FR3062394A1 - Microorganisme genetiquement optimise pour la production de molecules d'interet - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène. Selon l'invention la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates peut également être au moins partiellement inhibée. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel microorganisme génétiquement modifié, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt et des procédés de synthèse ou bioconversion de molécules d'intérêt.
Description
Titulaire(s) : fiée.
ENOBRAQ Société par actions simpliO Demande(s) d’extension :
® Mandataire(s) : CABINET LTL S.A.S. LAW TECH LINK.
FR 3 062 394 - A1 ® MICROORGANISME GENETIQUEMENT OPTIMISE POUR LA PRODUCTION DE MOLECULES D'INTERET.
(57) L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène. Selon l'invention la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates peut également être au moins partiellement inhibée. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel microorganisme génétiquement modifié, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt et des procédés de synthèse ou bioconversion de molécules d'intérêt.
i
Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d’intérêt
Domaine de l’invention
L’invention concerne un microorganisme génétiquement modifié, apte à utiliser du dioxyde de carbone comme source de carbone au moins partielle pour la production de molécules d’intérêt. Plus particulièrement, l’invention a trait à un microorganisme dans lequel au moins la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée. L’invention a également trait à des procédés pour la production d’au moins une molécule d’intérêt utilisant un tel microorganisme.
Etat de la technique
Depuis plusieurs années, de nombreux procédés microbiologiques ont été développés pour permettre la production de molécules d’intérêt en grandes quantités.
Ainsi, des procédés de fermentation sont utilisés pour faire produire des molécules par un microorganisme à partir d’une source de carbone fermentescible, telle que le glucose.
Des procédés de bioconversion ont également été développés, pour permettre à un microorganisme de convertir un co-substrat, non assimilable par ledit microorganisme, en une molécule d’intérêt. Là encore, une source de carbone est nécessaire, non plus pour la production proprement dite de la molécule d’intérêt, mais pour la production de cofacteurs, et plus particulièrement de NADPH, pouvant être nécessaire à la bioconversion. D’une manière générale, le rendement de production par de tels procédés microbiologiques est faible du fait principalement des besoins en cofacteurs et de la difficulté d’équilibrer les réactions métaboliques redox. Se pose également le problème du coût de revient de telles molécules, puisqu’une source de carbone assimilable par le microorganisme est toujours nécessaire. Autrement dit, actuellement pour produire une molécule d’intérêt avec un procédé microbiologique, il est nécessaire de fournir une molécule (glucose, ou autre), certes de moindre valeur industrielle, mais qui suffit à rendre la production de certaines molécules non économiquement intéressante.
En parallèle, le dioxyde de carbone (CO2), dont les émissions dans l’atmosphère ne cessent de croître, n’est pas ou peu utilisé dans les procédés microbiologiques actuels, alors que sa consommation par les microorganismes pour la production de molécules d’intérêt permettrait non seulement de réduire les coûts de production, mais également de répondre à des problématiques écologiques certaines.
H existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules d’intérêt en grandes quantités et avec des coûts de revient plus faibles qu’avec les procédés actuels.
Résumé de l’invention
L’intérêt d’utiliser des microorganismes non-photosynthétiques génétiquement modifiés pour pouvoir capturer le CO2 et l’utiliser comme source de carbone principale, au même titre que les plantes et les microorganismes photosynthétiques a déjà été démontré. Ainsi, des microorganismes modifiés de manière à exprimer une RuBisCO (Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase - EC 4.1.1.39) et une PRK (phosphoribulokinase - EC 2.7.1.19) fonctionnelles pour pouvoir ainsi reproduire un cycle de Calvin partiel et convertir le ribulose 5 phosphate en deux molécules de 3-phosphoglycérate par capture d’une molécule de dioxyde de carbone ont été développés.
En travaillant sur les solutions apportées par le cycle de Calvin pour produire des molécules d’intérêt en utilisant le CO2 comme source de carbone, les inventeurs ont eu l’idée de coupler une partie du cycle de Calvin (PRK/RuBisCO) à une inhibition au moins partielle de la glycolyse, afin d’augmenter le rendement de production de molécules d’intérêt. En outre, afin d’augmenter la consommation de CO2 exogène lors de la production de molécules d’intérêt, les inventeurs ont eu l’idée d’inhiber également au moins partiellement la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates. Les microorganismes ainsi développés permettent de produire à grande échelle et avec un rendement industriellement intéressant un grand nombre de molécules d’intérêt, telles que des acides aminés, acides organiques, terpènes, terpénoïdes, peptides, acides gras, polyols, etc.
L’invention a donc pour objet un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié présente une branche oxydative de la voie des pentoses phosphates également au moins partiellement inhibée.
L’invention concerne également Putilisation d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’invention, pour la production ou la surproduction d’une molécule d’intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
La présente invention concerne également un procédé biotechnologique pour produire ou surproduire au moins une molécule d’intérêt, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise en culture d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d’intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
Elle concerne également un procédé de production d’une molécule d’intérêt comprenant (i) l’insertion d’au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou bioconversion de ladite molécule d’intérêt dans un microorganisme recombinant selon l’invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l’expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
Description des figures
Figure 1 : Schéma général de la glycolyse, de la voie des pentoses phosphates et de la voie Entner-Doudoroff ;
Figure 2 : Représentation schématique de l’inhibition de la voie de la glycolyse, selon l’invention ;
Figure 3 : Représentation schématique de l’inhibition de la voie de la glycolyse, combinée à l’inhibition de la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates, selon l’invention.
Description détaillée de l’invention
Définitions
Ees termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des microorganismes qui ont été génétiquement modifiés pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues, ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de modification.
H est entendu que les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» se réfèrent non seulement au microorganisme recombinant particulier, mais à la descendance ou à la descendance potentielle d'un tel microorganisme. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.
Dans le contexte de l’invention, une voie métabolique au moins partiellement « inhibée » ou « inactivée » s’entend d’une voie métabolique altérée, qui ne peut plus se dérouler correctement dans le microorganisme considéré, comparativement au même microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber ladite voie métabolique). Notamment la voie métabolique peut être interrompue, entraînant l’accumulation d’un métabolite intermédiaire. Une telle interruption peut être obtenue par exemple par inhibition de l’enzyme nécessaire à la dégradation d’un métabolite intermédiaire de la voie métabolique considérée et/ou par inhibition de l’expression du gène codant pour cette enzyme. La voie métabolique peut également être atténuée, c’est-à-dire ralentie. Une telle atténuation peut être obtenue par exemple par inhibition partielle d’une ou plusieurs enzymes intervenant dans la voie métabolique considérée et/ou par inhibition partielle de l’expression d’un gène codant pour au moins une de ces enzymes et/ou en jouant sur les cofacteurs nécessaires pour certaines réactions. L’expression « voie métabolique au moins partiellement inhibée » signifie que le niveau de la voie métabolique considéré est réduit d’au moins 20%, plus préférentiellement au moins 30%, 40%, 50%, ou plus, comparativement au niveau dans un microorganisme sauvage. La réduction peut être plus importante, et notamment être au moins supérieure à 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l’invention, l’inhibition peut être totale, en ce sens que la voie métabolique considérée n’est plus du tout utilisée par ledit microorganisme. Selon l’invention, une telle inhibition peut être temporaire ou définitive.
Selon l’invention, on entend par « inhibition de l’expression d’un gène » le fait que ledit gène n’est plus exprimé dans le microorganisme considéré ou que son expression est réduite, comparativement au microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber l’expression du gène), conduisant à l’absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l’inhibition peut être totale, c’est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n’est plus du tout produite. L’inhibition de l’expression d’un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique correspondante. Selon l’invention, toute méthode d’inhibition d’un gène, connue en soi par l’homme de l’art et applicable à un microorganisme peut être utilisée. Par exemple, l’inhibition de l’expression d’un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ; 97:6640-5 ; Lodish et al., Molecular Cell Biology 4th ed. 2000. W. H. Lreeman and Company. ISBN 0-7167-3136-3) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l’expression d’un gène et/ou l’activité de la protéine encodée (Thomas et al., Cell. 1987;51:503-12) ; modification d’une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., Methods Mol Biol. 2011;765:275-94. doi: 10.1007/978-l-61779-197-0_16) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons), d'origine naturelle ou artificielle. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférants, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme ARN interférant ou ARNi désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d’un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L’inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d’édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via Γ utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim étal., PNAS; 93: 1156-1160), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al., Methods Mol Biol. 2016;1338:27-42. doi: 10.1007/978-14939-2932-0_3), d’un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites ‘CRISPR’ (Mali et al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.2649), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79). L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène.
Par voie de biosynthèse ou bioconversion « NADPH-dépendante » ou « consommatrice de NADPH », on entend dans le contexte de l’invention l’ensemble des voies de biosynthèse ou bioconversion dont une ou plusieurs enzymes nécessitent l’apport concomitant d’électrons obtenus par l’oxydation d’un cofacteur NADPH. Les voies de biosynthèse ou bioconversion « NADPH-dépendantes » concernent notamment la synthèse d'acides aminés (e.g. arginine, lysine, méthionine, thréonine, proline, glutamate, homosérine, isoleucine, valine), de terpénoïdes et de terpènes (e.g. farnésène), de vitamines et précurseurs (e.g. pantoate, pantothenate, transneurosporène, phylloquinone, tocophérols), de stérols (e.g. squalène, cholestérol, testostérone, progestérone, cortisone), de flavonoïdes (e.g. frambinone, vestinone), d'acides organiques (e.g. acide coumarique, acide 3-hydroxypropionique), de polyols (e.g. sorbitol, xylitol, glycérol), de polyamines (e.g. spermidine), de molécules aromatiques à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant (e.g. phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones).
Le terme «exogène» tel qu'utilisé ici en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui ne sont pas normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produites par le microorganisme considéré. A l’inverse, le terme endogène” ou natif en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui sont normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produit par le microorganisme considéré.
Microorganismes
L’invention propose des microorganismes génétiquement modifiés pour la production d’une molécule d’intérêt, endogène ou exogène.
Par microorganisme « génétiquement modifié », on entend que le génome du microorganisme a été modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant une enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse ou de bioconversion d’une molécule d’intérêt, ou codant un fragment biologiquement actif de celle-ci. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome dudit microorganisme ou d’un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l’invention, le génome du microorganisme s’entend de l’ensemble du matériel génétique contenu dans ledit microorganisme, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c’est-à-dire qui n’existe pas à l’état naturel dans ledit microorganisme, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome du microorganisme une unité transcriptionelle comportant la séquence nucléique d’intérêt, placée sous le contrôle d’un ou plusieurs promoteur(s). Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d’autres éléments de régulation de la transcription.
Des promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d’expression variable en fonction de la présence ou de l’absence de ces stimuli. Par exemple, lorsque le microorganisme est une levure, il est possible d’utiliser un promoteur constitutif, tel que celui d’un gène parmi TEF1, TDH3, PG1F PGK, ADH1. Des exemples de promoteurs inductibles utilisables chez la levure sont les promoteurs tetO-2, G AL 10, GAL10-CYC1, PH05.
