WO2018138288A1 - Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d'intérêt - Google Patents

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WO2018138288A1
WO2018138288A1 PCT/EP2018/052004 EP2018052004W WO2018138288A1 WO 2018138288 A1 WO2018138288 A1 WO 2018138288A1 EP 2018052004 W EP2018052004 W EP 2018052004W WO 2018138288 A1 WO2018138288 A1 WO 2018138288A1
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interest
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Cédric BOISART
Nicolas Morin
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Enobraq
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01039—Ribulose-bisphosphate carboxylase (4.1.1.39)

Definitions

  • the invention relates to a genetically modified microorganism capable of using carbon dioxide as an at least partial carbon source for the production of molecules of interest. More particularly, the invention relates to a microorganism in which at least the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway is at least partially inhibited. The invention also relates to processes for the production of at least one molecule of interest using such a microorganism. State of the art
  • fermentation processes are used to cause molecules to be produced by a microorganism from a fermentable carbon source, such as glucose.
  • Bioconversion processes have also been developed, to allow a microorganism to convert a co-substrate, not assimilable by said microorganism, into a molecule of interest.
  • a source of carbon is necessary, not for the actual production of the molecule of interest, but for the production of cofactors, and more particularly of NADPH, which may be necessary for bioconversion.
  • the yield of production by such microbiological processes is low mainly because of cofactor requirements and the difficulty of balancing the redox metabolic reactions.
  • CO 2 carbon dioxide
  • microorganisms genetically modified to capture C0 2 and use it as a main source of carbon, as well as photosynthetic plants and microorganisms have already been demonstrated.
  • the inventors have discovered that by coupling part of the Calvin cycle (PRK / RuBisCO) to a less partial of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway, it was possible to increase the production yield of molecules of interest. Interestingly, this inhibition, advantageously carried out downstream of the production of ribulose-5-phosphate promotes exogenous CO2 consumption by the microorganism.
  • the microorganisms thus developed make it possible to produce on a large scale and with an industrially interesting yield a large number of molecules of interest, such as amino acids, organic acids, terpenes, terpenoids, peptides, fatty acids, polyols, etc.
  • the subject of the invention is therefore a genetically modified microorganism expressing a functional RuBisCO enzyme and a phosphoribulokinase (PRK), and in which the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway is at least partially inhibited, said microorganism being genetically modified in a manner to produce an exogenous molecule of interest and / or to overproduce an endogenous molecule of interest, other than an RuBisCO and / or phosphoribulokinase (PRK) enzyme.
  • PRK phosphoribulokinase
  • the invention also relates to the use of a genetically modified microorganism according to the invention for the production or overproduction of a molecule of interest, other than RuBisCO enzyme and / or phosphoribulokinase (PRK), preferably selected from amino acids, peptides, proteins, vitamins, sterols, flavonoids, terpenes, terpenoids, fatty acids, polyols and organic acids.
  • a genetically modified microorganism for the production or overproduction of a molecule of interest, other than RuBisCO enzyme and / or phosphoribulokinase (PRK), preferably selected from amino acids, peptides, proteins, vitamins, sterols, flavonoids, terpenes, terpenoids, fatty acids, polyols and organic acids.
  • PRK phosphoribulokinase
  • the present invention also relates to a biotechnological process for producing or overproducing at least one molecule of interest other than an RuBisCO enzyme and / or a phosphoribulokinase (PRK), characterized in that it comprises a step of culturing a microorganism genetically modified according to the invention, under conditions allowing the synthesis or bioconversion, by said microorganism, of said molecule of interest, and optionally a step of recovery and / or purification of said molecule of interest.
  • a biotechnological process for producing or overproducing at least one molecule of interest other than an RuBisCO enzyme and / or a phosphoribulokinase (PRK) characterized in that it comprises a step of culturing a microorganism genetically modified according to the invention, under conditions allowing the synthesis or bioconversion, by said microorganism, of said molecule of interest, and optionally a step of recovery and / or purification of said molecule of interest.
  • It also relates to a method for producing a molecule of interest other than an RuBisCO enzyme and / or a phosphoribulokinase (PRK), comprising (i) inserting at least one sequence encoding an enzyme involved in the synthesis or bioconversion of said molecule of interest in a recombinant microorganism according to the invention, (ii) the cultivation of said microorganism under conditions permitting the expression of said enzyme and optionally (iii) the recovery and / or purification of said molecule of 'interest.
  • a method for producing a molecule of interest other than an RuBisCO enzyme and / or a phosphoribulokinase (PRK) comprising (i) inserting at least one sequence encoding an enzyme involved in the synthesis or bioconversion of said molecule of interest in a recombinant microorganism according to the invention, (ii) the cultivation of said microorganism under conditions permitting the expression of said enzyme and optionally (iii) the recovery
  • Figure 1 Schematic representation of glycolysis, the Entner-Doudoroff pathway and the pentose phosphate pathway, showing the inhibition of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway, according to the invention
  • Figure 2 Schematic representation of glycolysis and the pentose phosphate pathway, showing the inhibition of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway and the management of ribulose-5-phosphate by PRK and RuBisCO, according to US Pat. 'invention.
  • recombinant microorganism modified microorganism
  • recombinant host cell refers to microorganisms that have been genetically engineered to express or overexpress endogenous nucleotide sequences to express heterologous nucleotide sequences. or that have an alteration of the expression of an endogenous gene.
  • “Alteration” means that the expression of the gene, or level of an RNA molecule or equivalent RNA molecules encoding one or more polypeptide or subunit polypeptide, or the activity of one or more several polypeptides or polypeptide subunits is regulated, so that the expression, level or activity is greater or less than that observed in the absence of modification.
  • recombinant microorganism refers not only to the particular recombinant microorganism, but to the progeny or potential progeny of such a microorganism. As some changes may occur in subsequent generations because of mutation or environmental influences, this offspring may not be identical to the parent cell, but is still included in the term as used here.
  • an at least partially “inhibited” or “inactivated” metabolic pathway refers to an altered metabolic pathway, which can no longer proceed properly in the microorganism in question, compared to the same wild-type microorganism (not genetically modified to inhibit said metabolic pathway).
  • the metabolic pathway can be interrupted, resulting in the accumulation of an intermediate metabolite. Such an interruption can be obtained for example by inhibition of the enzyme necessary for the degradation of an intermediate metabolite of the metabolic pathway in question and / or by inhibition of the expression of the gene coding for this enzyme.
  • the metabolic pathway can also be attenuated, that is, slowed down.
  • Such attenuation can be obtained for example by partial inhibition of one or more enzymes involved in the metabolic pathway and / or by partial inhibition of the expression of a gene coding for at least one of these enzymes and / or by playing cofactors needed for some reactions.
  • the expression "at least partially inhibited metabolic pathway” means that the level of the metabolic pathway considered is reduced by at least 20%, more preferably at least 30%, 40%, 50%, or more, compared to the level in a wild microorganism. The reduction can be greater, and in particular be at least greater than 60%, 70%, 80%, 90%.
  • the inhibition may be complete, in that the metabolic pathway considered is not used at all by the said microorganism. According to the invention, such an inhibition can be temporary or permanent.
  • the term "inhibition of V expression of a gene” means that said gene is no longer expressed in the microorganism in question or that its expression is reduced, compared with the wild-type microorganism (non-genetically modified to inhibit the formation of the gene). expression of the gene), leading to the absence of production of the corresponding protein or to a significant decrease in its production, and in particular to a decrease of greater than 20%, more preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%.
  • the inhibition may be complete, that is to say that the protein encoded by said gene is no longer at all produced.
  • the inhibition of the expression of a gene can in particular be obtained by deletion, mutation, insertion and / or substitution of one or more nucleotides in the gene under consideration. Preferentially, the inhibition of the expression of the gene is obtained by total deletion of the corresponding nucleotide sequence.
  • any method of inhibition of a gene known per se by those skilled in the art and applicable to a microorganism may be used.
  • inhibition of gene expression can be achieved by homologous recombination (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci US A 2000; 97: 6640-5, Lodish et al., Molecular Cell Biology 4th ed. 2000.
  • the inhibition of the expression of the gene is obtained by knockout techniques. Inhibition of gene expression can also be achieved by gene silencing using interfering, ribozyme or antisense RNAs (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine).
  • interfering RNA or "RNAi” refers to any RNAi molecule (e.g. single-stranded RNA or double-stranded RNA) that can block expression of a target gene and / or facilitate degradation. corresponding mRNA.
  • Inhibition of the gene can also be achieved by genomic editing methods that allow direct genetic modifications to a given genome via the use of zinc finger nucleases (Kim et al., PNAS; 93: 1156). 1160), effector nucleases of the transcription activator type, called "TALEN” (Ousterout et al, Methods Mol Biol 2016, 1338: 27-42, doi: 10.1007 / 978-1-4939-2932-0_3), a system combining Cas9-like nucleases with short, regularly spaced, pooled palindromic repeats known as CRISPR (Mali et al., Nat. Methods, 2013 Oct; 10 (10): 957-63.
  • CRISPR Cas9-like nucleases with short, regularly spaced, pooled palindromic repeats
  • NADPH-dependent or “NADPH-consuming” biosynthesis or bioconversion is meant in the context of the invention all of the biosynthetic or bioconversion pathways in which one or more enzymes require the concomitant addition of electrons obtained. by the oxidation of an NADPH cofactor.
  • NADPH-dependent bioconversion or bioconversion pathways concern in particular the synthesis of amino acids (eg arginine, lysine, methionine, threonine, proline, glutamate, homoserine, isoleucine, valine), terpenoids and terpenes (eg farnesene), vitamins and precursors (eg pantoate, pantothenate, transneurosporene, phylloquinone, tocopherols), sterols (eg squalene, cholesterol, testosterone, progesterone, cortisone), flavonoids (eg frambinone, vestinone), organic acids (eg coumaric acid, 3-hydroxypropionic acid), polyols (eg sorbitol, xylitol, glycerol), polyamines (eg spermidine) of aromatic molecules from a stereospecific hydroxylation, via a NADP-dependent cytochrome p450 (eg phenyl),
  • exogenous refers to molecules that are not normally or naturally found in and / or produced by the microorganism of interest.
  • endogenous or “native” in reference to various molecules refers to molecules that are normally or naturally found in and / or produced by the microorganism in question.
  • the invention provides genetically modified microorganisms for the production of a molecule of interest, endogenous or exogenous.
  • microorganism By “genetically modified” microorganism is meant that the genome of the microorganism has been modified so as to integrate a nucleic sequence encoding an enzyme involved in the biosynthetic pathway or bioconversion of a molecule of interest, or encoding a biologically active fragment of it. Said nucleic sequence may have been introduced into the genome of said microorganism or one of its ascendants, by means of any suitable molecular cloning method.
  • the genome of the microorganism refers to all the genetic material contained in said microorganism, including the extrachromosomal genetic material contained for example in plasmids, episomes, synthetic chromosomes, etc.
  • the nucleic acid sequence introduced may be a heterologous sequence, that is to say one that does not exist in the natural state in said microorganism, or a homologous sequence.
  • a transcriptional unit containing the nucleic sequence of interest placed under the control of one or more promoter (s) is introduced into the genome of the microorganism.
  • Such a transcriptional unit also advantageously comprises the usual sequences such as transcriptional terminators and, if appropriate, other transcriptional regulation elements.
  • Promoters useful in the context of the present invention include constitutive promoters, i.e., promoters that are active in most cellular states and environmental conditions, as well as inducible promoters that are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli.
  • the microorganism when the microorganism is a yeast, it is possible to use a constitutive promoter, such as that of a gene among TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1.
  • constitutive promoter such as that of a gene among TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1.
  • inducible promoters examples include the tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1 and PHO5 promoters.
  • the genetically modified microorganism according to the invention has the following characteristics:
  • the microorganism is a eukaryotic cell, preferably chosen from yeasts, fungi, microalgae, or a prokaryotic cell, preferably a bacterium or cyanobacterium.
  • the microorganism genetically modified according to the invention is a yeast, preferably chosen from ascomycete yeasts (Spermophthoraceae and Saccharomycetaceae), basidiomycete yeasts (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, and Filobasidiella) and deuteromycete yeasts belonging to the yeast. with Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae, and Cryptococcaceae).
  • ascomycete yeasts Spermophthoraceae and Saccharomycetaceae
  • basidiomycete yeasts Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, and Filobasidiella
  • deuteromycete yeasts belonging to the yeast with Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae, and Cryptococcaceae).
  • the genetically modified yeast according to the invention belongs to the genus Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, or Debaryomyces.
  • the genetically modified yeast according to the invention is chosen from among Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii and Lipomyces starkeyi.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is a fungus, and more particularly a "filamentous" fungus.
  • “filamentous fungi” refers to all filamentous forms of the Eumycotina subdivision.
  • the genetically modified fungus according to the invention belongs to the genus Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus or Pyricularia.
  • the genetically modified fungus according to the invention is chosen from Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, and Trichoderma viride.
  • the microorganism genetically modified according to the invention is a microalgae.
  • microalgae refers to all eukaryotic-type microscopic algae, preferentially belonging to the classes or superclasses of Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomaceous or Bacillariophyta, Euglenophyceae, Rhodophyceae, or Trebouxiophyceae.
