JP2020506723A - 目的分子を産生するための遺伝的に最適化された微生物 - Google Patents
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Abstract
Description
定義
「組換え微生物」、「改変された微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用され、内因性ヌクレオチド配列を発現もしくは過剰発現し、異種ヌクレオチド配列を発現するように遺伝的に改変された微生物、または内因性遺伝子の変化した発現を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、または1つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするRNA分子もしくは同等のRNA分子のレベル、または1つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が調節されることを意味することから、発現、レベルまたは活性は、改変がない場合に観察されるものよりも高くなるかまたは低くなる。
本発明は、内因性または外因性の目的分子の産生のための遺伝的に改変された微生物を提案する。
− 機能性RuBisCO(EC4.1.1.39)の発現;
− 機能性PRK(EC2.7.1.19)の発現;
− 解糖の少なくとも部分的な阻害;および
− 目的分子の合成および/もしくは生物変換に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現、ならびに/または目的分子の合成および/もしくは生物変換と競合する活性をコードする少なくとも1つの遺伝子の阻害。
本発明によれば、微生物は、機能性RuBisCOおよび機能性PRKを自然に発現することができる。これは、例えば、微細藻類および藍藻類などの光合成微生物の場合に当てはまる。
本発明によれば、解糖経路は少なくとも部分的に阻害されていることから、微生物は、通常この代謝経路をもはや使用することができなくなる(図1−解糖)。言い換えれば、微生物は、(他の遺伝的改変とは無関係に)解糖経路が阻害されていない野生型微生物と同様にグルコースを同化する能力をもはや有していない。
特定の一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物はまた、ペントースリン酸経路の酸化分岐も少なくとも部分的に阻害されるように改変されている。
特定の一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、Entner−Doudoroff経路を有し、これは少なくとも部分的に阻害されている。主に細菌(特にグラム陰性菌)に見られるこの経路は、グルコースからピルビン酸を産生するための解糖およびペントース経路に代わるものである。より正確には、この経路は、P−グルコン酸でペントースリン酸経路に接続し、特にピルビン酸で解糖をもたらす。
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物は、目的の外因性分子の産生および/または目的の内因性分子の過剰産生を行うように形質転換されている。
a)理論収率の計算
i)ペントースリン酸経路および解糖を使用する野生型株と本発明による改変株との間のグルコースからの炭素固定収率の比較
(1)3グルコース+5ATP+6NADP++3H2O→5G3−P+5ADP+6NADPH+11H++3CO2
G3Pからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する:
(2)3グルコース+5ADP+6NADP++5NAD++5Pi→5ピルビン酸+5ATP+6NADPH+5NADH+11H++3CO2+2H2O
1モルのグルコースの平衡を正規化すると、次の収率が得られる:
(3)グルコース+1.67ADP+2NADP++1.67NAD++1.67Pi→1.67ピルビン酸+1.67ATP+2NADPH+1.67NADH+3.67H++CO2+0.67H2O
(4)グルコース+2ADP+2NAD++2Pi→2ピルビン酸+2ATP+2NADH+2H++2H2O
(5)グルコース+2ATP+2NADP++2H2O→23PG+2ADP+2NADPH+6H+
3PGからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する:
(6)グルコース+2NADP+→2ピルビン酸+2NADPH+4H+
(7)2.5グルコース+6ATP+3CO2+3H2O→63PG+6ADP+12H+
3PGからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する:
(8)2.5グルコース+3CO2→6ピルビン酸+3H2O+6H+
1モルのグルコースの平衡を正規化すると、次の収率が得られる:
(9)グルコース+1.2CO2→2.4ピルビン酸+1.2H2O+2.4H+
2つ目のケースでは、サッカロミセス・セレビシエ酵母、野生型株、およびPRK/RuBisCOエンジニアリングを組み込んで本発明に従って改変され、かつ解糖経路を阻害するようにPGK1遺伝子が欠失され、ペントース経路の酸化分岐を阻害するZWF1遺伝子が欠失された改変株でのクエン酸産生に計算が適用される。
(11)2ピルビン酸+ATP+NAD++2H2O→クエン酸+ADP+NADH+Pi+3H+
(12)グルコース+ADP+3NAD++Pi→クエン酸+ATP+3NADH+5H+
(13)0.83グルコース+CO2+ATP+NAD++H2O→クエン酸+ADP+NADH+Pi+5H+
バイオインフォマティクスによるアプローチでは、フラックス平衡解析(FBA)も実施して、本発明に従って記載される改変が異なる生合成経路の収率に与える影響をシミュレートした。
FBAシミュレーションは、OptFluxソフトウェア(Rocha et al.,BMC Syst Biol.2010 Apr 19;4:45.doi:10.1186/1752−0509−4−45)と、サッカロミセス・セレビシエ代謝モデルiMM904(Mo et al.,BMC Syst Biol.2009 Mar 25;3:37.doi:10.1186/1752−0509−37)を用いて実施した。このモデルは、(i)PRK型反応の追加、(ii)RuBisCO型反応の追加を伴う異種CO2固定経路を含む、本発明に従って記載される改善を含むように改変した。
得られた理論収率および本発明に従って提供される改善の割合を以下の表11に記載する。
