a filamentous fungus, such as Aspergillus terreus or Aspergillus niger, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II, and in which Expression of the pgk genes (Gene ID: 4354973) and gsdA (Gene ID: 4316232) is at least partially inhibited.
  • a yeast such as a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II, a farnesene synthase and in which the expression of a PGK1 gene (Gene ID: 5230) is at least partially inhibited.
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II, and in which the expression of the gene gapA (Gene ID: 947679) is at least partially inhibited.
  • This overproduction may also occur in a strain where at least partial inhibition of the gapA gene is combined with at least partial inhibition of the zw / gene (Gene ID: 946370).
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II, as well as GadB glutamate decarboxylase (Gene ID: 946058), and wherein expression of the gapA gene (Gene ID: 947679) is at least partially inhibited.
  • This overproduction may also occur in a strain where at least partial inhibition of the gapA gene is combined with at least partial inhibition of the zw / gene (Gene ID: 946370).
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II, and that an enzymatic activity allowing the oxidation of the glyoxylate to oxalate, preferably a glyoxylate dehydrogenase FPGLOXDH1 (mRNA: BAH29964.1), a glyoxylate oxidase GLO (mRNA: AOW73106.1), or an LDHA lactate dehydrogenase (Gene ID: 3939) and wherein the expression of gapA (Gene ID: 947679) and zwf (Gene ID: 946370) genes is at least partially inhibited.
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO type I or II
  • an enzymatic activity allowing the oxidation of the g
  • Example 1 Bioinformatic Analysis a) Calculation of theoretical yields i) Comparison of the carbon fixation yields from glucose between a wild strain using the pentose phosphate pathway and glycolysis, and a strain modified according to the invention
  • the theoretical maximum yield of pyruvate produced by the pentose phosphates is therefore 0.82 gpymvate / ggiucose (g of synthesized pyruvate, per g of glucose consumed), whereas it is 0.98 gpymvate / ggucose by the route of the pyruvate. glycolysis.
  • the carbon fixation flux is redirected to the oxidative branch of the pentose phosphate pathway, then towards PRK / RuBisCO engineering (see Figure 2).
  • This flow is related to the end of the glycolysis pathway, in the formation of 3-phosphoglycerate (3PG), with the following yield:
  • the calculation is applied to the production of citrate in S. cerevisiae yeast, in a wild-type strain and in a strain modified according to the invention incorporating PRK / RuBisCO engineering and deleted for the PGK1 gene in a to inhibit the glycolysis pathway; and for the ZWF1 gene to inhibit the oxidative branch of the pentose pathway.
  • ABF flow balance analysis
  • ABF simulations were performed with the OptFlux software (Rocha et al, BMC Syst Biol, 2010 Apr 19, 4:45, 10: 1818 / 1752-0509-4-45), and the metabolic model of Saccharomyces cerevisiae MM904 (Mo et al., BMC Syst Biol 2009 Mar 25, 3:37, doi: 10.1186 / 1752-0509-3-37).
  • This model has been modified to include the improvements described according to the invention, in particular a heterologous CO 2 fixation pathway with (i) addition of a PRK type reaction, (ii) addition of an RuBisCO type reaction.
  • the reactions necessary to simulate the production of molecules by heterologous pathways have also been added to the model.
  • a farnesene synthase-type reaction (EC 4.2.3.46 or EC 4.2.3.47) has in particular been added for the heterologous production of farnesene.
  • acetoacetyl-CoA reductase (EC 1.1.1.36) and polyhydroxybutyrate synthase (EC 2.3.1.B2 or 2.3.1.B5) reactions were added to the model for simulate a heterologous ⁇ -hydroxyburyrate production pathway, the monomer of polyhydroxybutyrate.
  • a reaction of glutamate decarboxylase type (EC 4.1.1.15) has been added in particular for the heterologous production of ⁇ -aminobutyric acid.
  • a reaction of aconitate decarboxylase type (EC 4.1.1.6) has been added in particular for the heterologous production of itaconic acid.
  • a lactate dehydrogenase-type reaction (EC 1.1.1.27) has in particular been added for the heterologous production of oxalate
  • the simulations were performed by applying to the model a set of constraints reproducible by those skilled in the art, aimed at simulating the in vivo culture conditions of a strain of S. cerevisiae under the conditions described according to the invention (for example, presence of non-limiting glucose in the medium, aerobic culture condition).
  • the simulations are carried out by virtually inactivating the reactions of the PGK1 enzymes (for example, glutamate, ⁇ -hydroxybutyric acid, farnesene) and ZWF1 (for example, citrate production), so as to simulate the decreases in activity of glycolysis and the pentose phosphate pathway, described according to the invention.
  • the PGK1 enzymes for example, glutamate, ⁇ -hydroxybutyric acid, farnesene
  • ZWF1 for example, citrate production
  • Table 11 Theoretical maximum production yields evaluated by ABF on a wild strain and a strain modified according to the modifications of the patent, for the production of different molecules.
  • MOIX / MOIGLUC moles of X molecule produced, relative to the moles of glucose consumed
  • CMolx / CMOI G L UC Molecules of carbon of X molecule produced, relative to the moles of glucose carbon consumed
  • gx / gGLuc g of molecule X products, relative to the g of glucose consumed.
  • the glycolysis pathway was inactivated by deletion of the PGK1 gene. Once the glycolysis is inhibited, the yeast strain obtained is no longer able to use glucose as a source of carbon and energy. It is therefore necessary to feed the biomass synthesis routes with glycerol and energetic pathways with ethanol. Strains deleted for PGK1 are cultured on YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) medium.
  • the deletion of the PGK1 gene was obtained in the following manner:
  • the coding phase of the G418 resistance gene derived from the KanMX cassette contained on the plasmid pUG6 (P30114-Euroscarf), was amplified with the oligonucleotides CB101 (SEQ ID No. l) and CB102 (SEQ ID NO: 2):
  • the underlined part of the oligonucleotides is perfectly homologous to the Kan sequence and the rest of the sequence corresponds to the regions adjacent to the coding phase of the PGK1 gene on the genome of Saccaromyces cerevisiae so as to generate a PCR amplicon containing at the ends homologous recombination sequences of the PGK1 gene locus.
  • strain CEN.PK 1605 was cultured in a volume of 50 ml YPD complex (yeast extract peptone dextrose) at 30 ° C to an optical density at 600 nm of 0.8. Cells were centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant was removed and the cells resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature.
  • YPD complex yeast extract peptone dextrose
  • the cells were resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • a transformation mix was prepared in a 2 ml tube as follows: 250 ⁇ . 50% PEG, 10 ⁇ . DNA "carrier" 5 mg / mL, 36 1M lithium acetate, 5 or 10 ⁇ ⁇ reaction purified PCR (deletion cassette) and water to 350 ⁇ .
  • the tube was centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant discarded.
  • the cells were resuspended in 2 mL of YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol), transferred to a 14 mL tube and incubated for 2 hours at 30 ° C 200 rpm. The cells were then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature. The supernatant was removed and the cells were resuspended in 1 ml sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l sterile water and plated on 180 ⁇ g / ml YPGE + G418.
  • YPGE yeast extract peptone glycerol ethanol
  • RuBisCO consumes ribulose-1.5bisP and one mole of CO 2 to form the 3-phosphoglycerate downstream of the deletion PGK1 in the glycolysis pathway.
  • the yeast gene In order to produce apha-farnesene, the yeast gene lacks the alpha-farnesene synthase gene (AFS1, SEQ ID No. 71, GenBank accession number AY182241).
  • the seven genes required for PRK-RuBisCO engineering were cloned on four plasmid vectors capable of replicating autonomously, with compatible origins of replication and each carrying a different complementation gene. auxotrophy or antibiotic resistance to select strains containing the three or four plasmid constructs.
  • Two of these plasmids are monocopies, with an Ars / CEN origin of replication and the third is multicopy with a 2 ⁇ origin.
  • strain EQ-0134 was cultured in a volume of 50 ml of complex YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) complex medium at 30 ° C. The cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • complex YPGE yeast extract peptone glycerol ethanol
  • the following transformation mix is prepared 250 of 50% PEG, 10 DNA "carrier” 5 mg / mL, 36 to 1 M lithium acetate, 10 ⁇ ⁇ (3 .mu.g of one of the following combinations , pFPP45 + pFPP56 + pFPP20 or pL4 + pFPP45 + pFPP56 + pFPP20) and water at 350 ⁇ .
  • YNB yeast nitrogen base including ammonium sulfate
  • the final mix is spread on YNB agar medium including ammonium sulfate + CSM without LUW (leucine uracil, tryptophan) + nseothenin if necessary, with glycerol and ethanol as carbon sources.
  • CSM ammonium sulfate + CSM without LUW (leucine uracil, tryptophan) + nseothenin if necessary, with glycerol and ethanol as carbon sources.
  • strain CEN.PK 1605 is transformed with the following plasmid combination: pL4 + pFL36 + pCM185 + pV51TEF.
  • the strain of interest is cultured on YNB + CSM-LUW medium with 10 g / l of glycerol and 7.5 g / l of ethanol, under conditions in which the expression of PRK is not induced, and presence, if any, of nseothricin. Under these conditions, it is necessary to feed the strain upstream and downstream of the deletion of the PGK1 gene.
  • the strains are adapted to a minimum mineral medium free of the amino acids and nitrogen bases included in the CSM-LUW, that is only YNB with 20 g / L of glucose, nseotherothin if necessary and a exogenous CO2 supply as described above. d) Production of farnesene in Erlenmeyer flask
  • Saccharomyces cerevisiae strain EQ-0253 deleted in the glycolytic pathway at the PGK1 gene, is cultured to produce farnesene by overproducing NADPH without loss of CO2, using PRK and RuBisCO.
  • This strain of interest is compared with a reference strain EQ-0353 producing farnesene following the introduction of a heterologous alpha-farnesene synthase, without deletion of PGK1 or addition of PRK and RuBisCO.
  • EQ-0253 (CEN.PK1605 Ap gk1: an) pL4 + pFPP56 + pFPP20 + pFPP45) and EQ-0353 (CEN.PK1605) (pL4 + pFL36 + pCM185 + pV51TEF) were grown in YNB medium with 20 g / L. of D-glucose, to which 100 ⁇ g / L of nseothricin was added.
  • a preculture containing 20 ml of culture medium was inoculated with 0.05 OD 50 mm into a 250 ml baffled Erlenmeyer flask, shaken at 120 rpm for 24 h at 30 ° C in a Minitron incubator where atmosphere was regulated at 10% CO2.
  • 50 ml of medium was inoculated at OD 600 nm 0.05 in a 250 ml Erlenmeyer flask and stirred, 120 rpm, 24 h at 30 ° C, 10% CO 2.
  • the culture also carried out in Erlenmeyer flasks (500 ml, baffled) from the second preculture, was inoculated with 0.05 OD 50 mm in 100 ml of the same culture medium, to which 50 ⁇ g / ml was added. of ampicillin, 10 ⁇ l of antifoam (Antifoam 204, Sigma, A6426) and 10% (v / v) of dodecane (Tippman et al, Talanta (2016), 146: 100-106). The cultures were shaken at 120 rpm at 30 ° C in the presence of 10% C0 2 . Growth monitoring was performed by measuring the turbidity at 600 nm.
  • the initial temperature of the oven was 70 ° C (4 min) and then gradually increased to 160 ° C (7 ° C / min) and then to 240 ° C (40 ° C / min) where it was maintained for 1.05 min.
  • the transfer line and source temperatures were 250 ° C and 200 ° C, respectively.
  • An external calibration comprising seven points was made from the farnesene isomer mixture (Sigma, W383902) for the quantification of -farnesene produced by the strains.
  • a Rezex ROA-Organic Acid H + column (8%) 150 ⁇ 7.8 mm, with a particle size of 8 ⁇ (Phenomenex, 00H-0138-KO) was used with a 4 ⁇ 3.0 mm Carbo-H pre-column.
  • the column temperature was 35 ° C and the flow rate was set at 0.5 mL / min.
  • the isocratic elution was carried out with a mobile aqueous phase at 5 mM H 2 SO 4 and lasted 30 min.
  • a volume of 20 ⁇ ⁇ was injected for each sample.
  • the identification of the compounds was based on the comparison of the retention times with the standards.
  • the external calibration comprises 10 points of variable glucose concentration (0- 20 g / L).
  • the ⁇ -famesene / Gic carbon yield is calculated in gram of farnesene produced per gram of glucose consumed for the two strains EQ-0253 and EQ-0353,
  • the coding phase of the hygromycin B resistance gene resulting from the hphMX cassette (loxP-pAgTEF1-hph-tAgTEF1-loxP) and contained on the plasmid pUG75 (P30671) - Euroscarf,) is amplified with the oligonucleotides Sdzwf 1 and Rdzwf 1 (Table 14). This makes it possible to generate an Azwfl PCR amplicon containing, at the ends, homologous recombination sequences of the ZWF1 glucose-6-phosphate dehydrogenase gene locus.
  • AAAAG AG AAAAG AAAAAAATTG ATCTATCG ATTTC AATTCAATTC AATTTAG AAAAACTC (SEQ ID NO: 6) ATCGAGCATCAAATGAAAC
  • strain CEN.PK 1605 is cultured in a volume of 50 ml of YPD (yeast extract peptone dextrose, here glucose 20 g / L) rich medium at 30 ° C. up to an optical density of 600 nm. 0.8.
  • the cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature.
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • ⁇ l of the resuspended cells are added to the transformation mixture and incubated at 42 ° C. for 40 minutes in a water bath. After incubation, the tube is centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant is discarded. The cells are resuspended in 2 ml YPD (yeast extract peptone dextrose) medium, transferred to a 14 ml tube and incubated for 2 hours at 30 ° C. and 200 rpm. The cells are then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature.
  • YPD yeast extract peptone dextrose
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l of sterile water and spread on YPD + Hygromycin B 200 ⁇ g / ml.
  • the colonies obtained were genotyped for the validation of the deletion of the ZWF1 gene and referenced EQSC-002 (CEN.PK 1605 Azwfl: ⁇ p).
  • strains EQSC-002 CEN.PK 1605 Azwfl :: hph
  • CEN.PK 1605 Mowfl :: hph
  • CEN.PK 1605 Moat has HIS3 leu2-3.112 trp-289 ura3-52 MAL.28c
  • CEN.PK 113- 7D GenBank: JRIV00000000
  • the strains EQSC-002 and CEN.PK1605 are cultured in a volume of 50 ml of rich YPD complex (yeast extract peptone dextrose, here glucose 20 g / L) at 30 ° C. up to an optical density. 600nm of 0.8.
  • the cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml of sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • a transformation mix is prepared in a 2 ml tube as follows: 250 50% of PEG, 10 of "carrier" DNA at 5 mg / ml, 36 of 1 M lithium acetate, 10 ⁇ l, purified PCR reaction (deletion cassette) and 350 ⁇ water. 50 ⁇ l of the resuspended cells are added to the transformation mixture and incubated at 42 ° C. for 40 minutes in a water bath. After incubation, the tube is centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant is discarded.
  • the cells are resuspended in 2 ml YPD (yeast extract peptone dextrose), transferred to a 14 ml tube and incubated for 2 hours at 30 ° C. and 200 rpm. The cells are then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature. The supernatant is removed and the cells are resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l of sterile water and spread on YPD + Hygromycin B 200 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml nseothenicin .
  • YPD yeast extract peptone dextrose
  • the colonies obtained were genotyped for the validation of the deletion of the IDH1 gene and are called EQSC-003 (CEN.PK 1605 Azwfl :: hph, Mdhl :: nat) and EQSC-005 (CEN.PK 1605 Aidhl :: nat) b) Inactivation of the PGK1 gene in a haploid strain of sex sign MAT alpha
  • the coding phase of the G418 resistance gene from the KanMX cassette ( ⁇ -pAgTEF1-kanMX-tAgTEF1-loxP) contained on the plasmid pUG6 (P30114) - Euroscarf is amplified with the oligonucleotides Sdpgk1 and Rdpgk1 (Table 13) making it possible to generate a pgkl PCR amplicon containing at the ends homologous recombination sequences of the PGK1 3-phosphoglycerate kin
  • Strain CEN.PK 1606 (Matte HIS3 leu2-3.112 trp-289 ura3-52 MAL.28c) resulting from the commercial strain CEN.PK 113-7D (GenBank: JRIV00000000) is transformed with the PCR fragment for the inactivation of PGK1 gene.
  • the strain CEN.PK 1606 is cultured in a volume of 50 ml of complex YPD (yeast extract peptone dextrose, here glucose 20g / L) rich medium at 30 ° C up to an optical density 600 nm of 0. 8.
  • the cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature.
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • a transformation mix is prepared in a 2 ml tube as follows: 250 50% of PEG, 10 of "carrier” DNA at 5 mg / ml, 36 of 1 M lithium acetate, 10 ⁇ l, purified PCR reaction (deletion cassette) and 350 ⁇ water.
  • ⁇ l of the resuspended cells are added to the transformation mixture and incubated at 42 ° C. for 40 minutes in a water bath. After incubation, the tube is centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant is discarded.
  • the cells are resuspended in 2 ml of YPGE (yeast extract peptone glycerol 20 g / l, ethanol 30 g / l), transferred to a 14 ml tube and incubated for 2 hours at 30 ° C. and 200 rpm. The cells are then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature.
  • YPGE yeast extract peptone glycerol 20 g / l, ethanol 30 g / l
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l of sterile water and spread on YPGE + 150 ⁇ , G418.
  • the colonies obtained were genotyped for the validation of the deletion of the PGK1 gene and referenced EQSC-008 (CEN.PK 1605, Apgkl :: kan).
  • kan is validated by growth tests on YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) agar medium supplemented with G418 150 ⁇ g / mL or Hygromycin B 200 ⁇ g / mL or nseothricin 50 ⁇ g / mL.
  • YPGE yeast extract peptone glycerol ethanol
  • the strain obtained is referenced as EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT ⁇ / MAT alpha, ZWF1 / Azwfl :: hph, ⁇ / Aidhl :: nat, PGK1 / Apgk1 :: kan).
  • the previously described strain EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT / alpha MATT, ZWF1 / Azwulf :: hph, JIH / Aidhl :: nat, PGK1 / 'Apgk1 :: kan) is grown on YPGE agar medium.
  • yeast extract peptone glycerol ethanol overnight at 30 ° C.
  • the cells are then placed in liquid culture in a deficient medium (Medium Sporulation, 1% potassium acetate + leucine + uracil + tryptophan) to induce the meiosis of diploid cells and thus leading to the formation of tetrads containing four haploid spores.
  • a deficient medium Medium Sporulation, 1% potassium acetate + leucine + uracil + tryptophan
  • Tetrads are plated on YNB.GE medium (yeast nitrogen base, glycerol, ethanol) + leucine + uracil + tryptophan + lg / L glutamic acid + methionine 20mg / L + cysteine 40mg / L and immediately dissected (using a micro-dissector) to isolate the spores on the same medium. The spores are germinated for several days at 30 ° C.
  • the genetic content of the haploid cells thus obtained is tested by growth on selective media: YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) supplemented with G418 150 ⁇ g / mL or hygromycin B 200 ⁇ g / mL or nseothricin 50 ⁇ g / mL and their sexual sign is tested by crossing with two strain of sex sign MAT a or MAT alpha.
  • the colonies obtained are genotyped for the validation of the deletion of the genes PGK1, IDH1, ZWF1 and the absence of transcripts corresponding to these genes is validated by real-time PCR after retro-transcription of the ribonucleic acids.
  • One of the obtained strain is referenced EQSC-004 (CEN.PK 1606 MAT alpha ⁇ zwfl :: hph, Aidhl :: nat, Apgklr .kan)
  • PRK-RuBisCO enzymes The six genes required for PRK-RuBisCO engineering (table 15 below) are cloned on three plasmid vectors capable of autonomously replicating, with compatible origins of replication and each carrying a different auxotrophy complementation gene. to select the strains containing the three plasmid constructs (see WO 2015107496). Two of these plasmids are monocopy with an ARS / CEN origin of replication and the third is multicopy with a 2 ⁇ origin.
  • the EQSC-004 strain (CEN.PK 1606 Azwfl :: hph, Aidhl :: nat, Apgkl :: kan) was cultured in a volume of 50 ml of rich YPGE complex (yeast extract peptone) medium. glycerol ethanol) at 30 ° C up to an optical density of 600 nm of 0.8. The cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml of sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature.
  • YPGE complex yeast extract peptone
  • glycerol ethanol glycerol ethanol
  • the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • resuspended cells 50 ⁇ of resuspended cells are added to the transformation mix and incubated at 42 0 C for 40 minutes in a water bath. After incubation, the tube is centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant is discarded. The cells are resuspended in 2 mL YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) + 2 mg / L Doxycycline, transferred to a 14 mL tube and incubated for 2 hours at 30 ° C at 200 rpm. The cells are then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature.
  • YPGE yeast extract peptone glycerol ethanol
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l of sterile water and spread on YNB.GE (yeast nitrogen base, glycerol, ethanol) + glutamic acid 1 g / L + methionine 20 mg / L + cysteine 40 mg / L + doxycycline 2 mg / L.
  • the strain obtained is referenced: EQSC-006 (CEN.PK 1606 Azwfl :: hph, tddhlr.nat, Apgkl :: kan) (pFPP45 + pFPP56 + pFPP20).
  • strain EQSC-005 (CEN.PK 1605 Aidhl :: nat) was cultured in a volume of 50 ml of complex YPGE (yeast extract peptone glycerol ethanol) complex at 30 ° C. 600nm optical density of 0.8.
  • the cells are centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature.
  • the supernatant is removed and the cells are resuspended in 25 ml of sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells are resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • ⁇ l of the resuspended cells are added to the transformation mixture and incubated at 42 ° C. for 40 minutes in a water bath. After incubation, the tube is centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant is discarded. The cells are resuspended in 2 ml YPD (yeast extract peptone dextrose), transferred to a 14 ml tube and incubated for 2 hours at 30 ° C. at 200 rpm. The cells are then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature.
  • YPD yeast extract peptone dextrose
  • strains EQSC-006 and EQSC-007 to growth on YNB (yeast nitrogen base) with glucose and C0 2 .
  • the batch cultures carried out in Erlenmeyer flasks are carried out with the appropriate culture medium and an exogenous CO2 supply of 10%, in a stirred incubator (120 RPM, 30 ° C.), with an inoculation at 0.05 OD 600 nm measured at using an EON spectrophotometer (BioTek Instruments).
  • the strain of interest is cultured on YNB + CSM-LUW medium with 10 g / l of glycerol and 7.5 g / l of ethanol, + glutamate at 50 mg / l under conditions in which the expression of PRK no. is not induced.
  • the strains are adapted to a minimum mineral medium free of all the amino acids except those indicated below, and nitrogenous bases included in the CSM-LUW, or only YNB with final concentrations. , 20 g / L glucose, 1 g / L glutamate, 40 mg / L L-cysteine and 20 mg / L L-methionine and an exogenous CO2 supply as described above. e) Production of citrate in Erlenmeyer flasks
  • Saccharomyces cerevisiae strain EQSC-006 deleted in the glycolytic pathway at the PGK1 gene, in the oxidative part of pentose phosphate and in the Krebs cycle is cultured to produce citrate without loss of CO2, using PRK and a RuBisCO.
  • This strain of interest is compared with a reference strain EQSC-007 producing citrate following the inactivation of the IDH1 gene, without deletion of PGK1 or ZWF1 nor addition of PRK and RuBisCO.
  • EQSC-006 CEN.PK 1605 Azwfl :: p, Aidhl :: nat, Apgk1 :: k, pFPP45 + pFPP56 + pFPP20
  • EQSC-007 CEN.PK 1605 Aidhl :: nat, pV51TEF + pFL36 + pCM185
  • YNB Yeast Nitrogen Base
  • a preculture containing 20 ml of culture medium was inoculated D06oo 0.05 nm in a baffled Erlenmeyer flask of 250 ml was put in stirring at 120 rpm at 30 ° C.
  • 50 ml of medium was inoculated with 0.05 OD 50 mm into a 250 ml Erlenmeyer flask and stirred at 120 rpm at 30 ° C.
  • the culture was made in Erlenmeyer flasks (500 ml, baffled) from the second preculture, inoculated with 0.05 OD 50 mm in 100 ml of the same medium, at 30 ° C, 120 rpm.
  • Isocratic elution at a flow rate of 0.5 ml / min was carried out with a 0.037% (v / v) aqueous solution of formic acid whose pH was adjusted to 4.5 with ammonium hydroxide.
  • the oven temperature of the column was 65 ° C.
  • the conditions of analysis in mass spectrometry were: negative electrospray mode, 450 ° C source temperature, 3 kV needle voltage, 50 V cone voltage.
  • An external calibration comprising seven points was carried out from a commercial solution of sodium citrate.
  • a Rezex ROA-Organic Acid H + column (8%) 150 ⁇ 7.8 mm, with a particle size of 8 ⁇ (Phenomenex, 00H-0138-KO) was used with a 4 ⁇ 3.0 mm Carbo-H pre-column.
  • the oven temperature for the column was 35 ° C and the flow rate was set at 0.5 mL / min.
  • Isocratic elution of 30 min was carried out with a mobile aqueous phase at 5 mM H 2 SO 4.
  • a volume of 20 ⁇ was injected for each sample. The identification of the compounds was based on the comparison of the retention times with the standards.
  • the external calibration included 10 points of variable glucose concentration (0 to 20 g / L).
  • the Ydtrate / Gic mass yield was calculated in grams of citrate produced per gram of glucose consumed for both EQSC-006 and EQSC-007, Ydtrate / GIC citrate (mg / Lacquers) strains.