  • the microalgae genetically modified according to the invention are chosen from Nannochloropsis sp. (eg Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina), Tetraselmis sp.
  • Chlorella sp (eg Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. (eg Chlorella salina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (eg Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp.
  • Chlorella salina Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris
  • Chlamydomonas sp (eg Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is a bacterium, preferentially chosen from phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteria , Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, or Verrucomicrobia.
  • the bacterium genetically modified according to the invention belongs to the genus Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc,
  • the bacterium genetically modified according to the invention is chosen from the species Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium Ijungdahlii , Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, E.
  • the microorganism can naturally express functional RuBisCO and PRK. This is the case, for example, with photosynthetic microorganisms, such as microalgae or cyanobacteria.
  • RuBisCO there are several forms of RuBisCO in nature (Tabita et al., J Exp Bot 2008; 59 (7): 1515-24. Doi: 10.1093 / jxb / erm361).
  • Forms I, II and III catalyze the carboxylation and oxygenation reactions of ribulose 1,5-bisphosphate.
  • Form I is present in eukaryotes and bacteria. It consists of two types of subunits: large subunits (RbcL) and small subunits (RbcS).
  • the functional enzymatic complex is a hexadecamer consisting of eight L subunits and eight S subunits.
  • RbcX Liu et al. , Nature, 2010 Jan 14, 463 (7278): 197-202, doi: 10.1038 / nature08651.
  • Form II is found mainly in proteobacteria, archaea and dinoflagellate algae. Its structure is much simpler: it is a dimer formed of two identical RbcL subunits.
  • the genes encoding type I RuBisCO may be called rbcL / rbcS (eg Synechococcus elongatus), or cbxLC / cbxSC, cfxLC / cfxSC, cbbL / cbbS (eg, Cupriavidus necator).
  • the genes encoding type II RuBisCO are generally called cbbM (eg, Rhodospirillum rubrum).
  • Form III is present in archaea. It is generally found in the form of RbcL subunit dimers, or dimer pentamers.
  • RuBisCO may be called rbcL (for example, Thermococcus kodakarensis), cbbL (for example, Haloferax sp.).
  • PRK Two classes of PRKs are known: Class I enzymes found in proteobacteria are octamers, while Class II enzymes in cyanobacteria and plants are tetramers or dimers. Depending on the organism, genes encoding PRK may be called prk (eg, Synechococcus elongatus), prkA (eg, Chlamydomonas reinhardtii), prkB (eg, Escherichia coli), prkl, prk2 (eg, Leptolyngbya). sp.), cbbP (eg, Nitrobacter vulgaris) or cfxP (eg, Cupriavidus necator).
  • the microorganism used does not naturally express functional RuBisCO and PRK
  • said microorganism is genetically modified to express a heterologous RuBisCO and PRK.
  • the microorganism is transformed so as to integrate into its genome one or more expression cassettes integrating the sequences coding for said proteins, and advantageously the appropriate transcriptional factors.
  • RuBisCO type I where the introduction and expression of genes encoding a specific chaperone (Rbcx) and general chaperones (GroES and GroEL, for example) are necessary to obtain a Functional RuBisCO.
  • the application WO2015 / 107496 describes in detail how to genetically modify a yeast so that it expresses a RuBisCO of type I and a functional PRK. It is also possible to refer to the method described in GUADALUPE-MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013).
  • the microorganism is genetically engineered to express type I RuBisCO. In another embodiment, the microorganism is genetically engineered to express an IL-type RuBisCO. In another embodiment, the microorganism is genetically modified. to express a RuBisCO type III.
  • the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway is at least partially inhibited, so that the microorganism is no longer able to join the glycolysis pathway via the pentose phosphate pathway.
  • the microorganism is genetically modified so as to inhibit the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway downstream of ribulose-5-phosphate production (FIG. 1).
  • the interruption of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway downstream of the production of ribulose-5-phosphate (Ru5P) is advantageously obtained by at least partial inhibition of a transaldolase (EC 2.2.1.2) normally produced by the microorganism.
  • Transaldolase is an enzyme that catalyzes a transferase type reaction between couples of sedoheptulose 7-phosphate / glyceraldehyde 3-phosphate and erythrose-4-phosphate / fructose 6-phosphate metabolites.
  • the genes encoding transaldolase may be called tal, talA, talB (for example in Escherichia coli, Synechocystis sp.), TALDO, TALDO 1, TALDOR (for example in Homo sapiens, Mus musculus), TAL1 (for example in Saccharomyces cerevisiae), TAL2 (for example in Nos toc punctiform), talAl, talA2 (for example Streptococcus gallolyticus), talB1, talB2 (for example Azotobacter vinelandii), or NQM1 (for example in Saccharomyces cerevisiae).
  • TALDO for example in Homo sapiens, Mus musculus
  • TAL1 for example in Saccharomyces cerevisiae
  • TAL2 for example in Nos toc punctiform
  • talAl, talA2 for example Streptococcus gallolyticus
  • interruption of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway downstream of ribulose-5-phosphate (Ru5P) production can be achieved by at least partial inhibition of a transketolase (EC 2.2 .1.1) normally produced by the microorganism.
  • Transketolase is an enzyme that catalyzes a transferase-like reaction between couples of sedoheptulose-7-phosphate / glyceraldehyde 3-phosphate, and ribose-5-phosphate / xylulose-5-phosphate metabolites, as well as between fructose-6 couples.
  • phosphate / glyceraldehyde 3-phosphate, and erythrose-4-phosphate / xylulose-5-phosphate is an enzyme that catalyzes a transferase-like reaction between couples of sedoheptulose-7-phosphate / glyceraldehyde 3-phosphate, and ribose-5-phosphate / xylulose-5-phosphate metabolites, as well as between fructose-6 couples.
  • the genes encoding transketolase may be called TKL, TKL1, TKL2 (eg Saccharomyces cerevisiae), tk1A, tk1B (eg Rhodobacter sphaeroides), tktA, tktB, (eg Escherichia coli), TKT, TKT1, TKT2 (for example Homo sapiens, Dictyostelium discoideum), or TKTL1, TKTL2 (eg Bos taurus), or cbbT, cbbTC, cbbTP (eg Cupriavidus necator, Synechococcus sp.).
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding transaldolase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited. Alternatively or additionally, the microorganism is genetically modified so that expression of the gene encoding transketolase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • Tables 3 and 4 below list, by way of example, the sequences encoding a transaldolase or a transketolase, which can be inhibited depending on the target microorganism.
  • the person skilled in the art knows which gene corresponds to the enzyme of interest to be inhibited as a function of the microorganism.
  • the junction between the pentose phosphate pathway and the glycolysis pathway is no longer possible via the non-oxidative branch of the pentose phosphates, or at least greatly reduced, in the genetically modified microorganism.
  • the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae in which the expression of the NQM1 and / or TAL1 gene is at least partially inhibited.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the talA gene is at least partially inhibited.
  • the genetically modified microorganism which expresses a functional RuBisCO and PRK, and whose non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway is at least partially inhibited, is no longer able to join the glycolysis pathway. the path of pentose phosphates. It is however able to produce glyceraldehyde-3-phosphate (G3P), from Ru5P synthesized by the oxidative branch of the pentose phosphate pathway, via the heterologous expression of PRK and RuBisCO, while fixing a carbon molecule. additional ( Figure 2).
  • the genetically modified microorganism is capable of producing NADPH via the oxidative branch of pentose phosphates, and G3P via the heterologous expression of PRK and RuBisCO, by using exogenous C0 2 , and in particular atmospheric CO2, as a carbon source. complementary.
  • the genetically modified microorganism according to the invention makes it possible to increase the carbon yield, by fixing and using exogenous CO2, for the production of NADPH and G3P (and subsequently of molecules of interest). Again, there is an increase in carbon yield.
  • the genetically modified microorganism according to the invention has an Entner-Doudoroff pathway, and this pathway is at least partially inhibited.
  • This pathway mainly found in bacteria (especially Gram-type), is an alternative to glycolysis and the pentose pathway for the production of pyruvate from glucose. More precisely, this pathway is connected to the pentose phosphate pathway at the ⁇ -gluconate level to supply glycolysis at the level of pyruvate in particular.
  • the microorganism is genetically modified so as to inhibit the reactions of the Entner-Doudoroff pathway downstream of the production of 6-phosphogluconate.
  • This inhibition makes it possible to eliminate a possible competitive pathway, and to ensure the availability of 6-phosphogluconate as a substrate for PRK / RuBisCO engineering.
  • Interruption of the Entner-Doudoroff pathway downstream of 6-phosphogluconate production specifically targets one or more reactions in the process of synthesizing pyruvate from 6-phosphogluconate.
  • 6-Phosphogluconate dehydratase catalyzes the dehydration of 6-phosphogluconate to 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate.
  • the genes encoding 6-phosphogluconate dehydratase may be called edd (GenBank NP_416365, for example, in Escherichia coli), or ilvD (for example, in Mycobacterium sp.).
  • 2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase catalyzes the synthesis of a pyruvate molecule and a glyceraldehyde-3-phosphate molecule from the 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate produced by the 6- phosphogluconate dehydratase.
  • the genes coding for 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase may be called eda (GenBank NP_416364, for example, in Escherichia coli), or kdgA (for example in Thermoproteus tenax), or dgaF ( for example in Salmonella typhimurium).
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene encoding 6-phosphogluconate dehydratase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • the microorganism is genetically modified so that the expression of the gene coding for 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase is at least partially inhibited. Preferably, the expression of the gene is completely inhibited.
  • Tables 5 and 6 below list, by way of example, the sequences encoding a 6-phosphogluconate dehydratase and a 2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase which can be inhibited depending on the target microorganism.
  • the person skilled in the art knows which gene corresponds to the enzyme of interest to be inhibited as a function of the microorganism.
  • the production of pyruvate is no longer possible via the Entner-Doudoroff pathway, or at least greatly reduced.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Escherichia coli in which the expression of the edd gene is at least partially inhibited.
  • the bacterium of the genus Escherichia coli is genetically modified so that the expression of the genes talA, and edd are at least partially inhibited.
  • the genetically modified microorganism which expresses a functional RuBisCO and PRK, and whose non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway and the Entner-Doudoroff pathway are at least partially inhibited, is no longer capable of producing pyruvate by the Entner-Doudoroff route or the pentose phosphate route.
  • the carbon flux from glucose during NADPH production is therefore oriented preferentially towards PRK / RuBisCO engineering.
  • the genetically modified microorganism is transformed so as to produce an exogenous molecule of interest and / or to overproduce an endogenous molecule of interest.
  • a molecule of interest is preferably a small organic molecule of molecular mass less than or equal to 0.8 kDa.
  • an "improved" yield is understood in terms of the amount of finished product.
  • the carbon yield corresponds in the context of the invention to the ratio of the amount of finished product / amount of fermentable sugar, especially by weight.
  • the carbon yield is increased in the genetically modified microorganisms according to the invention, compared to the wild microorganisms, placed under identical culture conditions.
  • the carbon yield is increased by 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, or more.
  • the genetically modified microorganism according to the invention can produce a larger quantity of the molecules of interest (finished product) compared to the heterologous molecules produced by a microorganism genetically modified simply to produce or overproduce this molecule.
  • the microorganism genetically can also overproduce an endogenous molecule compared to the wild-type microorganism.
  • the overproduction of an endogenous molecule is mainly understood in terms of quantities.
  • the genetically modified microorganism produces at least 20%, 30%, 40%, 50%, or more by weight of the endogenous molecule than the wild-type microorganism.
  • the microorganism according to the invention is genetically modified so as to produce or overproduce at least one molecule among amino acids, terpenoids, terpenes, vitamins and / or precursors of vitamins, sterols, flavonoids, organic acids. polyols, polyamines, aromatic molecules obtained from stereospecific hydroxylation, via NADP-dependent cytochrome p450, etc.
  • the microorganism is genetically modified to overproduce at least one amino acid, preferentially chosen from arginine, lysine, methionine, threonine, proline, glutamate, homoserine, isoleucine and valine. .
  • the microorganism is genetically engineered to produce or overproduce terpenoid pathway molecules, such as farnesene, and the terpenes pathway.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a vitamin or a precursor, preferentially chosen from pantoate, pantothenate, transneurosporene, phylloquinone and tocopherols.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a sterol, preferably selected from squalene, cholesterol, testosterone, progesterone and cortisone.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a flavonoid, preferably selected from rambinone and vestinone.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce an organic acid, preferably chosen from coumaric acid and 3-hydroxypropionic acid.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a polyol, preferably selected from sorbitol, xylitol and glycerol.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce a polyamine, preferentially spermidine.
  • the microorganism is genetically modified to produce or overproduce an aromatic molecule from a stereospecific hydroxylation, via a NADP-dependent cytochrome p450, preferentially chosen from phenylpropanoids, terpenes, lipids, tannins, flavors, hormones.
  • the genetically modified microorganism is advantageously cultured in a culture medium comprising the substrate to be converted.
  • the production or overproduction of a molecule of interest by a genetically modified microorganism according to the invention is obtained by culturing said microorganism in an appropriate culture medium known to those skilled in the art.