サッカロミセス・セレビシエの酵母株である、市販の株CEN.PK 113−7D(GenBank:JRIV00000000)に由来するCEN.PK 1605(Mat a HIS3 leu2−3.112 trp1−289 ura3−52 MAL.28c)を、CO2損失なしでNADPHを産生し、ひいてはグルコースからのα−ファルネセン産生の改善を可能にするようにエンジニアリングする。
そのために、解糖経路をPGK1遺伝子の欠失によって不活性化した。解糖が阻害されると、結果として生じる酵母株は、グルコースを炭素・エネルギー源として使用することができなくなる。したがって、バイオマス合成経路にグリセロールを供給し、エネルギー経路にエタノールを供給する必要がある。PGK1が欠失された株は、YPGE(酵母エキスペプトングリセロールエタノール)培地で増殖させる。
プラスミドpUG6(P30114−Euroscarf)に含まれるKanMXカセットに由来するG418耐性遺伝子のコーディングフェーズ(coding phase)を、オリゴヌクレオチドCB101(配列番号1)およびCB102(配列番号2)で増幅した:
配列番号1:CB101(フォワード):5′−ACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTC−3′
配列番号2:CB102(リバース):5′−GGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAAC−3′
解糖の代替経路を再構成し、Δpgk1株がグルコース上で増殖することを可能にするために、前記株を、以下の組合せ発現を可能にするように改変した:
・ リブロース−5Pを消費してリブロース−1.5bisPを与えることによってペントースリン酸経路に移植されるホスホリブロキナーゼPRKをコードする遺伝子ならびに
・ I型RuBisCO(構造遺伝子RbcLおよびRbcSおよびシャペロンRbcX、GroESおよびGroELを有する)。RuBisCOは、リブロース−1.5bisPと1モルのCO2を消費して、解糖経路のPGK1欠失の下流に3−ホスホグリセリン酸を形成する。
・ EQ−0153(CEN.PK 1605 Δpgk1::kan)(pFPP45+pFPP56+pFPP20)
・ EQ−0253(CEN.PK 1605 Δpgk1::kan)(pL4+pFPP56+pFPP20+pFPP45)
・ EQ−0353(CEN.PK 1605)(pL4+pFL36+pCM185+pV51TEF)
エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養を、適切な培地と10%外因性CO2供給により、振盪インキュベーター(120rpm、30℃)で、EON分光光度計(BioTek Instruments)を使用して測定した0.05OD600nmで接種して行う。目的株は、PRK発現が誘発されない条件下で、かつ適切な場合はノウルセオトリシンの存在下で、10g/Lのグリセロールと7.5g/Lのエタノールを含むYNB+CSM−LUW培地で増殖させる。これらの条件下では、PGK1遺伝子の欠失の前後に株を供給する必要がある。
PGK1遺伝子での解糖経路に欠失を有するサッカロミセス・セレビシエ株EQ−0253を、PRKとRuBisCOを使用してCO2損失なしでNADPHを過剰産生しながらファルネセンを産生するように増殖させる。
a)交配型MATaの半数体株でのZWF1遺伝子およびIDH1遺伝子の不活性化
・ ZWF1遺伝子の不活性化
この遺伝子の不活性化により、クエン酸を蓄積させることが可能になる(Rodriguez et al.,Microb Cell Fact.2016 Mar 3;15:48)。
KanMXカセット(loxP−pAgTEF1−kanMX−tAgTEF1−loxP)に由来し、プラスミドpUG6(P30114)−Euroscarfに含まれるG418耐性遺伝子のコーディングフェーズを、オリゴヌクレオチドSdpgk1およびRdpgk1で増幅して(表13)、3−ホスホグリセリン酸キナーゼPGK1遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むΔpgkl PCRアンプリコンを生成する。
反対の交配型EQSC−003(CEN.PK 1605 Δzwf1::hph、Δidh1::nat)とEQSC−008(CEN.PK 1606 Δpgk1::kan)の半数体株を、株EQSC−008の場合は寒天培地:YPD(酵母エキス・ペプトン・デキストロース)で、株EQSC−003の場合はYPGE(酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール)で30℃にて一晩増殖させる。次いで、YPGE(酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール)寒天培地+150μg/mLのG418+200μg/mLのハイグロマイシンBに直接接触させることによって2つの株を交配させる。G418およびハイグロマイシンBの二重選択により2つの親株が排除され、MATa/MATα、ZWF1/Δzwf1::hph、IDH1/Δidh1::nat、PGK1/Δpgk1::kan二倍体株のみがこの培地で増殖する。この交配から単離された二倍体クローンを収集する。3つのカセットΔzwf1::hph、Δidh1::nat、Δpgk1::kanの存在は、150μg/mLのG418または200μg/mLのハイグロマイシンBまたは50μg/mLのノーセオトリシンを補充したYPGE(酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール)寒天培地での増殖テストによって検証する。得られた株をEQSC−009(CEN.PK 1607、MATa/MATα、ZWF1/Δzwf1::hph、IDH1/Δidh1::nat、PGK1/Δpgk1::kan)と参照する。
PRK−RuBisCOエンジニアリングに必要な6つの遺伝子(以下の表15)は、適合した複製起点を有し、それぞれが異なる栄養要求性補完遺伝子を持つ自律複製が可能な3つのプラスミドベクターにクローニングされており、3つのプラスミド構築物を含む株の選択が可能になる(国際公開第2015107496を参照)。これらのプラスミドのうちの2つはArs/CEN複製起点を有するシングルコピーであり、3つ目は2μ起点を有するマルチコピーである。
グルコースとCO2を含むYNB(酵母ニトロゲンベース)液体培地での増殖に対する株EQSC−006およびEQSC−007の適応
PGK1遺伝子での解糖経路、ペントースリン酸経路の酸化部分、およびクレブス回路に欠失を有するサッカロミセス・セレビシエ株EQSC−006を、PRKとRuBisCOを使用してCO2損失なしでクエン酸を産生するように増殖させる。この目的株を、PGK1もしくはZWF1の欠失またはPRKとRuBisCOの添加なしで、IDH1遺伝子の不活性化後にクエン酸を産生する参照株EQSC−007と比較する。