D’une manière générale, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention présente les caractéristiques suivantes :
Expression d’une RuBisCO (EC 4.1.1.39) fonctionnelle ;
Expression d’une PRK (EC 2.7.1.19) fonctionnelle ;
Inhibition au moins partielle de la glycolyse ; et
Expression d’au moins un gène participant à la synthèse et/ou la bioconversion d’une molécule d’intérêt, et/ou inhibition d’au moins un gène codant une activité compétitrice à la synthèse et/ou la bioconversion d’une molécule d’intérêt.
Selon l’invention, tout microorganisme peut être utilisé. Préférentiellement le microorganisme est une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie ou cyanobactérie.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est une levure, préférentiellement choisie parmi les levures ascomycètes (Spermophthoraceae et Saccharomycetaceae), les levures basidiomycètes (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, et Filobasidiella) et les levures deuteromycètes appartenant au Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae. et Cryptococcaceae). Préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l’invention appartient au genre Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, ou Debaryomyces. Plus préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l’invention est choisie parmi Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii et Lipomyces starkeyi.
Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est un champignon, et plus particulièrement un champignon «filamenteux ». Dans le contexte de l’invention, les « champignons filamenteux » désignent toutes les formes filamenteuses de la sous-division Eumycotina. Par exemple, le champignon génétiquement modifié selon l’invention appartient au genre Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus ou Pyricularia. Préférentiellement, le champignon génétiquement modifié selon l’invention est choisi parmi Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, et Trichoderma viride.
Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est une microalgue. Dans le contexte de l’invention, on désigne par « microalgue » l’ensemble des algues microscopiques de type eucaryote, appartenant préférentiellement aux classes ou superclasses des Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomées ou Bacillariophyta, Euglénophyceae, Rhodophyceae, ou Trebouxiophyceae. Préférentiellement, les microalgues génétiquement modifiées selon l’invention sont choisies parmi Nannochloropsis sp. (e.g. Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina), Tetraselmis sp. (e.g. Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. (e.g. Chlorella salina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (e.g. Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp. (e.g. Dunaliella tertiolecta, Dunaliella salina), Phaeodactulum tricornutum, Botrycoccus braunii, Chroomonas salina, Cyclotella cryptica, Cyclotella sp., Ettlia texensis, Euglena gracilis, Gymnodinium nelsoni, Elaematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Neochloris oleoabundans, Nitzschia laevis, Onoraphidium sp., Pavlova lutheri, Phaeodactylum tricornutum, Porphyridium cruentum, Scenedesmus sp. (e.g. Scenedesmus obliquuus, Scenedesmus quadricaula, Scenedesmus sp.), Stichococcus bacillaris, Spirulina platensis, Thalassiosira sp.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est une bactérie, préférentiellement choisie parmi les phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, ou Verrucomicrobia. De manière préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l’invention appartient au genre Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena,
Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc, Phormidium, Prochlorococcus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, ou Zymomonas. De manière encore préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l’invention est choisie parmi les espèces Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Mannheimia succiniciproducens, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor, Zymomonas mobilis, Acaryochloris marina, Anabaena variabilis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violaceus, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochlorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Thermosynechococcus elongatus, Trichodesmium erythraeum, et Rhodopseudomonas palustris.
Expression d’une RuBisCO et d’une P RK fonctionnelles
Selon l’invention, le microorganisme peut exprimer naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles. C’est le cas par exemple des microorganismes photosynthétiques, tels que les microalgues ou les cyanobactéries.
H existe plusieurs formes de RuBisCO dans la nature (Tabita et al., J Exp Bot. 2008;59(7): 151524. doi: 10.1093/jxb/erm361). Les formes I, II et III catalysent les réactions de carboxylation et d’oxygénation du ribulose 1,5-biphosphate. La forme I est présente chez les eucaryotes et les bactéries. Elle est constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS). Le complexe enzymatique fonctionnel est un hexadécamère constitué de huit sous-unités L et huit sous-unités S. L’assemblage correct de ces sous-unités nécessite en outre l’intervention d’au moins une chaperonne spécifique : RbcX (Liu et al., Nature. 2010 Jan 14;463(7278): 197-202. doi: 10.1038/nature08651). La forme II se trouve principalement chez les protéobactéries, les archaea et les algues dinoflagellées. Sa structure est beaucoup plus simple : il s’agit d’un dimère formé de deux sous-unités RbcL identiques. Selon l’organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type I peuvent s’appeler rbcL/rbcS (par exemple, Synechococcus elongatus), ou encore cbxLC/cbxSC, cfxLC/cfxSC, cbbL/cbbS (par exemple, Cupriavidus necator). Selon l’organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type II s’appellent généralement cbbM (par exemple, Rhodospirillum rubrum). La forme III est présente chez les archaea. On la trouve généralement sous la forme de dimères de sous-unité RbcL, ou en pentamères de dimères. Selon l’organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type III peuvent s’appeler rbcL (par exemple, Thermococcus kodakarensis), cbbL (par exemple, Elaloferax sp.).
On connaît deux classes de PRKs : les enzymes de classe I qui se rencontrent chez les protéobactéries sont des octamères, tandis que celles de classe II qui se trouvent chez les cyanobactéries et chez les plantes sont des tétramères ou des dimères. Selon l’organisme, les gènes codant pour une PRK peuvent s’appeler prk (par exemple, Synechococcus elongatus), prkA (par exemple, Chlamydomonas reinhardtiï), prkB (par exemple, Escherichia coli), prkl, prk2 (par exemple, Leptolyngbya sp.), cbbP (par exemple, Nitrobacter vulgaris) ou encore cfxP (par exemple, Cupriavidus necator).
Dans le cas où le microorganisme utilisé n’exprime pas naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, ledit microorganisme est modifié génétiquement pour exprimer une RuBisCO et une PRK hétérologues. Avantageusement, dans un tel cas, le microorganisme est transformé de manière à intégrer dans son génome une ou plusieurs cassettes d’expression intégrant les séquences codant pour lesdites protéines, et avantageusement les facteurs transcriptionnels appropriés. Selon le type de RuBisCO à exprimer, il peut être nécessaire de faire également exprimer par le microorganisme une ou des protéines chaperonnes, afin de favoriser le bon assemblage des sous-unités formant la RuBisCO. C’est le cas notamment pour la RuBisCO de type I, où l’introduction et l’expression de gènes codant pour une chaperonne 5 spécifique (Rbcx) et des chaperonnes généralistes (GroES et GroEL, par exemple) s’avèrent nécessaire pour obtenir une RuBisCO fonctionnelle. La demande WO2015/107496 décrit en détail comment modifier génétiquement une levure pour qu’elle exprime une RuBisCO de type I et une PRK fonctionnelles. H est également possible de se référer à la méthode décrite dans GUADALUPE-MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013).
Dans un mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type I. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type II. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type III.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d’exemples, des séquences codant pour des 15 RuBisCO et PRK qui peuvent être utilisées pour transformer un microorganisme de manière à ce qu’il exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles.
Tableau 1 : Exemples de séquences codant pour une RuBisCO
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
rbcL | BAD78320.1 | 56685098 | Synechococcus elongatus |
rbcS | BAD78319.1 | 56685097 | Synechococcus elongatus |
cbbL2 | CAJ96184.1 | 113529837 | Cupriavidus necator |
cbbS | P09658.2 | 6093937 | Cupriavidus necator |
cbbM | P04718.1 | 132036 | Rhodospirillum rubrum |
cbbM | Q21YM9.1 | 115502580 | Rhodoferax ferrireducens |
cbbM | Q479W5.1 | 115502578 | Dechloromonas aromatica |
rbcL | 093627.5 | 37087684 | Thermococcus kodakarensis |
cbbL | CQR50548.1 | 811260688 | Haloferax sp. Arc-Hr |
Tableau 2 : Exemples de séquences codant pour une PRK
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
Prk | BAD78757.1 | 56685535 | Synechococcus elongatus |
cfXP | P19923.3 | 125575 | Cupriavidus necator |
PRK | P09559.1 | 125579 | Spinacia oleracea |
cbbP | P37100.1 | 585367 | Nitrobacter vulgaris |
Inhibition de la glycolyse
Selon l’invention, la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, de sorte que le microorganisme n’est plus en mesure d’utiliser normalement cette voie métabolique (figure 1 glycolyse). Autrement dit, le microorganisme n’a plus la capacité d’assimiler le glucose de manière similaire à un microorganisme sauvage, dans lequel la voie de la glycolyse n’a pas été inhibée (indépendamment de toute autre modification génétique).
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber, totalement ou partiellement, la glycolyse en aval de la production de glycéraldéhyde- 3 -pho sphate (G3 P).
Par exemple, la glycolyse est inhibée en amont de la production de 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG) ou en amont de la production de 3-phosphoglycérate (3PG).
Selon le microorganisme, les réactions impliquées entre le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le 3-phosphoglycérate (3PG) peuvent être prises en charge (i) par deux enzymes agissant de façon concomitante, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (EC 1.2.1.12, abréviée GAPDH ou plus rarement G3PDH) et la phosphoglycérate kinase (E.C. 2.7.2.3, abréviée PGK), ou bien (ii) par une seule enzyme de type glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase non phosphorylante (EC 1.2.1.9, abréviée GAPN).
La glycéraldéhyde-3-pho sphate déshydrogénase (GAPDH) catalyse la conversion réversible du G3P en 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG), en utilisant le couple NAD+/NADH comme donneur/accepteur d’électron selon le sens de la réaction. Selon l’organisme les gènes codant pour la GAPDH peuvent s’appeler gapA, gapB, gapC (e.g. Escherichia coli, Arabidopsis thaliana), GAPDH, GAPD, G3PD, GAPDHS (e.g. Homo sapiens), TDH1, TDH2, TDH3 (e.g. Saccharomyces cerevisiae), gap, gap2, gap3 (e.g. Mycobacterium sp., Nostoc sp.).
La phosphoglycérate kinase (PGK) catalyse la conversion réversible du 1,3-BPG en 3PG, en utilisant le couple ATP/ADP comme cofacteur. Selon l’organisme, les gènes codant pour la PGK peuvent s’appeler PGK, PGK1, PGK2, PGK3, pgkA, PGKB, PGKC, cbbK, cbbKC, cbbKP (e.g. Cupriavidus necator).