  • appropriate culture medium generally refers to a sterile culture medium providing nutrients essential or beneficial to the maintenance and / or growth of said microorganism, such as carbon sources; nitrogen sources such as ammonium sulphate; sources of phosphorus, for example, potassium phosphate monobasic; trace elements, for example, salts of copper, iodide, iron, magnesium, zinc or molybdate; vitamins and other growth factors such as amino acids or other growth promoters. Antifoam can be added as needed. According to the invention, this appropriate culture medium can be chemically defined or complex.
  • the culture medium can thus be of identical or similar composition to a synthetic medium, as defined by Verduyn et al., (Yeast 1992, 8: 501-17), adapted by Visser et al., (Biotechnology and Bioengineering. 2002. 79: 674-81), or commercially available such as YNB medium (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals or Sigma-Aldrich).
  • a synthetic medium as defined by Verduyn et al., (Yeast 1992, 8: 501-17), adapted by Visser et al., (Biotechnology and Bioengineering. 2002. 79: 674-81), or commercially available such as YNB medium (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals or Sigma-Aldrich).
  • the culture medium may comprise a simple carbon source, such as glucose, galactose, sucrose, molasses, or the by-products of these sugars, optionally supplemented with C0 2 as a carbon co-substrate.
  • a simple carbon source such as glucose, galactose, sucrose, molasses, or the by-products of these sugars, optionally supplemented with C0 2 as a carbon co-substrate.
  • the single carbon source must allow normal growth of the microorganism of interest. It is also possible in some cases to use a complex carbon source, such as lignocellulosic biomass, rice straw, or starch. The use of a complex carbon source generally requires pretreatment before use.
  • the culture medium contains at least one carbon source among monosaccharides such as glucose, xylose or arabinose, disaccharides such as sucrose, organic acids such as acetate, butyrate, propionate or valerate to promote different kinds of polyhydroxyalkanoate (PHA), treated or untreated glycerol.
  • monosaccharides such as glucose, xylose or arabinose
  • disaccharides such as sucrose
  • organic acids such as acetate, butyrate, propionate or valerate to promote different kinds of polyhydroxyalkanoate (PHA), treated or untreated glycerol.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • the nutritional factor supply N, O, P, S, K +, Mg2 +, Fe2 +, Mn, Co, Cu, Ca, Sn, Koller and al., Microbiology Monographs, G.-Q. Chen, 14: 85-119, (2010).
  • This is particularly the case for promoting the synthesis and intracellular accumulation of PHA including PHB.
  • any culture method allowing the production on an industrial scale of molecules of interest can be envisaged.
  • the culture is done in bioreactors, especially in batch mode, fed-batch and / or continuous culture.
  • the culture line associated with the production of the molecule of interest is fed-batch mode corresponding to a controlled feed into one or more substrates, for example via the addition of a concentrated solution of glucose, the concentration of which can be between 200 gL-1 and 700 gL-1.
  • Controlled vitamin feeding during the process may also be beneficial to productivity (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2002. 60: 67-72). It is also possible to add a solution of ammonium salts to limit nitrogen intake.
  • the fermentation is generally carried out in bioreactors, with possible stages of solid and / or liquid precultures in Erlenmeyer flasks, with a suitable culture medium containing at least one single carbon source and / or an exogenous CO 2 supply, required for production. of the molecule of interest.
  • the culture conditions of the microorganisms according to the invention are easily adaptable by those skilled in the art, depending on the microorganism and / or the molecule to be produced / overproduced.
  • the culture temperature is especially for yeasts between 20 ° C and 40 ° C, preferably between 28 ° C and 35 ° C, and more particularly about 30 ° C for S.cerevisiae.
  • the culture temperature is in particular between 25 ° C and 35 ° C, preferably 30 ° C for Cupriavidus necator.
  • the invention therefore also relates to the use of a genetically modified microorganism according to the invention, for the production or overproduction of a molecule of interest, other than an enzyme RuBisCO and / or a phosphoribulokinase (PRK) and preferably selected from amino acids, peptides, proteins, vitamins, sterols, flavonoids, terpenes, terpenoids, fatty acids, polyols and organic acids.
  • RuBisCO phosphoribulokinase
  • PRK phosphoribulokinase
  • the subject of the invention is also a biotechnological process for producing at least one molecule of interest other than an RuBisCO enzyme and / or a phosphoribulokinase (PRK), characterized in that it comprises a step of culturing a microorganism genetically modified according to the invention, under conditions allowing the synthesis or bioconversion, by said microorganism, of said molecule of interest, and optionally a step of recovery and / or purification of said molecule of interest.
  • PRK phosphoribulokinase
  • the microorganism is genetically modified to express at least one enzyme involved in the synthesis of said molecule of interest.
  • the microorganism is genetically modified to express at least one enzyme involved in the bioconversion of said molecule of interest.
  • the invention also relates to a method for producing a molecule of interest comprising (i) the insertion of at least one sequence encoding an enzyme involved in the synthesis or bioconversion of said molecule of interest in a microorganism recombinant according to the invention, (ii) the culture of said microorganism under conditions allowing the expression of said enzyme and optionally (iii) the recovery and / or purification of said molecule of interest.
  • a yeast such as a yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae, genetically modified to express a functional PRK and RuBisCO, a farnesene synthase and in which the expression of a TAL1 gene. (Gene ID: 851068) is at least partially inhibited.
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically engineered to express functional PRK and RuBisCO, and in which the expression of talA genes (Gene ID: 947006.) and sucA (Gene ID: 945303) is at least partially inhibited.
  • a bacterium such as a bacterium of the genus Escherichia coli, genetically engineered to express functional PRK and RuBisCO, and in which the expression of talA genes (Gene ID: 947006.) and sucA (Gene ID: 945303) is at least partially inhibited.
  • the carbon fixation flux is redirected from the oxidative branch of the pentose phosphate pathway to PRK / RuBisCO engineering ( Figure 2).
  • This flow is related to the end of the glycolysis pathway, in the formation of 3-phosphoglycerate (3PG), with the following yield:
  • ABSF flow balance analysis
  • FBA analyzes rely on mathematical models to simulate metabolic networks at the genome scale (Orth et al., Nat Biotechnol 2010; 28: 245-248).
  • the reconstructed networks contain the known metabolic reactions of a given organism and integrate the needs of the cell, in particular to ensure cell maintenance, or growth.
  • FBA analyzes make it possible to calculate the flow of metabolites through these networks, making it possible to predict theoretical growth rates as well as yields of production of metabolites.
  • the reactions necessary to simulate the molecule production by heterologous routes have also been added to the model.
  • a farnesene synthase-type reaction (EC 4.2.3.46 or EC 4.2.3.47) has in particular been added for the heterologous production of farnesene.
  • the acetoacetyl-CoA reductase (EC 1.1.1.36) and poly-P-hydroxybutyrate synthase (EC 2.3.1.B2 or 2.3.1.B5) reactions were added to the model. to simulate a heterologous pathway of ⁇ -hydroxyburyrate, the monomer of polyhydroxybutyrate.
  • the simulations were performed by applying to the model a set of constraints reproducible by those skilled in the art, aimed at simulating the in vivo culture conditions of a strain of S. cerevisiae under the conditions described according to the invention (for example, presence of non-limiting glucose in the medium, aerobic culture condition).
  • the simulations were performed by applying to the model a set of constraints reproducible by those skilled in the art, aimed at simulating the in vivo culture conditions of a strain of S. cerevisiae under the conditions described according to the invention (for example, presence of non-limiting glucose in the medium, aerobic culture condition).
  • the simulations are carried out by virtually inactivating the transaldolase enzyme reactions TAL1 and NQM1, so as to simulate the decreases in activity of the non-oxidative branch of the pentose pathway, described according to the invention.
  • Table 7 Maximum theoretical yield yields evaluated by ABF on a wild strain and a strain modified according to the invention, for the production of different molecules.
  • gx / gGLuc g of molecule X products, based on g of glucose consumed
  • the underlined part of the oligonucleotides is perfectly homologous to the KanMX sequence and the remainder of the sequence corresponds to the regions adjacent to the coding phase of the TAL1 gene on the Saccaromyces cerevisiae genome, so as to generate a PCR amplicon containing at the ends of the recombination sequences homologues of the TAL1 gene locus.
  • strain CEN.PK 1605 was cultured in a volume of 50 ml YPD complex (yeast extract peptone dextrose) at 30 ° C, up to a 600 nm optical density of 0.8. The cells were centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant was removed and the cells resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells were resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • YPD complex yeast extract peptone dextrose
  • a transformation mix was prepared in a 2 ml tube as follows: 250 of 50% PEG, 10 "carrier” DNA at 5 mg / mL, 36 ⁇ M, 1 M lithium acetate, 10 ⁇ ⁇ purified PCR reaction (deletion cassette) and water to 350 ⁇ .
  • the tube was centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature and the supernatant discarded.
  • Cells were resuspended in 2 mL of YPD, transferred to a 14 mL tube and incubated for 2 hours at 30 ° C 200 rpm. The cells were then centrifuged for 1 minute at 5000 rpm at room temperature. The supernatant was removed and the cells resuspended in 1 ml of sterile water and centrifuged again for 1 minute and resuspended in 100 ⁇ l of sterile water and spread on YPD + G418 180 ⁇ g / ml.
  • the coding phase of the hygromycin B resistance gene resulting from the hphMX cassette (loxP-pAgTEF1-hphMX-tAgTEF1-loxP) and contained on the plasmid pUG75 (P30671) - Euroscarf, is amplified with the oligonucleotides Sdnqml and Rdnqml ( Table 8). This makes it possible to generate an Anqml PCR amplicon containing, at the ends, homologous recombination sequences of the NQM1 Transaldolase gene locus.
  • strain EQ-0520 (CEN.PK1605 AtoH :: kan) was cultured in a volume of 50 ml YPD complex (yeast extract peptone dextrose) at 30 ° C up to an optical density. at 600nm of 0.8. The cells were centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. The supernatant was removed and the cells resuspended in 25 ml sterile water and centrifuged again for 5 minutes at 2500 rpm at room temperature. After removing the supernatant, the cells were resuspended in 400 ⁇ l of sterile 100 mM lithium acetate.
  • YPD complex yeast extract peptone dextrose
  • a transformation mix was prepared in a 2 ml tube as follows: 250 ⁇ l, 50% PEG, 10 ⁇ l, "carrier" DNA at 5 mg / ml, 36 ⁇ l, lithium acetate 1M, 10 ⁇ ⁇ purified PCR reaction (deletion cassette) and water to 350 ⁇ .
  • a gene encoding a phosphoribulokinase PRK which is grafted onto the pentose phosphate pathway by consuming ribulose-5P to give ribulose-1.5bisP and
  • RuBisCO type I (with RbcL and RbcS structural genes and RbcX, GroES and GroEL chaperones). RuBisCO consumes ribulose-1.5bisP and one mole of CO2 to form 3phosphoglycerate
  • yeast gene lacks alpha-farnesene synthase gene (AFS1; GenBank accession number AY182241).
  • the seven genes required for engineering were cloned on three plasmid vectors capable of replicating autonomously, with compatible origins of replication and each carrying a gene for complementation of different auxotrophies, making it possible to select the strains containing the three plasmid constructs. Two of these plasmids are monocopies, with an Ars / CEN origin of replication and the third is multicopy with a 2 ⁇ origin.
  • strain EQ-0521 was grown in a volume of 50 ml of YPD rich complex medium at 30 ° C and mix the following transformation: 250 ⁇ ⁇ of 50% PEG, 10 DNA " 5 mg / mL carrier, 36 1M lithium acetate, 10 (3 ⁇ % of a combination of pFPP45 + pFPP56 + pFPP20 or pL4 + pFPP56 + pFPP20 or pL5 + pFL36 + pCM185) and water at 350 ⁇ .
  • YNB yeast without nitrogen base supplemented with ammonium sulfate 1 , glucose
  • CSM MP Biomedicals
  • the strains obtained are:
  • EQ-0525 (CEN.PK1605) (pL5 + pFL36 + pCM185) Strains EQ-0523 (PRK / RuBisCO / AtoH :: kan ⁇ nqml :: hph), EQ-0524 (PRK / RuBisCO / AtoH :: kan Anqml :: hph + farnesene synthase) and EQ-0525 (farnesene synthase) to growth on YNB liquid medium with 20g / L glucose and 10% C0 2
  • the batch cultures carried out in Erlenmeyer flasks are carried out with the appropriate culture medium and an exogenous CO2 supply of 10%, in a shaking incubator (120 RPM, 30 ° C.), with an inoculation at 0.05 OD 600 nm measured using an EON spectrophotometer (BioTek Instruments).
  • the strain of interest is cultured on YNB + CSM-LUW medium with 20 g / L of glucose and an exogenous CO2 contribution of 10%
  • the strains are adapted to a minimum mineral medium free of the amino acids and nitrogenous base included in the CSM-LUW, that is only YNB with 20 g / L of glucose and an exogenous CO2 contribution.
  • This strain of interest is compared with a reference strain EQ-0525 producing farnesene following the addition of a heterologous farnesene synthase, without deletion of TAL1 and NQM1 nor addition of exogenous PRK and RuBisCO. Batch cultures carried out in Erlenmeyer flasks are carried out under the conditions described above.