  • Example 4 Improvement of Glutamate Production in E. coli
  • the deletion of the alpha-ketoglutarate dehydrogenase gene increases glutamate production (Usuda et al., J Biotechnol 2010 May 3; 147 (1): 17-30. doi: 10.1016 / j.jbiotec.2010.02.018).
  • the strain obtained is called EQ.EC002: MG1655 AsucA b) Deletion of Voperon edd-eda coding the Entner-Doudoroff metabolic pathway
  • the deletion of the edd-eda operon is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a 5 'homologous sequence on 50 nucleotides to adjacent regions of the deletion locus, i.e. ie at positions 1932065-1932115 and 1934604-1934654 on the chromosome thus generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome on either side of the entire operon.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC002 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol. The cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose. Counter-selection of the clones obtained is performed by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC003: MG1655 AsucA Aedd-eda c) Deletion of gapA gene
  • the deletion of the gapA gene is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a homologous sequence on 50 nucleotides to the adjacent regions of the deletion locus, that is to say the coding phase of the gene (gapA) (GenBank: X02662.1) thus generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC003 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • ribosome binding sequences presented in Table 19 below, with varying translation efficiencies (Levin-Karp et al, ACS Synth Biol 2013 Jun 21; 2 (6): 327-36, doi: 101021 / sb400002n, Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res, 2013 May, 41 (9): e98) are inserted between the coding phase of each gene.
  • the succession of each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertions in a vector pZAl l (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, a pl5A average replication origin and an ampicillin resistance gene.
  • A (SEQ ID NO: 9) AGGAGGTTTGGA
  • the clones are selected on LB medium supplemented with glycerol 2 g / L and pyruvate 5 g / L and with 100 mg / L ampicillin. After obtaining a sufficient quantity of biomass, cultures with a volume greater than or equal to 50 ml in a Erlenmeyer flask of at least 250 ml are inoculated in order to adapt the strain to the use of the PRK / RuBisCO engineering. This adaptation is carried out on the LB culture medium with 2 g / l of glucose, and an exogenous C0 2 feed at 37 ° C. as described above.
  • the cells from 500 ml of LB culture are inoculated in 20 ml of MS medium (40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / L of (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2 g / L of yeast, 30 g / l of CaCO 3 , 100 mg / l of ampicillin at a pressure of 0.1 C0 2 atmosphere.
  • MS medium 40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / L of (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2 g / L
  • Glutamate and residual glucose are measured with an organic analyzer (Sakura seiki).
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of glutamate produced per gram of glucose consumed.
  • the deletion of the zwf gene (GenelD: 946370) is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E.coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges, as detailed in Example 4A. .
  • the strain obtained is called EQ.ECO10: MG1655 AsucA Azwf c) Deletion of the gapA gene
  • the deletion of the gapA gene in the strain of Escherichia coli K-12, EQ.ECO10 is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E.coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges, as detailed in Example 4A].
  • ribosome binding sequences shown in Table 17 (see Example 4A)
  • RBSs ribosome binding sequences
  • Table 17 Table 17
  • variable translational efficiencies (Levin-Karp et al., ACS Synth Biol 2013 Jun 21; 2 (6): 327-36, doi: 101021 / sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May; 41 (9): e98) are inserted between the coding phase of each gene.
  • the sequence of each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertions in a vector pZAl 1 (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, an average replication origin pl5A and an ampicillin resistance gene.
  • icfA carbonic anhydrase
  • EQ.EC 014 (EQ.EC 011+ pEQECOOO): MG1655 AsucA AzwfAgapA (RuBisCO + PRK) EQ.EC 015 - »(EQ.EC 011+ pEQEC007): MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO + PRK + Carbonic Anhydrase)
  • the cells from 500 ml of LB culture are inoculated into 20 ml of MS medium (40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2 g / L yeast extract, 30 g / L L of CaC0 3 , 100 mg / L of ampicillin at a pressure of 0.1 C0 2 atmosphere.
  • MS medium 40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2
  • Glutamate and residual glucose are measured with a bio-analyzer (YSI Inc.).
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of glutamate produced per gram of glucose consumed.
  • the strain obtained is called EQ.EC002: MG1655 AsucA b) Deletion of the zwf gene Deletion of the zwf gene (GenelD: 946370) is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges, as detailed in Example 4A].
  • the strain obtained is called EQ.EC010: MG1655 AsucA Azwf c) Deletion of the gapA gene
  • the deletion of the gapA gene in the strain of Escherichia coli K-12, EQ.ECO10 is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E.coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges, as detailed in Example 4A].
  • the deletions are verified by genotyping and sequencing and the name of the strains obtained is:
  • Table 22 genes encoding type II RuBisCO, phosphoribulokinase, carbonic anhydrase, glutamate dehydrogenase and pyruvate carboxylase.
  • ribosome binding sequences shown in Table 17 (see Example 4A)
  • RBSs ribosome binding sequences
  • Table 17 The succession of each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertions in a vector pZAl l (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, a pl5A average replication origin and an ampicillin resistance gene.
  • pZAl l Expressys
  • pycA pyruvate carboxylase
  • CA carbonic anhydrase
  • CA carbonic anhydrase
  • EQ.EC 017 (EQ.EC 011+ pEQEC009): MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO + PRK + glutamate dehydrogenase + pyruvate carboxylase)
  • EQ.EC 018 (EQ.EC 011+ pEQECO10): MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO + PRK + carbonic anhydrase + glutamate dehydrogenase + pyruvate carboxylase + carbonic anhydrase)
  • the cells from 500 ml of LB culture are inoculated into 20 ml of MS medium (40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2 g / L yeast extract, 30 g / L L of CaC0 3 , 100 mg / L of ampicillin at a pressure of 0.1 C0 2 atmosphere.
  • MS medium 40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2
  • Glutamate and residual glucose are measured with a bio-analyzer (YSI Inc.).
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of glutamate produced per gram of glucose consumed.
  • This C. necator H16 strain has a mega plasmid pHG1 and two chromosomes. Deletion of the gapA gene is achieved by generating a vector containing the Bacillus substilis sac B suicide gene for gram negative bacteria (Quandt et al., Gene 1993 May 15; 127 (1): 15-21; Lindenkamp et al., Appl Environ Microbiol 2010 Aug; 76 (16): 5373-82 and Appl Environ Microbiol, 2012 Aug; 78 (15): 5375-83). a) Inactivation of the Entner-Doudorojf metabolic pathway
  • Two PCR amplicons corresponding to the adjacent regions of the edd and eda genes are cloned by restriction according to the procedure described in Srinivasan et al. (Appl., Environ Microbiol., 2002 Dec, 68 (12): 5925-32), in the plasmid pJQ200mpl8Cm.
  • the modified plasmid pJQ200mpl 8Cm is then transformed into a strain of E. coli S 17-1 by transformation by the calcium chloride method.
  • the transfer of the genetic material in C. necator is done by conjugation by depositing on a plate a culture deposition point of C.
  • necator on a box containing a cell layer of S 17-1 bacteria.
  • the selection is done on NT medium (Nutrient browth) at 30 ° C in the presence of 10% sucrose as a selection (Hogrefe et al., Bacteriol 1984 Apr; 158 (l): 43-8) and validated on a mineral medium containing 50 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • Two PCR amplicons corresponding to the adjacent regions of the gapA gene are cloned by restriction according to the procedure described in Lindenkamp et al. 2012, in the plasmid pjQ200mpl8Tc.
  • the modified plasmid pjQ200mpl8Tc : Aga /? A is then transformed into a strain of E. coli S 17-1 by transformation by the calcium chloride method.
  • the transfer of the genetic material is done by conjugation by depositing on a plate a culture deposition point of C. necator on a box containing a cell layer of S 17-1 bacteria.
  • the selection is made on NT medium (Nutrient browth) at 30 ° in the presence of 10% sucrose as a selection (Hogrefe et al., J Bacteriol 1984 Apr; 158 (l): 43-8.) And validated on a medium. mineral containing 25 ⁇ g / ml tetracycline.
  • EQCN_003 H16 Aedd-eda AgapA.
  • the strain EQCN_003, deleted in the glycolytic pathway at the gapA gene and in the Entner Doudoroff pathway at the edd-eda genes, is cultured in order to improve the production yield of the PHB by fixing exogenous C0 2 via the use of PRK and RuBisCO enzymes. b) Production of PHB in a bioreactor
  • the inoculum from a frozen stock is spread on a solid medium at a rate of 50 to 100 ⁇ ⁇ from a cryotube incubated at 30 ° C for 48 to 96 h, in the presence of fructose.
  • Expression of the genes encoding RuBisCO and PRK are maintained in C. necator in aerobic heterotrophic conditions (Rie Shimizu et al., Sci Rep. 2015; 5: 11617. Published online 2015 Jul 1.).
  • the strain of interest EQCN_003 improving the production yield of PHB is compared with a reference strain H16 naturally accumulating PHB under heterotrophic conditions in the presence of a nutritional limitation.
  • the productivity of the strains is compared in bioreactors.
  • the cultures carried out in bioreactors are inoculated from solid and / or liquid amplification chains into Erlenmeyer flasks under the conditions described above.
  • the bioreactors, Mycontrol type (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) of 750 ml or Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) of 2.5 L, are inoculated at a density equivalent to 0.01 DO ⁇ 20nm.
  • the accumulation of PHB is decoupled from growth.
  • the culture is regulated at 30 ° C, aeration is between 0.1 VVM (gas volume / liquid volume / min) and 1 VVM to maintain a minimum concentration of dissolved oxygen greater than 20% (30 ° C, 1 bar), the agitation is adapted according to the scale of the bioreactor used.
  • the inlet gas flow rate consists of air optionally supplemented with CO2.
  • the CO2 supplementation is between 1 and 10%.
  • the pH is regulated at 7 by a solution of ammonia at 14 or 7%.
  • the fed-batch culture mode allows a non-limiting carbon substrate contribution associated with a phosphorus or nitrogen limitation, while maintaining a constant carbon / phosphorus or carbon / nitrogen ratio.
  • the extraction and quantification of PHBs are carried out according to the method of Brandi et al. (Appl Environ Microbiol 2013 Jul; 79 (14): 4433-9).
  • the protocol consists of adding 1 ml of chloroform to 10 mg of lyophilized cells, followed by addition of 850 ⁇ l of methanol and 150 ⁇ l of sulfuric acid. The mixture is heated 2.5 h at 100 ° C, cooled and 500 ⁇ of water are added. The two phases are separated by centrifugation and the organic phase is dried by the addition of sodium sulfate. The samples are filtered and analyzed as described by Millier et al. (Appl Environ Microbiol 2013 Jul; 79 (14): 4433-9). Comparing the wild C.
  • An Escherichia coli strain K-12 genetically engineered to increase the yield of its glutamate production according to Example 4B] can be further modified to allow the constitutive expression of gadB glutamate decarboxylase (Gene ID: 946058) and thus increase the production yield of ⁇ -aminobutyric acid.
  • gadB glutamate decarboxylase Gene ID: 946058
  • alpha-ketoglutarate dehydrogenase gene also makes it possible to increase the production of glutamate (Usuda et al., J. Biotechnol, 2010 May 3, 147 (1): 17-30, doi: 10.1016 / j.jbiotec. 2010.02.018).
  • the gadB gene coding phase (Gene ID: 946058) is amplified from the genome of the MG1655 AsucA strain with primers homologous to the Escherichia coli K-12 genome spanning positions 1570595 to 1570645 and 1572095 to 1572045. Each of these primers are coupled to homologous floating sequences on 18 nucleotides at the ends of the fragment obtained by amplification of the pZE21MCS vector excluding the multiple cloning site. The two amplicons are combined according to the protocol of the In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech kit to form the plasmid pEQEC030 allowing the constitutive overexpression of the gadB gene. b) Insertion of the engineering needed for CO2 fixation
  • CDS coding sequences
  • Table 24 are amplified and assembled into blocks according to the protocol provided with the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix kit (E2321) to obtain 3 integration blocks described in
  • ribosome binding sequences shown in Table 19 (Example 4B)
  • variable translation efficiencies (Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21; 2 (6): 327-36, doi: 101021 / sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May; 41 (9): e98) are inserted between the coding phase of each gene.
  • each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertions in a vector pZAl l (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, a pl5A average replication origin and an ampicillin resistance gene.
  • pZAl l Expressys
  • GABA gamma-aminobutyrate
  • EQ.EC 013 (EQ.EC 002+ pZAll + pEQ030): MG1655 AsucA + (gadB)
  • EQ.EC 020 (EQ.EC 011 + pEQ030 + pEQEC006): MG1655 AsucA Azwf AgapA +
  • cells from 500 ml of LB culture are inoculated into 20 ml of MS medium (40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L MnSO 4 .7H 2 O, 2 g / L yeast extract, 30 g / L CaC0 3, 100 mg / L ampicillin and 30 mg / L kanamycin at a pressure of 0.1 atmosphere C0 2 at 30 ° C at pH 3.5.
  • MS medium 40 g / l glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l of (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 10 mg / L FeSO 4 .7H 2 O, 10 mg / L
  • the concentration of GABA is measured by high performance liquid chromatography (HPLC), using an OptimaPak C18 column (4.6 x 150 mm, RS tech Corporation, Daejeon, Korea). The samples are centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, 100 ⁇ l of the supernatant transferred to a new Eppendorf tube. In these tubes were added the following reagents: 200 ⁇ ⁇ buffer 1 M sodium bicarbonate pH 9.8, 100 ⁇ ⁇ dansyl chloride 80 g / L in acetonitrile and 600 ⁇ ⁇ of bidistilled water. The mixture is incubated at 80 ° C. for 40 minutes. The reaction is stopped by adding 100 ⁇ ⁇ of 2% acetic acid.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the mixture is centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant is then filtered through a 0.2 ⁇ Millipore filter and analyzed by HPLC on an Agilent system using a UV detector.
  • Derivatized samples are separated using a binary nonlinear gradient using eluent A [tetrahydrofuran / methanol / 50mM sodium acetate pH 6.2 (5: 75: 420, by volume)] and eluent B ( methanol). Residual glucose is measured with a bio-analyzer (YSI Inc.).
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of GABA produced per gram of glucose consumed. This yield increases significantly by 15% for the strain EQ.EC 020 AsucA Azwf AgapA (RubisCO + PRK) + (GadB) compared with the control strains EQ.EC 013 AsucA (GadB).
  • Escherichia coli strain K-12 genetically engineered to allow the constitutive expression of FGHLOXDH1 glyoxylate dehydrogenase (Gene ID: 946058) from Fomitopsis palustris, to reduce icd gene expression (Gene ID: 945702), and to inactivate the genes aceB (GenelD 948512) and sdhA (Gene ID: 945402), would increase the production yield of succinate and oxalic acid.
  • FGHLOXDH1 glyoxylate dehydrogenase Gene ID: 946058
  • Fomitopsis palustris to reduce icd gene expression
  • aceB GenelD 948512
  • sdhA Gene ID: 945402
  • isocitrate dehydrogenase (icd) expression makes it possible to redirect the metabolic flow towards the glyoxylic shunt.
  • aceB malate synthase
  • sdhA succinate dehydrogenase
  • Deletion of the succinate dehydrogenase gene enhances succinate production under aerobic conditions (Yang et al., Microbiol Res 2014 May-Jun; 169 (5-6): 432-40).
  • the deletion of the malate synthase gene allows the accumulation of glyoxylate which will be converted to oxalate by the constitutive expression of glyoxylate dehydrogenase.
  • a strain of Escherichia coli K-12 MG1655 whose sdhA gene has been deleted is used.
  • This strain is derived from a gene deletion library (Baba et al., Mol Syst Biol., 2006; 2: 2006.0008) in Escherichia coli K-12 and provided by the Coli Genetic Stock Center under the name JW0715-2 and with the reference 8302. (JW0713-1: MG1655 AsdhA :: Kan).
  • the plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol.
  • the cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose.
  • a counter selection of the clones obtained is performed by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC040: MG1655 AsdhA b) Deletion of the aceB gene
  • the deletion of the aceB gene (GenelD 948512) is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a 50 nucleotide homologous sequence to adjacent regions of the deletion locus, i.e. at the positions of 4215428 to 4215478. and 4217129. to 4217079 on the chromosome thus generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome on either side of the coding sequence of the aceB gene.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC040 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol. The cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose. Counter-selection of the clones obtained is carried out by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC041: MG1655 AsdhA AaceB c) Change of the promoter of the icd gene .
  • the replacement of the native promoter of the icd gene (Gene ID: 945702) by a weaker promoter is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges . . Introduction of the weak P oxbl promoter
  • the promoter of the icd gene is replaced by a cassette coupling the P 0 xbi promoter, characterized as weak, and a cassette of an antibiotic resistance gene to allow the selection of the insertion of the P ox bi cassette with gene of resistance to an antibiotic.
  • Amplification of a fusion fragment using the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix Kit (E2321) allows the substitution promoter to be associated with an antibiotic selection cassette.
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol.
  • the cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose.
  • Counter-selection of the clones obtained is carried out by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC042: MG1655 AsdhA AaceB Foot :: P ox bi d) Deletion of the zwf gene
  • Deletion of the zwf gene (GenelD: 946370) is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E.coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC042 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol. The cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose. Counter-selection of the clones obtained is performed by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC043: MG1655 AsdhA AaceB Foot :: P ox bi Azwf e) Deletion of gapA gene
  • the deletion of the gapA gene is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E.coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a 5 'homologous sequence on 50 nucleotides to the adjacent regions of the deletion locus, ie the coding phase of the gene (gapA) (GenBank: X02662.1) thus generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC043 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • the transformation of the amplicon obtained in the first step in the presence of the recombinase RedET is induced by 0.3% arabinose in liquid LB for 1H.
  • a second electroporation of the cells expressing RedET by the deletion cassette is carried out and the colonies are selected on LB agar supplemented with 0.2% glycerol and 0.3% pyruvate, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose and kanamycin 0.0015. %.
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol.
  • the cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose.
  • a counter selection of the clones obtained is carried out by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC044: MG1655 AsdhA AaceB Foot :: P ox bi tozwf AgapA f) Overexpression constitutive of genes FPGLOXDH1 and aceA
  • CDS The coding sequences (CDS) of the genes FPGLOXDH1 (Gene ID: 946058) and aceA (Gene ID: 948517) subcloned in a bacterial expression vector pZE21MCS (EXPRESSYS) in the form of synthetic operons according to the structure described in Table 24
  • This vector has a ColEl origin of replication and an antibiotic resistance gene kanamycin.
  • Each of these primers is coupled to 18 nucleotide homologous floating sequences at the ends of the fragment obtained by the amplification of the pZE21MCS vector excluding the multiple cloning site.
  • the two amplicons are combined according to the In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech protocol to form the plasmid pEQEC035 allowing constitutive overexpression of the FPGLOXDH1 and aceA genes.
  • CDS coding sequences of the genes described in Table 2 are amplified and assembled in blocks according to the protocol provided with the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix kit (E2321) so as to obtain 3 integration blocks described in Table 26. Each block is then amplified according to the In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech kit protocol to form the plasmids described below in Table 24.
  • CDS A RBS1 CDS B RBS2 RBS3 CDS D
  • ribosome binding sequences shown in Table 19 (Example 4B), having variable translational efficiencies (Levin-Karp et al, ACS Synth Biol 2013 Jun 21; 2 (6): 327-36. Doi: 10.1021 / sb400002n; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May; 41 (9): e98) are inserted between the coding phase of each gene.
  • each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertions in a vector pZAl 1 (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, an average replication origin pl5A and an ampicillin resistance gene.
  • EQ.EC045 (EQ.EC042 + pZAll + pZE21MCS): MG1655 AsdhA AaceB P icd :: P oxbl
  • EQ.EC046 (EQ.EC045 + pEQEC006 + pEQEC035): MG1655 AsdhA AaceB P icd :: P oxbl Azwf AgapA + (FPGLOXDHl + aceA) + (RuBisCO + PRK)
  • the cells from 500 ml of LB culture are inoculated into 20 ml of MS medium (40 g / l of glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l).
  • MS medium 40 g / l of glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l.
  • the concentration of succinate is measured by high performance liquid chromatography (HPLC), the culture samples are centrifuged at 12,000 g for 5 min. . Succinate dosage
  • the culture supernatant is filtered through a 0.2 ⁇ Millipore filter and analyzed on an Agilent HPLC system (series 1100) equipped with a cation exchange column. (Aminex HPX87-H, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), a UV absorbance detector (Agilent Technologies, G1315D) and a refractive index (RI) detector (Agilent Technologies, HP 1047 A).
  • the samples are separated on a mobile phase of 5 mM H 2 SO 4 at a flow rate of 0.4 ml / min.
  • the oven temperature of the column is 65 ° C.
  • Residual glucose is measured with a bio analyzer (Ysi Inc.) or HPLC-refractometry with an Aminex HPX87-H column.
  • the Y p / S carbon yield is calculated in gram of succinate produced per gram of glucose consumed.
  • the pellets are washed twice with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 mM EDTA and stored at -20 ° C.
  • Samples (1 ml) are transferred to a pre-cooled tube with 0.75 g of glass beads (425-600 ⁇ ) and introduced into a Fast Prep machine (Thermo Scientific, Erembodegem, The Netherlands) and subjected to 4 gusts of 20 seconds at the speed setting 6.
  • the lysates are centrifuged for 20 min at 40 ° C. and 36,000 g. Total protein assays are performed according to Lowry's method (Lowry et al., 1951).
  • the oxaloacetate acetyl hydrolase activity (EC 3.7.1.1) is measured using a modification of the direct optical determination of oxaloacetate (OAA) at 255 nm as described in (Lenz et al., 1976). The disappearance of the enol tautomer of ⁇ is monitored at 255 nm at 25 ° C. in a Hitachi model 100-60 spectrophotometer (Hitachi, Tokyo, Japan), using quartz cuvettes.
  • OOA direct optical determination of oxaloacetate
  • the reaction mixture of 1 ml contains 100 mM imidazole-HCl (pH 7.5), 0.9 mM MnCl 2 .2H 2 O, 1 mM OAA, 20 ⁇ l of cell extract (controls with different volumes of cell extracts confirm the linearity between the enzyme activity and the amount of cell extract).
  • the reaction is started by adding the cell extract.
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of doxalate produced per gram of glucose consumed.
  • RNA constructs i) Sequences of the guide RNAs to target the gene to be inactivated In each of these two genes, a nucleotide sequence punctuated by an NGG motif (underlined CRISPR target sequence) was determined (Table 27). In both cases, this sequence is specific to the targeted gene but also unique in the genome of Aspergillus niger. These sequences are used to express an RNAguide (gRNA) which by forming a hetero duplex with the homologous region of the genome of Aspergillus niger directs the action of the CAS9 endonuclease to induce a double strand break specifically on the chosen locus.
  • gRNA RNAguide
  • Plasmid pFC332 (Addgene # 87845) described in Sarkari et al. (Bioresour Technol 2017 Dec; 245 (Pt B): 1327-1333) contains an expression cassette of a gRNA, a cassette allowing the functional expression of the endonuclease Cas9 and an Hph cassette allowing the selection of this plasmid .
  • the plasmid further contains the AMA1-2.8 fragment which allows transient propagation of the plasmid.
  • an origin of replication for E. coli is also present.
  • the gRNA cassette between FS A and FS B can be easily exchanged.
  • This plasmid is modified by amplifying the different parts of this plasmid, in order to eliminate the antibiotic selection cassette and to modify the nucleotides allowing the specificity of the gRNA in favor of the sequences described in Table 27 to form the plasmids pEQ0610 for target pgkA and pEQOol 1 to target gsdA.
  • the donor plasmid consists of an In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech assembly between the plasmid pUC19 (GenBank: M77789.2) and the genomic targeting sequences (LA and RA) of approximately 1500 bp each, homologues at the chosen location for integration.
  • the LA and RA sequences are flanked 5 'and 3', respectively, of the locus sequence targeted by the ARNguide.
  • the genomic DNA / RNAide heterodimer is recognized by the double-stranded cleavage Cas9 endonuclease (locus 1: pgkA, locus2: gsdA) (Table 28).
  • the RA and LA fragments are amplified with the primers for the pgkA gene and the gsdA gene (Table 29).
  • the sequences of the amplicons are given in the listing sequence (SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 58).
  • An 18 nucleotide extension on all the forward primers of the three fragments is added according to the In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech protocol, in order to allow a functional assembly of the plasmids (pEQ0600 or pEQ0601) and the introduction of two restriction endonuclease sites of type II (restriction enzymes I-Ceul and I-Sce) I which have large asymmetric recognition sites (12 to 40 base pairs).
  • Promoters and terminators are identified on the basis of GenBank data.
  • the promoters chosen are determined from the +1 transcription point and go back 1.4Kb upstream so as to cover both the "core" sequences (TATA box) and the trans-activator sequences allowing the optimal functionality of the promoter concerned.
  • the cut is performed 500 bp after the stop codon of the gene.
  • each integration block of 4 expression cassettes is defined as follows: the first level comprises simple elements, namely promoters, coding sequences (CDS) and terminators.
  • the promoters (CDS)
  • Table 30 and terminators (Table 31), whose sequences are provided in the listing sequence (SEQ ID NO: 59-62), are amplified and assembled with the engineering CDSs according to Table 32.
  • the CDSs whose sequences are provided in the listing sequence (SEQ ID NO: 63-66), are amplified according to the protocol provided with the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix kit (E2321) to obtain the functional expression cassettes compiled in the table .
  • Each 4 gene integration block is organized to include 4 different couples (promoter / terminator) in order to limit trans interference.
  • Each 6-gene integration block is organized to include 6 different couples (promoter / terminator) in order to limit transcriptional interferences Donor fragment for insertion into the genome's target locus
  • Table 30 Native localization of Aspergillus niger promoters used in genomic combinatorics to insert the 6 genes of CO 2 fixation engineering into the genome of Aspergillus niger.