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失が、グルタミン酸産生を増加させる(Usuda et al.J Biotechnol.2010 May 3;147(1):17−30.doi:10.1016/j.jbiotec.2010.02.018)。
a)FlpリコンビナーゼによるFTR領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
上記の株JW0715−2の構築に使用したものと同じ欠失ストラテジーを再利用できるようにするため(Rodriguez et al.,2016)、リコンビナーゼを使用して選択カセットを欠失させた。
edd−edaオペロンの欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することによって実施する。
1.FRT−PKG−gb2−neo−FRT耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、染色体上の欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち位置1932065−1932115および1934604−1934654に50ヌクレオチド以上で相同な5′配列を有し、それによりオペロン全体の両側の細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
2.大腸菌K−12株EQ.EC002は、キットプロトコルに従ってプラスミドpRedETを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、0.2%グルコース、0.0003%テトラサイクリンを含むリッチ複合培地LB寒天上で選択する。
3.液体LB中0.3%アラビノースによって1時間誘発されたRedETリコンビナーゼの存在下に第1の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるRedETを発現する細胞の2回目のエレクトロポレーションを実施し、0.2%グルコース、0.0003%テトラサイクリンを補充し、0.3%L−アラビノースおよび0.0015%カナマイシンを添加したLB寒天上でコロニーを選択する。
4.プラスミドp707−Flpe(Gene BridgesのQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kitに付属)を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。0.2%グルコース、0.0003%テトラサイクリンを補充し、0.3%L−アラビノースを添加したLB寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが0.0015%カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
5.得られた株はEQ.EC003:MG1655 ΔsucA Δedd−edaと呼ぶ。
gapA遺伝子の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することによって実施する。
1.FRT−PKG−gb2−neo−FRT耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち遺伝子(gapA)(GenBank:X02662.1)のコーティングフェーズに50超ヌクレオチドの相同な5′配列を有し、それにより細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
2.大腸菌K−12株EQ.EC003は、キットプロトコルに従ってプラスミドpRedETを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、0.2%グルコース、0.0003%テトラサイクリンを含むリッチ複合培地LB寒天上で選択する。
3.液体LB中0.3%アラビノースによって1時間誘発されたRedETリコンビナーゼの存在下に第1の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるRedETを発現する細胞の2回目のエレクトロポレーションを実施し、0.2%グリセロールおよび0.3%ピルビン酸、0.0003%テトラサイクリンを補充し、0.3%L−アラビノースおよび0.0015%カナマイシンを添加したLB寒天上でコロニーを選択する。
・ EQ.EC002:MG1655 ΔsucA
・ EQ.EC003:MG1655 ΔsucA Δedd−eda
・ EQ.EC004:MG1655 ΔsucA Δedd−eda ΔgapA::kan
である。
大腸菌でのI型RuBisCOの異なる成分の組換え発現のために、以下の表17に記載される遺伝子を、以下の表18に記載される遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする。
EQ.EC005→(EQ.EC003+pZA11):MG1655 ΔsucA Δedd−eda
EQ.EC006→(EQ.EC004+pEQEC005):MG1655 ΔsucA Δedd−eda ΔgapA::kan(RuBisCO)
EQ.EC007→(EQ.EC004+pEQEC006):MG1655 ΔsucA Δedd−eda ΔgapA::kan(RuBisCO+PRK)
EQ.EC009→(EQ.EC004+pEQEC008):MG1655 ΔsucA Δedd−eda ΔgapA::kan(PRK)
グルタミン酸産生のために、500mLのLB培養からの細胞を、20mLのMS培地(40g/Lのグルコース、1g/LのMgSO4・7H2O、20g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのKH2PO4、10mg/LのFeSO4・7H2O、10mg/LのMnSO4・7H2O、2g/Lの酵母エキス、30g/LのCaCO3、100mg/Lのアンピシリン)にCO2雰囲気下0.1の圧力で接種する。
a)FlpリコンビナーゼによるFTR領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
この工程は、上記の例4A]と同じ方法で実施する。
zwf遺伝子(Gene ID:946370)の欠失は、相同組換えと、例4A]に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。