  • the concentration of farnesene is quantified from the supernatant of fermentation must. Briefly, the cell suspensions are centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The dodecane phase is diluted 10-fold in hexane and is injected into GC-MS for analysis according to the protocol described in Tippman et al. (Biotechnol Bioeng 2016, 1131: 72-81).
  • This strain is derived from a gene deletion library (Baba et al., Mol Syst Biol., 2006; 2: 2006.0008) in Escherichia coli and supplied by the Coli Genetic Stock Center under the name JW0715-2 and with the reference 8786 (JW0715-2: MG1655 AsucA :: Kan). a) Elimination of the selection cassette by specific recombination of the FTR regions by recombination Flp
  • the selection cassette had to be removed using a recombinase.
  • the plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination kit by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol.
  • the cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, tetracycline 0.0003% and added 0.3% L-arabinose.
  • Counter-selection of the clones obtained is carried out by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC002: MG1655 AsucA b) Deletion of the edd-eda operon, coding for the Entner-Doudorojf metabolic pathway
  • the deletion of the edd-eda operon is carried out by homologous recombination and use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit, according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a 50 nucleotide homologous 5'-sequence at adjacent regions of the deletion locus (positions 1932065- 1932115 and 1934604-1934654) on the chromosome, thus generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome on either side of the entire operon;
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC002 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%;
  • Plasmid p707-Flpe (supplied in the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® kit / ET® Recombination by Gene bridges) is transformed by electroporation according to the kit protocol. The cells are selected on LB agar supplemented with 0.2% glucose, 0.0003% tetracycline and added with 0.3% L-arabinose. Counter-selection of the clones obtained is carried out by verifying that they are no longer able to grow on the same medium supplemented with kanamycin 0.0015%.
  • the strain obtained is called EQ.EC003: MG1655 AsucA Aedd-eda c) Deletion of the talA gene
  • the deletion of the talA gene is carried out by homologous recombination and the use of the Quick & Easy E. coli Gene Deletion Red® / ET® Recombination Kit, according to the protocol of the supplier Gene bridges.
  • Oligonucleotides designed to amplify an expression cassette of a FRT-PKG-gb2-neo-FRT resistance gene and having a 5 'homologous sequence on 50 nucleotides to the adjacent regions of the deletion locus, that is to say the coding phase of the gene (talA) (Gene ID: 947006), thereby generating recombination arms of the cassette on the bacterial genome.
  • the strain of Escherichia coli K-12, EQ.EC003 is transformed by electroporation with the plasmid pRedET, according to the kit protocol.
  • the colonies obtained are selected on rich medium complex LB agar 0.2% glucose, tetracycline 0.0003%.
  • ribosome binding sequences presented in the Table, having variable translation efficiencies, as described in Zelcbuch et al. (Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res 2013 May; 41 (9): e98; Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21; 2 (6): 327-36. Doi: 10.1021 / sb400002n) are inserted between the coding phase of each gene.
  • each coding phase intercalated by an RBS sequence is constructed by successive insertion into a pZA1 vector (Expressys) which contains a PLtetO-1 promoter, a pl5A average replication origin, and an ampicillin resistance gene.
  • Table 11 Composition of expression cassettes on plasmids
  • A (SEQ ID NO: 5) AGGAGGTTTGGA
  • EQ.EC 021 (EQ.EC 004+ pEQEC005): MG1655 AsucA Aedd-eda-talAr.kan (RuBisCO)
  • EQ.EC 022 (EQ.EC 004+ pEQEC006): MG1655 AsucA Aedd-eda talAr. kan (RuBisCO + PRK)
  • EQ.EC 024 (EQ.EC 003+ pEQEC008): MG1655 AsucA Aedd-eda AtalArkan (PRK)
  • the clones are selected on LB medium supplemented with 100 mg / L of ampicillin. After obtaining a sufficient amount of biomass, cultures with a volume greater than or equal to 50 ml in Erlenmeyer flasks of at least 250 ml are seeded in order to adapt the strain to the use of PRK / RuBisCO engineering. . This adaptation is carried out on the LB culture medium with 2 g / l of glucose, and an exogenous C0 2 feed of 1 atmosphere at 37 ° C. as described above.
  • the cells from 500 ml of LB culture are inoculated into 20 ml of MS medium (40 g / l of glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l).
  • MS medium 40 g / l of glucose, 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 20 g / l).
  • Glutamate and residual glucose are measured with an organic analyzer (Sakura seiki).
  • the Y p / S carbon yield is calculated in grams of glutamate produced per gram of glucose consumed. This yield increases by 8% in the EQ.EC 022 strains (RuBisCO + PRK), compared with the control strains EQ.EC 020 (empty), EQ.EC 021 (RuBisCO alone).
  • the control strain EQ.EC 024 (PRK alone) is not viable.
  • Example 4 Improvement of PHB production in C. necator a) Inhibition of the non-oxidative branch of the pentose phosphate pathway The increase in reducing power can also improve in an interesting way the yield of already existing metabolic pathways. This is the case for the bacterial strain Ralstonia eutropha ATCC 17699 (Cupriavidus necator) which naturally produces polyhydroxybutyrate (PHB). This bacterium is capable of developing both in autotrophic and heterotrophic conditions.
  • the deletion, according to the invention, of the tal gene makes it possible to concentrate the metabolic flux on the oxidative pathway of the pentose phosphates by increasing the NADPH reduced nucleotide pool, thus making it possible to increase the production yield of PHB. , but also to use the pathway of glycolysis.
  • This Cuprividus necator strain (R. eutropha H16) has a plasmid pHG1 mega and two chromosomes. Deletion of the tal gene is achieved by generating a SacA suicide gene vector for gram negative bacteria, as described in Trocet et al. and Lindenkamp et al.
  • the transfer of the genetic material is done by conjugation by depositing on a plate a culture deposition point of Ralstonia Eutropha on a box containing a cellular carpet of bacteria S 17-1 and the selection is made on medium NT (Nutrient browth) to 30 ° C, in the presence of 10% sucrose as a selection (Hogrefe et al., J. Bacteriol 1984 Apr; 158 (l): 43-8.) And validated on a mineral medium containing 25 ⁇ g / ml tetracycline.
  • Two PCR amplicons corresponding to the adjacent regions of the edd and eda genes are cloned by restriction according to the procedure described in Srinivasan et al. (Appl., Environ Microbiol., 2002 Dec, 68 (12): 5925-32) in the plasmid pJQ200mpl8Cm.
  • the modified plasmid pJQ200mpl8Cm : Aedd-eda is then transformed into a strain of E. coli S 17-1, by transformation by the calcium chloride method.
  • the transfer of the genetic material is done by conjugation, by depositing on a plate a culture deposition point of Ralstonia Eutropha EQCN_010 on a box containing a cellular carpet of bacteria S 17-1 and the selection is done on NT medium (Nutrient browth) at 30 ° C., in the presence of 10% sucrose by selection (Hogrefe et al., J. Bacteriol 1984 Apr; 158 (1): 43-8) and validated on a mineral medium containing 50 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the inoculum from a frozen stock is spread on a solid medium at a rate of 50 to 100 ⁇ ⁇ from a cryotube incubated at 30 ° C for 48 to 96h, in the presence of glucose.
  • Expression of the genes encoding RuBisCO and PRK are maintained in C. necator under heterotrophic aerobic conditions (Rie Shimizu et al., Sci. Rep. 2015; 5: 11617. Published online 2015 Jul 1.).
  • the batch cultures carried out in Erlenmeyer flasks (10 ml in 50 ml, then 50 ml in 250 ml) are carried out with the appropriate culture medium, glucose 20 g / l and an exogenous C0 2 supply of 10% in a stirred incubator. (100-200 RPM, 30 ° C), with minimal inoculation
  • strain of interest EQCN_011 improving the production yield of PHB is compared with a reference strain H16 naturally accumulating PHB in heterotrophic conditions in the presence of a nutritional limitation.
  • the productivity of the strains is compared in bioreactors.
  • the cultures carried out in bioreactors are inoculated from solid and / or liquid amplification chains into Erlenmeyer flasks under the conditions described above.
  • the 750-ml My-control (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) bioreactors or 2.5 L Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) are stocked at a minimum concentration equivalent to
  • the accumulation of PHB is decoupled from growth.
  • the culture is regulated at 30 ° C, aeration is maintained between 0.1 VVM (gas volume / liquid volume / min) and 1 VVM, in order to maintain a minimum concentration of dissolved oxygen greater than 20% (30 ° C, 1 bar).
  • the agitation is adapted according to the scale of the bioreactor used.
  • the inlet gas flow rate consists of air optionally supplemented with CO2.
  • the CO2 supplementation is between 1 and 10%.
  • the pH is regulated to 7, by adding a solution of ammonia at 14 or 7%.
  • the fed-batch culture mode allows a non-limiting carbon substrate contribution associated with a phosphorus or nitrogen limitation, while maintaining a constant carbon / phosphorus or carbon / nitrogen ratio.
  • the protocol consists in adding 1 ml of chloroform to 10 mg of freeze-dried cells followed by addition of 850 ⁇ l of methanol and 150 ⁇ l of sulfuric acid. The mixture is heated for 2.5 hours at 100 ° C, cooled and 500 ⁇ 1 of water are added. The two phases are separated by centrifugation and the organic phase is dried by the addition of sodium sulfate. The samples are filtered and analyzed as described by Millier et al. (Appl Environ Microbiol 2013 Jul; 79 (14): 4433-9). Comparison of cultures of wild-type C. necator H16 and strain EQCN_011: H16 Atal Aedd-eda, respectively, shows a 2% increase in PHB production yield (in grams of PHB per gram of glucose consumed) in favor of the modified strain according to the invention.

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Abstract

L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO de type I ou II et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène et/ou à surproduire une molécule endogène. L'invention concerne également l'utilisation d'un tel microorganisme génétiquement modifié, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt et des procédés de synthèse ou bioconversion de molécules d'intérêt.

Description

Microorganisme génétiquement optimisé pour la production de molécules d'intérêt
Domaine de l'invention
L'invention concerne un microorganisme génétiquement modifié, apte à utiliser du dioxyde de carbone comme source de carbone au moins partielle pour la production de molécules d'intérêt. Plus particulièrement, l'invention a trait à un microorganisme dans lequel au moins la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée. L'invention a également trait à des procédés pour la production d'au moins une molécule d'intérêt utilisant un tel microorganisme. Etat de la technique
Depuis plusieurs années, de nombreux procédés microbiologiques ont été développés pour permettre la production de molécules d'intérêt en grandes quantités.
Ainsi, des procédés de fermentation sont utilisés pour faire produire des molécules par un microorganisme à partir d'une source de carbone fermentescible, telle que le glucose. Des procédés de bioconversion ont également été développés, pour permettre à un microorganisme de convertir un co-substrat, non assimilable par ledit microorganisme, en une molécule d'intérêt. Là encore, une source de carbone est nécessaire, non plus pour la production proprement dite de la molécule d'intérêt, mais pour la production de cofacteurs, et plus particulièrement de NADPH, pouvant être nécessaire à la bioconversion. D'une manière générale, le rendement de production par de tels procédés microbiologiques est faible du fait principalement des besoins en cofacteurs et de la difficulté d'équilibrer les réactions métaboliques redox. Se pose également le problème du coût de revient de telles molécules, puisqu'une source de carbone assimilable par le microorganisme est toujours nécessaire. Autrement dit, actuellement pour produire une molécule d'intérêt avec un procédé microbiologique, il est nécessaire de fournir une molécule (glucose, ou autre), certes de moindre valeur industrielle, mais qui suffit à rendre la production de certaines molécules non économiquement intéressante.
En parallèle, le dioxyde de carbone (C02), dont les émissions dans l'atmosphère ne cessent de croître, n'est pas ou peu utilisé dans les procédés microbiologiques actuels, alors que sa consommation par les microorganismes pour la production de molécules d'intérêt permettrait non seulement de réduire les coûts de production, mais également de répondre à des problématiques écologiques certaines.
Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules d'intérêt en grandes quantités et avec des coûts de revient plus faibles qu'avec les procédés actuels.
Résumé de l'invention
L'intérêt d'utiliser des microorganismes non-photosynthétiques génétiquement modifiés pour pouvoir capturer le C02 et l'utiliser comme source de carbone principale, au même titre que les plantes et les microorganismes photosynthétiques a déjà été démontré. Ainsi, des microorganismes modifiés de manière à exprimer une RuBisCO (Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase - EC 4.1.1.39) et une PRK (phosphoribulokinase - EC 2.7.1.19) fonctionnelles pour pouvoir ainsi reproduire un cycle de Calvin et convertir le ribulose 5 phosphate en deux molécules de 3-phosphoglycérate par capture d'une molécule de dioxyde de carbone ont été développés. En travaillant sur les solutions apportées par le cycle de Calvin pour produire des molécules d'intérêt en utilisant le CO2 comme source de carbone, les inventeurs ont découvert qu'en couplant une partie du cycle de Calvin (PRK/RuBisCO) à une inhibition au moins partielle de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates, il était possible d'augmenter le rendement de production de molécules d'intérêt. De manière intéressante, cette inhibition, avantageusement réalisée en aval de la production de ribulose-5-phosphate favorise la consommation de CO2 exogène par le microorganisme. Les microorganismes ainsi développés permettent de produire à grande échelle et avec un rendement industriellement intéressant un grand nombre de molécules d'intérêt, telles que des acides aminés, acides organiques, terpènes, terpénoïdes, peptides, acides gras, polyols, etc. L'invention a donc pour objet un microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt, autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou phosphoribulokinase (PRK).