  • Table 31 Native localization of Aspergillus Niger terminators used in genomic combinatorics to insert the 6 genes of C02 fixation engineering into the genome of Aspergillus niger.
  • TetrpC A AN 0648 TGATTTAATAGCTCCATGTCAAC G G GTAAACG ACTCATAG G AG AGTTG AAG nidulans (SEQ ID No. 37) (SEQ ID No. 41)
  • TnaD A AN 1006 ACGGGTTCGCATAGGTTTGG G G ATATTTG ACG ACG ATTCTG AG G Nidulans (SEQ ID No. 38) (SEQ ID NO: 42)
  • TgpdA A. niger An l6g01 G AATC AG G ACG G CAAACTG AAT CGTG GTCTAG CTG CCCTCC (SEQ I D
  • A. niger strain CBS 513-88 is cultured at 30 ° C. in an Erlenmeyer flask with 250 ml of transformation medium (Kusters-van Someren et al., Curr Genet, 1991 Sep; 20 (4): 293-9 ). After a growth of 16 h at 250 rpm, the mycelium is harvested by filtration on Miracloth (Calbiochem) and washed with deionized water. The protoplasts are carried out in the presence of 5 gL -1 of lysing enzymes from Trichoderma harzianum (St.
  • the protoplasts are washed with cold STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris / HCl 50 mM CaCl 2, pH 7.5) and then resuspended in 100 ⁇ l of STC and used directly for transformation.
  • cold STC 1.2 M sorbitol, 10 mM Tris / HCl 50 mM CaCl 2, pH 7.5
  • the plasmid pEQ0610 is transformed with a donor fragment to integrate part of the engineering into the genome while inactivating the pgkA gene.
  • the plasmid pEQ0611 is co transformed with a donor fragment to integrate the other part of the engineering into the genome while inactivating the gsdA gene.
  • plasmid pCAS_pyrG2 Due to the presence of the AMA1_2.8 replication origin, the plasmid pCAS_pyrG2 is easily lost resulting in only transient expression of the Cas9 protein, thus reducing the risk of non-targeted adverse effects.
  • lC ⁇ g linear cassettes and plasmid 5 .mu.g was mixed with 100 ⁇ ⁇ STC solution containing at least 10 7 protoplasts and 330 ⁇ ⁇ of polyethylene glycol (PEG) solution freshly prepared (PEG 6000 25%, CaCl 2 50 mM, Tris / 10 mM HCl pH 7.5) and kept on ice for 20 minutes. After mixing with a solution of 2 ml of additional PEG and incubating at room temperature for 10 minutes, the protoplast mixture is diluted with 4 ml of STC.
  • PEG polyethylene glycol
  • the transformants are selected on MM plates supplemented with 150 ⁇ g / ml hygromycin B or MM plates supplemented with Bleomycin 50 ⁇ g / ml. All transformants are purified by isolation of single colonies on the selection medium at least twice. The insertion of the fragments is verified by sequencing the target locus with the appropriate control primers.
  • Fungal cell genomic DNA is isolated with a modified protocol, using the Wizard® genomic DNA purification kit (Promega, Wisconsin, USA).
  • the mycelium is cultured overnight in CM (30 ° C., 150 rpm) in 290 ⁇ l of 50 mM EDTA solution and 10 ⁇ l of lyticase (10 mg / ml) to remove the cell wall. After 90 minutes of incubation at 37 ° C., the suspension is centrifuged and the supernatant is discarded.
  • the mycelium pellet is resuspended in 300 ⁇ l of nucleic acid lysis solution and 100 ⁇ l of protein precipitation solution. The samples are incubated on ice for 5 minutes and centrifuged.
  • the DNA is precipitated with isopropanol and washed with 70% ethanol.
  • the DNA pellet is rehydrated with a DNA rehydration solution containing RNase (100 ⁇ g / ml). The successful transformation and integration of the expression cassettes was verified by PCR.
  • Niger GSDA : p PmbfA -RbcL-trpC; PcoxA p RbcS-Tnia D; picdA p -H ph-TgpdA;
  • gsdA PmbfAp-RbcL-trpc; PcoxA p RbcS-Tnia D; picdAp-H ph-TgpdA;
  • CBS 513-88 pgkA : Pm bfA p -GrES-trpc; PcoxA p -G roEL-Tnia D; picdA p -Ble-TgpdA;
  • PsrpB p -PRK-glaAt Conidia (10 8 .L _1 ) from strains EQ1500 and EQ1502 are inoculated and cultured at 30 ° C. on a rotary shaker (180 rpm) in shake flasks containing Vogel's medium without MnSO 4 with a total content in glucose of 15% and a total nitrogen content of 0.2% and 10% CO2.
  • the determination of glucose and organic acids was carried out as previously described (Blumhoff et al, 2013, Steiger et al., 2016) on an HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with an Aminex HPX-87 H column (300 x 7.8 mm, BioRad, Hercules, CA).
  • a refractive index detector (RID-10A, Shimadzu) is used for the detection of glucose and citric acid, while a PDA detector (SPD-M20A, Shimadzu) at 300 nm is used to detect the cis-aconitic and trans-aconitic acid.
  • the column is used at 60 ° C. at a flow rate of 0.6 ml / min and with an aqueous solution of 0.004 M H 2 SO 4 as a mobile phase. The culture was performed in three biological replicates. d) Analytical method
  • a culture sample is centrifuged at 14,000 xg for 5 min.
  • the supernatant is filtered through a filter having a pore size of 0.45 ⁇ m.
  • the filtrate is maintained at -20 ° C. until analysis.
  • the concentration of citrate and oxalate is detected and quantified with ultraviolet light at 210 nm using an Amethyst C18-H column (250 x 4.6 mm, Sepax Technologies, Newark, DE, USA). Elution is carried out at 30 ° C. with 0.03% H 3 PO 4 at a flow rate of 0.8 ml / min. Reducing sugar is detected with the 3,5-dinitrosalicylic acid method.
  • Determination of the biomass 5 ml of sample are filtered through Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA, USA) to collect the hyphae and washed with distilled water. The hyphae are heated to 105 ° C in a "Miracloth". To calculate the cell dry weight (DCW), the Miracloth weight is measured previously and deducted from the total weight to generate the net weight, then the net weight per unit volume is calculated as DCW. After a complete analysis, the comparison of the yield of citric acid production as a function of the glucose consumption is 18% greater in the EQ1502 engineered strain compared to the EQ1500 wild type strain.
  • RNAguide RNA guide
  • the sequence identified in the second intron the first 20 nucleotides have a unique pattern in the genome, even allowing 2 mismatches.
  • the sequence identified in the fourth intron the first 20 nucleotides have a unique pattern in the genome, even allowing 2 mismatchs.
  • Table 35 Target Sequence for ARNguide
  • Plasmid pFC332 (Addgene # 87845) described in Sakari et al. (Bioresour technol 2017, 245 (Pt B): 1327-1333) contains a gRNA expression cassette, a cassette allowing the functional expression of the Cas9 endonuclease and an Hph cassette allowing the selection of this plasmid.
  • the plasmid further contains the AMA1-2.8 fragment which allows transient propagation of the plasmid.
  • an origin of replication for E. coli is also present.
  • the gRNA cassette between FS A and FS B can be easily exchanged.
  • this plasmid is modified by amplifying the different parts of this plasmid in order to eliminate the antibiotic selection cassette and to modify the nucleotides allowing the specificity of the gRNA in favor of the sequences described in FIG. Table 35 to form the plasmids pEQ0615 to target pgkA and pEQ0616 to target gsdA in the Aspergillus terreus genome.
  • the donor plasmid consists of an In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech assembly between the plasmid pUC19 (GenBank: M77789.2) and genomic targeting sequences (LA and RA) of about 1500 bp each homologous to the locus chosen for integration.
  • the LA and RA sequences are flanked 5 'and 3', respectively, of the locus sequence targeted by the ARNguide.
  • the genomic DNA / RNA hybrid heterodimer is recognized by the double-stranded cleavage Cas9 endonuclease (locus 1: pgkA, locus2: gsdA) (Table 35).
  • the RA and LA fragments are amplified with the primers described in Table 36 for the pgkA gene and in Table 37 for the gsdA gene.
  • the sequences of the amplicons are in the listing sequence (SEQ ID Nos. 67 to 70).
  • Promoters and terminators are identified on the basis of GenBank data.
  • the promoters chosen are determined from the +1 transcription point and go back 1.4Kb upstream so as to cover both the "core" sequences (TATA box) and the trans-activator sequences allowing the optimal functionality of the promoter concerned.
  • the cut is performed 500 bp after the stop codon of the gene.
  • each integration block of 4 expression cassettes is defined as follows: the first level comprises simple elements, namely promoters, coding sequences (CDS) and terminators.
  • the promoters (CDS)
  • Table 31 are amplified and assembled with the engineering CDS according to Table 32.
  • the CDS are amplified according to the protocol provided with the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix Kit (E2321) to obtain the expression cassettes functionalities compiled in the table.
  • Each 4 gene integration block is organized to include 4 different terminator promoter pairs in order to limit trans interferences.
  • Each 6 gene integration block is organized to include 6 different terminator promoter pairs so as to limit transcriptional interferences.
  • the different multiple expression cassettes (RbcS, RbcL and RbcX or GroES, GroEL and PRK are amplified and assembled around an antibiotic selection cassette (Table 38), according to the In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual protocol. - Clontech, to form the donor plasmids (pEQ0606 or pEQ0607).
  • Transformation of the DNA to Aspergillus terreus was performed according to the strategy applied for Aspergillus niger (Example 8) using A. terreus strain NIH262.
  • ⁇ contains 0.8 g of KH 2 PO 4 , 3 g of NH 4 NO 3 , 1 g of MgSO 4 . 7H20, 5 g of CaCl 2 .2 H 2 0, 1.67 mg of FeCl 3 .6H 2 0, 8 mg of ZnSO 4 .7H 2 O and 15 mg of CuSO 4 .7H 2 O per liter.
  • Culturing is carried out under stirring with 25 ml of medium in Erlenmeyer flasks 125 ml at 33 ° C in a rotary shaker at 200 rpm for 7-10 days in an environment of 10% C0 2.
  • the pH is not controlled during the fermentation and the shaking of the flasks is maintained during the fermentation. sampling for time studies to ensure a continuous supply of oxygen.All experiments are performed in triplicate.
  • Medium posers are obtained from Sigma Chemical, St. Louis, Missouri.
  • each sugar was dissolved in deionized water and passed through a column (440 x 45 mm) of Dowex 50-X8 cation exchange resin (100/200 mesh) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) to remove manganese, if any.
  • d) Analytical procedures The concentration of the cell mass is determined from the dry weight of the cells. The cell mass present in the fermentation broth is harvested by centrifugation at 10,000 g for 10 minutes and rinsed thoroughly three times with deionized water. The rinsed cell mass was thoroughly dried at 80 ° C until a constant weight was obtained. The fermentation broth after centrifugation (10,000 g, 10 min) is stored at -20 ° C.
  • the Aminex HPX 87P column is maintained at 85 ° C and the glucose is eluted with Milli-Q acidified deionized water (Millipore, Bedford, MA) at a flow rate of 0.6 ml min -1 .
  • the Aminex HPX 87H column is maintained at 65 ° C. and the sugars and organic acids are eluted with 5 mM H 2 SO 4 prepared using Milli-Q deionized filtered water at a flow rate of 0.5 ml min -1 .
  • ppb level is determined using an Optima 7000DV Optima 7000DV inductively coupled plasma (ICP-OES) spectrometer from Perkin-Elmer (Waltham, MA) by the procedure described by Bakota et al (Eur J Lipid Sci Technol., 2015; 117: 1452-1462.
  • ICP-OES Optima 7000DV inductively coupled plasma

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Abstract

L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène. Selon l'invention la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates peut également être au moins partiellement inhibée. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel microorganisme génétiquement modifié, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt et des procédés de synthèse ou bioconversion de molécules d'intérêt.

Description

Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d'intérêt
Domaine de l'invention
L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié, apte à utiliser du dioxyde de carbone comme source de carbone au moins partielle pour la production de molécules d'intérêt. Plus particulièrement, l'invention a trait à un microorganisme dans lequel au moins la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée. L'invention a également trait à des procédés pour la production d'au moins une molécule d'intérêt utilisant un tel microorganisme.
Etat de la technique Depuis plusieurs années, de nombreux procédés microbiologiques ont été développés pour permettre la production de molécules d'intérêt en grandes quantités.
Ainsi, des procédés de fermentation sont utilisés pour faire produire des molécules par un microorganisme à partir d'une source de carbone fermentescible, telle que le glucose.
Des procédés de bioconversion ont également été développés, pour permettre à un microorganisme de convertir un co-substrat, non assimilable par ledit microorganisme, en une molécule d'intérêt. Là encore, une source de carbone est nécessaire, non plus pour la production proprement dite de la molécule d'intérêt, mais pour la production de cofacteurs, et plus particulièrement de NADPH, pouvant être nécessaire à la bioconversion. D'une manière générale, le rendement de production par de tels procédés microbiologiques est faible du fait principalement des besoins en cofacteurs et de la difficulté d'équilibrer les réactions métaboliques rédox. Se pose également le problème du coût de revient de telles molécules, puisqu'une source de carbone assimilable par le microorganisme est toujours nécessaire. Autrement dit, actuellement pour produire une molécule d'intérêt avec un procédé microbiologique, il est nécessaire de fournir une molécule (glucose, ou autre), certes de moindre valeur industrielle, mais qui suffit à rendre la production de certaines molécules non économiquement intéressante.
En parallèle, le dioxyde de carbone (C02), dont les émissions dans l'atmosphère ne cessent de croître, n'est pas ou peu utilisé dans les procédés microbiologiques actuels, alors que sa consommation par les microorganismes pour la production de molécules d'intérêt permettrait non seulement de réduire les coûts de production, mais également de répondre à des problématiques écologiques certaines. Π existe donc toujours un besoin de procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules d'intérêt en grandes quantités et avec des coûts de revient plus faibles qu'avec les procédés actuels.
Résumé de l'invention L'intérêt d'utiliser des microorganismes non-photosynthétiques génétiquement modifiés pour pouvoir capturer le C02 et l'utiliser comme source de carbone principale, au même titre que les plantes et les microorganismes photosynthétiques a déjà été démontré. Ainsi, des microorganismes modifiés de manière à exprimer une RuBisCO (Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase - EC 4.1.1.39) et une PRK (phosphoribulokinase - EC 2.7.1.19) fonctionnelles pour pouvoir ainsi reproduire un cycle de Calvin partiel et convertir le ribulose- 5-phosphate en deux molécules de 3-phosphoglycérate par capture d'une molécule de dioxyde de carbone ont été développés.
En travaillant sur les solutions apportées par le cycle de Calvin pour produire des molécules d'intérêt en utilisant le CO2 comme source de carbone, les inventeurs ont découvert qu'il est possible d'augmenter le rendement de production de molécules d'intérêt en couplant une partie du cycle de Calvin (PRK/RuBisCO) à une inhibition au moins partielle de la glycolyse. Les inventeurs ont également découvert qu'il est possible d'augmenter la consommation de CO2 exogène lors de la production de molécules d'intérêt, en inhibant également au moins partiellement la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates. Les microorganismes ainsi développés permettent de produire à grande échelle et avec un rendement industriellement intéressant un grand nombre de molécules d'intérêt, telles que des acides aminés, acides organiques, terpènes, terpénoïdes, peptides, acides gras, polyols, etc.
L'invention a donc pour objet un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt, autre que l'enzyme RuBisCO ou phosphoribulokinase.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié présente une branche oxydative de la voie des pentoses phosphates également au moins partiellement inhibée.
L'invention concerne également l'utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
La présente invention concerne également un procédé biotechnologique pour produire ou surproduire au moins une molécule d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt. Elle concerne également un procédé de production d'une molécule d'intérêt comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Description des figures
Figure 1 : Schéma général de la glycolyse, de la voie des pentoses phosphates et de la voie Entner-Doudoroff ;
Figure 2 : Représentation schématique de l'inhibition de la voie de la glycolyse, selon l'invention ;
Figure 3 : Représentation schématique de l'inhibition de la voie de la glycolyse, combinée à l'inhibition de la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates, selon l'invention.
Description détaillée de l'invention
Définitions Les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des microorganismes qui ont été génétiquement modifiés pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues, ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de modification.
Il est entendu que les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» se réfèrent non seulement au microorganisme recombinant particulier, mais à la descendance ou à la descendance potentielle d'un tel microorganisme. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici. Dans le contexte de l'invention, une voie métabolique au moins partiellement « inhibée » ou « inactivée » s'entend d'une voie métabolique altérée, qui ne peut plus se dérouler correctement dans le microorganisme considéré, comparativement au même microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber ladite voie métabolique). Notamment la voie métabolique peut être interrompue, entraînant l'accumulation d'un métabolite intermédiaire. Une telle interruption peut être obtenue par exemple par inhibition de l'enzyme nécessaire à la dégradation d'un métabolite intermédiaire de la voie métabolique considérée et/ou par inhibition de l'expression du gène codant pour cette enzyme. La voie métabolique peut également être atténuée, c'est-à-dire ralentie. Une telle atténuation peut être obtenue par exemple par inhibition partielle d'une ou plusieurs enzymes intervenant dans la voie métabolique considérée et/ou par inhibition partielle de l'expression d'un gène codant pour au moins une de ces enzymes et/ou en jouant sur les cofacteurs nécessaires pour certaines réactions. L'expression « voie métabolique au moins partiellement inhibée » signifie que le niveau de la voie métabolique considéré est réduit d'au moins 20%, plus préférentiellement au moins 30%, 40%, 50%, ou plus, comparativement au niveau dans un microorganisme sauvage. La réduction peut être plus importante, et notamment être au moins supérieure à 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l'invention, l'inhibition peut être totale, en ce sens que la voie métabolique considérée n'est plus du tout utilisée par ledit microorganisme. Selon l'invention, une telle inhibition peut être temporaire ou définitive.
Selon l'invention, on entend par « inhibition de Γ expression d'un gène » le fait que ledit gène n'est plus exprimé dans le microorganisme considéré ou que son expression est réduite, comparativement au microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber l'expression du gène), conduisant à l'absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l'inhibition peut être totale, c'est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n'est plus du tout produite. L'inhibition de l'expression d'un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique correspondante. Selon l'invention, toute méthode d'inhibition d'un gène, connue en soi par l'homme de l'art et applicable à un microorganisme peut être utilisée. Par exemple, l'inhibition de l'expression d'un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 ; 97:6640-5 ; Lodish et al., Molecular Cell Biology 4th ed. 2000. W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-3136-3) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l'expression d'un gène et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas et al, Cell. 1987;51:503-12) ; modification d'une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al, Methods Mol Biol. 2011;765:275-94. doi: 10.1007/978-l-61779-197-0_16) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagénèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons), d'origine naturelle ou artificielle. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interfèrent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L'inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al, PNAS; 93: 1156- 1160), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al., Methods Mol Biol. 2016;1338:27-42. doi: 10.1007/978-1- 4939-2932-0_3), d'un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites 'CRISPR' (Mali et al, Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.2649), ou encore de méganucléases (Daboussi et al, Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79). L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène.
Par voie de biosynthèse ou bioconversion « NADPH- dépendante » ou « consommatrice de NADPH », on entend dans le contexte de l'invention l'ensemble des voies de biosynthèse ou bioconversion dont une ou plusieurs enzymes nécessitent l'apport concomitant d'électrons obtenus par l'oxydation d'un cofacteur NADPH. Les voies de biosynthèse ou bioconversion « NADPH-dépendantes » concernent notamment la synthèse d'acides aminés (e.g. arginine, lysine, méthionine, thréonine, proline, glutamate, homosérine, isoleucine, valine) acide γ- aminobutyrique, de terpénoïdes et de terpènes (e.g. farnésène), de vitamines et précurseurs (e.g. pantoate, pantothénate, transneurosporène, phylloquinone, tocophérols), de stérols (e.g. squalène, cholestérol, testostérone, progestérone, cortisone), de flavonoïdes (e.g. frambinone, vestinone), d'acides organiques (e.g. acide citrique, acide succinique, acide oxalique, acide itaconique, acide coumarique, acide 3-hydroxypropionique), de polyols (e.g. sorbitol, xylitol, glycérol), de polyamines (e.g. spermidine), de molécules aromatiques à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant (e.g. phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones).
Le terme «exogène» tel qu'utilisé ici en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui ne sont pas normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produites par le microorganisme considéré. A l'inverse, le terme "endogène" ou "natif en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui sont normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produit par le microorganisme considéré.
Microorganismes
L'invention propose des microorganismes génétiquement modifiés pour la production d'une molécule d'intérêt, endogène ou exogène. Par microorganisme « génétiquement modifié », on entend que le génome du microorganisme a été modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant une enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse ou de bioconversion d'une molécule d'intérêt, ou codant un fragment biologiquement actif de celle-ci. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome dudit microorganisme ou d'un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l'invention, le génome du microorganisme s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu dans ledit microorganisme, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel dans ledit microorganisme, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome du microorganisme une unité transcriptionelle comportant la séquence nucléique d'intérêt, placée sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s). Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. Des promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. Par exemple, lorsque le microorganisme est une levure, il est possible d'utiliser un promoteur constitutif, tel que celui d'un gène parmi TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1. Des exemples de promoteurs inductibles utilisables chez la levure sont les promoteurs tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05.
D'une manière générale, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention présente les caractéristiques suivantes :
Expression d'une RuBisCO (EC 4.1.1.39) fonctionnelle ;
Expression d'une PRK (EC 2.7.1.19) fonctionnelle ;
Inhibition au moins partielle de la glycolyse ; et
Expression d'au moins un gène participant à la synthèse et/ou la bioconversion d'une molécule d'intérêt, et/ou inhibition d'au moins un gène codant une activité compétitrice à la synthèse et/ou la bioconversion d'une molécule d'intérêt.
Selon l'invention, tout microorganisme peut être utilisé. Préférentiellement le microorganisme est une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie ou cyanobactérie. Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une levure, préférentiellement choisie parmi les levures ascomycètes (Spermophthomceae et Saccharomycetaceae), les levures basidiomycètes (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus , Filobasidium, et Filobasidiella) et les levures deuteromycètes appartenant au Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae, et Cryptococcaceae). Préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l'invention appartient au genre Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, ou Debaryomyces. Plus préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii et Lipomyces starkeyi. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est un champignon, et plus particulièrement un champignon «filamenteux ». Dans le contexte de l'invention, les « champignons filamenteux » désignent toutes les formes filamenteuses de la sous-division Eumycotina. Par exemple, le champignon génétiquement modifié selon l'invention appartient au genre Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus ou Pyricularia. Préférentiellement, le champignon génétiquement modifié selon l'invention est choisi parmi Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, et Trichoderma viride. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une microalgue. Dans le contexte de l'invention, on désigne par « microalgue » l'ensemble des algues microscopiques de type eucaryote, appartenant préférentiellement aux classes ou superclasses des Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomées ou Bacillariophyta, Euglenophyceae, Rhodophyceae, ou Trebouxiophyceae. Préférentiellement, les microalgues génétiquement modifiées selon l'invention sont choisies parmi Nannochloropsis sp. (e.g. Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina), Tetraselmis sp. (e.g. Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. ( e.g. Chlorella salina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (e.g. Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp. (e.g. Dunaliella tertiolecta, Dunaliella salina), Phaeodactulum tricornutum, Botrycoccus braunii, Chroomonas salina, Cyclotella cryptica, Cyclotella sp., Ettlia texensis, Euglena gracilis, Gymnodinium nelsoni, Haematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Neochloris oleoabundans, Nitzschia laevis, Onoraphidium sp., Pavlova lutheri, Phaeodactylum tricornutum, Porphyridium cruentum, Scenedesmus sp. (e.g. Scenedesmus obliquuus, Scenedesmus quadricaula, Scenedesmus sp.), Stichococcus bacillaris, Spirulina platensis, Thalassiosira sp.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une bactérie, préférentiellement choisie parmi les phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, ou Verrucomicrobia. De manière préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention appartient au genre Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc, Phormidium, Prochlorococcus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, ou Zymomonas. De manière encore préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi les espèces Agwbacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Mannheimia succiniciproducens, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor, Zymomonas mobïlis, Acaryochloris marina, Anabaena variabïlis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violaceus, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochlorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Thermosynechococcus elongatus, Trichodesmium erythraeum, et Rhodopseudomonas palustris.
Expression d'une RuBisCO et d'une PRK fonctionnelles
Selon l'invention, le microorganisme peut exprimer naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles. C'est le cas par exemple des microorganismes photosynthétiques, tels que les microalgues ou les cyanobactéries.
Il existe plusieurs formes de RuBisCO dans la nature (Tabita et al, J Exp Bot. 2008;59(7): 1515- 24. doi: 10.1093/jxb/erm361). Les formes I, II et III catalysent les réactions de carboxylation et d'oxygénation du ribulose-l,5-biphosphate. La forme I est présente chez les eucaryotes et les bactéries. Elle est constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS). Le complexe enzymatique fonctionnel est un hexadécamère constitué de huit sous-unités L et huit sous-unités S. L'assemblage correct de ces sous-unités nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne spécifique : RbcX (Liu et al. , Nature. 2010 Jan 14;463(7278): 197-202. doi: 10.1038/nature08651). La forme II se trouve principalement chez les protéobactéries, les archées (Archaea ou archéobactéries) et les algues dinoflagellées. Sa structure est beaucoup plus simple : il s'agit d'un homodimère (formé de deux sous-unités RbcL identiques). Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type I peuvent s'appeler rbcLIrbcS (par exemple, Synechococcus elongatus), ou encore cbxLC/cbxSC, cfxLC/cfxSC, cbbLIcbbS (par exemple, Cupriavidus necator). Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type II s'appellent généralement cbbM (par exemple, Rhodospirillum rubrum). La forme III est présente chez les archées. On la trouve généralement sous la forme de dimères de sous-unité RbcL, ou en pentamères de dimères. Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type III peuvent s'appeler rbcL (par exemple, Thermococcus kodakarensis), cbbL (par exemple, Haloferax sp.).