La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non-phosphorylante (GAPN) catalyse la conversion du G3P en 3PG, sans passer par l’intermédiaire 1,3-BPG. Cette réaction est catalysée en présence du couple de cofacteur NADP+/NADPH qui joue le rôle d’accepteur d’électron. Selon l’organisme les gènes codant pour la GAPN peuvent s’appeler GAPN (e.g. Bacillus sp., Streptococcus sp.), GAPN1 (e.g. Chlamydomonas sp.).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, l’expression du gène codant la phosphoglycérate kinase peut également être au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase nonphosphorylante soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 3, 4 et 5 ci-dessous listent, à titre d’exemples, les séquences codant une glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, une phosphoglycérate kinase et une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non-phosphorylante qui peuvent être inhibés en fonction du microorganisme cible. L’homme du métier sait quel gène correspond à l’enzyme d’intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 3 : Exemples de séquences codant pour une GAPDH
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
gapA | NP 416293.1 | 16129733 | Escherichia coli |
TDH1 | NP_012483.3 | 398364523 | Saccharomyces cerevisiae |
TDH2 | NP 012542.1 | 6322468 | Saccharomyces cerevisiae |
TDH3 | NP_011708.3 | 398366083 | Saccharomyces cerevisiae |
gap | CCE36949.1 | 378544675 | Mycobacterium tuberculosis |
gap2 | P34917.2 | 92090599 | Nostoc sp |
Tableau 4 : Exemples de séquences codant pour une PGK
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
Pgk | AKL94701.1 | 831186507 | Clostridium aceticum |
PGK1 | NP 009938.2 | 10383781 | Saccharomyces cerevisiae |
Pgk | BAG04189.1 | 166089481 | Microcystis aeruginosa |
PGKA | AAG34561.2 | 22711882 | Dictyostelium discoideum |
PGKB | CAJ03534.1 | 68126221 | Leishmania major |
cbbKC | AAC43444.1 | 976365 | Cupriavidus necator |
Tableau 5 : Exemples de séquences codant pour une GAPN
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
gapN | CUB58597.1 | 924094571 | Bacillus subtilis |
GAPN | NP 358622.1 | 933338 | Streptococcus pneumoniae |
GAPN1 | EDP03116.1 | 542583 | Chlamydomonas reinhardtii |
D’une manière générale, la production de 3-phosphoglycérate (3PG) n’est plus possible par le biais de la glycolyse, ou au moins fortement diminuée, dans le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l’expression du gène TDH1 (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID : 853465) et/ou TDH3 (Gene ID : 853106) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l’expression du gène PGK1 (Gene ID : 5230) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation, le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l’expression du gène PGK1 (Gene ID : 5230), l’expression du gène TDH1 (Gene ID: 853395), TDH2 (Gene ID : 853465) et/ou l’expression du gène TDH3 (Gene ID : 853106) sont au moins partiellement inhibées.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie de genre Escherichia coli dans laquelle l’expression du gène gapA (Gene ID : 947679) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie de genre Escherichia coli dans laquelle l’expression du gène pgk (Gene ID : 947414) est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation, le microorganisme est une bactérie de genre E. coli dans laquelle l’expression du gène pgk (Gene ID : 947414), et/ou l’expression du gène gapA (Gene ID : 947679) sont au moins partiellement inhibées.
Selon l’invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, est par contre apte à produire du 3PG par capture du CO2, à partir du ribulose-5-phosphate produits par la voie des pentoses phosphates (figure 2).
Les enzymes nécessaires à la métabolisation du 3PG en pyruvate n’étant pas inhibées dans le microorganisme, ledit microorganisme peut alors métaboliser le 3PG de manière à produire du pyruvate et de l’ATP.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié est apte à produire du pyruvate et des cofacteurs NADPH en utilisant du CO2 comme source de carbone complémentaire.
Dans le contexte de l’invention, on entend par source de carbone « complémentaire », le fait que le microorganisme utilise le CO2 comme source de carbone partielle, en complément des carbones fournis par des sucres fermentescibles (glucose, galactose, saccharose, fructose, etc.), qui constituent la source de carbone majoritaire, ou principale, pour la production de pyruvate.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention permet d’augmenter le rendement carbone, en fixant et en utilisant le CO2 normalement perdu lors du métabolisme du glucose par la voie des pentoses phosphates, pour la production de pyruvate (et par la suite de molécules d’intérêt).
Inhibition de branche oxydative de la voie des pentoses phosphates
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est également modifié de manière à ce que la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates soit également au moins partiellement inhibée.
Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5phosphate (figure 1 - voie des pentoses phosphates).
L’interruption de la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5-phosphate (Ru5P) cible spécifiquement une ou plusieurs réactions dans le processus de synthèse du Ru5P à partir de glucose-6-phosphate (G6P). Cette synthèse est généralement catalysée par les actions successives de trois enzymes : (i) la glucose-6phosphate déshydrogénase (EC. 1.1.1.49, abréviée G6PDH), (ii) la 6-phosphogluconolactonase (E.C. 3.1.1.31, abréviée PGL), et (iii) la 6-phosphogluconate déshydrogénase (EC 1.1.1.44, abréviée PGD).
La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) catalyse la première réaction de la voie des pentoses phosphates, c’est-à-dire l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6phosphogluconolactone, avec réduction concomitante d'une molécule de NADP+ en NADPH. Selon l’organisme les gènes codant pour la G6PDH peuvent s’appeler G6PD (par exemple chez Homo sapiens), G6pdx (par exemple chez Mus musculus), gsdA (par exemple chez Aspergillus nidulans), zwf (par exemple chez Escherichia coli), ou encore ZWL1 (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae).
La 6-phosphogluconolactonase (PGL) est une hydrolase catalysant la synthèse de 6phosphogluconate (6PGA) à partir de 6PGL. Selon l’organisme les gènes codant pour la PGL peuvent s’appeler pgl (par exemple chez Escherichia coli, Synechocystis sp.) pgls (par exemple chez Rhodobacteraceae bacterium), ou encore SOL (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae).
La 6-phosphogluconate déshydrogénase (PGD) est une oxidoréductase catalysant la synthèse de Ru5P à partir de 6PGA, avec réduction concomitante d'une molécule de NADP+ en NADPH et émission d’une molécule de CO2. Selon l’organisme, les gènes codant pour la PGD peuvent s’appeler gnd (par exemple chez Escherichia coli,_Saccharomyces cerevisiae), PGD (par exemple chez Homo sapiens), gntZ (par exemple chez Bacillus subtilis), ou encore 6-PGDH (par exemple chez Lactobacillus paracollinoides).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la glucose-6-phosphate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la 6-phosphogluconolactonase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la 6-phosphogluconate déshydrogénase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 6, 7 et 8 ci-dessous listent, à titre d’exemples, les séquences codant une glucose6-phosphate déshydrogénase, une 6-phosphogluconolactonase et 6-phosphogluconate déshydrogénase qui peuvent être inhibés en fonction du microorganisme cible. L’homme du métier sait quel gène correspond à l’enzyme d’intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 6 : Exemples de séquences codant pour une G6PDH
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
zwf | BAA15660.1 | 1736495 | Escherichia coli |
ZWF1 | NP 014158.1 | 6324088 | Saccharomyces cerevisiae |
gsdA | CAA54841.1 | 1523786 | Aspergillus nidulans |
Tableau 7 : Exemples de séquences codant pour une PGL
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
pgi | BAA35431.1 | 4062334 | Escherichia coli |
pgi | BAK51770.1 | 339275283 | Synechocystis |
Pgls | KPQ07176.1 | 938272062 | Rhodobacteraceae bacterium |
S0L3 | KZV10901.1 | 1023943655 | Saccharomyces cerevisiae |
Tableau 8 : Exemples de séquences codant pour une PGD
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
gnd | ALI40222.1 | 937519736 | Escherichia coli |
GND1 | EDN62420.1 | 151944127 | Saccharomyces cerevisiae |
gntZ | NP 391888.1 | 16081060 | Bacillus subtilis |
6-PGDH | WP 054711110.1 | 938929230 | Lactobacillus paracollinoides |
D’une manière générale, la production de ribulose-5-phosphate (Ru5P) n’est plus possible par le biais des pentoses phosphates, ou au moins fortement diminuée, dans le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure du genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l’expression du gène ZWF1 est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la levure du genre Saccharomyces cerevisiae est génétiquement modifiée de manière à ce que l’expression des gènes TDH1, TDH2, TDH3 et/ou PGK1, et l’expression du gène ZWF1 soient au moins partiellement inhibées.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l’expression du gène zwf est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la bactérie du genre Escherichia coli est génétiquement modifiée de manière à ce que l’expression des gènes gapA et/ou pgk, et l’expression du gène zwf soient au moins partiellement inhibées. Selon l’invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la voie de la glycolyse et la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates sont au moins partiellement inhibées n’est plus apte à produire du 3PG par la voie de la glycolyse ni du Ru5P par la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates. Il est par contre apte à produire du Ru5P en déviant la production de fructose-6-phosphate (F6P) et/ou glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P), produits en début de glycolyse (en amont de l’inhibition). Cette production est notamment possible grâce aux enzymes transketolase (EC 2.2.1.1), transaldolase (EC 2.2.1.2), ribose-5-phosphate isomérase (EC 5.3.1.6), etribulose-5-phosphate épimérase (EC 5.1.3.1) naturellement présentes et actives chez les microorganismes (figure 3).
Les enzymes nécessaires à la métabolisation du 3PG en pyruvate n’étant pas inhibées dans le microorganisme selon l’invention, ledit microorganisme peut alors métaboliser le 3PG de manière à produire du pyruvate et de ΓΑΤΡ.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié est apte à produire du pyruvate en utilisant du CO2 exogène comme source de carbone complémentaire.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention permet d’augmenter le rendement carbone, en fixant et en utilisant du CO2 exogène, pour la production de pyruvate (et par la suite de molécules d’intérêt). Là encore, il y a augmentation du rendement carbone.
Inhibition de la voie d’Entner-Doudoroff
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention a une voie d’Entner-Doudoroff, et celle-ci est en au moins partiellement inhibée. Cette voie, principalement retrouvée chez les bactéries (notamment de type Gram-), est une alternative à la glycolyse et à la voie des pentoses pour la production de pyruvate à partir de glucose. Plus précisément, cette voie se branche sur la voie des pentoses phosphates au niveau du P-gluconate pour alimenter la glycolyse au niveau notamment du pyruvate.
Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber les réactions de la voie d’Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate. Cette inhibition permet d’éliminer une possible voie compétitrice, et d’assurer la disponibilité du 6phosphogluconate comme substrat pour l’ingénierie PRK/RuBisCO.
L’interruption de la voie d’Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate cible spécifiquement une ou plusieurs réactions dans le processus de synthèse du pyruvate à partir de 6-phosphogluconate. Cette synthèse est initiée par les actions successives de deux enzymes: (i) la 6-phosphogluconate déshydratase (« EDD » - EC. 4.2.1.12), et (ii) la 2déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase (« EDA » - E.C. 4.1.2.14).
La 6-phosphogluconate déshydratase catalyse la déshydratation du 6-phosphogluconate en 2céto-3-désoxy-6-phosphogluconate. Selon l’organisme, les gènes codant pour la 6phosphogluconate déshydratase peuvent s’appeler edd (GenBank NP_416365, par exemple, chez Escherichia coli), ou ilvD (par exemple, chez Mycobacterium sp.\
La 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase catalyse la synthèse d’une molécule de pyruvate et d’une molécule de glycéraldéhyde-3-phosphate à partir du 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate produit par la 6-phosphogluconate déshydratase. Selon l’organisme, les gènes codant pour la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase peuvent s’appeler eda (GenBank NP_416364, par exemple, chez Escherichia coli), ou kdgA (par exemple chez Thermoproteus tenax), ou dgaL (par exemple chez Salmonella typhimurium).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la 6-phosphogluconate déshydratase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l’expression du gène codant la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l’expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 9 et 10 ci-dessous listent, à titre d’exemples, les séquences codant une 6phosphogluconate déshydratase et une 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase qui peuvent être inhibés en fonction du microorganisme cible. L’homme du métier sait quel gène correspond à l’enzyme d’intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 9 : Exemples de séquences codant pour une EDD
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
edd | NP 416365.1 | 16129804 | Escherichia coli |
ilvD | CND70554.1 | 893638835 | Mycobacterium tuberculosis |
edd | AJQ65426.1 | 764046652 | Salmonella enterica |
Tableau 10 : Exemples de séquences codant pour une EDA
Gène | GenBank | Gl | Organisme |
eda | AKF72280.1 | 817591701 | Escherichia coli |
kdgA | Q704D1.1 | 74500902 | Thermoproteus tenax |
eda | 068283.2 | 81637643 | Pseudomonas aeruginosa |
D’une manière générale, dans ce mode de réalisation, la production de pyruvate n’est plus possible par le biais de la voie Entner-Doudoroff, ou au moins fortement diminuée.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l’expression du gène edd est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la bactérie du genre Escherichia coli est génétiquement modifiée de manière à ce que l’expression des gènes gapA, et edd soient au moins partiellement inhibées.