L'invention concerne également l'utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
La présente invention concerne également un procédé biotechnologique pour produire ou surproduire au moins une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt. Elle concerne également un procédé de production d'une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Description des figures
Figure 1 : Représentation schématique de la glycolyse, de la voie Entner-Doudoroff et de la voie des pentoses phosphates, montrant l'inhibition de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates, selon l'invention ; Figure 2 : Représentation schématique de la glycolyse et de la voie des pentoses phosphates, montrant l'inhibition de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates et la prise en charge du ribulose-5- phosphate par PRK et RuBisCO, selon l'invention.
Description détaillée de l'invention
Définitions Les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des microorganismes qui ont été génétiquement modifiés pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues, ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de modification.
Il est entendu que les termes «microorganisme recombinant», «microorganisme modifié» et «cellule hôte recombinante» se réfèrent non seulement au microorganisme recombinant particulier, mais à la descendance ou à la descendance potentielle d'un tel microorganisme. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.
Dans le contexte de l'invention, une voie métabolique au moins partiellement « inhibée » ou « inactivée » s'entend d'une voie métabolique altérée, qui ne peut plus se dérouler correctement dans le microorganisme considéré, comparativement au même microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber ladite voie métabolique). Notamment la voie métabolique peut être interrompue, entraînant l'accumulation d'un métabolite intermédiaire. Une telle interruption peut être obtenue par exemple par inhibition de l'enzyme nécessaire à la dégradation d'un métabolite intermédiaire de la voie métabolique considérée et/ou par inhibition de l'expression du gène codant pour cette enzyme. La voie métabolique peut également être atténuée, c'est-à-dire ralentie. Une telle atténuation peut être obtenue par exemple par inhibition partielle d'une ou plusieurs enzymes intervenant dans la voie métabolique considérée et/ou par inhibition partielle de l'expression d'un gène codant pour au moins une de ces enzymes et/ou en jouant sur les cofacteurs nécessaires pour certaines réactions. L'expression « voie métabolique au moins partiellement inhibée » signifie que le niveau de la voie métabolique considéré est réduit d'au moins 20%, plus préférentiellement au moins 30%, 40%, 50%, ou plus, comparativement au niveau dans un microorganisme sauvage. La réduction peut être plus importante, et notamment être au moins supérieure à 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l'invention, l'inhibition peut être totale, en ce sens que la voie métabolique considérée n'est plus du tout utilisée par ledit microorganisme. Selon l'invention, une telle inhibition peut être temporaire ou définitive.
Selon l'invention, on entend par « inhibition de V expression d'un gène » le fait que ledit gène n'est plus exprimé dans le microorganisme considéré ou que son expression est réduite, comparativement au microorganisme sauvage (non génétiquement modifié pour inhiber l'expression du gène), conduisant à l'absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l'inhibition peut être totale, c'est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n'est plus du tout produite. L'inhibition de l'expression d'un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique correspondante. Selon l'invention, toute méthode d'inhibition d'un gène, connue en soi par l'homme de l'art et applicable à un microorganisme peut être utilisée. Par exemple, l'inhibition de l'expression d'un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 ; 97:6640-5 ; Lodish et al, Molecular Cell Biology 4th ed. 2000. W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-3136-3 ) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l'expression d'un gène et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas et al, Cell. 1987;51:503-12) ; modification d'une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al, Methods Mol Biol. 2011;765:275-94. doi: 10.1007/978-l-61779-197-0_16) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagénèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles (transposons), d'origine naturelle ou artificielle. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interfèrent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L'inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al, PNAS; 93: 1156-1160), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al, Methods Mol Biol. 2016;1338:27-42. doi: 10.1007/978-1- 4939-2932-0_3), d'un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites 'CRISPR' (Mali et al, Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.2649), ou encore de méganucléases (Daboussi et al, Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79). L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène.
Par voie de biosynthèse ou bioconversion « NADPH-dépendante » ou « consommatrice de NADPH », on entend dans le contexte de l'invention l'ensemble des voies de biosynthèse ou bioconversion dont une ou plusieurs enzymes nécessitent l'apport concomitant d'électrons obtenus par l'oxydation d'un cofacteur NADPH. Les voies de biosynthèse ou bioconversion « NADPH-dépendantes » concernent notamment la synthèse d'acides aminés (e.g. arginine, lysine, méthionine, thréonine, proline, glutamate, homosérine, isoleucine, valine), de terpénoïdes et de terpènes (e.g. farnésène), de vitamines et précurseurs (e.g. pantoate, pantothenate, transneurosporène, phylloquinone, tocophérols), de stérols (e.g. squalène, cholestérol, testostérone, progestérone, cortisone), de flavonoïdes (e.g. frambinone, vestinone), d'acides organiques (e.g. acide coumarique, acide 3-hydroxypropionique), de polyols (e.g. sorbitol, xylitol, glycérol), de polyamines (e.g. spermidine), de molécules aromatiques à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant (e.g. phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones).
Le terme «exogène» tel qu'utilisé ici en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui ne sont pas normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produites par le microorganisme considéré. A l'inverse, le terme "endogène" ou "natif en référence à diverses molécules (séquences nucléotidiques, peptides, enzymes, etc.), désigne des molécules qui sont normalement ou naturellement trouvées dans et / ou produit par le microorganisme considéré. Microorganismes
L'invention propose des microorganismes génétiquement modifiés pour la production d'une molécule d'intérêt, endogène ou exogène.
Par microorganisme « génétiquement modifié », on entend que le génome du microorganisme a été modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant une enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse ou de bioconversion d'une molécule d'intérêt, ou codant un fragment biologiquement actif de celle-ci. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome dudit microorganisme ou d'un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l'invention, le génome du microorganisme s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu dans ledit microorganisme, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel dans ledit microorganisme, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome du microorganisme une unité transcriptionelle comportant la séquence nucléique d'intérêt, placée sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s). Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. Des promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. Par exemple, lorsque le microorganisme est une levure, il est possible d'utiliser un promoteur constitutif, tel que celui d'un gène parmi TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1. Des exemples de promoteurs inductibles utilisables chez la levure sont les promoteurs tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05.
D'une manière générale, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention présente les caractéristiques suivantes :
Expression d'une RuBisCO (EC 4.1.1.39) fonctionnelle ;
Expression d'une PRK (EC 2.7.1.19) fonctionnelle ;
Inhibition au moins partielle de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates ; et
- Expression d'au moins un gène participant à la synthèse et/ou la bioconversion d'une molécule d'intérêt, et/ou inhibition d'au moins un gène codant une activité compétitrice à la synthèse et/ou la bioconversion d'une molécule d'intérêt.
Selon l'invention, tout microorganisme peut être utilisé. Préférentiellement le microorganisme est une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues, ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie ou cyanobactérie.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une levure, préférentiellement choisie parmi les levures ascomycètes (Spermophthoraceae et Saccharomycetaceae), les levures basidiomycètes (Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, et Filobasidiella) et les levures deuteromycètes appartenant au Fungi imperfecti (Sporobolomycetaceae, et Cryptococcaceae). Préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l'invention appartient au genre Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Lipomyces, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, ou Debaryomyces. Plus préférentiellement, la levure génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii et Lipomyces starkeyi. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est un champignon, et plus particulièrement un champignon «filamenteux ». Dans le contexte de l'invention, les « champignons filamenteux » désignent toutes les formes filamenteuses de la sous-division Eumycotina. Par exemple, le champignon génétiquement modifié selon l'invention appartient au genre Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochiobolus ou Pyricularia. Préférentiellement, le champignon génétiquement modifié selon l'invention est choisi parmi Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awomari, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, et Trichoderma viride. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une microalgue. Dans le contexte de l'invention, on désigne par « microalgue » l'ensemble des algues microscopiques de type eucaryote, appartenant préférentiellement aux classes ou superclasses des Chlorophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Diatomées ou Bacillariophyta, Euglénophyceae, Rhodophyceae, ou Trebouxiophyceae. Préférentiellement, les microalgues génétiquement modifiées selon l'invention sont choisies parmi Nannochloropsis sp. (e.g. Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina), Tetraselmis sp. (e.g. Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii), Chlorella sp. ( e.g. Chlorella salina, Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella emersonii, Chlorella minutissima, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris), Chlamydomonas sp. (e.g. Chlamydomonas reinhardtii) Dunaliella sp. (e.g. Dunaliella tertiolecta, Dunaliella salina), Phaeodactulum tricornutum, Botrycoccus braunii, Chroomonas salina, Cyclotella cryptica, Cyclotella sp.,Ettlia texensis, Euglena gracilis, Gymnodinium nelsoni, Haematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Monoraphidium minutum, Monoraphidium sp., Neochloris oleoabundans, Nitzschia laevis, Onoraphidium sp., Pavlova lutheri, Phaeodactylum tricornutum, Porphyridium cruentum, Scenedesmus sp. (e.g. Scenedesmus obliquuus, Scenedesmus quadricaula, Scenedesmus sp.), Stichococcus bacillaris, Spirulina platensis, Thalassiosira sp.
Dans un mode de réalisation, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est une bactérie, préférentiellement choisie parmi les phyla Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacterioidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, ou Verrucomicrobia. De manière préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention appartient au genre Acaryochloris, Acetobacter, Actinobacillus, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Anaerobiospirillum, Aquifex, Arthrobacter, Arthrospira, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Burkholderia, Chlorobium, Chromatium, Chlorobaculum, Clostridium, Corynebacterium, Cupriavidus, Cyanothece, Enterobacter, Deinococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Gloeobacter, Gluconobacter, Hydrogenobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Mannheimia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Microcystis, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrospina, Nitrospira, Nostoc, Phormidium, Prochlorococcus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptomyces, Synechoccus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Trichodesmium, ou Zymomonas. De manière encore préférée, la bactérie génétiquement modifiée selon l'invention est choisie parmi les espèces Agrobacterium tumefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium pasteurianum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beigerinckii, Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Hydrogenobacter thermophilus, Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Mannheimia succiniciproducens, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium etli, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptomyces coelicolor, Zymomonas mobilis, Acaryochloris marina, Anabaena variabilis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Chlorobium tepidum, Chlorobaculum sp., Cyanothece sp., Gloeobacter violaceus, Microcystis aeruginosa, Nostoc punctiforme, Prochlorococcus marinus, Synechococcus elongatus, Synechocystis sp., Thermosynechococcus elongatus, Trichodesmium erythraeum, et Rhodopseudomonas palustris.
Expression d'une RuBisCO et d'une PRK fonctionnelles
Selon l'invention, le microorganisme peut exprimer naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles. C'est le cas par exemple des microorganismes photosynthétiques, tels que les microalgues ou les cyanobactéries.
Il existe plusieurs formes de RuBisCO dans la nature (Tabita et al., J Exp Bot. 2008;59(7): 1515- 24. doi: 10.1093/jxb/erm361). Les formes I, II et III catalysent les réactions de carboxylation et d'oxygénation du ribulose 1,5-biphosphate. La forme I est présente chez les eucaryotes et les bactéries. Elle est constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS). Le complexe enzymatique fonctionnel est un hexadécamère constitué de huit sous-unités L et huit sous-unités S. L'assemblage correct de ces sous-unités nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne spécifique : RbcX (Liu et al., Nature. 2010 Jan 14;463(7278): 197-202. doi: 10.1038/nature08651). La forme II se trouve principalement chez les protéobactéries, les archaea et les algues dinoflagellées. Sa structure est beaucoup plus simple : il s'agit d'un dimère formé de deux sous-unités RbcL identiques. Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type I peuvent s'appeler rbcL/rbcS (par exemple, Synechococcus elongatus), ou encore cbxLC/cbxSC, cfxLC/cfxSC, cbbL/cbbS (par exemple, Cupriavidus necator). Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type II s'appellent généralement cbbM (par exemple, Rhodospirillum rubrum). La forme III est présente chez les archaea. On la trouve généralement sous la forme de dimères de sous-unité RbcL, ou en pentamères de dimères. Selon l'organisme, les gènes codant pour une RuBisCO de type III peuvent s'appeler rbcL (par exemple, Thermococcus kodakarensis), cbbL (par exemple, Haloferax sp. ) .
On connaît deux classes de PRKs : les enzymes de classe I qui se rencontrent chez les protéobactéries sont des octamères, tandis que celles de classe II qui se trouvent chez les cyanobactéries et chez les plantes sont des tétramères ou des dimères. Selon l'organisme, les gènes codant pour une PRK peuvent s'appeler prk (par exemple, Synechococcus elongatus), prkA (par exemple, Chlamydomonas reinhardtii), prkB (par exemple, Escherichia coli), prkl, prk2 (par exemple, Leptolyngbya sp.), cbbP (par exemple, Nitrobacter vulgaris) ou encore cfxP (par exemple, Cupriavidus necator).