On connaît deux classes de PRKs : les enzymes de classe I qui se rencontrent chez les protéobactéries sont des octamères, tandis que celles de classe II qui se trouvent chez les cyanobactéries et chez les plantes sont des tétramères ou des dimères. Selon l'organisme, les gènes codant pour une PRK peuvent s'appeler prk (par exemple, Synechococcus elongatus), prkA (par exemple, Chlamydomonas reinhardtiï), prkB (par exemple, Escherichia coli), prkl, prk2 (par exemple, Leptolyngbya sp.), cbbP (par exemple, Nitrobacter vulgaris) ou encore cfxP (par exemple, Cupriavidus necator).
Dans le cas où le microorganisme utilisé n'exprime pas naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, ledit microorganisme est modifié génétiquement pour exprimer une RuBisCO et une PRK hétérologues. Avantageusement, dans un tel cas, le microorganisme est transformé de manière à intégrer dans son génome une ou plusieurs cassettes d'expression intégrant les séquences codant pour lesdites protéines, et avantageusement les facteurs transcriptionnels appropriés. Selon le type de RuBisCO à exprimer, il peut être nécessaire de faire également exprimer par le microorganisme une ou des protéines chaperonnes, afin de favoriser le bon assemblage des sous-unités formant la RuBisCO. C'est le cas notamment pour la RuBisCO de type I, où l'introduction et l'expression de gènes codant pour une chaperonne spécifique (Rbcx) et des chaperonnes généralistes (GroES et GroEL, par exemple) s'avèrent nécessaire pour obtenir une RuBisCO fonctionnelle. La demande WO2015/107496 décrit en détail comment modifier génétiquement une levure pour qu'elle exprime une RuBisCO de type I et une PRK fonctionnelles. Il est également possible de se référer à la méthode décrite dans GUADALUPE- MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013).
Dans un mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type I. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type IL Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type III.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d'exemples, des séquences codant pour des RuBisCO et PRK qui peuvent être utilisées pour transformer un microorganisme de manière à ce qu'il exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles. Tableau 1 : Exemples de séquences codant pour une RuBisCO
Gène GenBank GI Organisme
rbcL BAD78320.1 56685098 Synechococcus elongatus rbcS BAD78319.1 56685097 Synechococcus elongatus cbbL2 CAJ96184.1 113529837 Cupriavidus necator
cbbS P09658.2 6093937 Cupriavidus necator
cbbM YP_427487.1 132036 Rhodospirillum rubrum
cbbM Q21YM9.1 115502580 Rhodoferax ferrireducens cbbM Q479W5.1 115502578 Dechloromonas aromatica rbcL 093627.5 37087684 Thermococcus kodakarensis cbbL CQR50548.1 811260688 Haloferax sp. Arc-Hr
Tableau 2 : Exemples de séquences codant pour une PRK
Inhibition de la glycolyse
Selon l'invention, la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, de sorte que le microorganisme n'est plus en mesure d'utiliser normalement cette voie métabolique (figure 1 - glycolyse). Autrement dit, le microorganisme n'a plus la capacité d'assimiler le glucose de manière similaire à un microorganisme sauvage, dans lequel la voie de la glycolyse n'a pas été inhibée (indépendamment de toute autre modification génétique).
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber, totalement ou partiellement, la glycolyse en aval de la production de glycéraldéhyde- 3 -pho sphate (G3P) .
Par exemple, la glycolyse est inhibée en amont de la production de 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG) ou en amont de la production de 3-phosphoglycérate (3PG).
Selon le microorganisme, les réactions impliquées entre le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le 3-phosphoglycérate (3PG) peuvent être prises en charge (i) par deux enzymes agissant de façon concomitante, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (EC 1.2.1.12, abréviée GAPDH ou plus rarement G3PDH) et la phosphoglycérate kinase (E.C. 2.7.2.3, abréviée PGK), ou bien (ii) par une seule enzyme de type glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase non phosphorylante (EC 1.2.1.9, abréviée GAPN).
La glycéraldéhyde- 3 -pho sphate déshydrogénase (GAPDH) catalyse la conversion réversible du G3P en 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG), en utilisant le couple NADVNADH comme donneur/accepteur d'électron selon le sens de la réaction. Selon l'organisme les gènes codant pour la GAPDH peuvent s'appeler gapA, gapB, gapC (e.g. Escherichia coli, Arabidopsis thaliana), GAPDH, GAPD, G3PD, GAPDHS (e.g. Homo sapiens), TDH1, TDH2, TDH3 (e.g. Saccharomyces cerevisiae), gap, gap2, gap3 (e.g. Mycobacterium sp., Nostoc sp.). La phosphoglycérate kinase (PGK) catalyse la conversion réversible du 1,3-BPG en 3PG, en utilisant le couple ATP/ADP comme cofacteur. Selon l'organisme, les gènes codant pour la PGK peuvent s'appeler PGK, PGK1, PGK2, PGK3, pgkA, PGKB, PGKC, cbbK, cbbKC, cbbKP (e.g. Cupriavidus necator). La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non-phosphorylante (GAPN) catalyse la conversion du G3P en 3PG, sans passer par l'intermédiaire 1,3-BPG. Cette réaction est catalysée en présence du couple de cofacteur NADPVNADPH qui joue le rôle d'accepteur d'électron. Selon l'organisme les gènes codant pour la GAPN peuvent s'appeler GAPN (e.g. Bacillus sp., Streptococcus sp.), GAPN1 {e.g. Chlamydomonas sp.). Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, l'expression du gène codant la phosphoglycérate kinase peut également être au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la glycéraldéhyde- 3 -phosphate déshydrogénase non- phosphorylante soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée. Les tableaux 3, 4 et 5 ci-dessous listent, à titre d'exemples, les séquences codant une glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, une phosphoglycérate kinase et une glycéraldéhyde- 3 -phosphate déshydrogénase non-phosphorylante qui peuvent être inhibées en fonction du microorganisme cible. L'homme du métier sait quel gène correspond à l'enzyme d'intérêt à inhiber en fonction du microorganisme. Tableau 3 : Exemples de séquences codant pour une GAPDH
Tableau 4 : Exemples de séquences codant pour une PGK
Tableau 5 : Exemples de séquences codant pour une GAPN
D'une manière générale, la production de 3-phosphoglycérate (3PG) n'est plus possible par le biais de la glycolyse, ou au moins fortement diminuée, dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention. Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l'expression du gène TDHl (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID : 853465) et/ou TDH3 (Gene ID : 853106) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l'expression du gène PGK1 (Gene ID : 5230) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l'expression du gène PGK1 (Gene ID : 5230), l'expression du gène TDHl (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID : 853465) et/ou l'expression du gène TDH3 (Gene ID : 853106) sont au moins partiellement inhibées.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie de genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène gapA (Gene ID : 947679) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie de genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène pgk (Gene ID : 947414) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation, le microorganisme est une bactérie de genre E. coli dans laquelle l'expression du gène pgk (Gene ID : 947414), et/ou l'expression du gène gapA (Gene ID : 947679) sont au moins partiellement inhibées. Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, est par contre apte à produire du 3PG par capture du C02, à partir du ribulo se- 5 -phosphate produits par la voie des pentoses phosphates (figure 2).
Les enzymes nécessaires à la métabolisation du 3PG en pyruvate n'étant pas inhibées dans le microorganisme, ledit microorganisme peut alors métaboliser le 3PG de manière à produire du pyruvate et de ΓΑΤΡ.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié est apte à produire du pyruvate et des cofacteurs NADPH en utilisant du CO2 comme source de carbone complémentaire.
Dans le contexte de l'invention, on entend par source de carbone « complémentaire », le fait que le microorganisme utilise le CO2 comme source de carbone partielle, en complément des atomes de carbone fournis par des sucres fermentescibles (glucose, galactose, saccharose, fructose, etc.), qui constituent la source de carbone majoritaire, ou principale, pour la production de pyruvate.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention permet d'augmenter le rendement carbone, en fixant et en utilisant le CO2 normalement perdu lors du métabolisme du glucose par la voie des pentoses phosphates, pour la production de pyruvate (et par la suite de molécules d'intérêt).
Inhibition de branche oxydative de la voie des pentoses phosphates
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est également modifié de manière à ce que la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates soit également au moins partiellement inhibée.
Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5- phosphate (figure 1 - voie des pentoses phosphates).
L'interruption de la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5-phosphate (Ru5P) cible spécifiquement une ou plusieurs réactions dans le processus de synthèse du Ru5P à partir de glucose-6-phosphate (G6P). Cette synthèse est généralement catalysée par les actions successives de trois enzymes : (i) la glucose-6- phosphate déshydrogénase (EC. 1.1.1.49, abréviée G6PDH), (ii) la 6-phosphogluconolactonase (E.C. 3.1.1.31, abréviée PGL), et (iii) la 6-phosphogluconate déshydrogénase (EC 1.1.1.44, abréviée PGD).
La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) catalyse la première réaction de la voie des pentoses phosphates, c'est-à-dire l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6- phosphogluconolactone (6PGL), avec réduction concomitante d'une molécule de NADP+ en NADPH. Selon l'organisme les gènes codant pour la G6PDH peuvent s'appeler G6PD (par exemple chez Homo sapiens), G6pdx (par exemple chez Mus musculus), gsdA (par exemple chez Aspergillus nidulans), zwf (par exemple chez Escherichia coli), ou encore ZWF1 (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae).
La 6-phosphogluconolactonase (PGL) est une hydrolase catalysant la synthèse de 6- phosphogluconate (6PGA) à partir de 6PGL. Selon l'organisme les gènes codant pour la PGL peuvent s'appeler pgl (par exemple chez Escherichia coli, Synechocystis sp.) pgls (par exemple chez Rhodobacteraceae bacterium), ou encore SOL (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae).
La 6-phosphogluconate déshydrogénase (PGD) est une oxydoréductase catalysant la synthèse de Ru5P à partir de 6PGA, avec réduction concomitante d'une molécule de NADP+ en NADPH et émission d'une molécule de C02. Selon l'organisme, les gènes codant pour la PGD peuvent s'appeler gnd (par exemple chez Escherichia coli,_Saccharomyces cerevisiae), PGD (par exemple chez Homo sapiens), gntZ (par exemple chez Bacillus subtilis), ou encore 6-PGDH (par exemple chez Lactobacillus paracollinoides).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la glucose-6-phosphate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 6-phosphogluconolactonase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 6-phosphogluconate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 6, 7 et 8 ci-dessous listent, à titre d'exemples, les séquences codant une glucose- 6-phosphate déshydrogénase, une 6-phosphogluconolactonase et 6-phosphogluconate déshydrogénase qui peuvent être inhibées en fonction du microorganisme cible. L'homme du métier sait quel gène correspond à l'enzyme d'intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 6 : Exemples de séquences codant pour une G6PDH
Gène GenBank GI Organisme
zwf BAA15660.1 946370 Escherichia coli
ZWF1 NP_014158.1 6324088 Saccharomyces cerevisiae gsdA CAA54841.1 1523786 Aspergillus nidulans gsdA CAK37895.1 4979751 Aspergillus niger
gsdA EAU38380.1 4316232 Aspergillus terreus Tableau 7 : Exemples de séquences codant pour une PGL
Tableau 8 : Exemples de séquences codant pour une PGD
D'une manière générale, la production de ribulo se- 5 -phosphate (Ru5P) n'est plus possible par le biais des pentoses phosphates, ou au moins fortement diminuée, dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure du genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l'expression du gène ZWFl est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la levure du genre Saccharomyces cerevisiae est génétiquement modifiée de manière à ce que l'expression des gènes TDHl, TDH2, TDH3 et/ou PGKl, et l'expression du gène ZWFl soient au moins partiellement inhibées.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène zw/est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la bactérie du genre Escherichia coli est génétiquement modifiée de manière à ce que l'expression des gènes gapA et/ou pgk, et l'expression du gène zwf soient au moins partiellement inhibées. Dans un autre exemple, le microorganisme est un champignon filamenteux du genre Aspergillus, tel que Aspergillus niger ou Aspergillus terreus, génétiquement modifié de manière à ce que l'expression des gènes pgk et gsdA soit partiellement inhibée.
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la voie de la glycolyse et la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates sont au moins partiellement inhibées n'est plus apte à produire du 3PG par la voie de la glycolyse ni du Ru5P par la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates. Il est par contre apte à produire du Ru5P en déviant la production de fructose-6-phosphate (F6P) et/ou glycéraldéhyde- 3 -phosphate (G3P), produits en début de glycolyse (en amont de l'inhibition). Cette production est notamment possible grâce aux enzymes transcétolase (EC 2.2.1.1), transaldolase (EC 2.2.1.2), ribose-5-phosphate isomérase (EC 5.3.1.6), et ribulose-5- phosphate épimérase (EC 5.1.3.1) naturellement présentes et actives chez les microorganismes (figure 3).
Les enzymes nécessaires à la métabolisation du 3PG en pyruvate n'étant pas inhibées dans le microorganisme selon l'invention, ledit microorganisme peut alors métaboliser le 3PG de manière à produire du pyruvate et de ΑΤΡ.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié est apte à produire du pyruvate en utilisant du C02 exogène comme source de carbone complémentaire.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention permet d'augmenter le rendement carbone, en fixant et en utilisant du CO2 exogène, pour la production de pyruvate (et par la suite de molécules d'intérêt). Là encore, il y a augmentation du rendement carbone.
Inhibition de la voie d'Entner-Doudoroff
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention a une voie d'Entner-Doudoroff, et celle-ci est en au moins partiellement inhibée. Cette voie, principalement retrouvée chez les bactéries (notamment de type Gram-), est une alternative à la glycolyse et à la voie des pentoses pour la production de pyruvate à partir de glucose. Plus précisément, cette voie se branche sur la voie des pentoses phosphates au niveau du P-gluconate pour alimenter la glycolyse au niveau notamment du pyruvate.
Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber les réactions de la voie d'Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate. Cette inhibition permet d'éliminer une possible voie compétitrice, et d'assurer la disponibilité du 6- phosphogluconate comme substrat pour l'ingénierie PRK/RuBisCO.
L'interruption de la voie d'Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate cible spécifiquement une ou plusieurs réactions dans le processus de synthèse du pyruvate à partir de 6-phosphogluconate. Cette synthèse est initiée par les actions successives de deux enzymes : (i) la 6-phosphogluconate déshydratase (« EDD » - EC. 4.2.1.12), et (ii) la 2- déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase (« EDA » - E.C. 4.1.2.14).
La 6-phosphogluconate déshydratase catalyse la déshydratation du 6-phosphogluconate en 2- céto-3-désoxy-6-phosphogluconate. Selon l'organisme, les gènes codant pour la 6- phosphogluconate déshydratase peuvent s'appeler edd (GenBank NP_416365, par exemple, chez Escherichia colï), ou ilvD (par exemple, chez Mycobacterium sp.).
La 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase catalyse la synthèse d'une molécule de pyruvate et d'une molécule de glycéraldéhyde- 3 -phosphate à partir du 2-céto-3-désoxy-6- phosphogluconate produit par la 6-phosphogluconate déshydratase. Selon l'organisme, les gènes codant pour la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase peuvent s'appeler eda (GenBank NP_416364, par exemple, chez Escherichia colï), ou kdgA (par exemple chez Thermoproteus tenax), ou dgaF (par exemple chez Salmonella typhimurium).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 6-phosphogluconate déshydratase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée. Les tableaux 9 et 10 ci-dessous listent, à titre d'exemples, les séquences codant une 6- phosphogluconate déshydratase et une 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase qui peuvent être inhibées en fonction du microorganisme cible. L'homme du métier sait quel gène correspond à l'enzyme d'intérêt à inhiber en fonction du microorganisme. Tableau 9 : Exemples de séquences codant pour une EDD
Tableau 10 : Exemples de séquences codant pour une EDA
D'une manière générale, dans ce mode de réalisation, la production de pyruvate n'est plus possible par le biais de la voie Entner-Doudoroff, ou au moins fortement diminuée.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène edd est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la bactérie du genre Escherichia coli est génétiquement modifiée de manière à ce que l'expression des gènes gapA, et edd soient au moins partiellement inhibées.
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la voie de la glycolyse et la voie Entner-Doudoroff sont au moins partiellement inhibées n'est plus apte à produire du 3PG par la voie de la glycolyse ni du pyruvate par la voie Entner-Doudoroff. Le flux de carbone à partir du glucose est par conséquent orienté de façon préférentielle vers l'ingénierie PRK/RuBisCO.
Production de molécules d'intérêt
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié est transformé de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt.
Dans le contexte de l'invention, on désigne préférentiellement par molécule d'intérêt une petite molécule organique, de masse moléculaire inférieure ou égale à 0,8 kDa. D'une manière générale, les modifications génétiques apportées au microorganisme, telles qu'exposées ci-dessus, permettent d'améliorer le rendement carbone des voies de synthèse et/ou de bioconversion de molécules d'intérêt.
Dans le contexte de l'invention, un rendement « amélioré » s'entend en termes de quantité de produit fini. D'une manière générale, le rendement carbone correspond dans le contexte de l'invention au ratio quantité de produit fini / quantité de sucre fermentescible, notamment en poids. Selon l'invention, le rendement carbone est augmenté chez les microorganismes génétiquement modifiés selon l'invention, comparativement aux microorganismes sauvages, placés dans des conditions de culture identiques. Avantageusement, le rendement carbone est augmenté de 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, ou plus. Le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention peut produire une plus grande quantité des molécules d'intérêt (produit fini) comparativement aux molécules hétérologues produites par un microorganisme modifié génétiquement simplement pour produire ou surproduire cette molécule. Selon l'invention, le microorganisme génétiquement peut également surproduire une molécule endogène comparativement au microorganisme sauvage. La surproduction d'une molécule endogène s'entend principalement en termes de quantités. Avantageusement, le microorganisme génétiquement modifié produit au moins 20%, 30%, 40%, 50%, ou plus en poids de la molécule endogène que le microorganisme sauvage. Avantageusement, le microorganisme selon l'invention est génétiquement modifié de manière à produire ou surproduire au moins une molécule parmi les acides aminés, les terpénoïdes, les terpènes, les vitamines et/ou précurseurs de vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les acides organiques, les polyols, les polyamines, les molécules aromatiques obtenues à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, etc.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour surproduire au moins un acide aminé, préférentiellement choisi parmi l'arginine, la lysine, la méthionine, la thréonine, la proline, le glutamate, l'homosérine, l'isoleucine, la valine, et l'acide γ- aminobutyrique .
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire des molécules de la voie des terpénoïdes, tel que le farnésène, et de la voie des terpènes.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une vitamine ou un précurseur, préférentiellement choisi parmi le pantoate, pantothénate, transneurosporène, phylloquinone et tocophérols. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un stérol, préférentiellement choisi parmi le squalène, cholestérol, testostérone, progestérone et la cortisone.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un flavonoïde, préférentiellement choisi parmi la frambinone et la vestinone.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un acide organique, préférentiellement choisi parmi l'acide coumarique, l'acide 3- hydroxypropionique, l'acide citrique, l'acide oxalique, l'acide succinique, et l'acide itaconique.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyol, préférentiellement choisi parmi le sorbitol, xylitol et le glycérol.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une polyamine, préférentiellement de la spermidine.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une molécule aromatique à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, préférentiellement choisie parmi les phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones.
Dans le cas où la molécule d'intérêt est obtenue par bioconversion, le microorganisme génétiquement modifié est avantageusement mis en culture dans un milieu de culture comprenant le substrat à convertir. D'une manière générale, la production ou surproduction d'une molécule d'intérêt par un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est obtenue par mise en culture dudit microorganisme dans un milieu de culture approprié, connu de l'homme du métier.
Le terme « milieu de culture approprié » désigne d'une manière générale un milieu de culture stérile apportant les nutriments essentiels ou bénéfiques à la maintenance et/ou à la croissance dudit microorganisme, tels que les sources carbonées ; les sources azotées telles que le sulfate d'ammonium ; les sources de phosphores, par exemple, le potassium phosphate monobasique ; les oligo-éléments, par exemple, les sels de cuivre, d'iodure, de fer, de magnésium, de zinc ou de molybdate ; les vitamines et autres facteurs de croissance tels que des acides aminés ou autres promoteurs de croissance. Un antimousse peut être ajouté selon les besoins. Selon l'invention, ce milieu de culture approprié peut être chimiquement défini ou complexe. Le milieu de culture peut ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu synthétique, tel que défini par Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8:501-17), adapté par Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81), ou commercialement disponible tel que le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals ou Sigma- Aldrich).
Notamment, le milieu de culture peut comprendre une source de carbone simple, tel le glucose, le galactose, le saccharose, les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres, éventuellement supplémentée en C02 comme co-substrat carboné. Selon la présente invention, la source de carbone simple doit permettre la croissance normale du microorganisme d'intérêt. Il est également possible, dans certains cas, d'utiliser une source de carbone complexe, telle que de la biomasse lignocellulosique, de la paille de riz, ou de l'amidon. L'utilisation d'une source de carbone complexe nécessite généralement un prétraitement avant utilisation.
Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient au moins une source de carbone parmi les monosaccharides tels que le glucose, le xylose ou l'arabinose, les disaccharides tels que le saccharose, les acides organiques tels que l'acétate, le butyrate, le propionate ou le valérate afin de favoriser différentes sortes de polyhydroxyalcanoate (PHA), du glycérol traité ou non-traité.
En fonction des molécules à produire et/ou surproduire, il est possible dé jouer sur l'apport en facteur nutritionnels (N, O, P, S, K, Mg, Fe, Mn, Co, Cu, Ca, Sn ; Koller et ah, Microbiology Monographs, G.-Q. Chen, 14: 85-119, (2010)). C'est le cas notamment pour favoriser la synthèse et l'accumulation intracellulaire de polyhydroalcanoate (PHA) dont le polyhydroxybutyrate (PHB).
Selon l'invention, tout mode de culture permettant la production à l'échelle industrielle de molécules d'intérêt peut être envisagé. Avantageusement, la culture se fait en bioréacteurs, notamment en mode batch, fed-batch et/ou culture continue. Préférentiellement, la conduite de culture associée à la production de la molécule d'intérêt est en mode fed-batch correspondant à une alimentation contrôlée en un ou plusieurs substrats, par exemple via l'ajout d'une solution concentrée en glucose dont la concentration peut être comprise entre 200 g.L"1 et 700 g.L 1. Une alimentation contrôlée en vitamines au cours du procédé peut également être bénéfique à la productivité (Alfenore et ah, Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60:67-72). Il est également possible d'ajouter une solution de sels d'ammonium pour limiter l'apport azoté. La fermentation est généralement conduite en bioréacteurs, avec de possibles étapes de précultures solides et/ou liquides en fioles d'Erlenmeyer, avec un milieu de culture approprié contenant au moins une source de carbone simple et/ou un apport de CO2 exogène, nécessaire à la production de la molécule d'intérêt. D'une manière générale, les conditions de culture des microorganismes selon l'invention sont aisément adaptables par l'homme du métier, en fonction du microorganisme et/ou de la molécule à produire/surproduire. Par exemple, la température de culture est notamment comprise pour les levures entre 20°C et 40°C, de préférence entre 28°C et 35°C, et plus particulièrement d'environ 30°C pour S. cerevisiae. La température de culture est notamment comprise entre 25°C et 35°C, de préférence 30°C pour Cupriavidus necator.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
L'invention a aussi pour objet un procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la synthèse de ladite molécule d'intérêt.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion de ladite molécule d'intérêt.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production d'une molécule d'intérêt comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Par exemple, il est possible de faire surproduire du citrate par un champignon, notamment un champignon filamenteux, tel qu'Aspergillus niger, génétiquement modifié pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, et dans lequel l'expression des gènes pgk (Gene ID : 4982539) et gsdA (Gene ID : 4979751) est au moins partiellement inhibée. Π est également possible de faire surproduire de l'acide itaconique par un champignon, notamment un champignon filamenteux, tel qu'Aspergillus terreus ou Aspergillus niger, génétiquement modifié pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, et dans lequel l'expression des gènes pgk (Gene ID : 4354973) et gsdA (Gene ID : 4316232) est au moins partiellement inhibée.
De même, il est possible de faire produire du farnésène par une levure telle qu'une levure du genre Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, une farnésène synthase et dans laquelle l'expression d'un gène PGK1 (Gene ID : 5230) est au moins partiellement inhibée. II est également possible de faire surproduire du glutamate par une bactérie, telle qu'une bactérie du genre Escherichia coli, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, et dans laquelle l'expression du gène gapA (Gene ID : 947679) est au moins partiellement inhibée. Cette surproduction peut également se réaliser dans une souche où l'inhibition au moins partielle du gène gapA est combinée avec l'inhibition au moins partielle du gène zw/(Gene ID : 946370).
De même, il est également possible de faire surproduire de l'acide γ-aminobutyrique par une bactérie, telle qu'une bactérie du genre Escherichia coli, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, ainsi qu'une glutamate décarboxylase gadB (Gene ID : 946058), et dans laquelle l'expression du gène gapA (Gene ID : 947679) est au moins partiellement inhibée. Cette surproduction peut également se réaliser dans une souche où l'inhibition au moins partielle du gène gapA est combinée avec l'inhibition au moins partielle du gène zw/(Gene ID : 946370).