Selon l’invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la voie de la glycolyse et la voie Entner-Doudoroff sont au moins partiellement inhibées n’est plus apte à produire du 3PG par la voie de la glycolyse ni du pyruvate par la voie Entner-Doudoroff. Le flux de carbone à partir du glucose est par conséquent orienté de façon préférentielle vers l’ingénierie PRK/RuBisCO.
Production de molécules d’intérêt
Selon l’invention, le microorganisme génétiquement modifié est transformé de manière à produire une molécule exogène d’intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d’intérêt.
D’une manière générale, les modifications génétiques apportées au microorganisme, telles qu’exposées ci-dessus, permettent d’améliorer le rendement carbone des voies de synthèse et/ou de bioconversion de molécules d’intérêt.
Dans le contexte de l’invention, un rendement « amélioré » s’entend en termes de quantité de produit fini. D’une manière générale, le rendement carbone correspond dans le contexte de l’invention au ratio quantité de produit fini / quantité de sucre fermentescible, notamment en poids. Selon l’invention, le rendement carbone est augmenté chez les microorganismes génétiquement modifiés selon l’invention, comparativement aux microorganismes sauvages, placés dans des conditions de culture identiques. Avantageusement, le rendement carbone est augmenté de 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, ou plus. Le microorganisme génétiquement modifié selon l’invention peut produire une plus grande quantité des molécules d’intérêt (produit fini) comparativement aux molécules hétérologues produites par un microorganisme modifié génétiquement simplement pour produire ou surproduire cette molécule. Selon l’invention, le microorganisme génétiquement peut également surproduire une molécule endogène comparativement au microorganisme sauvage. La surproduction d’une molécule endogène s’entend principalement en termes de quantités. Avantageusement, le microorganisme génétiquement modifié produit au moins 20%, 30%, 40%, 50%, ou plus en poids de la molécule endogène que le microorganisme sauvage. Avantageusement, le microorganisme selon l’invention est génétiquement modifié de manière à produire ou surproduire au moins une molécule parmi les acides aminés, les terpénoïdes, les terpènes, les vitamines et/ou précurseurs de vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les acides organiques, les polyols, les polyamines, les molécules aromatiques obtenues à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, etc.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour surproduire au moins un acide aminé, préférentiellement choisi parmi l’arginine, la lysine, la méthionine, la thréonine, la proline, le glutamate, l’homosérine, l’isoleucine et la valine.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire des molécules de la voie des terpénoïdes, tel que le famésène, et de la voie des terpènes.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une vitamine ou un précurseur, préférentiellement choisi parmi le pantoate, pantothenate, transneurosporène, phylloquinone et tocophérols.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un stérol, préférentiellement choisi parmi le squalène, cholestérol, testostérone, progestérone et la cortisone.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un flavonoïde, préférentiellement choisi parmi la frambinone et la vestinone.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un acide organique, préférentiellement choisi parmi l’acide coumarique, l’acide 3hydroxypropionique et l’acide citrique.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyol, préférentiellement choisi parmi le sorbitol, xylitol et le glycérol.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyamine, préférentiellement de la spermidine.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une molécule aromatique à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, préférentiellement choisie parmi les phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones.
Dans le cas où la molécule d’intérêt est obtenue par bioconversion, le microorganisme génétiquement modifié est avantageusement mis en culture dans un milieu de culture comprenant le substrat à convertir. D’une manière générale, la production ou surproduction d’une molécule d’intérêt par un microorganisme génétiquement modifié selon l’invention est obtenue par mise en culture dudit microorganisme dans un milieu de culture approprié, connu de l’homme du métier.
Le terme « milieu de culture approprié » désigne d’une manière générale un milieu de culture stérile apportant les nutriments essentiels ou bénéfiques à la maintenance et/ou à la croissance dudit microorganisme, tels que les sources carbonées ; les sources azotées telles que le sulfate d’ammonium ; les sources de phosphores, par exemple, le potassium phosphate monobasique ; les oligo-éléments, par exemple, les sels de cuivre, d’iodure, de fer, de magnésium, de zinc ou de molybdate ; les vitamines et autres facteurs de croissance tels que des acides aminés ou autres promoteurs de croissance. Un antimousse peut être ajouté selon les besoins. Selon l’invention, ce milieu de culture approprié peut être chimiquement défini ou complexe. Le milieu de culture peut ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu synthétique, tel que défini par Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8:501-17), adapté par Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81), ou commercialement disponible tel que le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals ou Sigma-Aldrich).
Notamment, le milieu de culture peut comprendre une source de carbone simple, telle le glucose, le galactose, le saccharose, les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres, éventuellement supplémentée en CO2 comme co-substrat carboné. Selon la présente invention, la source de carbone simple doit permettre la croissance normale du microorganisme d’intérêt, b est également possible, dans certains cas, d’utiliser une source de carbone complexe, telle que de la biomasse lignocellulosique, de la paille de riz, ou de l’amidon. L’utilisation d’une source de carbone complexe nécessite généralement un prétraitement avant utilisation.
Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient au moins une source de carbone parmi les monosaccharides tels que le glucose, le xylose ou l’arabinose, les disaccharides tels que le saccharose, les acides organiques tels que l’acétate, le butyrate, le propionate ou le valérate afin de favoriser différentes sortes de polyhydroxyalcanoate (PHA), du glycérol traité ou non-traité.
En fonction des molécules à produire et/ou surproduire, il est possible de jouer sur l’apport en facteur nutritionnels (N, O, P, S, K+, Mg2+, Fe2+, Mn, Co, Cu, Ca, Sn ; Koller et al., Microbiology Monographs, G.-Q. Chen, 14: 85-119, (2010)). C’est le cas notamment pour favoriser la synthèse et l’accumulation intracellulaire de PHA dont le PHB.
Selon l’invention, tout mode de culture permettant la production à l’échelle industrielle de molécules d’intérêt peut être envisagé. Avantageusement, la culture se fait en bioréacteurs, notamment en mode batch, fed-batch et/ou culture continue. Préférentiellement, la conduite de culture associée à la production de la molécule d’intérêt est en mode fed-batch correspondant à une alimentation contrôlée en un ou plusieurs substrats, par exemple via l’ajout d’une solution concentrée en glucose dont la concentration peut être comprise entre 200 g.L-1 et 700 g.L-1. Une alimentation contrôlée en vitamines au cours du procédé peut également être bénéfique à la productivité (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60:67-72). H est également possible d’ajouter une solution de sels d’ammonium pour limiter l’apport azoté.
La fermentation est généralement conduite en bioréacteurs, avec de possibles étapes de précultures solides et/ou liquides en Erlenmeyers, avec un milieu de culture approprié contenant au moins une source de carbone simple et/ou un apport de CO2 exogène, nécessaire à la production de la molécule d’intérêt.
D’une manière générale, les conditions de culture des microorganismes selon l’invention sont aisément adaptables par l’homme du métier, en fonction du microorganisme et/ou de la molécule à produire/surproduire. Par exemple, la température de culture est notamment comprise pour les levures entre 20°C et 40°C, de préférence entre 28°C et 35°C, et plus particulièrement d’environ 30°C pour S.cerevisiae. La température de culture est notamment comprise entre 25°C et 35°C, de préférence 30°C pour Cupriavidus necator.
L’invention a donc également pour objet rutilisation d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’invention, pour la production ou la surproduction d’une molécule d’intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
L’invention a aussi pour objet un procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d’intérêt, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise en culture d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d’intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la synthèse de ladite molécule d’intérêt.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion de ladite molécule d’intérêt.
L’invention a aussi pour objet un procédé de production d’une molécule d’intérêt comprenant (i) l’insertion d’au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d’intérêt dans un microorganisme recombinant selon l’invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l’expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
Par exemple, il est possible de faire surproduire du citrate par un champignon, notamment un champignon filamenteux, tel cyP Aspergillus niger, génétiquement modifié pour exprimer une PRK et une RuBisCO fonctionnelles, et dans lequel l’expression des gènes pgk (Gene ID : 4982539) et gsdA (Gene ID : 4979751) est au moins partiellement inhibée.
De même, il est possible de faire produire du farnésène par une levure telle qu’une levure du genre Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO fonctionnelles, une farnésène synthase et dans laquelle l’expression d’un gène PGK1 (Gene ID : 5230) est au moins partiellement inhibée.
Il est également possible de faire surproduire du glutamate par une bactérie, telle qu’une bactérie du genre Escherichia coli, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO fonctionnelles, et dans laquelle l’expression du gène gapA (Gene ID : 947679) est au moins partiellement inhibée.
EXEMPLES
Exemple 1: Analyse bio-informatique
a) Calcul de rendements théoriques
i) Comparaison des rendements de fixation de carbone à partir de glucose entre une souche sauvage utilisant la voie des pentoses phosphates et la glycolyse, et une souche modifiée selon l’invention
Afin d’évaluer le bénéfice apporté par les modifications décrites selon l’invention, des calculs de rendements théoriques ont été réalisés sur la base de la stœchiométrie des réactions impliquées.
Deux cas de figure ont été analysés : l’amélioration apportée par l’ingénierie PRK-RuBisCO (i) dans une souche inhibée pour la glycolyse sur le rendement d’une voie de biosynthèse NADPH-dépendante (par exemple, synthèse de farnésène), et (ii) dans une souche inhibée pour la glycolyse et pour la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates sur le rendement d’une voie de biosynthèse d’intérêt (par exemple, synthèse de citrate).
Dans le cadre de l’amélioration des voies de biosynthèse NADPH-dépendante, le bilan théorique de la formation de NADPH et de glycéraldéhyde-3-phosphate (G3-P) à partir de glucose par la voie des pentoses phosphates a été calculé selon l’équation ci-dessous (1) :
(1) 3 Glucose + 5 ATP + 6 NADP+ + 3 H2O 5 G3-P + 5 ADP+ 6 NADPH + 11H+ + 3 CO2
En descendant jusqu’à la formation de pyruvate à partir de G3P, on arrive au bilan suivant :
(2) 3 Glucose + 5 ADP + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5Pi 5 Pyruvate + 5 ATP+ 6 NADPH + 5 NADH + 11H+ + 3 CO2 + 2 H2O
Si on normalise le bilan pour une mole de glucose, on obtient le rendement suivant :
(3) Glucose + 1.67 ADP + 2 NADP+ + 1.67 NAD+ + 1.67 Pi 1.67 Pyruvate + 1.67 ATP+ 2 NADPH + 1.67 NADH + 3.67 H+ + CO2+ 0.67 H2O
Ainsi, en utilisant par la voie des pentoses phosphates, 1.67 moles de pyruvate et 2 moles de NADPH sont produites à partir d’une mole de glucose. Une mole de carbone est par contre perdue par décarboxylation, lors de la formation de ribulose-5-phosphate par la 6 phosphogluconate déshydrogénase (EC 1.1.1.44). En comparaison, la formation de pyruvate par la voie de la glycolyse donne le rendement suivant :
(4) Glucose + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi 2 Pyruvate + 2 ATP+ 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
Le rendement maximum théorique de production de pyruvate par la voie des pentoses phosphates est par conséquent de 0.82 gpyruvate/ggiucose (g de pyruvate synthétisé, par g de glucose consommé), alors qu’il est de 0.98 gpyruvate/ggiucose par la voie de la glycolyse.