Dans le cas où le microorganisme utilisé n'exprime pas naturellement une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, ledit microorganisme est modifié génétiquement pour exprimer une RuBisCO et une PRK hétérologues. Avantageusement, dans un tel cas, le microorganisme est transformé de manière à intégrer dans son génome une ou plusieurs cassettes d'expression intégrant les séquences codant pour lesdites protéines, et avantageusement les facteurs transcriptionnels appropriés. Selon le type de RuBisCO à exprimer, il peut être nécessaire de faire également exprimer par le microorganisme une ou des protéines chaperonnes, afin de favoriser le bon assemblage des sous-unités formant la RuBisCO. C'est le cas notamment pour la RuBisCO de type I, où l'introduction et l'expression de gènes codant pour une chaperonne spécifique (Rbcx) et des chaperonnes généralistes (GroES et GroEL, par exemple) s'avèrent nécessaire pour obtenir une RuBisCO fonctionnelle. La demande WO2015/107496 décrit en détail comment modifier génétiquement une levure pour qu'elle exprime une RuBisCO de type I et une PRK fonctionnelles. Il est également possible de se référer à la méthode décrite dans GUADALUPE- MEDINA et al. (Biotechnology for Biofuels, 6, 125, 2013).
Dans un mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type I. Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type IL Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer une RuBisCO de type III.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d'exemples, des séquences codant pour des RuBisCO et PRK qui peuvent être utilisées pour transformer un microorganisme de manière à ce qu'il exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles. Tableau 1 : Exemples de séquences codant pour une RuBisCO
Figure imgf000012_0001
Tableau 2 : Exemples de séquences codant pour une PRK
Gène GenBank Gl Organisme
Prk BAD78757.1 56685535 Synechococcus elongatus
cfXP P19923.3 125575 Cupriavidus necator
PRK P09559.1 125579 Spinacia oleracea
cbbP P37100.1 585367 Nitrobacter vulgaris Inhibition de la branche non-oxydative de la voie des ventôses phosphates
Selon l'invention, la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée, de sorte que le microorganisme n'est plus apte à rejoindre la voie de la glycolyse par la voie des pentoses phosphates. Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates en aval de la production de ribulose- 5 -phosphate (figure 1).
L'interruption de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates en aval de la production de ribulose-5-phosphate (Ru5P) est avantageusement obtenue par inhibition au moins partielle d'une transaldolase (E.C. 2.2.1.2) normalement produite par le microorganisme.
La transaldolase est une enzyme qui catalyse une réaction de type transférase entre les couples de métabolites sédoheptulose 7-phosphate/glycéraldéhyde 3-phosphate, et érythrose-4- phosphate/fructose 6-phosphate.
Selon l'organisme les gènes codant pour la transaldolase peuvent s'appeler tal, talA, talB (par exemple chez Escherichia coli, Synechocystis sp.), TALDO, TALDO 1 , TALDOR (par exemple chez Homo sapiens, Mus musculus), TAL1 (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae), TAL2 (par exemple chez Nos toc punctiforme), talAl, talA2 (par exemple Streptococcus gallolyticus), talB l, talB2 (par exemple Azotobacter vinelandii), ou encore NQM1 (par exemple chez Saccharomyces cerevisiae). De manière alternative ou additionnelle, l'interruption de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates en aval de la production de ribulose-5-phosphate (Ru5P) peut être obtenue par inhibition au moins partielle d'une transketolase (E.C. 2.2.1.1) normalement produite par le microorganisme.
La transketolase est une enzyme qui catalyse une réaction de type transférase entre les couples de métabolites sédoheptulose-7-phosphate/glycéraldéhyde 3-phosphate, et ribose-5- phosphate/xylulose-5-phosphate, ainsi qu'entre les couples fructose-6- phosphate/glycéraldéhyde 3-phosphate, et érythrose-4-phosphate/xylulose-5-phosphate. Selon l'organisme, les gènes codant pour la transketolase peuvent s'appeler TKL, TKLl, TKL2 (par exemple Saccharomyces cerevisiae), tklA, tklB (par exemple Rhodobacter sphaeroides), tktA, tktB, (par exemple Escherichia coli), TKT, TKT1, TKT2 (par exemple Homo sapiens, Dictyostelium discoideum), ou encore TKTL1, TKTL2 (par exemple Bos taurus), ou encore cbbT, cbbTC, cbbTP (par exemple Cupriavidus necator, Synechococcus sp.).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la transaldolase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée. De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la transketolase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 3 et 4 ci-dessous listent, à titre d'exemples, les séquences codant une transaldolase ou une transketolase, qui peuvent être inhibées en fonction du microorganisme cible. L'homme du métier sait quel gène correspond à l'enzyme d'intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 3 : Exemples de séquences codant pour une transaldolase
Figure imgf000014_0001
Tableau 4 : Exemples de séquences codant pour une transketolase
Figure imgf000014_0002
D'une manière générale, la jonction entre la voie des pentoses phosphates et la voie de la glycolyse n'est plus possible par le biais de la branche non-oxydative des pentoses phosphates, ou au moins fortement diminuée, dans le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention. Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une levure du genre Saccharomyces cerevisiae dans laquelle l'expression du gène NQM1 et/ou TAL1 est au moins partiellement inhibée.
Dans un autre exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène talA est au moins partiellement inhibée.
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée n'est plus apte à rejoindre la voie de la glycolyse par la voie des pentoses phosphates. Il est par contre apte à produire du glycéraldéhyde- 3 -phosphate (G3P), à partir du Ru5P synthétisé par la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates, via l'expression hétérologue de PRK et RuBisCO, tout en fixant une molécule de carbone supplémentaire (Figure 2).
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié est apte à produire du NADPH via la branche oxydative des pentoses phosphates, et du G3P via l'expression hétérologue de PRK et RuBisCO, en utilisant du C02 exogène, et notamment du CO2 atmosphérique, comme source de carbone complémentaire.
Ainsi, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention permet d'augmenter le rendement carbone, en fixant et en utilisant du CO2 exogène, pour la production de NADPH et de G3P (et par la suite de molécules d'intérêt). Là encore, il y a augmentation du rendement carbone.
Inhibition de la voie d'Entner-Doudoroff
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention a une voie d'Entner-Doudoroff, et celle-ci est en au moins partiellement inhibée. Cette voie, principalement retrouvée chez les bactéries (notamment de type Gram-), est une alternative à la glycolyse et à la voie des pentoses pour la production de pyruvate à partir de glucose. Plus précisément, cette voie se branche sur la voie des pentoses phosphates au niveau du P-gluconate pour alimenter la glycolyse au niveau notamment du pyruvate.
Préférentiellement, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à inhiber les réactions de la voie d'Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate. Cette inhibition permet d'éliminer une possible voie compétitrice, et d'assurer la disponibilité du 6- phosphogluconate comme substrat pour l'ingénierie PRK/RuBisCO. L'interruption de la voie d'Entner-Doudoroff en aval de la production de 6-phosphogluconate cible spécifiquement une ou plusieurs réactions dans le processus de synthèse du pyruvate à partir de 6-phosphogluconate. Cette synthèse est initiée par les actions successives de deux enzymes : (i) la 6-phosphogluconate déshydratase (« EDD » - EC. 4.2.1.12), et (ii) la 2- déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase (« EDA » - E.C. 4.1.2.14).
La 6-phosphogluconate déshydratase catalyse la déshydratation du 6-phosphogluconate en 2- céto-3-désoxy-6-phosphogluconate. Selon l'organisme, les gènes codant pour la 6- phosphogluconate déshydratase peuvent s'appeler edd (GenBank NP_416365, par exemple, chez Escherichia coli), ou ilvD (par exemple, chez Mycobacterium sp.). La 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase catalyse la synthèse d'une molécule de pyruvate et d'une molécule de glycéraldéhyde- 3 -phosphate à partir du 2-céto-3-désoxy-6- phosphogluconate produit par la 6-phosphogluconate déshydratase. Selon l'organisme, les gènes codant pour la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase peuvent s'appeler eda (GenBank NP_416364, par exemple, chez Escherichia coli), ou kdgA (par exemple chez Thermoproteus tenax), ou dgaF (par exemple chez Salmonella typhimurium).
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 6-phosphogluconate déshydratase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
De manière alternative ou additionnelle, le microorganisme est génétiquement modifié de manière à ce que l'expression du gène codant la 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase soit au moins partiellement inhibée. Préférentiellement, l'expression du gène est complètement inhibée.
Les tableaux 5 et 6 ci-dessous listent, à titre d'exemples, les séquences codant une 6- phosphogluconate déshydratase et une 2-déshydro-3-désoxy-phosphogluconate aldolase qui peuvent être inhibés en fonction du microorganisme cible. L'homme du métier sait quel gène correspond à l'enzyme d'intérêt à inhiber en fonction du microorganisme.
Tableau 5 : Exemples de séquences codant pour une EDD
Gène GenBank Gl Organisme
edd N P_416365.1 16129804 Escherichia coli
ilvD CN D70554.1 893638835 Mycobacterium tuberculosis
edd AJQ65426.1 764046652 Salmonella enterica Tableau 6 : Exemples de séquences codant pour une EDA
Figure imgf000017_0001
D'une manière générale, dans ce mode de réalisation, la production de pyruvate n'est plus possible par le biais de la voie Entner-Doudoroff, ou au moins fortement diminuée.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microorganisme est une bactérie du genre Escherichia coli dans laquelle l'expression du gène edd est au moins partiellement inhibée.
Dans un exemple particulier, la bactérie du genre Escherichia coli est génétiquement modifiée de manière à ce que l'expression des gènes talA, et edd soient au moins partiellement inhibées.
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié, qui exprime une RuBisCO et une PRK fonctionnelles, et dont la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates et la voie Entner-Doudoroff sont au moins partiellement inhibées n'est plus apte à produire du pyruvate par la voie Entner-Doudoroff ou la voie des pentoses phosphates. Le flux de carbone à partir du glucose lors de la production de NADPH est par conséquent orienté de façon préférentielle vers l'ingénierie PRK/RuBisCO.
Production de molécules d'intérêt
Selon l'invention, le microorganisme génétiquement modifié est transformé de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt.
Dans le contexte de l'invention, on désigne préférentiellement par molécule d'intérêt une petite molécule organique, de masse moléculaire inférieure ou égale à 0,8 kDa.
D'une manière générale, les modifications génétiques apportées au microorganisme, telles qu'exposées ci-dessus, permettent d'améliorer le rendement carbone des voies de synthèse et/ou de bioconversion de molécules d'intérêt.
Dans le contexte de l'invention, un rendement « amélioré » s'entend en termes de quantité de produit fini. D'une manière générale, le rendement carbone correspond dans le contexte de l'invention au ratio quantité de produit fini / quantité de sucre fermentescible, notamment en poids. Selon l'invention, le rendement carbone est augmenté chez les microorganismes génétiquement modifiés selon l'invention, comparativement aux microorganismes sauvages, placés dans des conditions de culture identiques. Avantageusement, le rendement carbone est augmenté de 2%, 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, ou plus. Le microorganisme génétiquement modifié selon l'invention peut produire une plus grande quantité des molécules d'intérêt (produit fini) comparativement aux molécules hétérologues produites par un microorganisme modifié génétiquement simplement pour produire ou surproduire cette molécule. Selon l'invention, le microorganisme génétiquement peut également surproduire une molécule endogène comparativement au microorganisme sauvage. La surproduction d'une molécule endogène s'entend principalement en termes de quantités. Avantageusement, le microorganisme génétiquement modifié produit au moins 20%, 30%, 40%, 50%, ou plus en poids de la molécule endogène que le microorganisme sauvage. Avantageusement, le microorganisme selon l'invention est génétiquement modifié de manière à produire ou surproduire au moins une molécule parmi les acides aminés, les terpénoïdes, les terpènes, les vitamines et/ou précurseurs de vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les acides organiques, les polyols, les polyamines, les molécules aromatiques obtenues à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, etc.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour surproduire au moins un acide aminé, préférentiellement choisi parmi l'arginine, la lysine, la méthionine, la thréonine, la proline, le glutamate, l'homosérine, l'isoleucine et la valine.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire des molécules de la voie des terpénoïdes, tel que le farnésène, et de la voie des terpènes.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une vitamine ou un précurseur, préférentiellement choisi parmi le pantoate, pantothenate, transneurosporène, phylloquinone et tocophérols. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un stérol, préférentiellement choisi parmi le squalène, cholestérol, testostérone, progestérone et la cortisone.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un flavonoïde, préférentiellement choisi parmi la frambinone et la vestinone. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un acide organique, préférentiellement choisi parmi l'acide coumarique et l'acide 3 -hydroxypropionique . Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire un polyol, préférentiellement choisi parmi le sorbitol, xylitol et le glycérol.
Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une polyamine, préférentiellement de la spermidine. Dans un exemple particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour produire ou surproduire une molécule aromatique à partir d'une hydroxylation stéréospécifique, via un cytochrome p450 NADP-dépendant, préférentiellement choisie parmi les phénylpropanoïdes, terpènes, lipides, tannins, arômes, hormones.