De même il est possible de faire surproduire de l'acide succinique et de l'acide oxalique par une bactérie, telle qu'une bactérie du genre Escherichia coli, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO de type I ou II fonctionnelles, ainsi qu'une activité enzymatique permettant l'oxydation du glyoxylate en oxalate, préférentiellement une glyoxylate déshydrogénase FPGLOXDH1 (ARNm : BAH29964.1), une glyoxylate oxydase GLO (ARNm: AOW73106.1), ou une lactate déshydrogénase LDHA (Gene ID : 3939), et dans laquelle l'expression des gènes gapA (Gene ID : 947679) et zwf (Gene ID : 946370) est au moins partiellement inhibée. EXEMPLES
Exemple 1: Analyse bio-informatique a) Calcul de rendements théoriques i) Comparaison des rendements de fixation de carbone à partir de glucose entre une souche sauvage utilisant la voie des pentoses phosphates et la glycolyse, et une souche modifiée selon l 'invention
Afin d'évaluer le bénéfice apporté par les modifications décrites selon l'invention, des calculs de rendements théoriques ont été réalisés sur la base de la stœchiométrie des réactions impliquées. Deux cas de figure ont été analysés : l'amélioration apportée par l'ingénierie PRK-RuBisCO (i) dans une souche inhibée pour la glycolyse sur le rendement d'une voie de biosynthèse NADPH-dépendante (par exemple, synthèse de farnésène), et (ii) dans une souche inhibée pour la glycolyse et pour la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates sur le rendement d'une voie de biosynthèse d'intérêt (par exemple, synthèse de citrate). Dans le cadre de l'amélioration des voies de biosynthèse NADPH-dépendante, le bilan théorique de la formation de NADPH et de glycéraldéhyde-3-phosphate (G3-P) à partir de glucose par la voie des pentoses phosphates a été calculé selon l'équation ci-dessous (1) :
(1) 3 Glucose + 5 ATP + 6 NADP+ + 3 H20→ 5 G3-P + 5 ADP+ 6 NADPH + 11 H+ + 3 C02
En descendant jusqu'à la formation de pyruvate à partir de G3P, on arrive au bilan suivant : (2) 3 Glucose + 5 ADP + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5 Pi→ 5 Pyruvate + 5 ATP+ 6 NADPH + 5 NADH + 11 H+ + 3 C02 + 2 H20
Si on normalise le bilan pour une mole de glucose, on obtient le rendement suivant :
(3) Glucose + 1.67 ADP + 2 NADP+ + 1.67 NAD+ + 1.67 Pi→ 1.67 Pyruvate + 1.67 ATP+ 2 NADPH + 1.67 NADH + 3.67 H+ + C02+ 0.67 H20 Ainsi, en utilisant par la voie des pentoses phosphates, 1.67 moles de pyruvate et 2 moles de NADPH sont produites à partir d'une mole de glucose. Une mole de carbone est par contre perdue par décarboxylation, lors de la formation de ribulose-5-phosphate par la 6- phosphogluconate déshydrogénase (EC 1.1.1.44). En comparaison, la formation de pyruvate par la voie de la glycolyse donne le rendement suivant :
(4) Glucose + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 P;→ 2 Pyruvate + 2 ATP+ 2 NADH + 2 H+ + 2 H20
Le rendement maximum théorique de production de pyruvate par la voie des pentoses phosphates est par conséquent de 0.82 gpymvate/ggiucose (g de pyruvate synthétisé, par g de glucose consommé), alors qu'il est de 0.98 gpymvate/ggiucose par la voie de la glycolyse.
En intégrant l'ingénierie PRK/RuBisCO dans une souche inhibée pour la glycolyse (par exemple APGKl dans le cadre de la levure S. cerevisiae), le flux de fixation de carbone est redirigé vers la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates, puis vers l'ingénierie PRK/RuBisCO (cf. figure 2). Ce flux se rattache à la fin de la voie de la glycolyse, au niveau de la formation de 3-phosphoglycérate (3PG), avec le rendement suivant :
(5) Glucose + 2 ATP + 2 NADP+ + 2 H20→ 2 3PG + 2 ADP + 2 NADPH + 6 H+
En descendant jusqu'à la formation de pyruvate à partir de 3PG, on arrive au bilan suivant :
(6) Glucose + 2 NADP+→ 2 Pyruvate + 2 NADPH + 4 H+ L'intégration des modifications selon l'invention dans un microorganisme permet de récupérer la molécule de carbone autrement perdue par la décarboxylation dans la voie des pentoses. Le rendement maximum théorique de fixation de carbone est par conséquent de 0.98 gpymvate/ggiucose, ce qui permet d'améliorer de 20.5% le rendement obtenu par la production de pyruvate par la voie des pentoses phosphates, tout en produisant du NADPH. Dans un second cas de figure (cf. figure 3), l'ingénierie PRK/RuBisCO est intégrée dans une souche à la fois inhibée pour la glycolyse (par exemple APGKl dans le cadre de la levure S. cerevisiae), et pour la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates (par exemple AZWFl dans le cadre de la levure S. cerevisiae). Le bilan théorique de la formation de NADPH et de 3-phosphoglycérate (3PG) à partir de glucose devient alors (7) 2.5 Glucose + 6 ATP + 3 C02 + 3 H20→ 6 3PG + 6 ADP + 12 H+
En descendant jusqu'à la formation de pyruvate à partir de 3PG, on arrive au bilan suivant
(8) 2.5 Glucose + 3 C02→ 6 Pyruvate+ + 3 H20 + 6 H+ Si on normalise le bilan pour une mole de glucose, on obtient le rendement suivant : (9) Glucose + 1.2 C02→ 2.4 Pyruvate + 1.2 H20 + 2.4 H+
L'intégration des modifications selon l'invention permet de fixer 1.2 molécule de carbone supplémentaire par mole de glucose consommée. Le rendement maximum théorique correspondant est de 1.17 gpymvate/ggiucose, soit ca. 20 % d'amélioration, comparé au rendement de fixation de carbone de la glycolyse. ii) Application à la production de citrate
Dans un second cas de figure, on applique le calcul à la production de citrate chez la levure S. cerevisiae, dans une souche sauvage et dans une souche modifiée selon l'invention intégrant une ingénierie PRK/RuBisCO et délétée pour le gène PGKl de façon à inhiber la voie de la glycolyse, et pour le gène ZWF1 pour inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses.
La production de citrate à partir de pyruvate se résume par l'équation bilan suivante :
(11) 2 Pyruvate + ATP + NAD+ + 2 H20→ Citrate + ADP + NADH + P; + 3H+
Cette synthèse ne nécessite pas de NADPH, mais 2 moles de pyruvate. De façon optimale, une souche sauvage obtient ces 2 moles de pyruvate par la glycolyse, à partir d'une mole de glucose d'après l'équation (4), avec le bilan suivant :
(12) Glucose + ADP + 3 NAD+ + P;→ Citrate + ATP+ 3 NADH + 5 H+
Le rendement gdtrate/ggiucose correspondant est de 1.07
Dans le cadre d'une souche modifiée selon l'invention, inhibée pour la voie de la glycolyse et la voie des pentoses phosphates, les 2 pyruvates nécessaires sont obtenus avec seulement 0.83 mole de glucose (cf. équation 9), avec le bilan suivant :
(13) 0.83 Glucose + C02 + ATP + NAD+ + H20→ Citrate + ADP+ NADH + P; + 5 H+
Le rendement gdtrate/ggiucose correspondant est de 1.28, soit une augmentation théorique maximale d'environ 20 % par rapport au rendement de la souche sauvage. b) Simulation de rendements de biosynthèse par analyse de balance de flux
Dans une approche bio-informatique, des analyses de type « Analyse de balance de flux » (ABF) ont également été réalisées pour simuler l'impact des modifications décrites selon l'invention sur le rendement de différentes voies de biosynthèse. Les ABF reposent sur des modèles mathématiques permettant de simuler des réseaux métaboliques à l'échelle d'un génome (Orth et ah , Nat Biotechnol. 2010 ; 28: 245-248). Les réseaux reconstruits contiennent les réactions métaboliques connues d'un organisme donné et intègrent les besoins de la cellule, pour assurer notamment la maintenance cellulaire, ou la croissance. Les ABF permettent de calculer le flux des métabolites au travers de ces réseaux, permettant de prédire des taux de croissance théoriques ainsi que des rendements de productions de métabolites. i) Procédure
Les simulations ABF ont été réalisées avec le logiciel OptFlux (Rocha et al, BMC Syst Biol. 2010 Apr 19;4:45. doi: 10.1186/1752-0509-4-45), et le modèle métabolique de Saccharomyces cerevisiae ÏMM904 (Mo et al., BMC Syst Biol. 2009 Mar 25;3:37. doi: 10.1186/1752-0509-3- 37). Ce modèle a été modifié pour inclure les améliorations décrites selon l'invention, notamment une voie hétérologue de fixation de C02 avec (i) ajout d'une réaction de type PRK, (ii) ajout d'une réaction de type RuBisCO.
Dans des exemples de réalisation particuliers, les réactions nécessaires pour simuler la production de molécules par des voies hétérologues ont également été ajoutées au modèle.
Dans un exemple de réalisation particulier, une réaction de type farnésène synthase (EC 4.2.3.46 ou EC 4.2.3.47) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue de farnésène.
Dans un second exemple de réalisation particulier, les réactions de type acetoacetyl-CoA réductase (EC 1.1.1.36), et poly- -hydroxybutyrate synthase (EC 2.3.1.B2 ou 2.3.1.B5), ont été rajoutées au modèle pour simuler une voie de production hétérologue de β-hydroxyburyrate, le monomère du polyhydroxybutyrate.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, une réaction de type glutamate décarboxylase (EC 4.1.1.15) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue de l'acide γ- aminobutyrique . Dans un autre exemple de réalisation particulier, une réaction de type aconitate décarboxylase (EC 4.1.1.6) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue de l'acide itaconique.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, une réaction de type lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue d'oxalate
Les simulations ont été réalisées en appliquant au modèle un ensemble de contraintes reproductibles par l'homme du métier, visant à simuler les conditions de culture in vivo d'une souche de S. cerevisiae dans les conditions décrites selon l'invention (par exemple, présence de glucose non limitante dans le milieu, condition de culture aérobie).
Dans des exemples de réalisation particuliers, les simulations sont réalisées en inactivant virtuellement les réactions des enzymes PGK1 (par exemple, glutamate, acide β- hydroxybutyrique, farnésène) et ZWF1 (par exemple, production de citrate), de façon à simuler les diminutions d'activité de la glycolyse et de la voie des pentoses phosphates, décrites selon l'invention.
Les simulations sont réalisées en parallèle sur un modèle de type « souche sauvage », non modifié, de façon à évaluer l'impact des améliorations décrites selon l'invention sur le rendement de production des voies de biosynthèse testées. ii) Résultats
Les rendements théoriques obtenus et les pourcentages d'amélioration apportés par l'invention sont décrits dans le tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 : Rendements de production maximums théoriques évalués par ABF sur une souche sauvage et une souche modifiée selon les modifications du brevet, pour la production de différentes molécules.
MOIX/MOIGLUC : moles de molécule X produites, rapportées aux moles de glucose consommées
CMolx / CMOIGLUC : moles de carbone de molécule X produites, rapportées aux moles de carbone de glucose consommées
gx/gGLuc : g de molécule X produits, rapportés aux g de glucose consommés.
Exemple 2 : Amélioration de la production de farnésène chez S. cerevisiae Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl- 289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) est ingéniérée pour produire du NADPH sans perte de C02 et ainsi permettre l'amélioration de la production d'alpha-farnésène à partir de glucose. a) Inactivation de la voie de la glycolyse
Pour cela, la voie de la glycolyse a été inactivée par délétion du gène PGKl. Une fois la glycolyse inhibée, la souche de levure obtenue n'est plus à même d'utiliser le glucose comme source de carbone et d'énergie. Il est donc nécessaire d'alimenter les voies de synthèse de biomasse par du glycérol et les voies énergétiques par de l'éthanol. Les souches délétées pour PGKl sont cultivées sur milieu YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol).
La délétion du gène PGKl a été obtenue de la manière suivante : La phase codante du gène de résistance au G418, issue de la cassette KanMX contenue sur le plasmide pUG6 {P30114 - Euroscarf) a été amplifiée avec les oligonucléotides CB101 (SEQ ID N°l) et CB102 (SEQ ID N°2) :
SEQ ID N°l : CB101 (forward): 5'-
ACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGGG TAAGGAAAAGACTC ACGTTTC-3 '
SEQ ID N°2 : CB102 (reverse): 5'-
GGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTAGA AAAACTCATCGAGCATCAAATGAAAC -3' La partie soulignée des oligonucléotides est parfaitement homologue à la séquence Kan et le reste de la séquence correspond aux régions adjacentes à la phase codante du gène PGKl sur le génome de Saccaromyces cerevisiae de manière à générer un amplicon PCR contenant aux extrémités des séquences de recombinaison homologues du locus du gène PGKl.
Pour la réaction de transformation selon l'homme de l'art (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor lab course manual, 1997 ; Gietz and Schiest, 1995, Methods in Molecular and Cellular Biology 5[5]:225-269), la souche CEN.PK 1605 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose) à 30°C jusqu'à une densité optique à 600 nm de 0,8. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM. Parallèlement, on a préparé un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit : 250 μΐ. de 50% de PEG, 10 μΐ. d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 5 ou 10 μΐ^ de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau.
Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de milieu YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 °C 200 tours par minute. Les cellules ont ensuite été centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalé sur YPGE+G418 180 μg/mL.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène PGKl et référencées EQ-0134 (CEN.PK1605 Apgkl :±an). b) Introduction des enzymes PRK - RuBisCO - alpha-farnésène synthase
Afin de reconstituer une voie alternative à la glycolyse et permettre à la souche Apgkl de pousser sur glucose, ladite souche a été modifiée de manière à permettre l'expression combinatoire :
• d'un gène codant pour une phosphoribulokinase PRK qui se greffe sur la voie des pentoses phosphates en consommant le ribulose-5P pour donner le ribulose- 1.5bisP et
• d'une RuBisCO de type I (avec les gènes structuraux RbcL et RbcS et les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL). La RuBisCO consomme le ribulose- 1.5bisP et une mole de C02 pour former le 3-phosphoglycerate en aval de la délétion PGKl dans la voie de la glycolyse.
Cette voie alternative permet de nouveau à la souche de consommer le glucose comme source principale de carbone et d'énergie.
Pour produire de l'apha-farnésène, il manque à la levure le gène de alpha-farnésène synthase (AFS1; SEQ ID N° 71 ; GenBank accession number AY182241).
Aussi, les sept gènes nécessaires à l'ingénierie PRK-RuBisCO (Tableau 12) ont été clonés sur quatre vecteurs plasmidiques capables de se répliquer de manière autonome, avec des origines de réplication compatibles et portant chacun un gène différent de complémentation d'auxotrophie ou de résistance à un antibiotique, permettant de sélectionner les souches contenant les trois ou quatre constructions plasmidiques.
Deux de ces plasmides sont monocopies, avec une origine de réplication de type Ars/CEN et le troisième est multicopie avec une origine 2μ.
Tableau 12 : Description des cassettes d'expression et de la composition des plasmides
Les gènes issus de Synechococcus elongatus tels que rbcL, rbcS, rbcX et prk (tels que décrits dans WO 2015107496 A 1 ) et alpha-farnésène synthase de Malus domestica (Tippmann et al. , Biotechnol Bioeng. 2016 Jan;113(l):72-81) ont été optimisés pour l'utilisation de codons chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Selon le protocole précédemment décrit pour la transformation des levures, la souche EQ-0134 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM. Parallèlement, le mix de transformation suivant est préparé 250 de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ^ (3 μg d'une des combinaisons suivantes, pFPP45+pFPP56+pFPP20 ou pL4+pFPP45+pFPP56+pFPP20) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YNB (yeast nitrogen base incluant le sulfate d'ammonium) avec glycérol et éthanol, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 °C sous atmostphère enrichie à 10% C02. Le mix final est étalé sur milieu gélosé YNB incluant le sulfate d'ammonium + CSM sans LUW (leucine uracile, tryptophane) + nourséothricine le cas échéant, avec glycérol et éthanol comme sources carbonées.
Selon le protocole précédemment décrit, la souche CEN.PK 1605 est transformée avec la combinaison de plasmides suivante : pL4+pFL36+pCM185+pV51TEF.
Les clones obtenus ont été génotypés pour tous les gènes de l'ingénierie puis adaptés sur milieu liquide YNB sulfate d'ammonium et glucose. · EQ-0153 (CEN.PK1605 Apgkl :±m) pFPP45+pFPP56+pFPP20)
• EQ-0253 (CEN.PK1605 Apgkl ::kan) (pL4+pFPP56+ pFPP20+pFPP45)
• EQ-0353 (CEN.PK1605) (pL4+ pFL36+ pCM185+pV51TEF) c) Adaptation des souches EQ-0153 et EQ-0253 à la croissance en milieu liquide avec glucose et C02. Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées avec le milieu de culture approprié et un apport de CO2 exogène de 10%, en incubateur agité (120 RPM, 30°C), avec une inoculation à 0,05 D.O. 600 nm mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre EON (BioTek Instruments). La souche d'intérêt est cultivée sur milieu YNB+CSM-LUW avec 10 g/L de glycérol et 7,5 g/L d'éthanol, dans des conditions où l'expression de la PRK n'est pas induite, et en présence le cas échéant de nourséothricine. Il est, dans ces conditions, nécessaire d'alimenter la souche en amont et en aval de la délétion du gène PGK1.
Après obtention d'une quantité de biomasse suffisante, des cultures d'un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250 ml minimum sont ensemencées afin d'effectuer l'adaptation de la souche à l'utilisation de l'ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture YNB+CSM-LUW avec 20 g/L de glucose, en présence le cas échéant de nourséothricine et un apport en C02 exogène comme décrit ci-dessus.
Après observation d'un démarrage de croissance significatif, les souches sont adaptées à un milieu minéral minimum exempt des acides aminés et bases azotées inclus dans le CSM-LUW, soit uniquement du YNB avec 20 g/L de glucose, nourséothricine si nécessaire et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus. d) Production de farnésène en fiole d' Erlenmeyer
La souche EQ-0253 de Saccharomyces cerevisiae, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène PGK1, est cultivée afin de produire du farnésène en surproduisant du NADPH sans perte de CO2, en utilisant une PRK et une RuBisCO.
Cette souche d'intérêt est comparée à une souche de référence EQ-0353 produisant du farnésène suite à l'introduction d'une alpha-farnésène synthase hétérologue, sans délétion de PGK1 ni ajout de PRK et RuBisCO.
Les souches EQ-0253 (CEN.PK1605 Ap gkl :±an) pL4+pFPP56+ pFPP20+pFPP45) et EQ- 0353 (CEN.PK1605) (pL4+ pFL36+ pCM185+pV51TEF) ont été cultivées dans un milieu YNB avec 20 g/L de D-glucose, auquel a été ajouté 100 μg/L de nourséothricine. Une pré- culture contenant 20 ml de milieu de culture a été inoculée à DOôoonm 0,05 dans une fiole d'Erlenmeyer bafflé de 250 ml, mis en agitation à 120 rpm durant 24 h à 30°C dans un incubateur Minitron dont l'atmosphère était régulée à 10% de CO2. A partir de la première préculture, 50 ml de milieu a été inoculé à DO 6oonm 0,05 dans un Erlenmeyer de 250 ml et mis en agitation, 120 rpm, 24 h à 30°C, 10% CO2. La culture, menée également en fioles d'Erlenmeyers (500 mL, bafflés) à partir de la deuxième pré-culture, a été inoculée à DOôoonm 0,05 dans 100 ml du même milieu de culture, auquel a été ajouté 50 μg/ml d'ampicilline, 10 μΐ d'antimousse (Antifoam 204, Sigma, A6426) et 10% (v/v) de dodécane (Tippman ét al , Talanta (2016), 146: 100-106). Les cultures ont été agitées à 120 rpm à 30°C en présence de 10% C02. Un suivi de croissance a été effectué par mesure de la turbidité à 600 nm.
Pour extraire le farnésène, 500 μΐ de phase organique ont été collectés et centrifugés à 5,000 g pendant 5 min pour une séparation complète des deux phases. La phase organique a été conservée à 4°C jusqu'à l'analyse en GC-MS. La détection et la quantification de α-farnésène ont été réalisées par spectrométrie de masse simple quadripôle. Une colonne Zebron ZB-FFAP a été utilisée avec l'hydrogène comme gaz vecteur à un débit fixé à 2,95 ml/min. La température d'entrée était de 260°C, 1 μΐ d'échantillon a été injecté en mode « splitless ». La température initiale du four était de 70°C (4 min) puis elle a été augmentée progressivement jusqu'à 160°C (7°C / min) puis jusqu'à 240°C (40°C / min) où elle a été maintenue pendant 1,05 min. Pour la détection en spectrométrie de masse, les températures de la ligne de transfert et de la source étaient respectivement de 250°C et 200°C. L'acquisition en masse a été faite entre t=10 min et t=20 min. Une calibration externe comprenant sept points a été réalisée à partir du mix d'isomères de farnésène (Sigma, W383902) pour la quantification de -farnésène produit par les souches.
Pour quantifier le glucose consommé par les souches, 500 μΐ du milieu de culture ont été prélevés à la même DO d'extraction du farnésène, centrifugé à 5 000 g, 5 min à 4°C. Le surnageant a été filtré (Minicart RC4, sartorius 0.45μιη) et conservé dans un vial à -20°C. Le glucose contenu dans cet échantillon a été quantifié par HPLC-UV Ultimate 3000 (Thermo Scientific) équipée d'une pompe, d'un autosampler réfrigérant à 8°C et d'un détecteur à indice de réfraction (RI, précision instruments IOTA 2). Une colonne Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) 150 x 7,8 mm, de granulométrie 8 μιη (Phenomenex, 00H-0138-KO) a été utilisée avec une pré-colonne Carbo-H 4 x 3.0 mm. La température de la colonne était de 35°C et le débit était fixé à 0,5 mL/min. L'élution isocratique a été réalisée avec une phase mobile aqueuse à 5 mM d'H2S04 et a duré 30 min. Un volume de 20 μΐ^ a été injecté pour chaque échantillon. L'identification des composés a été basée sur la comparaison des temps de rétention avec les standards. La calibration externe comprend 10 points de concentration variable en glucose (0- 20 g/L).
Le rendement carbone Υα-famésène/Gic est calculé en gramme de farnésène produit par gramme de glucose consommé pour les deux souches EQ-0253 et EQ-0353,
_ farnésène (mg/L aqueux)
I a-farnésène/Glc— ', " ~ " ·
glucose (mg/Laqueux)
Tableau 13 : Rendement massique d'cc-farnésène sur D-glucose
L'augmentation du rendement massique d'cc-farnésène sur D-glucose observée a été de 9,6% pour la souche EQ-0253, par rapport à la souche de contrôle EQ-0353.
Exemple 3 : Amélioration de la production de citrate chez S. cerevisiae
a) Inactivation du gène ZWFl et du gène IDHl dans une souche haploïde de signe sexuel MAT a
• Inactivation du gène ZWFl
La phase codante du gène de résistance à l'hygromycine B, issue de la cassette hphMX (loxP- pAgTEFl-hph-tAgTEFl-loxP) et contenue sur le plasmide pUG75 (P30671) - Euroscarf,), est amplifiée avec les oligonucléotides Sdzwf 1 et Rdzwf 1 (Tableau 14). Cela permet de générer un amplicon PCR Azwfl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la glucose-6-phosphate déshydrogénase ZWFl.
Tableau 14 : Oligonucléotides
Nom Séquence
Sdzwf 1 AAG AGTAAATCCAATAG AATAG AAAACCACATAAG G CAAGATG G GTAAAAAG CCTG AACTC (SEQ I D N °3) ACCG
Rdzwfl ATTTCAGTG ACTTAG CCG ATAAATG AATGTG CTTG CA 1 1 1 1 1 1 1 ATTCCTTTGCCCTCGGACG (SEQ I D N °4)
Sd pgkl ACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTAC 1 1 1 1 1 ACAACAAATATAAAACAATGGGTAAGGAA (SEQ I D N °5) AAGACTCACGTTTC
Rdpgkl G G G AAAG AG AAAAG AAAAAAATTG ATCTATCG ATTTC AATTCAATTC AATTTAG AAAAACTC (SEQ I D N °6) ATCGAGCATCAAATGAAAC
Sdid hl TCTCCCTATCCTCATTCTTCTCCC 1 1 1 1 CCTCCATAATTGTAAGAGAAAAATGGGTACCACTCT (SEQ I D N °7) TGACGACACGG
Rdid h l AATTTG AACAC ACTTAAGTTG CAG AACAAAAAAAAG G G G AATTG 1 1 1 1 C ATTAG G G G CAG G (SEQ I D N °8) G CATG CTCATGTAG AG C La partie soulignée des oligonucléotides correspond à la partie parfaitement homologue à la séquence du gène de sélection, le reste de la séquence correspondant aux régions adjacentes à la phase codante du gène cible à déléter sur le génome de Saccaromyces cerevisiae.
La souche précédemment décrite CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000 est transformée avec le fragment PCR Azwfl décrit ci-dessus.
Pour la réaction de transformation, la souche CEN.PK 1605 est cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20 g/L) à 30°C jusqu'à une densité optique 600nm de 0,8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 μΐ^ de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ, de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de milieu YPD (yeast extract peptone dextrose), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 °C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalé sur YPD + HygromycineB 200 μg/mL.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène ZWF1 et référencées EQSC-002 (CEN.PK 1605 Azwfl :±p ).
• Inactivation du gène IDH1
L'inactivation de ce gène permet d'accumuler du citrate (Rodriguez et ah , Microb Cell Fact. 2016 Mar 3; 15:48). La phase codante du gène de résistance à la nourséothricine, issue de la cassette natMX (loxP- pAgTEFl-nat-tAgTEFl-loxP) contenue sur le plasmide (pUG74 (P30670) - Euroscarf) est amplifiée avec les oligonucléotides Sdidhl et Rdidhl (tableau 13). Cela permet de générer un amplicon PCR Aidhl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la sous unité de l'isocitrate déshydrogénase IDH1.