大腸菌K−12株EQ.EC010のgapA遺伝子(Gene ID:946370)の欠失は、相同組換えと、例4A]に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。
・ EQ.EC002:MG1655 ΔsucA
・ EQ.EC010:MG1655 ΔsucA Δzwf
・ EQ.EC011:MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA
である。
大腸菌での機能性PRK/RuBisCO系の異なる成分の組換え発現のために、表20に記載され、I型RuBisCO、ホスホリブロキナーゼ、シャペロンおよび炭酸脱水酵素をコードする遺伝子を、上記の遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする(表21)。
EQ.EC012→(EQ.EC002+pZA11):MG1655 ΔsucA
EQ.EC014→(EQ.EC011+pEQEC006):MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA(RuBisCO+PRK)
EQ.EC015→(EQ.EC011+pEQEC007):MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA(RuBisCO+PRK+炭酸脱水酵素)
グルタミン酸産生のために、500mLのLB培養からの細胞を、20mLのMS培地(40g/Lのグルコース、1g/LのMgSO4・7H2O、20g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのKH2PO4、10mg/LのFeSO4・7H2O、10mg/LのMnSO4・7H2O、2g/Lの酵母エキス、30g/LのCaCO3、100mg/Lのアンピシリン)にCO2雰囲気下0.1の圧力で接種する。
この工程は、上記の例4A]と同じ方法で実施する。
zwf遺伝子(Gene ID:946370)の欠失は、相同組換えと、例4A]に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。得られた株はEQ.EC010:MG1655 ΔsucA Δzwfと呼ぶ。
大腸菌K−12株EQ.EC010のgapA遺伝子の欠失は、相同組換えと、例4A]に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene DeletionRed(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証し、得られた株の名称は
・ EQ.EC002:MG1655 ΔsucA
・ EQ.EC010:MG1655 ΔsucA Δzwf
・ EQ.EC011:MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA
である。
大腸菌での機能性PRK/RuBisCO系の異なる成分の組換え発現のために、表22に記載され、II型RuBisCO、ホスホリブロキナーゼおよび炭酸脱水酵素をコードする遺伝子を、上記の遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする(表23)。
EQ.EC016→(EQ.EC002+pEQEC011):MG1655 ΔsucA(グルタミン酸デヒドロゲナーゼ+ピルビン酸カルボキシラーゼ)
EQ.EC017→(EQ.EC011+pEQEC009):MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA(RuBisCO+PRK+グルタミン酸デヒドロゲナーゼ+ピルビン酸カルボキシラーゼ)
EQ.EC018→(EQ.EC011+pEQEC010):MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA(RuBisCO+PRK+炭酸脱水酵素+グルタミン酸デヒドロゲナーゼ+ピルビン酸カルボキシラーゼ+炭酸脱水酵素)
グルタミン酸産生のために、500mLのLB培養からの細胞を、20mLのMS培地(40g/Lのグルコース、1g/LのMgSO4・7H2O、20g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのKH2PO4、10mg/LのFeSO4・7H2O、10mg/LのMnSO4・7H2O、2g/Lの酵母エキス、30g/LのCaCO3、100mg/Lのアンピシリン)にCO2雰囲気下0.1の圧力で接種する。
本発明に従って提案される遺伝的改変により得られる還元力の増加はまた、既存の代謝経路よりもかなりの利益を有し得る。
eddおよびeda遺伝子の隣接領域(eddの上流およびedaの下流)に対応する2つのPCRアンプリコンを、Srinivasan et al.(Appl Environ Microbiol.2002 Dec;68(12):5925−32)に記載されている手順に従った制限により、プラスミドpJQ200mp18Cmでクローニングする。
gapA遺伝子の隣接領域に対応する2つのPCRアンプリコンを、Lindenkamp et al.2012に記載されている手順に従った制限により、プラスミドpjQ200mp18Tcでクローニングする。
凍結ストックからの接種物を、フルクトースの存在下に30℃で48〜96時間インキュベートしたクライオチューブから50〜100μLの割合で固体培地に広げる。RuBisCOおよびPRKをコードする遺伝子の発現は、従属栄養好気性条件下にカプリアビダス・ネカトールで維持される(Rie Shimizu et al.,Sci Rep.2015;5: 11617.Published online 2015 Jul 1.)。
例4B]に従ってグルタミン酸産生の収率を増加させるように遺伝的に改変された大腸菌K−12株は、グルタミン酸デカルボキシラーゼgadB(Gene ID:946058)の構成的発現を可能にし、ひいてはγ−アミノ酪酸の産生収率を増加させるように改変することもできる。
・ EQ.EC002:MG1655 ΔsucA
・ EQ.EC010:MG1655 ΔsucA Δzwf
・ EQ.EC011:MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA
gadB遺伝子の過剰発現を、細菌発現ベクターpZE21MCS(EXPRESSYS)にサブクローニングする。このベクターは、ColE1複製起点およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を有する。