En intégrant l’ingénierie PRK/RuBisCO dans une souche inhibée pour la glycolyse (par exemple APGKl dans le cadre de la levure S. cerevisiae), le flux de fixation de carbone est redirigé vers la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates, puis vers l’ingénierie PRK/RuBisCO (cf. figure 2). Ce flux se rattache à la fin de la voie de la glycolyse, au niveau de la formation de 3-phosphoglycérate (3PG), avec le rendement suivant :
(5) Glucose + 2 ATP + 2 NADP+ + 2 H2O 2 3PG + 2 ADP + 2 NADPH + 6 H+
En descendant jusqu’à la formation de pyruvate à partir de 3PG, on arrive au bilan suivant :
(6) Glucose + 2 NADP+ 2 Pyruvate + 2 NADPH + 4 H+
L’intégration des modifications selon l’invention dans un microorganisme permet de récupérer la molécule de carbone autrement perdue par la décarboxylation dans la voie des pentoses. Le rendement maximum théorique de fixation de carbone est par conséquent de 0.98 gpyruvate/ggiucose, ce qui permet d’améliorer de 20.5% le rendement obtenu par la production de pyruvate par la voie des pentoses phosphates, tout en produisant du NADPH.
Dans un second cas de figure (cf. figure 3), l’ingénierie PRK/RuBisCO est intégrée dans une souche à la fois inhibée pour la glycolyse (par exemple APGKl dans le cadre de la levure S. cerevisiae), et pour la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates (par exemple AZWFl dans le cadre de la levure S. cerevisiae). Le bilan théorique de la formation de NADPH et de 3-phosphoglycérate (3PG) à partir de glucose devient alors (7) 2.5 Glucose + 6 ATP + 3 CO2 + 3 H2O 6 3PG + 6 ADP + 12 H+
En descendant jusqu’à la formation de pyruvate à partir de 3PG, on arrive au bilan suivant (8) 2.5 Glucose + 3 CO2 —> 6 Pyruvate+ + 3 H2O + 6 H+
Si on normalise le bilan pour une mole de glucose, on obtient le rendement suivant :
(9) Glucose + 1.2 CO2 2.4 Pyruvate + 1.2 H2O + 2.4 H+
L’intégration des modifications selon l’invention permet de fixer 1.2 molécule de carbone supplémentaire par mole de glucose consommée. Le rendement maximum théorique correspondant est de 1.17 gpyruvate/ggiucose, soit ca. 20 % d’amélioration comparé au rendement de fixation de carbone de la glycolyse.
ii) Application à la production de citrate
Dans un second cas de figure, on applique le calcul à la production de citrate chez la levure S. cerevisiae, dans une souche sauvage et dans une souche modifiée selon l’invention intégrant une ingénierie PRK/RuBisCO et délétée pour le gène PGK1 de façon à inhiber la voie de la glycolyse, et pour le gène ZWF1 pour inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses.
La production de citrate à partir de pyruvate se résume par l’équation bilan suivante :
(11) 2 Pyruvate + ATP + NAD+ + 3 H2O + HCO3 Citrate + ADP + NADH + CO2 + Pi + 2H+
Cette synthèse ne nécessite pas de NADPH, mais 2 moles de pyruvate. De façon optimale, une souche sauvage obtient ces 2 moles de pyruvate par la glycolyse, à partir d’une mole de glucose d’après l’équation (4), avec le bilan suivant :
(12) Glucose + ADP + 3 NAD+ + Pi + 2 H2O Citrate + ATP+ 3 NADH + 5 H+
Le rendement gcitrate/ggiucose correspondant est de 1.07
Dans le cadre d’une souche modifiée selon l’invention, inhibée pour la voie de la glycolyse et la voie des pentoses phosphates, les 2 pyruvates nécessaires sont obtenus avec seulement 0.83 mole de glucose (cf. équation 9), avec le bilan suivant :
(13) 0.83 Glucose + CO2 + ATP + NAD+ + 3 H2O Citrate + ADP+ NADH + Pi + 5 H+
Le rendement gcitrate/ggiucose correspondant est de 1.28, soit une augmentation théorique maximale d’environ 20 % par rapport au rendement de la souche sauvage.
b) Simulation de rendements de biosynthèse par analyse de balance de flux
Dans une approche bio-informatique, des analyses de type « Analyse de balance de flux » (ABF) ont également été réalisées pour simuler l’impact des modifications décrites selon l’invention sur le rendement de différentes voies de biosynthèse.
Les ABF reposent sur des modèles mathématiques permettant de simuler des réseaux métaboliques à l’échelle d’un génome (Orth et al., Nat Biotechnol. 2010 ; 28: 245-248). Les réseaux reconstruits contiennent les réactions métaboliques connues d’un organisme donné et intègrent les besoins de la cellule, pour assurer notamment la maintenance cellulaire, ou la croissance. Les ABF permettent de calculer le flux des métabolites au travers de ces réseaux, permettant de prédire des taux de croissance théoriques ainsi que des rendements de productions de métabolites.
z) Procédure
Les simulations ABF ont été réalisées avec le logiciel OptFlux (Rocha et al., BMC Syst Biol. 2010 Apr 19;4:45. doi: 10.1186/1752-0509-4-45), et le modèle métabolique de Saccharomyces cerevisiae ÎMM904 (Mo et al., BMC Syst Biol. 2009 Mar 25;3:37. doi: 10.1186/1752-0509-337). Ce modèle a été modifié pour inclure les améliorations décrites selon l’invention, notamment une voie hétérologue de fixation de CO2 avec (i) ajout d’une réaction de type PRK, (ii) ajout d’une réaction de type RuBisCO.
Dans des exemples de réalisation particuliers, les réactions nécessaires pour simuler la production de molécules par des voies hétérologues ont également été ajoutées au modèle.
Dans un exemple de réalisation particulier, une réaction de type farnésène synthase (EC 4.2.3.46 ou EC 4.2.3.47) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue de farnésène.
Dans un second exemple de réalisation particulier, les réactions de type acetoacetyl-CoA réductase (EC 1.1.1.36), et poly-3-hydroxybutyrate synthase (EC 2.3.1.B2 ou 2.3.1.B5), ont été rajoutées au modèle pour simuler une voie de production hétérologue de β-hydroxyburyrate, le monomère du polyhydroxybutyrate. Les simulations ont été réalisées en appliquant au modèle un ensemble de contraintes reproductibles par l’homme du métier, visant à simuler les conditions de culture in vivo d’une souche de S. cerevisiae dans les conditions décrites selon l’invention (par exemple, présence de glucose non limitante dans le milieu, condition de culture aérobie).
Dans des exemples de réalisation particuliers, les simulations sont réalisées en inactivant virtuellement les réactions des enzymes PGK1 (par exemple, glutamate, acide βhydroxybutyrique, famésène) et ZWF1 (par exemple, production de citrate), de façon à simuler les diminutions d’activité de la glycolyse et de la voie des pentoses phosphates, décrites selon 5 l’invention.
Les simulations sont réalisées en parallèle sur un modèle de type « souche sauvage », non modifié, de façon à évaluer l’impact des améliorations décrites selon l’invention sur le rendement de production des voies de biosynthèse testées.
ii) Résultats
Les rendements théoriques obtenus et les pourcentages d’amélioration apportés par l’invention sont décrits dans le tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 : Rendements de production maximums théoriques évalués par ABF sur une souche sauvage et une souche modifiée selon les modifications du brevet, pour la production de différentes molécules.
Molécule cible | Rendements de production maximums théoriques avec une souche sauvage | Rendements de production maximums théoriques avec une souche modifiée selon l'invention | Pourcentage d'amélioration du rendement massique théorique gx/gGLuc apporté par l'invention | ||||
MoIx/MoIgluc | CMolx/ CMoIgluc | gx/gGLUC | MoIx/MoIgluc | CMolx/ CMoIgluc | gx/gGLUC | ||
Citrate | 1 | 1 | 1.07 | 1.2 | 1.2 | 1.28 | + 20 % |
Glutamate | 0.92 | 0.77 | 0.75 | 1.09 | 0.91 | 0.89 | + 18.7 % |
Acide β- hydroxybutyrique | 0.92 | 0.61 | 0.53 | 1.09 | 0.73 | 0.63 | + 18.2 % |
Farnésène | 0.21 | 0.54 | 0.24 | 0.24 | 0.59 | 0.27 | +12.5 % |
MoIx/MoIgluc : moles de mo | écule X produites, rapportées aux moles de g | ucose consommées |
CMolx / CMoIgluc : moles de carbone de molécule X produites, rapportées aux moles de carbone de glucose consommées gx/gGLuc : g de molécule X produits, rapportés aux g de glucose consommés.
Exemple 2 : Amélioration de la production de farnésène chez S. cerevisiae
Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) est ingéniérée pour produire du NADPH sans perte de CO2 et ainsi permettre l’amélioration de la production d’alpha farnésène à partir de glucose.
a) Inactivation de la voie de la glycolyse
Pour cela, la voie de la glycolyse a été inactivée par délétion du gène PGK1. Une fois la glycolyse inhibée, la souche de levure obtenue n’est plus à même d’utiliser le glucose comme source de carbone et d’énergie. Il est donc nécessaire d’alimenter les voies de synthèse de biomasse par du glycérol et les voies énergétiques par de l’éthanol. Les souches délétées pour PGK1 sont cultivées sur YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol).
La délétion du gène PGK1 a été obtenue de la manière suivante :
La phase codante du gène de résistance au G418, issue de la cassette KanMX contenue sur le plasmide pUG6 (P30114) - Euroscarf a été amplifiée avec les oligonucléotides CB 101 (SEQ ID N°l) et CB 102 (SEQ ID N°2) :
SEQ ID N°1 : CB 101 (forward): 5’ACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGGG TAAGGAAAAGACTC ACGTTTC-3 ’
SEQ ID N°2 : CB102 (reverse): 5’GGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTAGA AAAACTCATCGAGCATCAAATGAAAC -3’
La partie soulignée des oligonucléotides est parfaitement homologue à la séquence KanMX et le reste de la séquence correspond aux régions adjacentes à la phase codante du gène PGK1 sur le génome de Saccaromyces cerevisiae de manière à générer un amplicon PCR contenant aux extrémités des séquences de recombinaison homologues du locus du gène PGK1.
Pour la réaction de transformation, la souche CEN.PK 1605 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose) à 30°C jusqu’à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 400 pl d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on a préparé un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 5 ou 10 pL de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 pl.
μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau.
Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 °C 200 tours par minute. Les cellules ont ensuite été centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 μΐ d’eau stérile et étalé sur YPGE+G418 180 pg/mL.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène PGK1 et référencées EQ-0134 (CEN.PK1605 ApgL7::kan).
b) Introduction des enzymes PRK-RuBisCO
Afin de reconstituer une voie alternative à la glycolyse et permettre à la souche Apgkl de pousser sur glucose, ladite souche a été modifiée de manière à permettre l’expression combinatoire :
• d’un gène codant pour une phosphoribulokinase PRK qui se greffe sur la voie des pentoses phosphates en consommant le ribulose-5P pour donner le ribulose-1.5bisP et • une RuBisCO de type I (avec les gènes structuraux RbcL et RbcS et les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL). La RuBisCO consomme le ribulose-1.5bisP et une mole de CO2 pour former le 3-phosphoglycerate en aval de la délétion PGK1 dans la voie de la glycolyse.
Cette voie alternative permet de nouveau à la souche de consommer le glucose comme source principale de carbone et d’énergie.
Pour produire de l’apha-farnésène, il manque à la levure le gène de l’alpha-farnésène synthase (AFS1; GenBank accession number AY182241).
Aussi, les sept gènes nécessaires à l’ingénierie PRK-RuBisCO (Tableau 12) ont été clonés sur trois vecteurs plasmidiques capables de se répliquer de manière autonome, avec des origines de réplication compatibles et portant chacun un gène de complémentation d’auxotrophies différents, permettant de sélectionner les souches contenant les trois constructions plasmidiques.
Deux de ces plasmides sont monocopies, avec une origine de réplication de type Ars/CEN et le troisième est multicopies avec une origine 2μ.
Tableau 12 : Description des cassettes d’expression et de la composition des plasmides
GenBank | Optimisa tion de codons | Promoteur | Termina teur | ori | Marqueur auxotrophie | Plasmides | |||
RbcL | BAD7832 0.1 | Oui | TDH3p | ADH1 | 2p | URA3 | pFPP 45 | pL4 | |
RbcS | BAD7831 9.1 | Oui | TEFlp | PGK1 | 2p | URA3 | pFPP 45 | pL4 | |
RbcX | BAD8071 1.1 | Oui | TEFlp | PGK1 | ARS- CEN6 | LEU2 | pFPP 56 | ||
GroES | U00096 | Non | PGIlp | CYC1 | ARS- CEN6 | LEU2 | pFPP 56 | ||
GroEL | AP009048 | Non | TDH3 | ADH1 | ARS- CEN6 | LEU2 | pFPP 56 | ||
PRK | BAD7875 7.1 | Oui | Tet-OFF | CYC1 | ARS41 6- CEN4 | TRP1 | pFPP 20 | ||
alphafarnésè ne synthas e | AY182241 | Oui | PGIlp | CYC1 | 2p | URA3 | pL4 | pL5 | |
Vide | Tet-OFF | CYC1 | ARS41 6- CEN4 | TRP1 | pCM 185 | ||||
Vide | ARS- CEN6 | LEU2 | pFL3 6 |
Les gènes issus de Synechococcus elongatus tels que RbcL, RbcS, RbcX et PRK (tels que décrits dans WO 2015107496 Al) et l’alpha-famésène synthase de Malus domestica (Tippmann et al., Biotechnol Bioeng. 2016 Jan;l 13(1):72-81) ont été optimisés pour rutilisation de codons chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Selon le protocole précédemment décrit, la souche EQ-0134 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C et avec le mix de transformation suivant 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL (3pg de d’une combinaison pFPP45+pFPP56+pFPP20 ou pL4+pFPP56+pFPP20 ou pL5+pFL36+pCM185) et de l'eau à 350 μΐ.
μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YNB (yeast without nitrogen base supplémenté en sulfate d’ammonium1, glycérol éthanol) complémenté avec un milieu commercial CSM (MP Biomedicals) adapté aux marqueurs de sélection, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 Le mix final est étalé sur YNB+sulphate d’ammonium+CSM - LUW (leucine uracile, tryptophane en glycérol éthanol.
Les clones obtenus ont été génotypés pour tous les gènes de l’ingénierie et adaptés sur milieu liquide YNB sulfate d’ammonium et glucose.
• EQ-0153 (CEN.PK1605 A^H::kan) (pFPP45+pFPP56+pFPP20) • EQ-0253 (CEN.PK1605 Apgkl::kan) (pL4+pFPP56+ pFPP20) • EQ-0353 (CEN.PK1605) (pL5+ pFL36+ pCM185)
Adaptation des souches EQ-0153 (PRK/RuBisCO/APGKl) et EQ-0253 (PRK/RuBisCO/APGKl + farnésène synthase) à la croissance sur milieu liquide YNB (yeast nitrogen base) avec glucose et CO2.
Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées avec le milieu de culture approprié et un apport de CO2 exogène de 10%, en incubateur agité (120 RPM, 30°C), avec une inoculation à 0.05 D.O.ôOOnm mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre EON (BioTek Instruments). La souche d’intérêt est cultivée sur milieu YNB+CSM-LUW avec 10 g/L de glycérol et 7,5 g/L d’éthanol, dans des conditions où l’expression de la PRK n’est pas induite. H est, dans ces conditions, nécessaire d’alimenter la souche en amont et en aval de la délétion du gène PGK1.
Après obtention d’une quantité de biomasse suffisante, des cultures d’un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250ml minimum sont ensemencées afin d’effectuer l’adaptation de la souche à Putilisation de l’ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture YNB+CSM-LUW avec 20 g/L de glucose et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus.
Après observation d’un démarrage de croissance significatif, les souches sont adaptées à un milieu minéral minimum exempt des acides aminés et base azoté inclus dans le CSM-LUW, soit uniquement du YNB avec 20 g/L de glucose et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus.
c) Production de farnésène en Erlenmeyers
La souche EQ-0253 de Saccharomyces cerevisiae, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène PGK1, est cultivée afin de produire du farnésène en surproduisant du NADPH sans perte de CO2, en utilisant une PRK et une RuBisCO.
Cette souche d’intérêt est comparée à une souche de référence EQ-0353 produisant du farnésène suite à l’introduction d’une farnésène synthase hétérologue, sans délétion de PGK1 ni ajout de PRK et RuBisCO. Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées dans les conditions décrites précédemment.
La concentration en farnésène est quantifiée à partir du surnageant de moûts de fermentation. Brièvement, les suspensions de cellules sont centrifugées à 5000rpm pour 5 minutes. La phase dodécane est diluée 10 fois dans de l’hexane et est injectée en GC-MS pour analyse selon le protocole décrit dans (Tippman et al. 2016).
Une augmentation de 10% en poids du rendement carbone (gramme de farnésène par gramme de glucose consommé) est observée pour la souche EQ-0253 en comparaison de la souche EQ0353.
Exemple 3 : Amélioration de la production de citrate chez S. cerevisiae
a) Inactivation du gène ZWF1 (chromosome : XIV ; position 196426 à 197943, brin complémentaire )
La phase codante du gène de résistance à l’hygromycine B, issue de la cassette hphMX (loxPpAgTEEl-hphMX-tAgTEEl-loxP) et contenue sur le plasmide pUG75 (P30671) - Euroscarf, est amplifiée avec les oligonucléotides Sdzwfl et Rdzwfl (Tableau 13). Cela permet de générer un amplicon PCR Azwfl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la glucose-6-phosphate déshydrogénase ZWL1.
Tableau 13 : Oligonucléotides
Nom | séquence |
Sdzwfl | AAGAGTAAATCCAATAGAATAGAAAACCACATAAGGCAAGATGGGTAAAAAGCCTGAACT |
(SEQ.ID N°3) | CACCG |
Rdzwfl | Al 1 1CAGTGACTTAGCCGATAAATGAATGTGCTTGCATTI 1 1 1 1ATTCCI 1 IGCCCTCGGAC |
(SEQ.ID N°4) | G |
Sdpgkl | ACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTI 1 1ACAACAAATATAAAACAATGGGTAAGGA |
(SEQ.ID N°5) | AAAGACTCACGTTTC |
Rdpgkl | GGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTAGAAAAACT |
(SEQ.ID N°6) | CATCGAGCATCAAATGAAAC |
Sdidhl | TCTCCCTATCCTCATTCTTCTCCCTTTTCCTCCATAATTGTAAGAGAAAAATGGGTACCACTC |
(SEQ.ID N°7) | TTGACGACACGG |
Rdidhl | AATTTGAACACACTTAAGTTGCAGAACAAAAAAAAGGGGAATTGTTTTCATTAGGGGCAG |
(SEQ.ID N°8) | GGCATGCTCATGTAGAGC |
La partie soulignée des oligonucléotides correspond à la partie parfaitement homologue à la séquence du gène de sélection, le reste de la séquence correspondant aux régions adjacentes à la phase codante du gène cible à détecter sur le génome de Saccaromyces cerevisiae.
La souche précédemment décrite CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl-289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIV00000000) est transformée avec le fragment PCR Azwfl décrit ci-dessus.
Pour la réaction de transformation, la souche CEN.PK 1605 est cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20g/L) à 30°C jusqu’à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 pl d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 pl.
μΐ des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPD (yeast extract peptone glucose), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 pl d’eau stérile et étalé sur YPD + HygromycineB 200 pg/mL.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène ZWF1 et référencées EQSC-002 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph).
b) Inactivation du gène IDH1 (Chromosome XIV ; position 557920 à 559002, brin complémentaire )
L’inactivation de ce gène permet d’accumuler du citrate (Rodriguez et al., Microb Cell Fact. 2016 Mar 3;15:48).
La phase codante du gène de résistance à la Nourseothricin, issue de la cassette natMX (loxPpAgTEFl-natMX-tAgTEFl-loxP) contenue sur le plasmide pUG74 (P30670) - Euroscarf est amplifiée avec les oligonucléotides Sdidhl et Rdidhl (tableau 13). Cela permet de générer un amplicon PCR didhl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la sous unité de l’isocitrate déshydrogénase IDH1.
La souche précédemment décrite EQSC-002 (CEN.PK 1605 Azwfl::/zp/z) est transformée avec le fragment PCR pour l’inactivation du gène IDH1.
Pour la réaction de transformation la souche EQSC-002 est cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20g/L) à 30°C jusqu’à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 pl d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 pl.
pl des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPD (yeast extract peptone glucose), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 pl d’eau stérile et étalé sur YPD + HygromycineB 200 pg/mL, 5Qpg/mL· Nourseothricin.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène IDH1 et nomment EQSC-003 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Aidhl::nat).
c) Inactivation du gène PGK1 (chromosome III, position 137746 à 138996, brin sens)
La phase codante du gène de résistance au G418 issue de la cassette KanMX (loxP-pAgTEElkanMX-tAgTEEl-loxP) contenue sur le plasmide pUG6 (P30114) - Euroscarf est amplifiée avec les oligonucléotides Sdpgkl et Rdpgkl (Tableau 13) permettant de générer un amplicon PCR Apgkl contenant aux extrémités des séquences de recombinaisons homologues du locus du gène de la 3-phosphoglycerate kinase PGK1.
La souche précédemment décrite EQSC-003 (CEN.PK 1605 Azwfl : :hph, Aidhl::nat) est transformée avec le fragment PCR pour Tinactivation du gène PGK1.