Les souches précédemment décrites, EQSC-002 (CEN.PK 1605 Azwfl ::hph) et CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) sont transformées avec le fragment PCR pour l'inactivation du gène IDH1. Pour la réaction de transformation les souches EQSC-002 et CEN.PK1605 sont cultivées dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20 g/L) à 30°C jusqu'à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ, de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ. 50 μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPD (yeast extract peptone dextrose), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalées sur YPD + HygromycineB 200 μg/mL, 50 μg/mL nourséothricine.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène IDH1 et se nomment EQSC-003 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Mdhl::nat) et EQSC-005 (CEN.PK 1605 Aidhl::nat) b) Inactivation du gène PGK1 dans une souche haploïde de signe sexuel MAT alpha La phase codante du gène de résistance au G418 issue de la cassette KanMX (ΙοχΡ-pAgTEFl- kanMX-tAgTEFl-loxP) contenue sur le plasmide pUG6 (P30114) - Euroscarf est amplifiée avec les oligonucléotides Sdpgkl et Rdpgkl (Tableau 13) permettant de générer un amplicon PCR pgkl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la 3-phosphoglycerate kinase PGK1.
La souche CEN.PK 1606 (Mat alpha HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) est transformée avec le fragment PCR pour l'inactivation du gène PGK1.
Pour la réaction de transformation la souche CEN.PK 1606 est cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20g/L) à 30°C jusqu'à une densité optique 600 nm de 0,8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2 500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit : 250 de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ, de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPGE (yeast extract peptone glycérol 20 g/L, éthanol 30g/L), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalé sur YPGE + 150 μ^ηύ, G418.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène PGK1 et référencées EQSC-008 (CEN.PK 1605, Apgkl::kan).
c) Construction d'une souche inactivée pour IDH1, ZWF1 et PGK1 par croisement Les souches haploïdes de signes sexuels opposés EQSC-003 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Aidhl::nat) et EQSC-008 (CEN.PK1606 Apgkl::kan) sont mises à pousser une nuit sur un milieu gélosé : YPD (yeast extract peptone dextrose) pour la souche EQSC-008 et YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) pour la souche EQSC003, à 30°C. Puis les 2 souches sont croisées par mise en contact direct sur un milieu gélosé YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) + G418 150 μg/mL + hygromycine B 200μg/mL. La doubles sélection G418 et hygromycine B permet d'éliminer les deux souches parentales, seules les souches diploïdes MAT a/MAT alpha, ZWFl/Azwfl::hph, JDHl/Aidhl::nat, VG \IApgkl::kan poussent sur ce milieu. Un clone isolé diploïde issu de ce croisement est prélevé. La présence des 3 cassettes Azwfl::hph, Aidhl::nat, Apgklr. kan est validé par des tests de croissance sur milieu gélosé YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) supplémenté en G418 150 μg/mL ou Hygromycine B 200μg/mL ou nourséothricine 50 μg/mL. La souche obtenue est référencée EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT a/MAT alpha, ZWF1/Azwfl::hph, ΙΌΗΙ/ Aidhl::nat, PGKl/ Apgkl::kan). La souche précédemment décrite EQSC-009 (CEN.PK 1607, MAT a/MAT alpha, ZWF1/Azwfl::hph, JDïïl/Aidhl::nat, PGK1/ 'Apgkl : :kan) est mise à pousser sur un milieu gélosé YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) une nuit à 30°C. Les cellules sont ensuite mises en culture liquide dans un milieu carencé (Sporulation Médium, 1% potassium acétate + leucine + uracile + tryptophane) permettant d'induire la méiose des cellules diploïdes et conduisant ainsi à la formation de tétrades contenant quatre spores haploïdes. Les tétrades sont étalées sur le milieu YNB.GE (yeast nitrogen base, glycerol, ethanol) + leucine + uracile + tryptophane + acide glutamique lg/L + méthionine 20mg/L + cystéine 40mg/L et immédiatement disséquées (à l'aide d'un micro-dissecteur) pour isoler les spores sur le même milieu. Les spores sont mises à germer plusieurs jours à 30°C. Le contenu génétique des cellules haploïdes ainsi obtenues est testé par croissance sur milieux sélectifs : YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) supplémenté en G418 150 μg/mL ou Hygromycine B 200 μg/mL ou nourséothricine 50 μg/mL et leur signe sexuel est testé par croisement avec deux souche tectrices de signe sexuel MAT a ou MAT alpha. Les colonies obtenues sont génotypées pour la validation de la délétion des gènes PGK1, IDH1, ZWF1 et l'absence de transcrits correspondants à ces gènes est validée par PCR en temps réel après rétro-transcription des acides ribonucléiques. L'une des souche obtenue est référencée EQSC-004 (CEN.PK 1606 MAT alpha Δ zwfl::hph, Aidhl::nat, Apgklr. kan)
d) Introduction des enzymes PRK-RuBisCO Les six gènes nécessaires à l'ingénierie PRK-RuBisCO (tableau 15 ci-dessous) sont clonés sur trois vecteurs plasmidiques capables de se répliquer de manière autonome, avec des origines de réplication compatibles et portant chacun un gène de complémentation d'auxotrophies différent, permettant de sélectionner les souches contenant les trois constructions plasmidiques (voir WO 2015107496). Deux de ces plasmides sont monocopie avec une origine de réplication de type ARS/CEN et le troisième est multicopie avec une origine 2μ.
Tableau 15 : Description des cassettes d'expression et de la composition des plasmides
Selon le protocole de transformation précédemment décrit la souche EQSC-004 (CEN.PK 1606 Azwfl::hph, Aidhl::nat, Apgkl::kan) a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C jusqu'à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM. Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 μΐ^ de 50% de PEG, 10 μΐ. d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 μΐ. d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ. ^g) d'une combinaison pFPP45+pFPP56+pFPP20 et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) + Doxycycline à 2 mg/L, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30°C à 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalées sur YNB.GE (yeast nitrogen base, glycérol, éthanol) + acide glutamique 1 g/L + méthionine 20 mg/L + cystéine 40 mg/L + doxycycline à 2 mg/L. La souche obtenue est référencée : EQSC-006 (CEN.PK 1606 Azwfl::hph, tddhlr.nat, Apgkl::kan) (pFPP45+pFPP56+pFPP20).
Selon le protocole de transformation précédemment décrit la souche EQSC-005 (CEN.PK 1605 Aidhl::nat) a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C jusqu'à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 μΐ^ de 50% de PEG, 10 μΐ, d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 μΐ, d'acétate de lithium 1 M, 10 μΐ, ^g) d'une combinaison pV51TEF+pFL36+pCM185 et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPD (yeast extract peptone dextrose), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C à 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5 000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalées sur YNBD (yeast nitrogen base dextrose) + doxycycline à 2 mg/L. La souche obtenue est référencée : EQSC-007 (CEN.PK 1605 Mdhl::nat) (pV51TEF+pFL36+pCM185). d) Phase d'adaptation et d'évolution des souches EQSC-006 et EQSC-007
Adaptation des souches EQSC-006 et EQSC-007 à la croissance sur milieu liquide YNB (yeast nitrogen base) avec glucose et C02.
Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées avec le milieu de culture approprié et un apport de CO2 exogène de 10%, en incubateur agité (120 RPM, 30°C), avec une inoculation à 0,05 D.O. 600 nm mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre EON (BioTek Instruments). La souche d'intérêt est cultivée sur milieu YNB+CSM-LUW avec 10 g/L de glycérol et 7,5 g/L d'éthanol, + glutamate à 50 mg/L dans des conditions où l'expression de la PRK n'est pas induite.
Après obtention d'une quantité de biomasse suffisante, des cultures d'un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250 ml minimum sont ensemencées afin d'effectuer l'adaptation de la souche à l'utilisation de l'ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture YNB+CSM-LUW avec 20 g/L de glucose, glutamate à 50 mg/L et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus.
Après observation d'un démarrage de croissance significatif, les souches sont adaptées à un milieu minéral minimum exempt de tous les acides aminés sauf ceux indiqués ci-après, et bases azotées inclus dans le CSM-LUW, soit uniquement du YNB avec en concentrations finales, 20 g/L de glucose, glutamate à 1 g/L, L-cystéine à 40 mg/L et L-méthionine à 20 mg/L et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus. e) Production de citrate en fioles d' Erlenmeyer
La souche EQSC-006 de Saccharomyces cerevisiae, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène PGK1, dans la partie oxydative des pentoses phosphate et dans le cycle de Krebs est cultivée afin de produire du citrate sans perte de CO2, en utilisant une PRK et une RuBisCO. Cette souche d'intérêt est comparée à une souche de référence EQSC-007 produisant du citrate suite à l'inactivation du gène IDH1, sans délétion de PGK1 ou ZWF1 ni ajout de PRK et RuBisCO.
Les souches EQSC-006 (CEN.PK 1605 Azwfl:: p , Aidhl::nat, Apgkl::k , pFPP45+pFPP56+pFPP20) et EQSC-007 (CEN.PK 1605 Aidhl::nat, pV51TEF+pFL36+pCM185) ont été mises en culture dans le milieu Yeast Nitrogen Base (YNB) supplémenté avec 20 g/L de D-glucose (YNB D20).
Afin d'établir les rendements massiques citrate sur glucose, une pré-culture contenant 20 ml de milieu de culture a été inoculée à D06oonm 0,05 dans une fiole d'Erlenmeyer bafflée de 250 ml, mise en agitation à 120 rpm à 30°C. A partir de la première pré-culture, 50 ml de milieu ont été inoculés à DOôoonm 0,05 dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml et mis en agitation à 120 rpm, à 30°C. La culture a été faite en fioles d'Erlenmeyer (500 ml, bafflés) à partir de la deuxième pré-culture, inoculée à DOôoonm 0,05 dans 100 ml du même milieu, à 30°C, 120 rpm. Les suivis de croissance ont été effectués par mesure de la turbidité à 600 nm. Pour la quantification du citrate, 500 μΐ^ du milieu de culture ont été prélevés, centrifugés à 5 000 g, 5 min, 4°C. Le surnageant a été filtré (Minicart RC4, sartorius 0,45μιη) et conservé dans un vial à -20°C avant analyse en HPLC (Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC) couplée à un spectromètre de masse simple quadripôle. 20 μΐ^ de chaque échantillon ont été injectés sur une colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad, 125-0140). Une élution isocratique à un débit de 0,5 ml/min a été réalisée avec une solution aqueuse d'acide formique 0,037% (v/v) dont le pH a été ajusté à 4,5 avec de l'hydroxyde d'ammonium. La température du four de la colonne était de 65 °C. Les conditions d'analyse en spectrométrie de masse étaient : mode électrospray négatif, température de la source 450°C, tension de l'aiguille 3 kV, tension du cône 50 V. Une calibration externe comprenant sept points a été réalisée à partir d'une solution commerciale de citrate de sodium.
Pour quantifier le glucose consommé par les souches, 500 μΐ du milieu de culture ont été prélevés, à la même DOÔOO nm de culture que pour la quantification du citrate, centrifugés à 5 000 g, 5 min à 4°C. Le surnageant a été filtré (Minicart RC4, sartorius 0.45μιη) et conservé dans un vial à -20°C. Le glucose contenu dans cet échantillon a été quantifié par HPLC-RI Ultimate 3000 (Thermo Scientific) équipée d'une pompe, d'un autosampler réfrigérant à 8°C et d'un détecteur à indice de réfraction (RI, précision instruments IOTA 2). Une colonne Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) 150 x 7,8 mm, de granulométrie 8 μιη (Phenomenex, 00H-0138- KO) a été utilisée avec une pré-colonne Carbo-H 4 x 3.0 mm. La température du four pour la colonne était de 35°C et le débit a été fixé à 0,5 mL/min. Une élution isocratique de 30 min a été réalisée avec une phase mobile aqueuse à 5 mM H2SO4. Un volume de 20 μΐ a été injecté pour chaque échantillon. L'identification des composés a été basée sur la comparaison des temps de rétention avec les standards. La calibration externe comprenait 10 points de concentration variable en glucose (0 à 20 g/L). Le rendement massique Ydtrate/Gic a été calculé en gramme de citrate produit par gramme glucose consommé pour les deux souches EQSC-006 et EQSC-007, Ydtrate /GIC citrate (mg/Laqueux)
glucose (mg/Laqueux)
Tableau 16 : Rendement massique, citrate sur D-glucose
Une augmentation du rendement massique, citrate sur D-glucose, de 19,5% a été observée pour la souche EQSC-006 par rapport à la souche de contrôle EQSC-007.
Exemple 4 : Amélioration de la production de glutamate chez E. coli La délétion du gène de l'alpha-cétoglutarate déshydrogénase augmente la production de glutamate (Usuda et al. J Biotechnol. 2010 May 3;147(1): 17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018).
Dans ces exemples, une souche d'Escherichia coli K12 MG1655 dont le gène sucA a été délété a donc été utilisée. Cette souche est issue d'une banque de délétion de gènes (Baba et al. Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0008) chez Escherichia coli et fournie par le Coli Genetic Stock Center sous le nom JW0715-2 et avec la référence 8786. (JW0715-2 : MG1655 AsucA ::Kan)
4 A] Amélioration de la production de glutamate par inactivation de la glvcolvse a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par la recombinase Flp Afin de pouvoir réutiliser la même stratégie de délétion que celle utilisée pour construire la souche JW0715-2 ci-dessus (Rodriguez et al, 2016), la cassette de sélection a été supprimée à l'aide d'une recombinase. Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline
0.0003. et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre- sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC002 : MG1655 AsucA b) Délétion de Vopéron edd-eda codant la voie métabolique d'Entner-Doudoroff
La délétion de l'opéron edd-eda est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion, c'est-à-dire aux positions 1932065- 1932115 et 1934604-1934654 sur le chromosome générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien de part et d'autre de la totalité de l'opéron.
2. La souche d'Escherichia coli K-12, EQ.EC002 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003%.
3. La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant 1 h. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0.3% L-arabinose et kanamycine à 0,0015%.
4. Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre- sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%.
5. La souche obtenue se nomme EQ.EC003 : MG1655 AsucA Aedd-eda c) Délétion du gène gapA La délétion du gène gapA est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion c'est à dire la phase codante du gène (gapA) (GenBank: X02662.1) générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien.
2. La souche d' Escherichia coli K-12, EQ.EC003 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnés sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003%.
3. La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET qui sera induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant 1 h. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glycérol et pyruvate 0,3%, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose et kanamycine 0,0015%.
Les délétions sont vérifiées par génotypage et séquençage et le nom des souches obtenues est
• EQ.EC002 : MG1655 _AsucA
• EQ.EC003 : MG\655 AsucA Aedd-eda
• EQ.EC004 : MG1655 AsucA Aedd-eda AgapA::kan
d) Insertion de l'ingénierie nécessaire à la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants d'une RuBisCO de type I chez E. coli les gènes décrits dans le tableau 17 ci-dessous sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique contenant les gènes décrits dans le tableau 18 ci-dessous. Tableau 17 : gènes codant pour un système PRK et RuBisCO de type I
Tableau 18 : Composition des cassettes d'expression
Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le tableau 19 ci-dessous, ayant des efficacités de traduction variables (Levin-Karp et al, ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ; Zelcbuch et ah, Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAl l (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à l'ampicilline.
Tableau 19 : Séquences intercistroniques RBS
Nom Séquences RBS
A (SEQ ID N°9) AGGAGGTTTGGA
B (SEQ ID N°10) AACAAAATGAGGAGGTACTGAG
C (SEQ ID N011) AAGTTAAGAGGCAAGA
D (SEQ ID N°12) TTCGCAGGGGGAAG
E (SEQ ID N°13) TAAGCAGGACCGGCGGCG
F (SEQ ID N°14) CACCATACACTG Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessus
EQ.EC 005-»(EQ.EC 003+ pZAl l) : MG1655 AsucA Aedd-eda
EQ.EC 006 ·* (EQ.EC 004+ pEQEC005) : MG1655 AsucA Aedd-eda A gapA ::kan (RuBisCO) EQ.EC 007 (EQ.EC 004+ pEQECOOô) : MG1655 AsucA Aedd-eda A gapA ::kan (RuBisCO+PRK)
EQ.EC 009 ·* (EQ.EC 004+ pEQEC008) : MG1655 AsucA Aedd-eda AgapA ::kan (PRK)
Les clones sont sélectionnés sur milieu LB supplémenté glycérol 2 g/L et pyruvate 5 g/L et par 100 mg/L d'ampicilline. Après obtention d'une quantité de biomasse suffisante, des cultures d'un volume supérieur ou égal à 50 mL en fiole d'Erlenmeyer de 250 ml minimum sont ensemencées afin d'effectuer l'adaptation de la souche à l'utilisation de l'ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture LB avec 2 g/L de glucose, et un apport en C02 exogène à 37 °C comme décrit ci-dessus. e) Production de glutamate Pour la production de glutamate, les cellules issues de 500 ml de culture en LB sont inoculées dans 20 ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04.7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaC03, 100 mg/L d'ampicilline à une pression 0,1 atmosphère C02.
Le glutamate et le glucose résiduels sont mesurés avec un bio analyseur (Sakura seiki). Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de glutamate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 10% pour les souches EQ.EC 007 (RuBisCO+PRK) par comparaison avec les souches contrôles EQ.EC 005 (vide), EQ.EC 006 (RuBisCO seule). La souche contrôle EQ.EC 009 (PRK seule) n'est pas viable. 4B] Amélioration de la production par inactivation de la glvcolvse et de la voie oxydative des pentoses phosphates a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par la recombinase Flp Cette étape est réalisée de manière identique à l'exemple 4A] ci-dessus. La souche obtenue se nomme EQ.EC002 : MG1655 AsucA b) Délétion du gène zwf
La délétion du gène zwf (GenelD : 946370) est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red® /ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges, comme détaillé à l'exemple 4A].
La souche obtenue se nomme EQ.ECOlO : MG1655 AsucA Azwf c) Délétion du gène gapA
La délétion du gène gapA dans la souche de Escherichia coli K-12, EQ.ECOlO est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges, comme détaillé à l'exemple 4A].
Les délétions sont vérifiées par génotypage et séquençage et le nom des souches obtenues est :
• EQ.EC002 : MG1655 AsucA
· EQ.ECOlO : MG1655 AsucA Azwf
• EQ.EC011 : MG1655 AsucA Azwf AgapA
d) Insertion de l'ingénierie nécessaire à la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants du système PRK/RuBisCO fonctionnel chez E. coli les gènes décrits dans le Tableau 20 et codant pour une RuBisCO de type I, une phosphoribulokinase, une chaperonne et une anhydrase carbonique sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique contenant les gènes décrits ci-avant (Tableau 21). Tableau 20 : gènes codant pour une RuBisCO de type I, une phosphoribulokinase et une anhydrase carbonique
Tableau 21 : Nom de plasmides et composition des cassettes d'expression
Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le tableau 17 (voir l'exemple 4A]), ayant des efficacités de traduction variables (Levin-Karp et al, ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ; Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAl 1 (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à l'ampicilline. L'ajout d'une anhydrase carbonique (icfA) permet en outre une interconversion d'ions bicarbonate en molécules de C02 disponibles et améliore l'efficacité de la RuBisCO.
Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessous
EQ.EC 012-»(EQ.EC 002+ pZAl l) : MG1655 AsucA
EQ.EC 014 (EQ.EC 011+ pEQECOOô) : MG1655 AsucA AzwfAgapA (RuBisCO+PRK) EQ.EC 015 -»(EQ.EC 011+ pEQEC007) : MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO+PRK+ Anhydrase carbonique)
Après transformation, les clones sont sélectionnés sur milieu LB glycérol, pyruvate, supplémenté par 100 mg/L d'ampicilline. Une phase d'adaptation et évolution des souches ayant l'ingénierie PRK et RuBiSCO est réalisée tel que décrit dans l'exemple 4A]. e) Production de glutamate
Pour la production de glutamate, les cellules issues de 500 ml de culture en LB sont inoculées dans 20 ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04.7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaC03, 100 mg/L d'ampicilline à une pression 0,1 atmosphère C02.
Le glutamate et le glucose résiduels sont mesurés avec un bio-analyseur (YSI Inc.). Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de glutamate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 15% pour les souches EQ.EC 014 (RubisCO+PRK) et EQ.EC 015 (RubisCO+PRK+ Anhydrase carbonique) par comparaison avec les souches contrôles EQ.EC 012 (vide).
4C] Amélioration de la production par inactivation de la glvcolvse et de la voie oxydative des pentoses phosphates, et surexpression d'une pyruvate decarboxylase et d'une glutamate déshydrogénase. a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par la recombinase Flp
Cette étape est réalisée de manière identique à l'exemple 4A] ci-dessus. La souche obtenue se nomme EQ.EC002 : MG1655 AsucA b) Délétion du gène zwf La délétion du gène zwf (GenelD : 946370) est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges, comme détaillé à l'exemple 4A]. La souche obtenue se nomme EQ.EC010 : MG1655 AsucA Azwf c) Délétion du gène gapA
La délétion du gène gapA dans la souche de Escherichia coli K-12, EQ.ECOlO est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges, comme détaillé à l'exemple 4A]. Les délétions sont vérifiées par génotypage et séquençage et le nom des souches obtenues est :
• EQ.EC002 : MG1655 AsucA
• EQ.ECOlO : MG1655 AsucA Azwf
• EQ.EC011 : MG1655 AsucA Azwf AgapA d) Insertion de l'ingénierie notamment nécessaire à la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants du système PRK/RuBisCO fonctionnel chez E. coli les gènes décrits dans le Tableau 22 et codant pour une RuBisCO de type II, une phosphoribulokinase et une anhydrase carbonique sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique contenant les gènes décrits ci-avant (Tableau 23).
Tableau 22 : gènes codant pour une RuBisCO de type II, une phosphoribulokinase, une anhydrase carbonique, une glutamate déshydrogénase et une pyruvate carboxylase.
Gènes GenBank Organism
cbbM YP_427487.1 Rhodospirillum rubrum
Prk BAD78757.1 Synechococcus elongatus
CA YP_427143.1 Rhodospirillum rubrum
gdhA NP_416275.1 Escherichia coli K-12
pycA NP_389369.1 Bacillus subtilis
Tableau 23 : Nom de plasmides et composition des cassettes d'expression
Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le tableau 17 (voir l'exemple 4A]), ayant des efficacités de traduction variables sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAl l (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à l'ampicilline. L'ajout d'une glutamate déshydrogénase (gdhA) et d'une pyruvate carboxylase (pycA) permettent une meilleure production d'acide glutamique. L'ajout d'une anhydrase carbonique (CA) permet en outre une inter-conversion d'ions bicarbonate en molécules de C02 disponibles et améliore l'efficacité de la RuBisCO.
Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessous : EQ.EC 016 -»(EQ.EC 002+ pEQECOl l) : MG1655 AsucA (glutamate déshydrogénase+pyruvate carboxylase )
EQ.EC 017 (EQ.EC 011+ pEQEC009) : MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO +PRK+ glutamate déshydrogénase+pyruvate carboxylase)
EQ.EC 018 (EQ.EC 011+ pEQECOlO) : MG1655 AsucA Azwf AgapA (RuBisCO+PRK+ Anhydrase carbonique + glutamate déshydrogénase+pyruvate carboxylase+ anhydrase carbonique)
Après transformation, les clones sont sélectionnés sur milieu LB glycérol, pyruvate, supplémenté par 100 mg/L d'ampicilline. Une phase d'adaptation et évolution des souches ayant l'ingénierie PRK et RuBiSCO est réalisée tel que décrit dans l'exemple 4A]. e) Production de glutamate
Pour la production de glutamate, les cellules issues de 500 ml de culture en LB sont inoculées dans 20 ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04.7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaC03, 100 mg/L d'ampicilline à une pression 0,1 atmosphère C02.
Le glutamate et le glucose résiduels sont mesurés avec un bio-analyseur (YSI Inc.). Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de glutamate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 15% pour les souches EQ.EC 017 et EQ.EC 018 par comparaison avec la souche contrôle EQ.EC 016.
Exemple 5 : Amélioration de la production de polyhvdroxybutyrate chez C. necator
L'augmentation du pouvoir réducteur obtenu grâce aux modifications génétiques proposées selon l'invention peut aussi avoir un gain considérable sur des voies métaboliques déjà existantes.
C'est le cas pour la souche bactérienne Cupriadus necator ATCC 17699 qui produit naturellement du polyhydroxybutyrate (PHB). Cette bactérie est capable de se développer aussi bien en conditions d'autotrophie qu'en conditions d'hétérotrophie. La délétion du gène gapA (glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogenase NC_008313.1) permet de dévier le flux métabolique sur la voie des pentoses phosphates et d'augmenter le pool de nucléotides réduits NADPH permettant d'augmenter le rendement de production de PHB.
Cette souche C. necator H16 possède un méga plasmide pHGl et deux chromosomes. La délétion du gène gapA est réalisée en générant un vecteur contenant le gène suicide sacB de Bacillus substilis pour les bactéries gram négatives (Quandt et ah, Gene. 1993 May 15;127(1): 15-21 ; Lindenkamp et al, Appl Environ Microbiol. 2010 Aug;76(16):5373-82 et Appl Environ Microbiol. 2012 Aug;78(15):5375-83). a) Inactivation de la voie métabolique d'Entner-Doudorojf
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes des gènes edd et eda (en amont de edd et en aval de eda) sont clonées par restriction selon la procédure décrite dans Srinivasan et al. (Appl Environ Microbiol. 2002 Dec;68(12):5925-32), dans le plasmide pJQ200mpl8Cm. Le plasmide modifié pJQ200mpl 8Cm::Aedd-eda est alors transformé dans une souche d'E.coli S 17-1 par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Le transfert du matériel génétique dans C. necator est fait par conjugaison en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de C. necator sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S 17- 1. La sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30°C en présence de 10% saccharose à titre de sélection (Hogrefe et ah, J Bacteriol. 1984 Apr;158(l):43-8) et validé sur un milieu minéral contenant 50 μg/ml chloramphénicol.