大腸菌での機能性I型RuBisCOの異なる成分の組換え発現のために、表17に記載される遺伝子(例4A])を、表22に記載される構築構造に従って合成オペロンとしてクローニングする。
表24に記載される遺伝子のコーディング配列(CDS)を、表24に記載される3つの統合ブロックが得られるように、NEBuilder(登録商標)HiFi DNA Assembly Master Mix Kit(E2321)で提供されるプロトコルに従って増幅し、ブロックにアセンブルする。
EQ.EC013→(EQ.EC002+pZA11+pEQ030):MG1655 ΔsucA+(gadB)
EQ.EC020→(EQ.EC011+pEQ030+pEQEC006):MG1655 ΔsucA Δzwf ΔgapA+(gadB)+(RuBisCO+PRK)
GABA産生のために、500mLのLB培養からの細胞を、20mLのMS培地(40g/Lのグルコース、1g/LのMgSO4・7H2O、20g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのKH2PO4、10mg/LのFeSO4・7H2O、10mg/LのMnSO4・7H2O、2g/Lの酵母エキス、30g/LのCaCO3、100mg/Lのアンピシリンおよび30mg/Lのカナマイシン)にCO2雰囲気下0.1の圧力で、30℃にてpH3.5で接種する。
オオウズラタケ(Fomitopsis palustris)からのグリオキシル酸デヒドロゲナーゼFPGLOXDH1(Gene ID:946058)の構成的発現を可能にし、icd遺伝子(Gene ID:945702)の発現を減少させ、かつaceB遺伝子(Gene ID:948512)とsdhA遺伝子(Gene ID:945402)を不活性化するように遺伝的に改変された大腸菌K−12株は、コハク酸およびシュウ酸の産生収率を増加させる。
上記の株JW0715−2の構築に使用したものと同じ欠失ストラテジーを再利用できるようにするため(Rodriguez et al.,2016)、リコンビナーゼを使用して選択カセットを欠失させる。
aceB遺伝子(Gene ID:948512)の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。
i.ストラテジー
弱いプロモーターによるicd遺伝子(Gene ID:945702)のネィティブプロモーターの代替を、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することにより実施する。
icd遺伝子プロモーターを、弱いと特徴付けられるプロモーターPoxb1を結合するカセットと、抗生物質耐性遺伝子を含むPoxb1カセットの挿入の選択を可能にする抗生物質耐性遺伝子カセットとで代替する。
zwf遺伝子(Gene ID:946370)の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することによって実施する。
gapA遺伝子の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってQuick & Easy E.coli Gene Deletion Red(登録商標)/ET(登録商標)Recombination Kit(Gene Bridges)を使用することによって実施する。
FPGLOXDH1遺伝子(Gene ID:946058)およびaceA遺伝子(Gene ID:948517)のコーティング配列(ICDS)を、表24に記載される構造に従って合成オペロンとして細菌発現ベクターpZE21MCS(EXPRESSYS)にサブクローニングする。このベクターは、ColE1複製起点およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を有する。
大腸菌での機能性I型RuBisCOの異なる成分の組換え発現のために、表17に記載される遺伝子(例4A])を、合成オペロンの形態でクローニングする。
EQ.EC045→(EQ.EC042+pZA11+pZE21MCS):MG1655 ΔsdhA ΔaceB Picd::Poxb1
EQ.EC046→(EQ.EC045+pEQEC006+pEQEC035): MG1655 ΔsdhA ΔaceB Picd::Poxb1 Δzwf ΔgapA+(FPGLOXDH1+aceA)+(RuBisCO+PRK)
コハク酸およびシュウ酸の産生のために、500mLのLB培養からの細胞を、20mLのMS培地(40g/Lのグルコース、1g/LのMgSO4・7H2O、20g/Lの(NH4)2SO4、1g/LのKH2PO4、10mg/LのFeSO4・7H2O、10mg/LのMnSO4・7H2O、2g/Lの酵母エキス、30g/LのCaCO3、100mg/Lのアンピシリン、30mg/Lのカナマイシン)にCO2雰囲気下0.1の圧力で、30℃にてpH3.5で接種する。
培養上清を0.2μm Milliporeフィルターでろ過し、カチオン交換カラム(Aminex HPX87−H,Bio−Rad,Hercules、CA、USA)、UV吸光度検出器(Agilent Technologies、G1315D)および屈折率(RI)検出器(Agilent Technologies、HP1047A)を備えたAgilent HPLCシステム(シリーズ1100)で分析する。サンプルは、流量0.4mL/分にて5mMのH2S04移動相で分離する。カラムオーブンの度は65℃である。
ペレットを、2mM EDTAを含む10mM リン酸カリウムバッファー(pH7.5)で2回洗浄し、−20℃で保存する。サンプル(1mL)を、0.75gのガラスビーズ(425〜600μm)で予冷したチューブに移し、Fast Prepホモジナイザー(Thermo Scientific、エーレムボーデゲム、オランダ)に導入し、スピード調節6で4回20秒間バーストさせる。溶解物を4℃および36,000gで20分間遠心分離する。総タンパク質の測定を、ローリー法(Lowry et al.,1951)に従って実施する。オキザロ酢酸アセチルヒドロラーゼ(EC3.7.1.1.1)活性を、(Lenz et al.,1976)に記載されているように、255nmでのオキザロ酢酸(OAA)の直接光学測定の変更を使用して測定する。OAAエノール互変異性体の消失は、石英キュベットを使用してHitachi Model 100−60分光光度計(日立、東京、日本)で25℃にて255nmで調べる。1mLの反応混合物は、100mM イミダゾール−HCl(pH7.5)、0.9mM MnCl2・2H2O、1mM OAA、20μLの細胞抽出物を含む(細胞抽出物の容量が異なる対照により、酵素活性と細胞抽出物の量との間の線形関係が確認される)。反応は、細胞抽出物を加えることで開始される。
a)ストラテジー