Pour la réaction de transformation la souche EQSC-002 est cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose, ici glucose 20g/L) à 30°C jusqu’à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 pl d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, on prépare un mix de transformation dans un tube de 2 ml comme suit: 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 pl.
pl des cellules remises en suspension sont ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube est centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant est jeté. Les cellules sont remises en suspension dans 2 mL de YPGE (yeast extract peptone glycérol 20g/L, éthanol 30g/L), transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 C 200 tours par minute. Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et resuspendues dans 100 pl d’eau stérile et étalé sur YPGE + HygromycineB 200 pg/mL, 5()μg/mL Nour.seolhricin, 150pg/mL G418.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène PGK1 et référencées EQSC-004 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Mdhl::nat, Apgkl::kan).et EQSC-005 (CEN.PK 1605 Mdhl::nat)
Les six gènes nécessaires à l’ingénierie PRK-RuBisCO (tableau 14 ci-dessous) sont clonés sur trois vecteurs plasmidiques capables de se répliquer de manière autonome, avec des origines de réplication compatibles et portant chacun un gène de complémentation d’auxotrophies différent, permettant de sélectionner les souches contenant les trois constructions plasmidique (voir WO 2015107496). Deux de ces plasmides sont monocopies avec une origine de réplication de type ARS/CEN et le troisième est multicopies avec une origine 2μ.
Tableau 14 : Description des cassettes d’expression et de la composition des plasmides
GenBank | Optimisation de codons | Promoteur | Termin ateur | ori | Marqueur auxotrophie | Plasmides | |
RbcL | BAD78320.1 | Oui | TDH3p | ADH1 | 2p | URA3 | pFPP45 |
RbcS | BAD78319.1 | Oui | TEFlp | PGK1 | 2p | URA3 | pFPP45 |
RbcX | BAD80711.1 | Oui | TEFlp | PGK1 | ARS-CEN6 | LEU2 | pFPP56 |
GroES | U00096 | Non | PGIlp | CYC1 | ARS-CEN6 | LEU2 | pFPP56 |
GroEL | AP009048 | Non | TDH3 | ADH1 | ARS-CEN6 | LEU2 | pFPP56 |
PRK | BAD78757.1 | Oui | Tet-OFF | CYC1 | ARS416- CEN4 | TRP1 | pFPP20 |
Vide | Tet-OFF | ARS416- CEN4 | TRP1 | pCM185 | |||
Vide | TEFlp | PGK1 | 2p | URA3 | V51TEF | ||
Vide | ARS-CEN6 | LEU2 | pFL36 |
Selon le protocole précédemment décrit la souche EQSC-004 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Aidhl::nat, ApgkI::kan) a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C et avec le mix de transformation suivant 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL (3pg) de d’une combinaison pFPP45+pFPP56+pFPP20 et de l'eau à 350 pl.
De même, la souche EQSC-005 (CEN.PK 1605 Aidhl::nat) a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPGE (yeast extract peptone glycérol éthanol) à 30°C et avec le mix de transformation suivant 250 pL de 50% de PEG, 10 pL d’ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 pL d'acétate de lithium 1 M, 10 pL (3pg) de d’une combinaison V51TEF+pFL36+pCM185, pour la souche contrôle)et de l'eau à 350 pL.
pl des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42 0 C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YNB (yeast without nitrogen base supplémenté en sulfate d’ammonium1, glycérol éthanol) complémenté avec un milieu commercial CSM (MP Biomedicals) adapté aux marqueurs de sélection et complémenté en glutamate a 50mg/L, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 0 Le mix final est étalé sur YNB+sulphate d’ammonium+CSM - LUW (leucine, uracile, tryptophane) + glutamate à 50mg/L+20g/L glycérol+30g/L éthanol + doxycycline à 2mg/L. Les souches obtenues sont • EQSC-006 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, Aidhl::nat, Apgkl::kan) (pFPP45+pFPP56+pFPP20) • EQSC-007 (CEN.PK 1605 Aidhl::nat (pV51TEF+pFL36+pCM185)
d) Extraction de métabolites
Adaptation des souches EQSC-006 et EQSC-007 à la croissance sur milieu liquide YNB (yeast nitrogen base) avec glucose et CO2.
Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées avec le milieu de culture approprié et un apport de CO2 exogène de 10%, en incubateur agité (120 RPM, 30°C), avec une inoculation à 0.05 D.O.ôOOnm mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre EON (BioTek Instruments). La souche d’intérêt est cultivée sur milieu YNB+CSM-LUW avec 10 g/L de glycérol et 7,5 g/L d’éthanol, + glutamate à 50 mg/L dans des conditions où l’expression de la PRK n’est pas induite.
Après obtention d’une quantité de biomasse suffisante, des cultures d’un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250ml minimum sont ensemencées afin d’effectuer l’adaptation de la souche à l’utilisation de l’ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture YNB+CSM-LUW avec 20 g/L de glucose, glutamate à 50 mg/L et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus.
Après observation d’un démarrage de croissance significatif, les souches sont adaptées à un milieu minéral minimum exempt des acides aminés et base azoté inclus dans le CSM-LUW, soit uniquement du YNB avec 20 g/L de glucose glutamate à 50 mg/L et un apport en CO2 exogène comme décrit ci-dessus.
e) Production de citrate en Erlenmeyers
La souche EQSC-006 de Saccharomyces cerevisiae, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène PGK1, est cultivée afin de produire du citrate en surproduisant du NADPH sans perte de CO2, en utilisant une PRK et une RuBisCO.
Cette souche d’intérêt est comparée à une souche de référence EQSC-007 produisant du citrate suite à l’inactivation du gène IDH1, sans délétion de PGK1 ou ZWL1 ni ajout de PRK et RuBisCO. Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées dans les conditions décrites précédemment.
La méthode décrite par Sasidharan et al. ( PLoS One. 2012;7(8):e44283) a été utilisée. Une culture de 5 unités DO est lysée par cassage aux billes dans un tampon adapté. Les métabolites sont analysés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC-MS) sur une colonne de type ZIC-pHILIC sur un appareil Agilent 1200 Sériés.
Le rendement carbone (correspondant ici au ratio gramme de citrate obtenu par gramme de glucose consommé) est augmenté de 15% pour la souche EQSC-006 006 (CEN.PK 1605 Azwfl::hph, \idhl::nat, Apgkl::kan) (pFPP45+pFPP56+pFPP20) en comparaison à la souche EQSC-005 (CEN.PK 1605 Mdhl::nat).
Exemple 4 : Amélioration de la production de glutamate chez E. coli
La délétion du gène de l’alpha-ketoglutarate déshydrogénase augmente la production de glutamate (Usuda at al. J Biotechnol. 2010 May 3; 147(1): 17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018).
Dans cet exemple, une souche d’Escherichia coli K12 MG 1655 dont le gène suc A a été délété a donc été utilisée. Cette souche est issue d’une banque de délétion de gènes (Baba et al. Mol
Syst Biol. 2006;2:2006.0008) chez Escherichia coli et fournie par le Coli Genetic Stock Center sous le nom JW0715-2 et avec la référence 8786. (JW0715-2 : MG1655 \sucA ::Kan)
a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par la recombinase Flp
Afin de pouvoir réutiliser la même stratégie de délétion que celle utilisée pour construire la souche JW0715-2 ci-dessus (Rodriguez et al., 2016), la cassette de sélection a été supprimée à l’aide d’une recombinase.
Le plasmide p707-Llpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Délétion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu’ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycin 0.0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC002 : MG1655 \sucA
b) Délétion de l’opéron edd-eda codant la voie métabolique d’Entner-Doudoroff
La délétion de l’opéron edd-eda est réalisée par recombinaison homologue et rutilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Délétion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d’expression d’un gène de résistance ERT-PKG-gb2-neo-ERT et possédant une séquence 5’ homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion, c’est-à-dire aux positions 19320651932115 et 1934604-1934654 sur le chromosome générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien de part et d’autre de la totalité de l’opéron.
2. La souche de Escherichia coli K-12, EQ.EC002 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnés sur milieu riche complexe LB agar 0.2% glucose, tétracycline 0.0003%.
3. La transformation de l’amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l’arabinose 0.3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose et kanamycin 0.0015%.
4. Le plasmide p707-Llpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Délétion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu’ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté par kanamycin 0.0015%.
5. La souche obtenue se nomme EQ.EC003 : MG1655 AsucA Aedd-eda
c) Délétion du gène gapA
La délétion du gène gapA est réalisée par recombinaison homologue et Γ utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Délétion Red®/ET® Recombination Kit selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d’expression d’un gène de résistance ERT-PKG-gb2-neo-ERT et possédant une séquence 5’ homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion c’est à dire la phase codante du gène (gapA) (GenBank: X02662.1) générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien.
2. La souche de Escherichia coli K-12, EQ.EC003 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnés sur milieu riche complexe LB agar 0.2% glucose, tétracycline 0.0003%.
3. La transformation de l’amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET qui sera induite par l’arabinose 0.3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0.2% glycérol et pyruvate 0.3%, tétracycline 0.0003% et additionné de 0.3% L-arabinose et kanamycin 0.0015%.
Les délétions sont vérifiées par génotypage et séquençage et le nom des souches obtenues est • EQ.EC002 : MG1655 AsucA • EQ.EC003 : MG 1655 AsucA Aedd-eda • EQ.EC004 : MG1655 AsucA Aedd-eda AgapA::kan
d) Insertion de l’ingénierie nécessaire à la fixation du CO2
Pour l’expression recombinante des différents composants d’une RuBisCO de type I chez E. coli les gènes décrits dans le tableau 15 ci-dessous sont clonés sous la forme d’un opéron synthétique contenant les gènes décrits dans le tableau 16 ci-dessous.
Tableau 15 : gènes codant pour une RuBisCO de type I
Gènes | GenBank | Organisme |
rbcL | BAD78320.1 | Synechococcus elongatus |
rbcS | BAD78319.1 | Synechococcus elongatus |
rbcX | BAD80711.1 | Synechococcus elongatus |
Prk | BAD78757.1 | Synechococcus elongatus |
Tableau 16 : Composition des cassettes d’expression
Plasmide | Structure c | e l'opéron synthétique dans vecteur pZAll | |||||||
geneA | RBS1 | geneB | RBS2 | geneC | RBS3 | geneD | RBS4 | geneE | |
pZAll | |||||||||
pEQEC005 | rbcS | D | rbcL | B | RbcX | F | |||
pEQEC006 | rbcS | D | rbcL | B | RbcX | F | Prk | ||
pEQEC008 | Prk |
Pour contrôler le niveau d’expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le tableau 17 ci-dessous, ayant des efficacités de traduction variables 10 (Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ;
Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertions successives dans un vecteur pZAll (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A et un gène de résistance à 15 Γ ampicilline.