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_002 obtenue est donc délétée pour les gènes de la voie métabolique d'Entner-Doudoroff edd-eda. EQCN_002 : H16 Aedd-eda. b) Inactivation de la voie de la glycolyse
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes du gène gapA sont clonés par restriction selon la procédure décrite dans Lindenkamp et al. 2012, dans le plasmide pjQ200mpl8Tc. Le plasmide modifié pjQ200mpl8Tc::Aga/?A est alors transformé dans une souche d'E.coli S 17-1 par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Le transfert du matériel génétique est fait par conjugaison en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de C. necator sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S 17-1. La sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30° en présence de 10% sucrose à titre de sélection (Hogrefe et al, J Bacteriol. 1984 Apr;158(l):43-8.) et validé sur un milieu minéral contenant 25 μg/ml tétracycline.
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_003 obtenue est donc délétée pour le gène gapA. EQCN_003 : H16 Aedd-eda AgapA.
La souche EQCN_003, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène gapA et dans la voie d'Entner Doudoroff au niveau des gènes edd-eda est cultivée afin d' améliorer le rendement de production du PHB en fixant du C02 exogène via l'utilisation des enzymes PRK et RuBisCO. b) Production de PHB en bioréacteur
L'inoculum issu d'un stock congelé est étalé sur milieu solide à raison de 50 à 100 μΐ^ issus d'un cryotube mis en incubation à 30°C pendant 48 à 96 h, en présence de fructose. L'expression des gènes codant pour la RuBisCO et la PRK sont maintenus chez C. necator en conditions aérobies hétéro trophes (Rie Shimizu et al. , Sci Rep . 2015; 5: 11617. Published online 2015 Jul 1.).
Des cultures en mode batch effectuées en fiole d'Erlenmeyers (10 mL dans 50 mL, puis 50 mL dans 250 mL) sont réalisées avec le milieu de culture approprié, en fructose 20 g/L et un apport de C02 exogène de 10% en incubateur agité (100-200 RPM, 30°C), avec une inoculation minimale de 0.01.
La souche d'intérêt EQCN_003 améliorant le rendement de production de PHB est comparée à une souche H16 de référence accumulant naturellement du PHB en conditions hétérotrophes en présence d'une limitation nutritionnelle. La productivité des souches est comparée en bioréacteurs. Les cultures effectuées en bioréacteurs sont ensemencées à partir de chaînes d'amplifications solides et/ou liquides en fioles d'Erlenmeyers dans les conditions décrites précédemment. Les bioréacteurs, de type My- control (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) de 750 ml ou Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) de 2,5 L, sont ensemencés à densité équivalente à 0.01 DOô20nm. L'accumulation de PHB est découplée de la croissance. La culture est régulée à 30°C, l'aération est comprise entre 0,1 VVM (volume gaz/volume liquide/min) et 1 VVM afin de maintenir une concentration minimale en oxygène dissous supérieure à 20% (30°C, 1 bar), l'agitation est adaptée en fonction de l'échelle du bioréacteur utilisé. Le débit de gazage en entrée est constitué d'air éventuellement supplémenté en CO2. La supplémentation en CO2 est comprise entre 1 et 10%. Le pH est régulé à 7 par une solution d'ammoniaque à 14 ou 7 %. Le mode de culture en fed-batch permet un apport en substrat carboné non limitant associé à une limitation en phosphore ou en azote, en conservant un ratio carbone/phosphore ou carbone/azote constant. L'extraction et la quantification de PHB sont réalisées selon la méthode de Brandi et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9). Le protocole consiste à rajouter 1ml de chloroforme à 10 mg de cellules lyophilisées, suivi d'un ajout de 850 μΐ de méthanol et de 150 μΐ d'acide sulfurique. Le mélange est chauffé 2.5 h à 100°C, refroidi et 500 μΐ d'eau sont rajoutés. Les deux phases sont séparées par centrifugation et la phase organique est séchée par l'ajout de de sulfate de sodium Les échantillons sont filtrés et analysés comme décrit par Millier et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9). En comparant les cultures C. necator sauvage H16 et la souche EQCN_003 : H16 Aedd-eda AgapA, on constate une augmentation de 5% du rendement carbone, correspondant ici au ratio gramme de PHB par gramme de fructose consommé. Exemple 6 : Amélioration de la production de GABA chez E. coli
Une souche Escherichia coli K-12, génétiquement modifiée pour accroître le rendement de sa production en glutamate selon l'exemple 4B], peut encore être modifiée pour permettre l'expression constitutive d'une glutamate décarboxylase gadB (Gene ID : 946058) et ainsi augmenter le rendement de production de l'acide γ-aminobutyrique.
La délétion du gène de l'alpha-cétoglutarate déshydrogenase permet en outre d'augmenter la production de glutamate (Usuda et al. J Biotechnol. 2010 May 3;147(1): 17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018).
Dans cet exemple, on utilise les souches ci-dessous, obtenues selon l'exemple 4B] : · EQ.EC002 : MG1655_AsucA
• EQ.EC010 : MG1655_AsucA Azwf
• EQ.EC011 : MG1655 AsucA Azwf AgapA a) Surexpression constitutive du gène gadB La surexpression du gène gadB est sous cloné dans un vecteur d'expression bactérien pZE21MCS (EXPRESSYS). Ce vecteur possède une origine de réplication de type ColEl et un gène de résistance à l'antibiotique kanamycine.
Rapidement, la phase codante gène gadB (Gene ID : 946058) est amplifiée à partir du génome de la souche MG1655 AsucA avec des amorces homologues au génome d' Escherichia coli K- 12 couvrant des positions 1570595 à 1570645 et 1572095 à 1572045. Chacune de ces amorces est couplée à des séquences flottantes homologues sur 18 nucléotides aux extrémités du fragment obtenu par l'amplification du vecteur pZE21MCS excluant le site multiple de clonage. Les deux amplicons sont associés selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech pour former le plasmide pEQEC030 permettant la surexpression constitutive du gène gadB. b) Insertion de l'ingénierie nécessaire à la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants d'une RuBisCO de type I fonctionnelle chez E. coli, les gènes décrits dans le tableau 17 (exemple 4A]), sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique en suivant la structure de construction décrite dans le Tableau 22.
L'assemblage des différents vecteurs
Les séquences codantes (CDS) des gènes décrits dans le
Tableau 24 sont amplifiées et assemblées en blocs selon le protocole fourni avec le kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2321) de manière à obtenir 3 blocs d'intégration décrits dans le
Tableau 24. Chaque bloc est ensuite amplifié selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech pour former les plasmides décrits ci-dessous dans le
Tableau 24.
Tableau 24 : Composition des cassettes d'expression
Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le tableau 19 (exemple 4B]), ayant des efficacités de traduction variables (Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ; Zelcbuch et al, Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAl l (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à l'ampicilline. L'ajout d'une glutamate décarboxylase (gadB) permet en outre une conversion de glutamate en gamma-aminobutyrate (GABA). Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessous
EQ.EC 013 (EQ.EC 002+ pZAll+pEQ030) : MG1655 AsucA + (gadB)
EQ.EC 020 (EQ.EC 011+pEQ030+pEQEC006) : MG1655 AsucA Azwf AgapA +
(gadB) + (RuBisCO+PRK)
Après transformation, les clones sont sélectionnés sur milieu LB glycérol, pyruvate, supplémenté par 100 mg/L d'ampicilline et 30 mg/L kanamycine. Une phase d'adaptation et évolution des souches ayant l'ingénierie PRK et RuBiSCO est réalisée tel que décrit dans l'exemple 4A] . c) Production de GABA
Pour la production de GABA, les cellules issues de 500ml de culture en LB sont inoculées dans 20ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04.7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaC03, 100 mg/L d'ampicilline et 30mg/L de kanamycine à une pression 0,1 atmosphère C02, à 30 ° C à un pH de 3,5.
La concentration de GABA est mesurée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), à l'aide d'une colonne OptimaPak C18 (4,6 x 150 mm, RS tech Corporation, Daejeon, Corée). Les échantillons sont centrifugés à 12 000 tr / min pendant 5 minutes, 100 μΐ du surnageant transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Dans ces tubes sont rajoutés les réactifs suivants : 200 μΐ^ de tampon bicarbonate de sodium 1 M de pH 9,8, 100 μΐ^ de chlorure de dansyle 80 g / L dans l'acétonitrile et 600 μΐ^ d'eau bidistillée. Le mélange est incubé à 80 0 C pendant 40 minutes. On arrête la réaction par l'ajout de 100 μΐ^ d'acide acétique 2%. Le mélange est centrifugé à 12 000 tr / min pendant 5 minutes. Le surnageant est ensuite filtré à travers un filtre Millipore de 0,2 μιη et analysé par HPLC sur un système Agilent en utilisant un détecteur UV. Les échantillons dérivatisés sont séparés en utilisant un gradient non linéaire binaire en utilisant l'éluant A [tétrahydrofurane / méthanol / acétate de sodium 50 mM à pH 6,2 (5: 75: 420, en volume)] et l'éluant B (méthanol). Le glucose résiduel est mesuré avec un bio-analyseur (YSI Inc.).
Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de GABA produit par gramme de glucose consommé. Ce rendement augmente significativement de 15% pour la souche EQ.EC 020 AsucA Azwf AgapA (RubisCO+PRK)+(GadB) par comparaison avec les souches contrôles EQ.EC 013 AsucA (GadB).
Exemple 7 : Amélioration de la production de succinate et oxalate chez E. coli
Une souche Escherichia coli K-12, génétiquement modifiée pour permettre l'expression constitutive d'une glyoxylate déshydrogénase FPGLOXDH1 (Gene ID : 946058) de Fomitopsis palustris, pour réduire l'expression du gène icd (Gene ID : 945702), et pour inactiver les gènes aceB (GenelD 948512) et sdhA (Gene ID : 945402), permettrait d'augmenter le rendement de production de succinate et d'acide oxalique.
La réduction d'expression de l'isocitrate déshydrogénase (icd) permet de rediriger le flux métabolique vers le shunt glyoxylique. L'inactivation de la malate synthase (aceB) et de la succinate déshydrogénase (sdhA) permettent de ne pas reconsommer respectivement le glyoxylate et le succinate produits. La délétion du gène de la succinate déshydrogénase augmente la production succinate en conditions aérobie (Yang et ah, Microbiol res. 2014 May- Jun ; 169(5-6) :432-40). La délétion du gène de la malate synthase permet l'accumulation de glyoxylate qui sera converti en oxalate par l'expression constitutive de la glyoxylate déshydrogénase.
Dans cet exemple, une souche d'Escherichia coli K-12 MG1655 dont le gène sdhA a été délété est utilisée. Cette souche est issue d'une banque de délétion de gènes (Baba et al. Mol Syst Biol. 2006 ;2 :2006.0008) chez Escherichia coli K-12 et fournie par le Coli Genetic Stock Center sous le nom JW0715-2 et avec la référence 8302. (JW0713-1 : MG1655 AsdhA ::Kan). a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par la recombinase Flp Afin de pouvoir réutiliser la même stratégie de délétion que celle utilisée pour construire la souche JW0715-2 ci-dessus (Rodriguez et al, 2016), la cassette de sélection est supprimée à l'aide d'une recombinase.
Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC040 : MG1655 AsdhA b) Délétion du gène aceB La délétion du gène aceB (GenelD 948512) est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion, c'est-à-dire aux positions de 4215428 à 4215478. et de 4217129. à 4217079 sur le chromosome générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien de part et d'autre de la séquence codante du gène aceB.
La souche d'Escherichia coli K-12, EQ.EC040 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tetracycline 0,0003%.
La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde transformation de la cassette de délétion est effectuée par électroporation dans des cellules exprimant RedET et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose et kanamycine 0,0015%.
Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombinaison par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'elles ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC041 : MG1655 AsdhA AaceB c) Changement du promoteur du gène icd . Stratégie
Le remplacement du promoteur natif du gène icd (Gene ID : 945702) par un promoteur plus faible est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges. . Introduction du promoteur faible P oxbl
Le promoteur du gène icd est remplacé par une cassette couplant le promoteur P0xbi , caractérisé comme faible, et une cassette d'un gène de résistance à un antibiotique pour permettre la sélection de l'insertion de la cassette Poxbi avec gène de résistance à un antibiotique.
Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologue sur 50 nucléotides à la région adjacente gauche du locus du promoteur Pied (Genomic target LA) pour l'oligo sens c'est-à-dire aux positions de 1194911 à 1194961 sur le génome, et la séquence Spacer R (Tableau 23) pour l'oligo reverse permettent l'amplification d'un fragment permettant l'assemblage avec le fragment P0xbi . Des oligonucléotides dessinés pour amplifier le promoteur Poxbi à partir du plasmide PSF- OXB1 (Sigma #OGS553) et possédant une séquence 5' homologue sur 50 nucléotides à la région adjacente droite du locus du promoteur Pied (Genomic target RA) pour l'oligo reverse c'est-à-dire aux positions de 1195173 à 1195123 sur le génome, et la séquence Spacer S (Tableau 25) pour l'oligo produisent l'amplification du fragment Poxbi . L'amplification d'un fragment de fusion à l'aide du kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2321) permet d'associer le promoteur de substitution à une cassette de sélection antibiotique.
Tableau 25: Séquences des amorces pour amplifier le promoteur du gène OXB1
Nom Séquences d'homologie avec le vecteur PSF-OXB1
POXB1-S (SEQ ID N°15) TCGTTGCGTTACACACAC
POXB1-R (SEQ ID N°16) TGTGTCGAGTGGATGGTAG
Spacer S (SEQ ID N°17) GCATGAATTCG
Spacer R (SEQ ID N° 18) CGAATTCATGC La souche à' Escherichia coli K-12, EQ.EC041 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003%.
La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant lh. Pour se faire, une seconde transformation de la cassette de délétion est effectuée par électroporation dans des cellules exprimant RedET et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose et kanamycine 0,0015%.
Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombinaison par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'elles ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%. La souche obtenue se nomme EQ.EC042 : MG1655 AsdhA AaceB Pied ::Poxbi d) Délétion du gène zwf
La délétion du gène zwf (GenelD : 946370) est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red® /ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion, c'est-à-dire aux positions 1934789 à 1934839 et 1936364 à 1936314 sur le chromosome générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien de part et d'autre de la totalité de l'opéron. La souche d'Escherichia coli K-12, EQ.EC042 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003%.
La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant 1 h. Pour se faire, une seconde transformation de la cassette de délétion est effectuée par électroporation dans des cellules exprimant RedET et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0.3% L-arabinose et kanamycine 0,0015%.
Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombinaison par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre- sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycine 0,0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC043 : MG1655 AsdhA AaceB Pied ::Poxbi Azwf e) Délétion du gène gapA
La délétion du gène gapA est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombinaison Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion c'est à dire la phase codante du gène (gapA) (GenBank: X02662.1) générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien.
La souche d'Escherichia coli K-12, EQ.EC043 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0.2% glucose, tétracycline 0.0003%.
La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET est induite par l'arabinose 0.3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glycérol et pyruvate 0.3%, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose et kanamycin 0.0015%.
Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombinaison par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'elles ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycin 0.0015%. La souche obtenue se nomme EQ.EC044 : MG1655 AsdhA AaceB Pied ::Poxbi àzwf AgapA f) Surexpression constitutive des gènes FPGLOXDH1 et aceA
Les séquences codantes (CDS) des gènes FPGLOXDH1 (Gene ID : 946058) et aceA (Gene ID: 948517) sous clonées dans un vecteur d'expression bactérien pZE21MCS (EXPRESSYS) sous forme d'operons synthétique selon la structure décrite dans le Tableau 24. Ce vecteur possède une origine de réplication de type ColEl et un gène de résistance à l'antibiotique kanamycine.
Chacune de ces amorces est couplée à des séquences flottantes homologues sur 18 nucléotides aux extrémités du fragment obtenu par l'amplification du vecteur pZE21MCS excluant le site multiple de clonage. Les deux amplicons sont associés selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech pour former le plasmide pEQEC035 permettant la surexpression constitutive des gènes FPGLOXDH1 et aceA. g) Insertion de l'ingénierie nécessaire à la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants d'une RuBisCO de type I fonctionnelle chez E. coli, les gènes décrits dans le Tableau 17 (exemple 4A]), sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique.
Les séquences codantes (CDS) des gènes décrits dans le Tableau 2sont amplifiées et assemblées en blocs selon le protocole fournis avec le kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2321) de manière à obtenir 3 blocs d'intégration décrits dans le Tableau 26. Chaque bloc est ensuite amplifié selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech pour former les plasmides décrits ci-dessous dans le Tableau 24.
Tableau 26 : Composition des cassettes d'expression
Structure de l'opéron synthétique
Type de Bloc 1 Bloc I I Bloc I I I
Plasmide
vecteu r CDS
CDS A RBS1 CDS B RBS2 RBS3 CDS D
C
pZAll pZAll
pEQEC006 pZAll rbcS D rbcL B rbcX F prk pZE21MCS pZE21MCS
pEQEC035 pZE21MCS FPG LOXDH 1 D aceA Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le Tableau 19 (exemple 4B]), ayant des efficacités de traduction variables (Levin-Karp et al, ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ; Zelcbuch et al, Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAl 1 (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à l'ampicilline.
Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessous
EQ.EC045 (EQ.EC042+ pZAll+ pZE21MCS) : MG1655 AsdhA AaceB Picd ::Poxbl
EQ.EC046 (EQ.EC045 + pEQEC006+ pEQEC035) : MG1655 AsdhA AaceB Picd ::Poxbl Azwf AgapA + ( FPGLOXDHl+aceA) + (RuBisCO+PRK)
Après transformation, les clones sont sélectionnés sur milieu LB glycérol, pyruvate, supplémenté par 100 mg/L d'ampicilline et 30 mg/L kanamycine. Une phase d'adaptation et évolution des souches ayant l'ingénierie PRK et RuBiSCO est réalisée tel que décrit dans l'exemple 4A]. h) Production de succinate et oxalate
Pour la production de succinate et d' oxalate, les cellules issues de 500 ml de culture en LB sont inoculées dans 20 ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04.7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaC03, 100 mg/L d'ampicilline et 30 mg/L de kanamycine à une pression 0,1 atmosphère C02, à 30 0 C à un pH de 3,5.
La concentration de succinate est mesurée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), les échantillons de culture sont centrifugés à 12 000 g pendant 5 min. . Dosage succinate
Le surnageant de culture est filtré à travers un filtre Millipore de 0,2 μιη et analysé sur un système HPLC Agilent (série 1100) équipé d'une colonne échangeuse de cations. (Aminex HPX87-H, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), un détecteur d'absorbance UV (Agilent Technologies, G1315D) et un détecteur d'indice de réfraction (RI) (Agilent Technologies, HP 1047 A). Les échantillons sont séparés sur une phase mobile de H2SO4 à 5 mM à un débit de 0,4 ml / min. La température du four de la colonne est 65 0 C.
Le glucose résiduel est mesuré avec un bio analyseur (Ysi Inc.) ou par HPLC-réfractométrie avec une colonne Aminex HPX87-H. Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de succinate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 6% pour la souche ingénierie EQ.EC046 par comparaison avec la souche contrôle EQ.EC045 (vide). ii) dosage de Voxalate
Les culots sont lavés deux fois avec du tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 7,5) contenant de l'EDTA 2 mM et conservés à -20 0 C. Des échantillons (1 ml) sont transférés dans un tube de pré-refroidi avec 0,75 g de billes de verre (425-600 μιη) et introduits dans une machine Fast Prep (Thermo Scientific, Erembodegem, Pays-Bas) et soumis à 4 des rafales de 20 s au réglage de la vitesse 6. Les lysats sont centrifugés pendant 20 min à 4 0 C et 36 000 g. Les dosages de protéines totales sont effectués selon la méthode de Lowry (Lowry et al. , 1951). L'activité oxaloacétate acétyl hydrolase (EC 3.7.1.1) est mesurée en utilisant une modification de la détermination optique directe de l'oxaloacétate (OAA) à 255 nm comme décrit dans (Lenz et ah, 1976). La disparition du tautomère énolique de ΓΟΑΑ est contrôlée à 255 nm à 25 0 C dans un spectrophotomètre Hitachi modèle 100-60 (Hitachi, Tokyo, Japon), en utilisant des cuvettes de quartz. Le mélange réactionnel de 1 ml contient 100 mM d'imidazole-HCl (pH 7,5), 0,9 mM de MnCl2.2H20, 1 mM d'OAA, 20 μΐ d'extrait cellulaire (témoins avec différents volumes d'extraits cellulaires confirment la linéarité entre l'activité enzymatique et la quantité d'extrait cellulaire). La réaction est démarrée par l'addition de l'extrait cellulaire.
Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de doxalate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 3% pour la souche ingénierie EQ.EC046 par comparaison avec la souche contrôle EQ.EC045 (vide). Exemple 8 : Amélioration de la production de citrate chez Aspergillus niger a) Stratégie
L' inactivation du gène pgkA (Locus tag An08g02260), conduisant à la non fonctionnalité de la voie de la glycolyse, et celle du gène gsdA (Locus tag An02gl2140), inhibant la partie oxydative de la voie des pentoses phosphates, sont mises à profit pour intégrer les 6 gènes permettant l'expression fonctionnelle des enzymes PRK et RuBisCO, à savoir RbcS, RbcL, RbcX, GroES, GroEL et PRK permettant la fixation du C02. b) Constructions ADN i) Séquences des ARN guides pour cibler le gène à inactiver Dans chacun de ces deux gènes une séquence de 20 nucléotides ponctuée par un motif NGG (séquence cible CRISPR soulignée) a été déterminée (Tableau 27). Dans chacun des deux cas, cette séquence est propre au gène ciblé mais aussi unique dans le génome d' Aspergillus niger. Ces séquences sont utilisées pour exprimer un ARNguide (ARNg) qui en formant un hétéro duplex avec la région homologue du génome d' Aspergillus niger dirige l'action de l'endonucléase CAS9 pour induire une cassure double brin spécifiquement sur le locus choisit.
Tableau 27: Séquence cible pour ARNg
Le plasmide pFC332 (Addgene #87845) décrit dans Sarkari et al. (Bioresour Technol. 2017 Dec;245(Pt B): 1327- 1333) contient une cassette d'expression d'un ARNg, une cassette permettant l'expression fonctionnelle de l'endonucléase Cas9 et une cassette Hph permettant la sélection de ce plasmide. Le plasmide contient en outre le fragment AMA1_2.8 qui permet une propagation transitoire du plasmide. Enfin, une origine de réplication pour E. coli est également présente. Afin de cibler un autre gène, la cassette d'ARNg entre FS A et FS B peut être facilement échangée. Ce plasmide est modifié en amplifiant les différentes parties de ce plasmide, afin d'éliminer la cassette de sélection antibiotique et de modifier les 20 nucléotides permettant la spécificité de l'ARNg au profit des séquences décrites dans le Tableau 27 pour former les plasmides pEQ0610 pour cibler pgkA et pEQOôl 1 pour cibler gsdA.
Plasmide donneur
Régions d'homologies avec le génome
Le plasmide donneur consiste en un assemblage de type In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech entre le plasmide pUC19 (GenBank: M77789.2) et les séquences de ciblage génomique (LA et RA) d'environ 1500 bp chacune, homologues au locus choisi pour l'intégration. Les séquences LA et RA sont adjacents en 5' et 3' respectivement de la séquence du locus ciblée par l'ARNguide. L'hétérodimère ADN génomique/ ARNguide est reconnu par l'endonucléase Cas9 pour clivage double brin (locus 1 : pgkA; locus2 : gsdA) (Tableau 28). Les fragments RA et LA sont amplifiés avec les amorces pour le gène pgkA et le gène gsdA (Tableau 29). Les séquences des amplicons sont données dans le séquence listing (SEQ ID N°55 à SEQ ID N°58). Une extension de 18 nucléotides sur toutes les amorces forward des trois fragments est rajoutée selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech, afin de permettre un assemblage fonctionnel des plasmides (pEQ0600 ou pEQ0601) et l'introduction de deux sites de restriction pour des endonucléases de restriction de type II (Les enzymes de restriction I-Ceul et I-Sce)I qui ont de grands sites de reconnaissance asymétriques (12 à 40 paires de bases). Ce sont des séquences de reconnaissance de 18 paires de bases, donc rares. Le fait que le clivage soit asymétrique au site de reconnaissance permet de libérer un fragment dépourvu de séquences issues du vecteur bactérien pUC19. Ces deux enzymes permettent d'extraire par restriction le bloc d'intégration après amplification par clonage chez E. coll. Tableau 28 : Amplification des régions d'homologies pour le gène
Tableau 29: Amplification des régions d'homologies pour le gène
Cassettes d'expression de l'ingénierie
Les promoteurs et les terminateurs sont identifiés sur la base des données GenBank. Les promoteurs choisis sont déterminés à partir du point +1 de transcription et remontent 1.4Kb en amont de manière à couvrir à la fois les séquences « core » (TATA box) et les séquences trans- activatrices permettant la fonctionnalité optimale du promoteur concerné.
Pour les terminateurs, la coupure est effectuée 500 bp après le codon stop du gène.