解糖経路の非機能性をもたらすにpgkA遺伝子(Locus tag(遺伝子座タグ) An08g02260)の不活性化、およびペントースリン酸経路の酸化部分を阻害するgsdA遺伝子(Locus tag An02g12140)の不活性化は、PRKおよびRuBisCO酵素の機能性発現のための6つの遺伝子、すなわちCO2固定のためのRbcS、RbcL、RbcX、GroES、GroELおよびPRKを統合するために使用される。
i)不活性化すべき遺伝子を標的とするためのガイドRNA配列
これらの2つの遺伝子のそれぞれにおいて、NGGモチーフによって区切られた20ヌクレオチドの配列(下線を引いたCRISPR標的配列)を決定した(表27)。いずれの場合も、この配列は、標的遺伝子に特異的であるが、アスペルギルス・ニガーのゲノムでもユニークである。これらの配列は、アスペルギルス・ニガーのゲノムの相同領域とヘテロ二本鎖を形成することによりCAS9エンドヌクレアーゼの作用を指示して、選択された遺伝子座で特異的に二本鎖切断を誘発するガイドRNA(gRNA)を発現するために使用する。
ゲノムとの相同領域
ドナープラスミドは、プラスミドpUC19(GenBank:M77789.2)と、統合のために選択された遺伝子座と相同な、それぞれ約1500bpのゲノム標的配列(genomic targeting sequences)(LAおよびRA)との間のIn−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit User Manual(Clontech社)アセンブリから成る。LAおよびRA配列は、ガイドRNAが標的とする遺伝子座配列にそれぞれ5′および3′で隣接している。ゲノムDNA/ガイドRNAヘテロダイマーは、二本鎖切断のCas9エンドヌクレアーゼによって認識される(遺伝子座1:pgkA;遺伝子座2:gsdA)(表28)。RAおよびLAフラグメントは、pgkA遺伝子およびgsdA遺伝子のプライマーで増幅する(表29)。アンプリコン配列は、配列表に記載されている(配列番号55〜配列番号58)。In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit User Manual(Clontech社)のプロトコルに従って、3つのフラグメントのすべてのフォワードプライマーに18ヌクレオチドの伸長部を加えて、プラスミド(pEQ0600またはpEQ0601)の機能性アセンブリと、大きな非対称認識部位(12〜40個の塩基対)を持つII型制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素I−CeuIおよびI−SceI)の2つの制限部位の導入とを可能にする。これらは18個の塩基対の認識配列であり、したがってまれである。切断が調査部位(reconnaissance site)で非対称であるという事実により、細菌ベクターpUC19からの配列を欠くフラグメントの放出が可能になる。これらの2つの酵素により、大腸菌でのクローニングによる増幅後の制限により統合ブロックの抽出が可能になる。
プロモーターとターミネーターを、GenBankデータに基づいて同定する。選択されたプロモーターは、+1転写点から決定し、「コア」配列(TATAボックス)と当該プロモーターの最適な機能を可能にするトランス活性化配列の両方をカバーするために1.4kb上流に移動する。
4つの発現カセットの各統合ブロックの構造は次のように定義される:最初のレベルは、単純な要素、すなわちプロモーター、コーディング配列(CDS)およびターミネーターから成る。プロモーター要素(表30)およびターミネーター要素(表31)(その配列は、配列表(配列番号59〜62)に提供されている)は、表32に従ってエンジニアリングCDSで増幅し、アセンブルする。CDS(その配列は、配列表(配列番号63〜66)で提供されている)は、NEBuilder(登録商標)HiFi DNA Assembly Master Mix Kit(E2321)で提供されているプロトコルに従って増幅することで、表にまとめられている機能性発現カセットを得る。4つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉(trans interference)を制限するために4つの異なるペア(プロモーター/ターミネーター)を含むように編成されている。6つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために、6つの異なるペア(プロモーター/ターミネーター)を含むように編成されている。
異なる複数の発現カセット(RbcS、RbcLおよびRbcX)または(GroES、GroELおよびPRK)を、In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit User Manual(Clontech社)のプロトコルに従って増幅し、、抗生物質選択カセット(表)の周りにアセンブルして、ドナープラスミド(pEQ0602またはpEQ0603)を形成する。
アスペルギルス・ニガーでのDNAの形質転換は、真菌の細胞壁の存在に制約されており、酵母または大腸菌と比較して非常に効果がない。それにもかかわらず、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)のLysing Enzyme(登録商標)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)のキチナーゼおよび、ヘリックス・ポマティア(Helix pomatia)のβ−グルクロニダーゼからなるカクテルなどの細胞壁分解酵素での処理により真菌糸体(fungal hyphae)または分生胞子を発芽させて調製したプロトプラストの形質転換(de Bekker et al.,J Microbiol Methods.2009 Mar;76(3):305−6)により、形質転換体を産生することが可能になる。
細胞外代謝産物の定量化のために、培養サンプルを14,000xgで5分間遠心分離する。上清を、0.45pm孔径のフィルターでろ過する。ろ液を、分析するまで−20℃で保持する。クエン酸およびシュウ酸の濃度は、Amethyst C18−Hカラム(250×4.6mm、Slepax Technologies Newark、DE、USA)を使用して210nmの紫外線で検出および定量化する。0.8mL/分の流量で0.03%H3PO4を用いて30℃にて溶出を行う。3,5−ジニトロサリチル酸法で還元糖を検出する。バイオマス測定:5mLのサンプルをミラクロス(Calbiochem、San Diego、CA、USA)でろ過して菌糸体を収集し、蒸留水で洗浄する。菌糸体を「ミラクロス」で105℃に加熱する。乾燥菌体重量(DCW)の計算のために、ミラクロスの重量を事前に測定し、総重量から差し引いて正味重量を出し、次いで単位容量当たりの正味重量をDCWとして計算する。