Tableau 17 : Séquences intercistroniques RBS
Nom | Séquences RBS |
A (SEQ ID N°9) | AGGAGGTTTGGA |
B (SEQ. ID N°10) | AACAAAATGAGGAGGTACTGAG |
C (SEQ. ID N°ll) | AAGTTAAGAGGCAAGA |
D (SEQID N°12) | TTCGCAGGGGGAAG |
E (SEQID N°13) | TAAGCAGGACCGGCGGCG |
F (SEQID N°14) | CACCATACACTG |
Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessus
EQ.EC 005(EQ.EC 003+ pZAll) : MG1655 \sucA Aedd-eda
EQ.EC 006 ^(EQ.EC 004+ pEQEC005) : MG1655 AsucA Aedd-eda Δ gapA ::kan (RuBisCO)
EQ.EC 007 ^(EQ.EC 004+ pEQEC006) : MG1655 AsucA Aedd-eda Δ gapA ::kan (RuBisCO+PRK)
EQ.EC 009 ^(EQ.EC 004+ pEQEC008) : MG1655 AsucA Aedd-eda AgapA ::kan (PRK)
Les clones sont sélectionnés sur milieu LB supplémenté glycérol 2g/L et pyruvate 5g/L et par 100 mg/L d’ampicilline. Après obtention d’une quantité de biomasse suffisante, des cultures d’un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250ml minimum sont ensemencées afin d’effectuer l’adaptation de la souche à Putilisation de l’ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture LB avec 2 g/L de glucose, et un apport en CO2 exogène à 37°C comme décrit ci-dessus.
e) Production de glutamate
Pour la production de glutamate, les cellules issues de 500ml de culture en LB sont inoculées dans 20ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgSO4’.7H2O, 20 g/L de (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 10 mg/L EeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 2 g/L d’extrait de levure, 30 g/L de CaCO3, 100 mg/L d’ampicilline à une pression 0,1 atmosphère CO2.
Le glutamate et le glucose résiduels sont mesurés avec un bio analyseur (Sakura seiki). Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de glutamate produit par gramme de glucose consommé.
Ce rendement augmente significativement de 10% pour les souches EQ.EC 007 (RuBisCO+PRK) par comparaison avec les souches contrôles EQ.EC 005 (vide), EQ.EC 006 (RuBisCO seule). La souche contrôle EQ.EC 009 (PRK seule) n’est pas viable.
Exemple 5 : Amélioration de la production de polyhydroxybutyrate chez C. necator
L’augmentation du pouvoir réducteur obtenu grâce aux modifications génétiques proposées selon l’invention peut aussi avoir un gain considérable sur des voies métaboliques déjà existantes.
C’est le cas pour la souche bactérienne Cupriadus necator ATCC 17699 qui produit naturellement du polyhydroxybutyrate (PHB). Cette bactérie est capable de se développer aussi bien en conditions d’autotrophie qu’en conditions d’hétérotrophie. La délétion du gène gapA (glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogenase NC_OO8313.1) permet de dévier le flux métabolique sur la voie des pentoses phosphates et d’augmenter le pool de nucléotides réduits NADPH permettant d’augmenter le rendement de production de PHB.
Cette souche C. necator H16 possède un mega plasmide pHGl et deux chromosomes. La délétion du gène gapA est réalisée en générant un vecteur contenant un gène suicide Sac A pour les bactéries gram négatives (Quandtet al., Gene. 1993 May 15; 127( 1): 15-21 ; Lindenkamp et al., Appl Environ Microbiol. 2010 Aug;76(16):5373-82 et Appl Environ Microbiol. 2012 Aug;78(15):5375-83).
a) Inactivation de la voie métabolique d’Entner-Doudoroff
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes des gènes edd et eda (en amont de edd et en aval de eda) sont clonées par restriction selon la procédure décrite dans Srinivasan et al. (Appl Environ Microbiol. 2002 Dec;68(12):5925-32), dans le plasmide pJQ200mpl8Cm.
Le plasmide modifiépJQ200mpl8CmvAedd-eda est alors transformé dans une souche d'E.coli S17-1 par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Le transfert du matériel génétique est fait par conjugaison en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de C. necator sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S17-1. La sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30° en présence de 10% sucrose à titre de sélection (Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr;158(l):43-8) et validé sur un milieu minéral contenant 50pg/ml chloramphénicol.
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_002 obtenue est donc délétée pour les gènes de la voie métabolique d’Entner-Doudoroff edd-eda. EQCN_002 : H16 Aedd-eda./q Inactivation de la voie de la glycolyse
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes du gène gapA sont clonés par restriction selon la procédure décrite dans Lindenkamp et al.2012, dans le plasmide pjQ200mpl8Tc.
Le plasmide modifié pjQ200mpl8Tc::AgapA est alors transformé dans une souche ti'E.coli S17-1 par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Le transfert du matériel génétique est fait par conjugaison en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de C. necator sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S17-1. La sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30° en présence de 10% sucrose à titre de sélection (Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr; 158(1):43-8.) et validé sur un milieu minéral contenant 25pg/ml tétracycline..
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_003 obtenue est donc délétée pour le gène gapA. EQCN_003 : H16 Aedd-eda AgapA.
La souche EQCN_003, délétée dans la voie glycolytique au niveau du gène gapA et dans la voie d’Entner Doudoroff au niveau des gènes edd-eda est cultivée afin d’améliorer le rendement de production du PHB en fixant du CO2 exogène via l’utilisation des enzymes PRK et RuBisCO.
b) Production de PHB en bioréacteur
L’inoculum issu d’un stock congelé est étalé sur milieu solide à raison de 50 à 100 pL issus d’un cryotube mis en incubation à 30°C pendant 48 à 96h, en présence de glucose. L’expression des gènes codant pour la RuBisCO et la PRK sont maintenus chez C. necator en conditions aérobies hétérotrophes (Rie Shimizuet al., Sci Rep. 2015; 5: 11617. Published online 2015 Jul I·)·
Des cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers (10 mL dans 50 mL, puis 50 mL dans 250 mL) sont réalisées avec le milieu de culture approprié, en glucose 20 g/L et un apport de CO2 exogène de 10% en incubateur agité (100-200 RPM, 30°C), avec une inoculation minimale de 0.01.
La souche d’intérêt EQCN_003 améliorant le rendement de production de PHB est comparée à une souche H16 de référence accumulant naturellement du PHB en conditions hétérotrophes en présence d’une limitation nutritionnelle.
La productivité des souches est comparée en bioréacteurs. Les cultures effectuées en bioréacteurs sont ensemencées à partir de chaînes d’amplifications solides et/ou liquides en erlenmeyers dans les conditions décrites précédemment. Les bioréacteurs, de type My-control (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) de 750ml ou Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) de 2,5L, sont ensemencés à une concentration minimale équivalente à 0.01 DO620nm.
L’accumulation de PHB est découplée de la croissance. La culture est régulée à 30°C, l’aération est comprise entre 0,1 WM (volume gaz/volume liquide/min) et 1 WM afin de maintenir une concentration minimale en oxygène dissous supérieur à 20% (30°C, 1 bar), l’agitation est adaptée en fonction de l’échelle du bioréacteur utilisé. Le débit de gazage en entrée est constitué d’air éventuellement supplémenté en CO2. La supplémentation en CO2 est comprise entre 1 et 10%. Le pH est régulé à 7 par une solution d’ammoniaque à 14 ou 7 %. Le mode de culture en fed-batch permet un apport en substrat carboné non limitant associé à une limitation en phosphore ou en azote, en conservant un ratio carbone/phosphore ou carbone/azote constant. L’extraction et la quantification de PHB sont réalisées selon la méthode de Brandi et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9). Le protocole consiste à rajouter 1ml de chloroforme à 10 mg de cellules lyophilisées, suivi d’un ajout de 850 μΐ de méthanol et de 150μ1 d’acide sulfurique. Le mélange est chauffé 2.5H à 100°C, refroidi et 500μ1 d’eau sont rajoutés. Les deux phases sont séparées par centrifugation et la phase organique est séchée par l’ajout de de sulfate de sodium Les échantillons sont filtrés et analysés comme décrit par Millier et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79( 14):4433-9).
En comparant les cultures C. necator sauvage H16 et la souche EQCN_003 : H16 Aedd-eda AgapA, on constate une augmentation de 5% du rendement carbone, correspondant ici au ratio gramme de PHB par gramme de glucose consommé.
Claims (19)
- REVENDICATIONS1- Microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la voie de la glycolyse est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène.
- 2- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1, dans lequel la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates est également au moins partiellement inhibée.
- 3- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1 ou 2, ledit microorganisme étant génétiquement modifié pour exprimer une enzyme RuBisCO et/ou une PRK recombinantes.
- 4- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 3, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à inhiber la glycolyse en amont de la production de 1,3-biphospho-D-glycérate (1,3-BPG) ou en amont de la production de 3phosphoglycérate (3PG), et en aval de la production de glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P).
- 5- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 2 à 4, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à inhiber la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates en amont de la production de ribulose-5-phosphate.
- 6- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 5, dans lequel la molécule exogène et/ou la molécule endogène est choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
- 7- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 6, ledit microorganisme étant une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues, ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie.
- 8- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 7, dans lequel l’expression du gène codant la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée.
- 9- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel l’expression du gène codant la phosphoglycérate kinase est au moins partiellement inhibée.
- 10- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 8 ou 9, dans lequel l’expression du gène codant la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou la 6phosphogluconolactonase ou la 6-phosphogluconate déshydrogénase est au moins partiellement inhibée.
- 11- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 10, ledit microorganisme étant une levure du genre Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans laquelle l’expression du gène TDH1, TDH2 et/ou TDH3 est au moins partiellement inhibée.
- 12- Microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 11, ledit microorganisme étant une levure Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans laquelle l’expression du gène PGK1 est au moins partiellement inhibée.
- 13- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 11 ou 12, dans lequel l’expression du gène ZWF1 est au moins partiellement inhibée.
- 14- Utilisation d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 13, pour la production ou la surproduction d’une molécule d’intérêt, préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
- 15- Procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d’intérêt, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mise en culture d’un microorganisme génétiquement modifié selon l’une des revendications 1 à 13, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d’intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
- 16- Procédé biotechnologique selon la revendication 15, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion ou la synthèse de ladite molécule d’intérêt.
- 17- Procédé biotechnologique selon la revendication 15 ou 16, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour inhiber au moins partiellement une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d’intérêt.
- 18- Procédé de production d’une molécule d’intérêt comprenant (i) l’insertion d’au moins une 5 séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d’intérêt dans un microorganisme recombinant selon l’une des revendications 1 à 13, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l’expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.
- 19- Procédé de production d’une molécule d’intérêt comprenant (i) l’inhibition de l’expression 10 d’au moins un gène codant une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d’intérêt dans un microorganisme recombinant selon l’une des revendications 1 à 13, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l’expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d’intérêt.1/3Stacose•e-phaiphata isomérasePhosptofifuetokinaei»SuçoteHwoMwaseSfaeais®6-pliiosphate dfeihfaraeùiase fiADfH e<*ejpho· glaconolaeteeawSftiMseê-ptoïptateIFruaozeS-pTasphste atp !I sfractow·. ·ι> , ·ι .gtucaaa· factoiSÊ .f·.....l-phospftnte ilolaséSpàtaspitajiitcnnoteI fBiessebphmphate aldelaseI· ; .S ITphisspfteie Bmp î; ;;; :r . J-pAesptateΤΗΜβ-phesphate , isoméraseGlycéraldÉhyde3-ph«sphete déshwdHiiin·»·MADH2.3 bipiiMpfrsÿipicVatc·Phosphojlyeérate | kinase jAFP «4 j-ffàosphonMnssPhMpknglïetaia mutase2-phospIwÿfyefratePhotptMénolpiiruvatePyrwate kinaseΛΡ *4Pyrwate *·«
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