La structure de chaque bloc d'intégration de 4 cassettes d'expression est définie comme suit : le premier niveau comprend des éléments simples, à savoir des promoteurs, des séquences codantes (CDS) et des terminateurs. Les éléments promoteurs (
Tableau 30) et terminateurs ( Tableau 31), dont les séquences sont fournies dans le séquence listing (SEQ ID N°59 à 62), sont amplifiés et assemblés avec les CDS de l'ingénierie selon le Tableau 32. Les CDS, dont les séquences sont fournies dans le séquence listing (SEQ ID N°63 à 66), sont amplifiés selon le protocole fournis avec le kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2321) de manière à obtenir les cassettes d'expressions fonctionnelles compilées dans le tableau. Chaque bloc d'intégration de 4 gènes est organisé pour inclure 4 couples différents (promoteur/terminateur) de façon à limiter les interférences trans. Chaque bloc d'intégration de 6 gènes est organisé pour inclure 6 couples différents (promoteur/terminateur) de façon à limiter les interférences transcriptionnelles Fragment donneur pour insertion dans le locus cible du génome
Les différentes cassettes d'expression multiples (RbcS, RbcL et RbcX) ou (GroES, GroEL et PRK) sont amplifiées et assemblées autour d'une cassette de sélection antibiotiques (
Tableau ), selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech, pour former les plasmides donneurs (pEQ0602 ou pEQ0603).
Tableau 30 : Localisation native des promoteurs iïAspergillus niger utilisés dans la combinatoire génomique pour insérer les 6 gènes de l'ingénierie de fixation du C02 dans le génome d'Aspergillus niger.
Tableau 31 : Localisation native des terminateurs d'Aspergillus Niger utilisés dans la combinatoire génomique pour insérer les 6 gènes de l'ingénierie de fixation du C02 dans le génome d'Aspergillus niger.
Terminateurs Organism Gene I D Primer forward Primer reverse
TtrpC A. AN 0648 TGATTTAATAGCTCCATGTCAAC G G GTAAACG ACTCATAG G AG AGTTG nidulans AAG (SEQ I D N°37) (SEQ I D N °41)
FGSC A4
TniaD A. AN 1006 ACGGGTTCGCATAGGTTTGG G G G ATATTTG AC ACG ATTCTG AG G nidulans (SEQ I D N°38) (SEQ I D N °42)
FGSC A4
TglaA A. niger An03g06 CGACCGCGACGGTGACTGAC CCGGAGATCCTGATCATCCG (SEQ I D
CBS 513- 550 (SEQ I D N°39) N°43)
oo
TgpdA A. niger An l6g01 G AATC AG G ACG G CAAACTG AAT CGTG GTCTAG CTG CCCTCC (SEQ I D
CBS 513- 830 (SEQ I D N°40) N°44)
88 Tableau 32 : Assemblage des cassettes d'expression
Cassette Gene GenBank Optimisation Promoteur Terminateur d'expression de codons
CAS 1 RbcL BAD78320.1 Oui PmbfAp trpct
CAS 2 RbcS BAD78319.1 Oui PcoxAp TniaD
CAS 3 RbcX BAD80711.1 Oui PsrpBp glaAt
CAS 4 Hph pUG75(P30671) Non picdAp TgpdA
CAS 5 GroES U00096 Non PmbfAp trpct
CAS 6 GroEL AP009048 Non PcoxAp TniaD
CAS 7 PRK BAD78757.1 Oui PsrpBp glaAt
CAS 8 Ble pUG66(P30116) Non picdAp TgpdA
Tableau 33 : Assemblage des plasmides
Plasmide Séquence Promoteur Gene Terminateur Séquence ori Marqueur sélection génomique Génomique
pEQ0600 LAI RAI coli Ampiciline pEQ0601 LA2 RA2 coli Ampiciline
PmbfAp RbcL trpct coli Ampiciline et pEQ0602 PcoxAp RbcS TniaD coli Hydromycine
LA2 PsrpBp RbcX glaAt RA2 coli B
picdAp Hph TgpdA coli
PmbfAp GroES Trpct coli Ampiciline et pEQ0603
PcoxAp GroEL TniaD coli Bleomycine
LAI RAI
PsrpBp PRK glaAt coli
picdAp Ble TgpdA coli
c) Transformation d'Aspergillus niger
La transformation de l'ADN dans Aspergillus niger est contrainte par la présence de la paroi cellulaire fongique, et est extrêmement inefficace par rapport à la levure ou à Escherichia coli. Néanmoins, la transformation de protoplastes préparés à partir de hyphes fongiques ou conidiospores en germination par traitement avec des enzymes dégradant la paroi cellulaire telles que le cocktail « Lysing Enzyme® de Trichoderma harzianum, chitinase de Streptomyces griseus et β-glucuronidase » de Hélix pomatia (de Bekker et al., J Microbiol Methods. 2009 Mar ; 76(3) :305-6) permet de donner des transformants.
La souche A. niger CBS 513-88 est cultivée à 30 0 C dans un Erlenmeyer de IL avec 250 ml de milieu de transformation (Kusters-van Someren et al., Curr Genêt. 1991 Sep ;20(4) :293-9). Après une croissance de 16 h à 250 rpm, le mycélium est récolté par filtration sur Miracloth (Calbiochem) et lavé avec de l'eau désionisée. Les protoplastes sont réalisés en présence de 5 g.L"1 d'enzymes de lyse provenant de Trichoderma harzianum (Sigma Saint Louis, MO, USA), de 0,075 Uml-1 chitinase de Streptomyces griseus (Sigma) et de 460 Uml-1 glucuronidase de Hélix, pomatia (Sigma) dans KMC (KCl 0,7 M, CaC12 50 mM, 20 mM de Mes / NaOH, pH 5,8) pendant 2 heures à 37 0 C et 120 tr / min. La protoplastation est surveillée toutes les 30 minutes avec un microscope. Les protoplastes sont filtrés à travers un filtre Miracloth et recueillis par centrifugation à 2000 x g et 4 0 C pendant 10 minutes. Les protoplastes sont lavés avec du STC froid (sorbitol 1,2 M, Tris / HC1 10 mM, CaC12 50 mM, pH 7,5) et ensuite remis en suspension dans 100 pi de STC et directement utilisés pour la transformation.
Afin d'intégrer une voie métabolique dans le génome de A. niger, une co-transformation d'un plasmide et d'un fragment linéaire est nécessaire. Le plasmide pEQ0610 est co transformé avec un fragment donneur pour intégrer une partie de l'ingénierie dans le génome tout en inactivant le gène pgkA. De même, le plasmide pEQ0611 est co transformé avec un fragment donneur pour intégrer l'autre partie de l'ingénierie dans le génome tout en inactivant le gène gsdA. Ces séquences servent d'une part de matrices pour la recombinaison homologue et d'autre part de marqueur de sélection : lors de l'intégration avec l'expression fonctionnelle des gènes de résistance antibiotique Hph ou Ble. Les souches sont directement sélectionnées sur des plaques de milieu minimal avec un ajout d'Hygromycine B ou de Bleomycine permettant une sélection directe sur l'événement d'intégration. En raison de la présence de l'origine de réplication AMA1_2.8, le plasmide pCAS_pyrG2 est facilement perdu entraînant seulement une expression transitoire de la protéine Cas9, réduisant ainsi le risque d'effets indésirables non ciblés. lC^g de cassettes linéaires et 5μg de plasmide sont mélangés avec 100 μΐ^ de solution STC contenant au moins 107 protoplastes et 330 μΐ^ de solution de polyéthylène glycol (PEG) fraîchement préparée (PEG 6000 25%, CaCl2 50 mM, Tris / HCl 10 mM, pH 7,5) et gardée sur la glace pendant 20 min. Après mélange avec une solution de 2 ml de PEG supplémentaire et une incubation à température ambiante pendant 10 minutes, le mélange de protoplastes est dilué avec 4 ml de STC.
La sélection des transformants est réalisée sur des plaques MM additionnées de 150 μg / mL d'hygromycine B ou de plaques MM additionnées de Bleomycine 50 μg / mL. Tous les transformants sont purifiés par isolement de colonies uniques sur le milieu de sélection au moins deux fois. L'insertion des fragments est vérifiée en séquençant le locus cible avec les amorces de contrôle appropriées.
L'ADN génomique des cellules fongiques est isolé avec un protocole modifié, en utilisant le kit de purification d'ADN génomique Wizard® (Promega, Wisconsin, États-Unis). Le mycélium est cultivé pendant une nuit dans CM (30 0 C, 150 tr / min) dans 290 pi de solution d'EDTA 50 mM et 10 pi de lyticase (10 mg / ml) pour éliminer la paroi cellulaire. Après 90 min d'incubation à 37 0 C, la suspension est centrifugée et le surnageant est jeté. Le culot de mycélium est remis en suspension dans 300 μΐ de solution de lyse de noyaux et 100 μΐ de solution de précipitation de protéine. Les échantillons sont incubés sur de la glace pendant 5 minutes et centrifugés. L'ADN est précipité à l'isopropanol et lavé avec de l'éthanol à 70%. Le culot d'ADN est réhydraté avec une solution de réhydratation d'ADN contenant de la RNase (100 μg / ml). La transformation et l'intégration réussies des cassettes d'expression ont été vérifiées par PCR.
Tableau 34 : Souches utilisées pour l'étude de rendement
Souches Génome Modification génétique
A. niger
EQ1500
CBS 513-88
A. niger gsdA : : PmbfAp-RbcL-trpc ; PcoxAp_RbcS-Tnia D ; picdAp-H ph-TgpdA ;
EQ1501
CBS 513-88 PsrpBp-RbcX-glaAt
gsdA : : PmbfAp-RbcL-trpc ; PcoxAp_RbcS-Tnia D ; picdAp-H ph-TgpdA ;
A. niger PsrpBp-RbcX-glaAt
EQ1502
CBS 513-88 pgkA : : Pm bfAp-GrES-trpc ; PcoxAp-G roEL-Tnia D ; picdAp-Ble-TgpdA ;
PsrpBp-PRK-glaAt Des conidies (108.L_1) issues des souches EQ1500 et EQ1502 sont inoculées et cultivées à 30 0 C sur un agitateur rotatif (180 tr / min) dans des flacons à agitation contenant du milieu de Vogel sans MnS04 avec une teneur totale en glucose de 15% et une teneur totale en azote de 0,2% et 10% de C02. La détermination du glucose et des acides organiques a été réalisée comme décrit précédemment (Blumhoff et al, 2013; Steiger et al., 2016) sur une HPLC (Shimadzu, Kyoto; Japon) équipée d'une colonne Aminex HPX-87 H (300 x 7,8 mm, BioRad, Hercules, CA). Un détecteur d'indice de réfraction (RID-10 A, Shimadzu) est utilisé pour la détection du glucose et de l'acide citrique, tandis qu'un détecteur PDA (SPD-M20A, Shimadzu) à 300 nm est utilisé pour détecter l'acide cis-aconitique et trans-aconitique. La colonne est utilisée à 60 0 C à un débit de 0,6 ml / min et avec une solution aquuese d'H2S04 0,004 M en tant que phase mobile. La culture a été réalisée en trois réplicats biologiques. d) Méthode analytique
Pour la quantification des métabolites extracellulaires, un échantillon de culture est centrifugé à 14 000 xg pendant 5 min. Le surnageant est filtré à travers un filtre ayant une taille de pores de 0,45 pm. Le filtrat est maintenu à -20 0 C jusqu'à l'analyse. La concentration de citrate et d'oxalate est détectée et quantifiée avec de la lumière ultraviolette à 210 nm en utilisant une colonne Améthyste C18-H (250 x 4,6 mm, Sepax Technologies, Newark, DE, USA). L'élution est réalisée à 30°C avec 0,03% de H3P04 à un débit de 0,8 ml / min. Le sucre réducteur est détecté avec la méthode à l'acide 3,5-dinitrosalicylique. Détermination de la biomasse : 5 ml d'échantillon sont filtrés à travers Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA, USA) pour collecter les hyphes et lavés avec de l'eau distillée. Les hyphes sont chauffés à 105 °C dans un « Miracloth ». Pour le calcul du poids sec des cellules (DCW), le poids de Miracloth est mesuré précédemment et déduit du poids total pour générer le poids net, puis le poids net par unité de volume est calculé comme DCW. Après analyse complète, la comparaison du rendement de production d'acide citrique en fonction de la consommation de glucose est supérieure de 18% dans la souche ingénieriée EQ1502 en comparaison de la souche sauvage EQ1500.
Exemple 9 : Amélioration de la production d'itaconate chez Aspergillus terreus a) Stratégie
L'inactivation du gène pgkA (Locus tag (ATEG_00224), conduisant à la non fonctionnalité de la voie de la glycolyse, et celle du gène gsdA (Locus tag ATEG_01623), inhibant la partie oxydative de la voie des pentoses phosphates, sont mises à profit pour intégrer les 6 gènes permettant l'expression fonctionnelle des enzymes PRK et RuBisCO, à savoir rbcS, rbcL, rbcX, gwES, groEL et prk permettant la fixation du C02. b) Constructions ADN
i) Séquences des ARN guides pour cibler le gène à inactiver Dans chacun de ces deux gènes une séquence de 20 nucléotides ponctuée par un motif NGG (séquence cible CRISPR soulignée) a été déterminée (Tableau 35). Dans chacun des deux cas, cette séquence est propre au gène ciblé mais aussi unique dans le génome d'Aspergillus terreus. Ces séquences sont utilisées pour exprimer un ARNguide (ARNg) qui en formant un hétéro- duplex avec la région homologue du génome d'Aspergillus terreus dirige l'action de l'endonuclesae CAS9 pour induire une cassure double brin spécifiquement sur le locus choisit. Pour pgkA, la séquence identifiée dans le second intron, les 20 premiers nucléotides présentent un pattern unique dans le génome, même en autorisant 2 mismatchs. Pour gsdA la séquence identifiée dans quatrième intron, les 20 premiers nucléotides présentent un pattern unique dans le génome, même en autorisant 2 mismatchs. Tableau 35 : Séquence cible pour ARNguide
Le plasmide pFC332 (Addgene #87845) décrit dans Sakari et al. (Bioresour technol. 2017 ; 245(Pt B) : 1327- 1333) contient une cassette d'expression d'un ARNg, une cassette permettant l'expression fonctionnelle de l'endonucléase Cas9 et une cassette Hph permettant la sélection de ce plasmide. Le plasmide contient en outre le fragment AMA1_2.8 qui permet une propagation transitoire du plasmide. Enfin, une origine de réplication pour E. coli est également présente.
Afin de cibler un autre gène, la cassette d'ARNg entre FS A et FS B peut être facilement échangée. Ainsi ce plasmide est modifié en amplifiant les différentes parties de ce plasmide afin d'éliminer la cassette de sélection antibiotique et de modifier les 20 nucléotides permettant la spécificité de l'ARNg au profit des séquences décrites dans le Tableau 35 pour former les plasmides pEQ0615 pour cibler pgkA et pEQ0616 pour cibler gsdA dans le génome d'Aspergillus terreus. ii) Plasmide donneur
Régions d'homologie avec le génome Le plasmide donneur consiste en un assemblage de type In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech entre le plasmide pUC19 (GenBank: M77789.2) et séquences de ciblage génomique (LA et RA) d'environ 1500 bp chacune homologues au locus choisi pour l'intégration. Les séquences LA et RA sont adjacents en 5' et 3' respectivement de la séquence du locus ciblée par l'ARNguide. L'hétérodimère ADN génomique/ ARNguide est reconnu par l'endonucléase Cas9 pour clivage double brin (locus 1 : pgkA; locus2 : gsdA) (Tableau 35). Les fragments RA et LA sont amplifiés avec les amorces décrites Tableau 36, pour le gène pgkA, et Tableau 37, pour le gène gsdA. Les séquences des amplicons sont dans le séquence listing (SEQ ID N°67 à 70).
Une extension de 18 nucléotides sur toutes les amorces forward des trois fragments est rajoutée selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech afin de permettre un assemblage fonctionnel des plasmides (pEQ0604 ou pEQ0605) (33) et l'introduction de deux sites de restriction pour des endonucléases de restriction de type II (Les enzymes de restriction I-Ceul et I-Scel) qui ont de grands sites de reconnaissance asymétriques (12 à 40 paires de bases). Ce sont des séquences de reconnaissance de 18 paires de bases, donc rares et non présentes dans l'assemblage décrit. Le fait que le clivage soit asymétrique au site de reconnaissance permet de libérer un fragment dépourvu de séquences du vecteur bactérien pUC19. Ces deux enzymes permettent d'extraire par restriction le bloc d'intégration après amplification par clonage chez E. coll.
Tableau 36 : Amplification des régions d'homologies pour le gène pgkA
Amplicon Primer position Primer séquence
5' pgkA_Aterreus Forwa rd CTTG G G G AATTG G G ACACG (SEQ I D N°47)
Reverse TCTTG CCG ATG AG CTTCTCC (SEQ I D N°48)
3' pgkA_Aterreus Forwa rd CAGATCATCCTCCTGGAGAACC (SEQ I D N°49)
Reverse ACG G CACG AATGTTCACCTG (SEQ I D N °50) Tableau 37 : Amplification des régions d'homologies pour le gène gsdA
Cassettes d'expression de l'ingénierie
Les promoteurs et les terminateurs sont identifiés sur la base des données GenBank. Les promoteurs choisis sont déterminés à partir du point +1 de transcription et remontent 1.4Kb en amont de manière à couvrir à la fois les séquences « core » (TATA box) et les séquences trans- activatrices permettant la fonctionnalité optimale du promoteur concerné.
Pour les terminateurs la coupure est effectuée 500 bp après le codon stop du gène.
La structure de chaque bloc d'intégration de 4 cassettes d'expression est définie comme suit : le premier niveau comprend des éléments simples, à savoir des promoteurs, des séquences codantes (CDS) et des terminateurs. Les éléments promoteurs (
Tableau 30) et terminateurs (
Tableau 31), sont amplifiés et assemblées avec les CDS de l'ingénierie selon le Tableau 32. Les CDS sont amplifiés selon le protocole fournis avec le kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2321) de manière à obtenir les cassettes d'expressions fonctionnelles compilées dans le tableau. Chaque bloc d'intégration de 4 gènes est organisé pour inclure 4 couples différents promoteur terminateur de façon à limiter les interférences trans Chaque bloc d'intégration de 6 gènes est organisé pour inclure 6 couples différents promoteur terminateur de façon à limiter les interférences transcriptionnelles.
Fragment donneur pour insertion dans le locus cible du génome
Les différentes cassettes d'expression multiples (RbcS, RbcL et RbcX ou GroES, GroEL et PRK sont amplifiées et assemblées autour d'une cassette de sélection antibiotiques (Tableau 38), selon le protocole du kit In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual - Clontech, pour former les plasmides donneurs (pEQ0606 ou pEQ0607).
Tableau 38 : Assemblage des plasmides
c) Transformation d' Aspergillus terreus
La transformation de l'ADN à' Aspergillus terreus est réalisée conformément à la stratég appliquée pour Aspergillus niger (exemple 8) en utilisant la souche A. terreus NIH262.
Tableau 39 : Souches utilisées pour l'étude de rendement
Culture de souches d'A. terreus EQ1600 et EQ1602 sur glucose 3%. La composition de milieu optimisée décrite par Hevekerl et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 2014 ; 98 :6983-6989) est utilisée. Π contient 0,8 g de KH2P04, 3 g de NH4N03, 1 g de MgS04. 7H20, 5 g de CaCl2.2 H20, 1,67 mg de FeCl3.6H20, 8 mg de ZnS04.7H20 et 15 mg de CuS04.7H20 par litre. Pour imiter la concentration de sucre typique obtenue à partir d'hydrolysat de paille de blé (150 g/L) prétraité à l'acide dilué (0,75% v / v, 160°C, 10 min) et saccharifié enzymatiquement (pH 5,0, 45°C, 72 h), une quantité adéquate de glucose à hauteur de 30 g L"1 est utilisée. Les sucres et tous les autres composants sont ajoutés à partir de solutions mères stériles. Le pH du milieu sans CaCl2 est ajusté à 3,1 avec du H2S04 0,5 M avant d'inoculer la préparation de spores pour les souches EQ1600 et EQ1602. La culture est réalisée sous agitation avec 25 ml de milieu dans des fioles d'Erlenmeyer de 125 ml à 33°C dans un agitateur rotatif à 200 tr / min pendant 7-10 jours dans un environnement de 10% C02. Le pH n'est pas contrôlé pendant la fermentation. L'agitation des flacons est maintenue pendant l'échantillonnage pour des études de temps afin d'assurer un apport continu d'oxygène. Toutes les expériences sont réalisées en triplicat. Tous les composants de milieu sont obtenus auprès de Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Pour ces expériences, chaque sucre a été dissous dans de l'eau désionisée et passé à travers une colonne (440 x 45 mm) de résine échangeuse de cations Dowex 50-X8 (100/200 mesh) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) pour éliminer le manganèse, le cas échéant. d) Procédures analytiques La concentration de la masse cellulaire est déterminée à partir du poids sec des cellules. La masse cellulaire présente dans le bouillon de fermentation est récoltée par centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes et rincée soigneusement trois fois avec de l'eau désionisée. La masse cellulaire rincée a été complètement séchée à 80°C jusqu'à obtention d'un poids constant. Le bouillon de fermentation après centrifugation (10 000 g, 10 min) est conservé à -20 0 C avant analyse du glucose, de l'acide itaconique et des sous-produits (acide succinique, acide a- cétoglutarique, acide malique, acide cis-aconitique, et l'acide trans-aconitique) en utilisant une chromato graphie liquide à haute performance (HPLC). Un équipement HPLC Shimadzu Prominence (Shimadzu America, Inc., Columbia, MD) est utilisé. Deux colonnes (colonne Aminex HPX-87P, 300 x 7,8 mm avec cartouche de décendrage et cartouche de protection Carbo-P, et une colonne Aminex HPX 87H, 300 x 7,8 mm avec cartouche Microguard Cation H (Bio-Rad)) sont respectivement utilisées pour l'analyse des sucres et acides organiques. La colonne Aminex HPX 87P est maintenue à 85°C et le glucose est élué avec de l'eau désionisée acidifiée Milli-Q (Millipore, Bedford, MA) à un débit de 0,6 ml min"1. La colonne Aminex HPX 87H est maintenue à 65°C et les sucres et les acides organiques sont élués avec du H2SO4 5 mM préparé en utilisant de l'eau filtrée désioniée Milli-Q à un débit de 0,5 ml min"1. La détection est effectuée en utilisant un détecteur d'indice de réfraction pour les sucres et un détecteur UV à 210 nm pour les acides organiques. L'acide propionique (1%, poids / volume) est utilisé comme étalon interne afin d'estimer le liquide perdu pendant la fermentation aérobie de 7-10 jours à 33°C sous 10% CO2. Tous les standards de HPLC, y compris les acides organiques, sont achetés auprès de Sigma. La concentration de manganèse (niveau de ppb) est déterminée en utilisant un spectromètre d'émission à plasma à couplage inductif (ICP-OES) Optima 7000DV de Perkin-Elmer (Waltham, MA) par la procédure décrite par Bakota et al. (Eur J Lipid Sci Technol. 2015 ; 117 : 1452-1462.
Sur la base des résultats de la production d'acide itaconique à partir du glucose, un incrément de rendement massique, d'acide itaconique à partir de glucose, de 15% est observé pour la souche avec ingénierie EQ1602 par rapport à la souche référence EQ1600.

Claims

REVENDICATIONS
1- Microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, en amont de la production de 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG) ou en amont de la production de 3-phosphoglycérate (3PG), et en aval de la production de glycéraldéhyde- 3 -phosphate (G3P), ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt, autre que l'enzyme RuBisCO ou phosphoribulokinase. 2- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1, dans lequel la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates est également au moins partiellement inhibée.
3- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1 ou 2, ledit microorganisme étant génétiquement modifié pour exprimer une enzyme RuBisCO et/ou une PRK recombinantes. 4- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 2 à 3, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5-phosphate.
5- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 4, dans lequel la molécule exogène et/ou la molécule endogène est choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
6- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 5, ledit microorganisme étant une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues, ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie. 7- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel l'expression du gène codant la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée.
8- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'expression du gène codant la phosphoglycérate kinase est au moins partiellement inhibée. 9- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 7 ou 8, dans lequel l'expression du gène codant la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou la 6- phosphogluconolactonase ou la 6-phosphogluconate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée. 10- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 9, ledit microorganisme étant une levure du genre Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans laquelle l'expression du gène TDHl, TDH2 et/ou TDH3 est au moins partiellement inhibée. 11- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 10, ledit microorganisme étant une levure Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans laquelle l'expression du gène PGK1 est au moins partiellement inhibée.
12- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 10 ou 11, dans lequel l'expression du gène ZWF1 est au moins partiellement inhibée.
13- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 9, ledit microorganisme étant un champignon filamenteux du genre Aspergillus génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel l'expression des gènes pgk et gsdA est au moins partiellement inhibée. 14- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 9, ledit microorganisme étant une bactérie E. coli génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel l'expression du gène gapA et/ou pgk, et éventuellement du gène zwf, est au moins partiellement inhibée.
15- Utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 14, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
16- Utilisation selon la revendication 15, pour la production ou la surproduction de glutamate, citrate, itaconate ou GABA.
17- Procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 14, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
18- Procédé biotechnologique selon la revendication 17, selon lequel la molécule d'intérêt est choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
19- Procédé biotechnologique selon la revendication 17 ou 18, selon lequel la molécule d'intérêt est choisie le glutamate, citrate, itaconate ou GABA.
20- Procédé biotechnologique selon l'une des revendications 17 à 19, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion ou la synthèse de ladite molécule d'intérêt.
21- Procédé biotechnologique selon l'une des revendications 17 à 19, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour inhiber au moins partiellement une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d'intérêt. 22- Procédé de production d'une molécule d'intérêt comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'une des revendications 1 à 14, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt. 23- Procédé de production d'une molécule d'intérêt comprenant (i) l'inhibition de l'expression d'au moins un gène codant une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'une des revendications 1 à 14, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
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