a)ストラテジー
解糖経路の非機能性をもたらすpgkA遺伝子(Locus tag ATEG_00224)の不活性化、およびペントースリン酸経路の酸化部分を阻害するgsdA遺伝子(Locus tag ATEG_01623)の不活性化は、PRKおよびRuBisCO酵素の機能性発現のための6つの遺伝子、すなわちCO2固定のためのRbcS、RbcL、RbcX、groES、groELおよびPRKを統合するために使用される。
i)不活性化すべき遺伝子を標的とするためのガイドRNA配列
ゲノムとの相同領域
ドナープラスミドは、プラスミドpUC19(GenBank:M77789.2)と、統合のために選択された遺伝子座と相同な、それぞれ約1500bpのゲノム標的配列(LAおよびRA)との間のIn−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit User Manual(Clontech社)アセンブリから成る。LAおよびRA配列は、ガイドRNAが標的とする遺伝子座配列にそれぞれ5′および3′で隣接している。ゲノムDNA/ガイドRNAヘテロダイマーは、二本鎖切断のCas9エンドヌクレアーゼによって認識される(遺伝子座1:pgkA;遺伝子座2:gsdA)(表35)。RAおよびLAフラグメントは、pgkA遺伝子については表36に、gsdA遺伝子については表37に記載されているプライマーで増幅する。アンプリコン配列は、配列表に記載されている(配列番号67〜70)。
プロモーターとターミネーターを、GenBankデータに基づいて同定する。選択されたプロモーターは、+1転写点から決定し、「コア」配列(TATAボックス)と当該プロモーターの最適な機能を可能にするトランス活性化配列の両方をカバーするために1.4kb上流に移動する。
4つの発現カセットの各統合ブロックの構造は次のように定義される:最初のレベルは、単純な要素、すなわちプロモーター、コーディング配列(CDS)およびターミネーターから成る。プロモーター要素(表30)およびターミネーター要素(表31)は、表32に従ってエンジニアリングCDSで増幅し、アセンブルする。CDSは、NEBuilder(登録商標)HiFi DNA Assembly Master Mix Kit(E2321)で提供されているプロトコルに従って増幅することで、表にまとめられている機能性発現カセットを得る。4つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために4つの異なるペア(プロモーター/ターミネーター)を含むように編成されている。6つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために、6つの異なるペア(プロモーター/ターミネーター)を含むように編成されている。
異なる複数の発現カセット(RbcS、RbcLおよびRbcXまたはGroES、GroELおよびPRK)を、In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit User Manual(Clontech社)のプロトコルに従って増幅し、、抗生物質選択カセット(表38)の周りにアセンブルして、ドナープラスミド(pEQ0606またはpEQ0607)を形成する。
アスペルギルス・テレウスDNAの形質転換は、アスペルギルス・テレウス株NIH262を使用して、アスペルギルス・ニガーに適用されたストラテジー(例8)に従って行う。
Hevekerl et al.(Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98:6983−6989)によって記載される最適化された培地組成を使用する。それには、1リットルあたり0.8gのKH2PO4、3gのNH4NO3、1gのMgSO4・7H2O、5gのCaCl2・2H2O、1.67mgのFeCl3・6H2O、8mgのZnSO4.7H2Oおよび15mgのCuSO4・7H2Oが含まれている。希酸(0.75%v/v、160℃、10分)で前処理し、酵素的に糖化(pH5.0、45℃、72時間)した麦わら加水分解物(150g/L)から得られる典型的な糖濃度を模倣するために、30g/Lまでの適切な量のグルコースを使用する。糖と他のすべての成分は、滅菌原液から加える。株EQ1600およびEQ1602の胞子調製物に接種する前に、CaCl2を含まない培地のpHを0.5M H2SO4で3.1に調節する。培養は、10%CO2の環境で7〜10日間、33℃で125mLエルレンマイヤーフラスコに25mLの培地を入れて、200rpmにて振盪培養器で振盪させながら行う。発酵中、pHは調べない。酸素の継続的な供給を確保するために、時間研究のためのサンプリング中はフラスコの振盪を維持する。すべての実験を3回行う。すべての培地成分は、Sigma Chemical、St.Louis、Missouriから得られる。これらの実験では、必要に応じて、各糖を脱イオン水に溶解し、Dowex 50−X8(100/200メッシュ)カチオン交換樹脂(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA)のカラム(440×45mm)に通してマンガンを除去する。
細胞集団の濃度は、乾燥菌体重量から決定する。発酵ブロスに存在する細胞集団を10,000gで10分間遠心分離することにより収集し、脱イオン水で慎重に3回すすぐ。すすいだ細胞集団を、恒量が得られるまで80℃で完全に乾燥させた。遠心分離(10,000g、10分)後の発酵ブロスは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してグルコース、イタコン酸および副産物(コハク酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、cis−アコニット酸およびtrans−アコニット酸)を分析するまで−20℃で保存する。Shimadzu Prominence HPLCシステム(Shimadzu America、Inc.,Columbia、MD)を使用する。糖と有機酸の分析のために、それぞれ2つのカラム(灰出しカートリッジとCarbo−P保護カートリッジ付きのAminex HPX−87Pカラム300×7.8mmと、Microguard Cation Hカートリッジ(Bio−Rad)付きの1つのAminex HPX 87Hカラム300×7.8mm)を使用する。Aminex HPX 87Pカラムは85℃に維持し、グルコースはMilli−Q酸性脱イオン水(Millipore、Bedford、MA)を用いて0.6mL/分の流量で溶出させる。