Dans le cas où la molécule d'intérêt est obtenue par bioconversion, le microorganisme génétiquement modifié est avantageusement mis en culture dans un milieu de culture comprenant le substrat à convertir. D'une manière générale, la production ou surproduction d'une molécule d'intérêt par un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention est obtenue par mise en culture dudit microorganisme dans un milieu de culture approprié, connu de l'homme du métier. Le terme « milieu de culture approprié » désigne d'une manière générale un milieu de culture stérile apportant les nutriments essentiels ou bénéfiques à la maintenance et/ou à la croissance dudit microorganisme, tels que les sources carbonées ; les sources azotées telles que le sulfate d'ammonium ; les sources de phosphores, par exemple, le potassium phosphate monobasique ; les oligo-éléments, par exemple, les sels de cuivre, d'iodure, de fer, de magnésium, de zinc ou de molybdate ; les vitamines et autres facteurs de croissance tels que des acides aminés ou autres promoteurs de croissance. Un antimousse peut être ajouté selon les besoins. Selon l'invention, ce milieu de culture approprié peut être chimiquement défini ou complexe. Le milieu de culture peut ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu synthétique, tel que défini par Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8:501-17), adapté par Visser et al., (Biotechnology and bioengineering. 2002. 79:674-81), ou commercialement disponible tel que le milieu YNB (Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals ou Sigma- Aldrich).
Notamment, le milieu de culture peut comprendre une source de carbone simple, telle le glucose, le galactose, le saccharose, les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres, éventuellement supplémentée en C02 comme co-substrat carboné. Selon la présente invention, la source de carbone simple doit permettre la croissance normale du microorganisme d'intérêt. Il est également possible, dans certains cas, d'utiliser une source de carbone complexe, telle que de la biomasse lignocellulosique, de la paille de riz, ou de l'amidon. L'utilisation d'une source de carbone complexe nécessite généralement un prétraitement avant utilisation. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient au moins une source de carbone parmi les monosaccharides tels que le glucose, le xylose ou l'arabinose, les disaccharides tels que le saccharose, les acides organiques tels que l'acétate, le butyrate, le propionate ou le valérate afin de favoriser différentes sortes de polyhydroxyalcanoate (PHA), du glycérol traité ou non-traité.
En fonction des molécules à produire et/ou surproduire, il est possible dé jouer sur l'apport en facteur nutritionnels (N, O, P, S, K+, Mg2+, Fe2+, Mn, Co, Cu, Ca, Sn ; Koller et al., Microbiology Monographs, G.-Q. Chen, 14: 85-119, (2010)). C'est le cas notamment pour favoriser la synthèse et l'accumulation intracellulaire de PHA dont le PHB. Selon l'invention, tout mode de culture permettant la production à l'échelle industrielle de molécules d'intérêt peut être envisagé. Avantageusement, la culture se fait en bioréacteurs, notamment en mode batch, fed-batch et/ou culture continue. Préférentiellement, la conduite de culture associée à la production de la molécule d'intérêt est en mode fed-batch correspondant à une alimentation contrôlée en un ou plusieurs substrats, par exemple via l'ajout d'une solution concentrée en glucose dont la concentration peut être comprise entre 200 g.L-1 et 700 g.L-1. Une alimentation contrôlée en vitamines au cours du procédé peut également être bénéfique à la productivité (Alfenore et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002. 60:67-72). Il est également possible d'ajouter une solution de sels d'ammonium pour limiter l'apport azoté.
La fermentation est généralement conduite en bioréacteurs, avec de possibles étapes de précultures solides et/ou liquides en Erlenmeyers, avec un milieu de culture approprié contenant au moins une source de carbone simple et/ou un apport de C02 exogène, nécessaire à la production de la molécule d'intérêt.
D'une manière générale, les conditions de culture des microorganismes selon l'invention sont aisément adaptables par l'homme du métier, en fonction du microorganisme et/ou de la molécule à produire/surproduire. Par exemple, la température de culture est notamment comprise pour les levures entre 20°C et 40°C, de préférence entre 28°C et 35°C, et plus particulièrement d'environ 30°C pour S.cerevisiae. La température de culture est notamment comprise entre 25°C et 35°C, de préférence 30°C pour Cupriavidus necator.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), et préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques. L'invention a aussi pour objet un procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'invention, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la synthèse de ladite molécule d'intérêt.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion de ladite molécule d'intérêt.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production d'une molécule d'intérêt comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'invention, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
Par exemple, il est possible de faire produire du farnésène par une levure, telle qu'une levure du genre Saccharomyces cerevisiae, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO fonctionnelles, une farnésène synthase et dans laquelle l'expression d'un gène TAL1 (Gene ID : 851068) est au moins partiellement inhibée.
Il est également possible de faire surproduire du glutamate par une bactérie, telle qu'une bactérie du genre Escherichia coli, génétiquement modifiée pour exprimer une PRK et une RuBisCO fonctionnelles, et dans laquelle l'expression des gènes talA (Gene ID : 947006.) et sucA (Gene ID : 945303) est au moins partiellement inhibée. EXEMPLES
Exemple 1: Analyse bio-informatique a) Comparaison des rendements de fixation de carbone à partir de glucose entre une souche sauvage utilisant la voie des pentoses phosphates et la glycolyse, et une souche modifiée selon l'invention
Afin d'évaluer le bénéfice apporté par les modifications selon l'invention, des calculs de rendements théoriques ont été réalisés sur la base de la stœchiométrie des réactions impliquées.
Deux cas de figure ont été analysés : (i) une souche sauvage, utilisant la voie des pentoses phosphates pour alimenter une voie de biosynthèse NADPH-dépendante (par exemple, synthèse de farnésène), et (ii) une souche modifiée selon l'invention, dans les mêmes conditions.
Dans le cadre de l'amélioration des voies de biosynthèse NADPH-dépendantes, le bilan théorique de la formation de NADPH et de glycéraldéhyde-3-phosphate (G3-P) à partir de glucose par la voie des pentoses phosphates a été calculé selon l'équation ci-dessous (1) :
(1) 3 Glucose + 5 ATP + 6 NADP+ + 3 H20→ 5 G3-P + 5 ADP+ 6 NADPH + 11H+ + 3 C02 En descendant jusqu'à la formation de pyruvate à partir de G3P, on arrive au bilan suivant :
(2) 3 Glucose + 5 ADP + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5Pi→ 5 Pyruvate + 5 ATP+ 6 NADPH + 5 NADH + 11H+ + 3 C02 + 2 H20
Si on normalise le bilan pour une mole de glucose, on obtient le rendement suivant :
(3) Glucose + 1.67 ADP + 2 NADP+ + 1.67 NAD+ + 1.67 Pi→ 1.67 Pyruvate + 1.67 ATP+ 2 NADPH + 1.67 NADH + 3.67 H+ + C02+ 0.67 H20
En passant par la voie des pentoses, 1.67 moles de pyruvate et 2 moles de NADPH sont produites à partir d'une mole de glucose. Une mole de carbone est par contre perdue par décarboxylation, lors de la formation de ribulose-5-phosphate par la 6-phosphogluconate déshydro gênas e (EC 1.1.1.44). Le rendement maximum théorique de production de pyruvate lors de la production de 2 NADPH par la voie des pentoses phosphates est par conséquent de 0.82 gpymvate/ggiucose (g de pyruvate synthétisé, par glucose consommé). En intégrant l'ingénierie PRK/RuBisCO dans une souche inhibée pour la branche non- oxydative de la voie des pentoses phosphates (par exemple ATALl-ANQMl dans le cadre de la levure S. cerevisiae), le flux de fixation de carbone est redirigé de la branche oxydative de la voie des pentoses phosphates vers l'ingénierie PRK/RuBisCO (figure 2). Ce flux se rattache à la fin de la voie de la glycolyse, au niveau de la formation de 3-phosphoglycérate (3PG), avec le rendement suivant :
(5) Glucose + 2 ATP + 2 NADP+ + 2 H20→ 2 3PG + 2 ADP + 2 NADPH + 6 H+
En descendant jusqu'à la formation de pyruvate à partir de 3PG, on arrive au bilan suivant :
(6) Glucose + 2 NADP+→ 2 Pyruvate + 2 NADPH + 4 H+ L'intégration des modifications selon l'invention permet de récupérer la molécule de carbone autrement perdue par la décarboxylation dans la voie des pentoses phosphates. Le rendement maximum théorique de synthèse de pyruvate lors de la production de 2 NADPH par l'ingénierie est par conséquent de 0.98 gpymvate/ggiucose, ce qui permet d'améliorer de. 20.5%, celui obtenu par la voie des pentoses phosphates. b) Simulation de rendements de biosynthèse par analyse de balance de flux
Dans une approche bioinformatique, des analyses de type « Analyse de balance de flux » (ABF) ont également été réalisées pour simuler l'impact des modifications décrites selon l'invention sur le rendement de différentes voies de biosynthèse.
Les analyses FBA reposent sur des modèles mathématiques permettant de simuler des réseaux métaboliques à l'échelle d'un génome (Orth et al., Nat Biotechnol. 2010 ; 28: 245-248). Les réseaux reconstruits contiennent les réactions métaboliques connues d'un organisme donné et intègrent les besoins de la cellule, pour assurer notamment la maintenance cellulaire, ou la croissance. Les analyses FBA permettent de calculer le flux des métabolites au travers de ces réseaux, permettant de prédire des taux de croissance théoriques, ainsi que des rendements de production de métabolites. i) Procédure
Les simulations ABF ont été réalisées avec le logiciel OptFlux (Rocha et al., BMC Syst Biol. 2010 Apr 19;4:45. doi: 10.1186/1752-0509-4-45), et le modèle métabolique de Saccharomyces cerevisiae ÏMM904 (Mo et al., BMC Syst Biol. 2009 Mar 25;3:37. doi: 10.1186/1752-0509-3- 37). Ce modèle a été modifié pour inclure les améliorations décrites selon l'invention, notamment une voie hétérologue de fixation de CO2 avec (i) ajout d'une réaction de type PRK, (ii) ajout d'une réaction de type RuBisCO.
Dans des exemples de réalisation particuliers, les réactions nécessaires pour simuler la production de molécule par des voies hétérologues ont également été ajoutées au modèle.
Dans un exemple de réalisation particulier, une réaction de type farnésène synthase (EC 4.2.3.46 ou EC 4.2.3.47) a notamment été rajoutée pour la production hétérologue de farnésène.
Dans un second exemple de réalisation particulier, les réactions de type acetoacetyl-CoA reductase (EC 1.1.1.36), et poly-P-hydroxybutyrate synthase (EC 2.3.1.B2 ou 2.3.1.B5), ont été rajoutées au modèle pour simuler une voie de production hétérologue de β-hydroxyburyrate, le monomère du polyhydroxybutyrate. Les simulations ont été réalisées en appliquant au modèle un ensemble de contraintes reproductibles par l'homme du métier, visant à simuler les conditions de culture in vivo d'une souche de S. cerevisiae dans les conditions décrites selon l'invention (par exemple, présence de glucose non limitante dans le milieu, condition de culture aérobie).
Les simulations ont été réalisées en appliquant au modèle un ensemble de contraintes reproductibles par l'homme du métier, visant à simuler les conditions de culture in vivo d'une souche de S. cerevisiae dans les conditions décrites selon l'invention (par exemple, présence de glucose non limitante dans le milieu, condition de culture aérobie).
Dans des exemples de réalisation particuliers, les simulations sont réalisées en inactivant virtuellement les réactions des enzymes transaldolases TAL1 et NQM1, de façon à simuler les diminutions d'activité de la branche non-oxydative de la voie des pentoses, décrites selon l'invention.
Les simulations sont réalisées en parallèle sur un modèle de type « souche sauvage », non modifié, de façon à évaluer l'impact des améliorations décrites selon l'invention sur le rendement de production des voies de biosynthèse testées. ii) Résultats
Les rendements théoriques obtenus et les pourcentages d'amélioration apportés par l'invention sont décrits dans le tableau 7 ci-dessous. Tableau 7 : Rendements de production maximums théoriques évalués par ABF sur une souche sauvage et une souche modifiée selon l'invention, pour la production de différentes molécules.
Figure imgf000025_0001
M I /M I : moles de molécule X produites, rapportées aux moles de glucose consommées CMolx / CM I : moles de carbone de molécule X produites, rapportées aux moles de carbone de glucose consommées
gx/gGLuc : g de molécule X produits, rapporté aux g de glucose consommés
Exemple 2: Amélioration de la production hétérologue de farnésène chez S. cerevisiae Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae, CEN.PK 1605 (Mat a HIS3 leu2-3.112 trpl- 289 ura3-52 MAL.28c) issue de la souche commerciale CEN.PK 113-7D (GenBank : JRIVOOOOOOOO) est ingéniérée pour produire du NADPH sans perte de C02 et ainsi permettre l'amélioration de la production d'alpha farnésène à partir de glucose. a) Inactivation de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates La branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates a été inactivée par la délétion du gène TAL1 et de son paralogue NQM1. i) Inactivation du gène TAL1 : Chromosome XI (836350 à 837357, brin complémentaire)
Pour se faire, la phase codante du gène de résistance au G418, issue de la cassette KanMX contenue sur le plasmide pUG6 (P30114) - Euroscarf a été amplifiée avec les oligonucléotides Sdtall- Rdtall (Tableau 8). Tableau 8 : Oligonucléotides
Figure imgf000026_0001
La partie soulignée des oligonucléotides est parfaitement homologue à la séquence KanMX et le reste de la séquence correspond aux régions adjacentes à la phase codante du gène TALl sur le génome de Saccaromyces cerevisiae, de manière à générer un amplicon PCR contenant aux extrémités des séquences de recombinaison homologues du locus du gène TALl .