Claims (23)
- 機能性RuBisCO酵素および機能性ホスホリブロキナーゼ(PRK)を発現し、解糖経路が1,3−ビホスホ−D−グリセリン酸(1,3−BPG)の産生の上流または3−ホスホグリセリン酸(3PG)の産生の上流、およびグリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)の産生の下流で少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物であって、当該微生物が、RuBisCO酵素またはホスホリブロキナーゼ酵素以外の、目的の外因性分子を産生および/または目的の内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている、微生物。
- ペントースリン酸経路の酸化分岐もまた少なくとも部分的に阻害されている、請求項1に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、組換えRuBisCO酵素および/またはPRKを発現するように遺伝的に改変されている、請求項1または2に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、リブロース−5−リン酸産生の上流の前記ペントースリン酸経路の酸化分岐を阻害するように遺伝的に改変されている、請求項2または3に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記外因性分子および/または前記内因性分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択される、請求項4に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、真核細胞であり、酵母、真菌、微細藻類または原核細胞から選択的に選ばれ、優先的には細菌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼまたは6−ホスホグルコノラクトナーゼまたは6−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項7または8に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、機能性I型またはII型RuBisCOと機能性ホスホリブロキナーゼ(PRK)を発現するように遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビシエ属の酵母であって、TDH1、TDH2および/またはTDH3遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、機能性I型またはII型RuBisCOと機能性ホスホリブロキナーゼ(PRK)を発現するように遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビシエ酵母であって、PGK1遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- ZWF1遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項10または11に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、機能性I型またはII型RuBisCOと機能的ホスホリブロキナーゼ(PRK)を発現するように遺伝的に改変されたアスペルギルス属の糸状菌であって、pgk遺伝子およびgsdA遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- 前記微生物が、機能性I型またはII型RuBisCOと機能的ホスホリブロキナーゼ(PRK)を発現するように遺伝的に改変された大腸菌であって、gapA遺伝子および/またはpgk遺伝子、ならびに任意にzwf遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択的に選ばれる目的分子の産生または過剰産生のための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物の使用。
- グルタミン酸、クエン酸、イタコン酸またはGABAの産生または過剰産生のための、請求項15に記載の使用。
- 少なくとも1つの目的分子を産生するための生物工学的方法であって、請求項1〜14のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物を、当該微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および/または精製する工程とを含むことを特徴とする、方法。
- 前記目的分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択される、請求項17に記載の生物工学的方法。
- 前記目的分子が、グルタミン酸、クエン酸、イタコン酸またはGABAから選択される、請求項17または18に記載の生物工学的方法。
- 前記微生物が、前記目的分子の生物変換または合成に関与する少なくとも1つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている、請求項17〜19のいずれか一項に記載の生物工学的方法。
- 前記微生物が、前記目的分子の分解に関与する酵素を少なくとも部分的に阻害するように遺伝的に改変されている、請求項17〜19のいずれか一項に記載の生物工学的方法。
- 目的分子を産生する方法であって、(i)請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも1つの配列を挿入することと、(ii)前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に(iii)前記目的分子を回収および/または精製することとを含む、方法。
- 目的分子を産生する方法であって、(i)請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の分解に関与する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現を阻害することと、(ii)前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に(iii)前記目的分子を回収および/または精製することとを含む、方法。
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