Pour la réaction de transformation, la souche CEN.PK 1605 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose) à 30°C, jusqu'à une densité optique 600nm de 0.8. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM.
Parallèlement, un mix de transformation a été préparé dans un tube de 2 ml comme suit: 250 de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 μΐ, d'acétate de lithium 1 M, 10 μϊ^ de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42°C pendant 40 minutes dans un bain d'eau.
Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YPD, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30 ° C 200 tours par minute. Les cellules ont ensuite été centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et ressuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalé sur YPD+G418 180 μg/mL.
Les colonies obtenues ont été génotypées pour validation de la délétion du gène TALl et référencées EQ-0520 (CEN.PK1605 AtoH::kan). ii) Inactivation du gène NQM1 : Chromosome VII (580435 à 581436, brin complémentaire)
La phase codante du gène de résistance à l'hygromycine B, issue de la cassette hphMX (loxP- pAgTEFl-hphMX-tAgTEFl-loxP) et contenue sur le plasmide pUG75 (P30671) - Euroscarf, est amplifiée avec les oligonucléotides Sdnqml et Rdnqml (tableau 8). Cela permet de générer un amplicon PCR Anqml contenant aux extrémités des séquences de recombinaison homologues du locus du gène de la Transaldolase NQM1.
Pour la réaction de transformation, la souche EQ-0520 (CEN.PK1605 AtoH::kan) a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD (yeast extract peptone dextrose) à 30°C jusqu'à une densité optique à 600nm de 0,8. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 2500 tr / min à la température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 25 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 5 minutes à 2500 tr / min à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, les cellules ont été remises en suspension dans 400 μΐ d'acétate de lithium stérile 100 mM. Parallèlement, un mix de transformation a été préparé dans un tube de 2 ml comme suit: 250 μΐ, de 50% de PEG, 10 μΐ, d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 μΐ, d'acétate de lithium 1 M, 10 μϊ^ de réaction PCR purifiée (cassette de délétion) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42°C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YPD, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30°C à 200 tours par minute. Les cellules ont ensuite été centrifugées pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml d'eau stérile et centrifugées de nouveau pendant 1 minute et ressuspendues dans 100 μΐ d'eau stérile et étalées sur YPD + HygromycineB 200 μg/mL +G418 180 μg/mL. Les colonies obtenues ont été génotypées pour la validation de la délétion du gène TALl et référencées EQ-0521 (CEN.PK1605 AtoH::kan \nqml::hph). b) Introduction des enzymes PRK/RuBisCO/Farnésène synthase
Afin de créer une voie alternative à la glycolyse et permettant à la souche EQ-0521 (CEN.PK1605 AtoH::kan Anqml::hph) d'augmenter le rendement de certains produits métabolique par la fixation de CO2, la souche est modifiée pour exprimer:
• un gène codant pour une phosphoribulokinase PRK qui se greffe sur la voie des pentoses phosphate en consommant le ribulose-5P pour donner le ribulose-1.5bisP et
• une RuBisCO de type I (avec les gènes structuraux RbcL et RbcS et les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL). La RuBisCO consomme le ribulose-1.5bisP et une mole de CO2 pour former le 3phosphoglycerate
Pour produire de l'alpha-farnésène, il manque à la levure le gène de alpha- farnésène synthase (AFS1; GenBank accession number AY182241).
Tableau 9 : Cassettes d'expression et composition des plasmides
Figure imgf000029_0001
Les sept gènes nécessaires à l'ingénierie (Tableau 9) ont été clonés sur trois vecteurs plasmidiques capables de se répliquer de manière autonome, avec des origines de réplication compatibles et portant chacun un gène de complémentation d'auxotrophies différents, permettant de sélectionner les souches contenant les trois constructions plasmidiques. Deux de ces plasmides sont monocopies, avec une origine de réplication de type Ars/CEN et le troisième est multicopies avec une origine 2μ.
Les gènes issus de Synechococcus elongatus, tels que RbcL, RbcS, RbcX et PRK (préalablement décrits dans WO 2015107496 Al) et l'alpha-farnésène synthase de Malus domestica (Tippmann et al. Biotechnol Bioeng. 2016 Jan;113(l):72-81) ont été optimisés pour l'utilisation de codons chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Selon le protocole précédemment décrit la souche EQ-0521 a été cultivée dans un volume de 50 ml de milieu riche complexe YPD à 30°C et avec le mix de transformation suivant : 250 μΐ^ de 50% de PEG, 10 d'ADN « porteur » à 5 mg / mL, 36 d'acétate de lithium 1 M, 10 (3μ% de d'une combinaison pFPP45+pFPP56+pFPP20 ou pL4+pFPP56+pFPP20ou pL5+pFL36+pCM185) et de l'eau à 350 μΐ.
50 μΐ des cellules remises en suspension ont été ajoutés au mélange de transformation et incubés à 42°C pendant 40 minutes dans un bain d'eau. Après incubation, le tube a été centrifugé pendant 1 minute à 5000 tr / min à température ambiante et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été remises en suspension dans 2 mL de YNB (yeast without nitrogen base supplémenté en sulfate d'ammonium1, glucose ) complémenté avec un milieu commercial CSM (MP Biomedicals) adapté aux marqueurs de sélection, transférées dans un tube de 14 mL et incubées pendant 2 heures à 30°C. Le mix final est étalé sur YNB+sulphate d'ammonium+CSM - LUW (leucine uracile, tryptophane en 20g/L glucose et 2μg/mL de doxycycline.
Les souches obtenues sont :
• EQ-0523 (CEN.PK1605 AtoH::kan Anqml::hph) (pFPP45+pFPP56+pFPP20)
• EQ-0524 (CEN.PK1605 AtoH::kan Anqml::hph) (pL4+pFPP56+ pFPP20)
• EQ-0525 (CEN.PK1605) (pL5+pFL36+pCM185) Les souches EQ-0523 (PRK/RuBisCO/AtoH::kan \nqml::hph) , EQ-0524 (PRK/RuBisCO/ AtoH::kan Anqml::hph + farnésène synthase) et EQ-0525 (farnésène synthase) à la croissance sur milieu liquide YNB avec 20g/L glucose et 10% C02
Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées avec le milieu de culture approprié et un apport en CO2 exogène de 10%, en incubateur agité (120 RPM, 30°C), avec une inoculation à 0.05 D.O.600nm mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre EON (BioTek Instruments). La souche d'intérêt est cultivée sur milieu YNB+CSM-LUW avec 20 g/L de glucose et un apport en CO2 exogène de 10%
Après observation d'un démarrage de croissance significatif, les souches sont adaptées à un milieu minéral minimum exempt des acides aminés et base azoté inclus dans le CSM-LUW, soit uniquement du YNB avec 20 g/L de glucose et un apport en CO2 exogène de 10% c) Production de farnésène en Erlenmeyers La souche EQ-0524 de Saccharomyces cerevisiae, dont la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est inhibée par inhibition des gènes TAL1 et NQM1, est cultivée afin de produire du farnésène en surproduisant du NADPH sans perte de CO2, en utilisant une PRK et une RuBisCO exogènes. Cette souche d'intérêt est comparée à une souche de référence EQ- 0525 produisant du farnésène suite à l'ajout d'une farnésène synthase hétérologue, sans délétion de TAL1 et NQM1 ni ajout de PRK et RuBisCO exogène. Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers sont réalisées dans les conditions décrites précédemment.
La concentration en farnésène est quantifiée à partir du surnageant de moûts de fermentation. Brièvement, les suspensions de cellules sont centrifugées à 5000rpm pendant 5 minutes. La phase dodécane est diluée 10 fois dans de l'hexane et est injectée en GC-MS, pour analyse selon le protocole décrit dans Tippman et al. (Biotechnol Bioeng. 2016; 1131 :72-81).
Une augmentation de 3% du rendement de production, en gramme de farnésène par gramme de glucose consommé, est observée chez la souche EQ-0253, comparativement à la souche EQ- 0253
Exemple 3 : Amélioration de la production de glutamate chez E. coli
Il a déjà été décrit que la délétion du gène de l'alpha-ketoglutarate déshydrogénase augmente la production de glutamate (Usuda et al., J Biotechnol. 2010 May 3; 147(1): 17-30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.02.018). Les expérimentations décrites ci-dessous ont donc été réalisées chez une souche d'Escherichia coli K12 MG1655, dont le gène sucA a été délété. Cette souche est issue d'une banque de délétion de gènes (Baba et al., Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0008) chez Escherichia coli et fournie par le Coli Genetic Stock Center sous le nom JW0715-2 et avec la référence 8786. (JW0715-2 : MG1655 AsucA::Kan). a) Elimination de la cassette de sélection par recombinaison spécifique des régions FTR par recombinaison Flp
Afin de pouvoir réutiliser la même stratégie de délétion que celle utilisée pour construire la souche JW0715-2 ci-dessus, la cassette de sélection a dû être éliminée, à l'aide d'une recombinase.
Le plasmide p707-Flpe (fourni dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% de glucose, tétracycline 0.0003% et additionné de 0,3% de L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté en kanamycin 0,0015%.
La souche obtenue se nomme EQ.EC002 : MG1655 AsucA b) Délétion de l'opéron edd-eda, codant pour la voie métabolique d'Entner-Doudorojf
La délétion de l'opéron edd-eda est réalisée par recombinaison homologue et utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit, selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologue, sur 50 nucléotides, aux régions adjacentes du locus de délétion (positions 1932065-1932115 et 1934604-1934654) sur le chromosome, générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien de part et d'autre de la totalité de l'opéron ;
2. La souche de Escherichia coli K- 12, EQ.EC002 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% ;
3. La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape en présence de la recombinase RedET, induite par l'arabinose 0.3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose et kanamycin 0,0015%.
4. Le plasmide p707-Flpe (fournit dans le kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination par Gene bridges) est transformé par électroporation selon le protocole du kit. Les cellules sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glucose, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose. Une contre sélection des clones obtenus est effectuée en vérifiant qu'ils ne sont plus capables de pousser sur le même milieu supplémenté en kanamycin 0,0015%.
5. La souche obtenue se nomme EQ.EC003 : MG1655 AsucA Aedd-eda c) Délétion du gène talA
La délétion du gène talA est réalisée par recombinaison homologue et l'utilisation du kit Quick&Easy E. coli Gene Deletion Red®/ET® Recombination Kit, selon le protocole du fournisseur Gene bridges.
1. Des oligonucléotides dessinés pour amplifier une cassette d'expression d'un gène de résistance FRT-PKG-gb2-neo-FRT et possédant une séquence 5' homologues sur 50 nucléotides aux régions adjacentes du locus de délétion, c'est à dire la phase codante du gène (talA) (Gene ID : 947006), générant ainsi des bras de recombinaison de la cassette sur le génome bactérien.
2. La souche de Escherichia coli K- 12, EQ.EC003 est transformée par électroporation avec le plasmide pRedET, selon le protocole du kit. Les colonies obtenues sont sélectionnées sur milieu riche complexe LB agar 0,2% glucose, tétracycline 0,0003%.
3. La transformation de l'amplicon obtenu lors de la première étape, en présence de la recombinase RedET qui sera induite par l'arabinose 0,3% en LB liquide pendant 1H. Pour se faire, une seconde électroporation des cellules exprimant RedET par la cassette de délétion est effectuée et les colonies sont sélectionnées sur LB agar complémenté avec 0,2% glycérol et pyruvate 0,3%, tétracycline 0,0003% et additionné de 0,3% L-arabinose et kanamycin 0,0015%.
Les délétions sont vérifiées par génotypage et séquençage et le nom des souches obtenues est
• EQ.EC002 : MG1655 AsucA
• EQ.EC003 : MG1655 AsucA Aedd-eda
• EQ.EC020 : MG1655 AsucA Aedd-edda AtalAr. kan d) Insertion de l'ingénierie PRK/RuBisCO pour la fixation du CO2
Pour l'expression recombinante des différents composants d'une RuBisCO de type I chez E. coli, les gènes décrits dans le
Tableau ci-dessous sont clonés sous la forme d'un opéron synthétique contenant les gènes décrits dans
Tableau ci-dessous.
Pour contrôler le niveau d'expression de ces gènes, des séquences de liaison aux ribosomes (RBS) présentées dans le Tableau , ayant des efficacités de traduction variables, comme décrit dans Zelcbuch et al. (Zelcbuch et al., Nucleic Acids Res. 2013 May;41(9):e98 ; Levin-Karp et al., ACS Synth Biol. 2013 Jun 21;2(6):327-36. doi: 10.1021/sb400002n ) sont insérées entre la phase codante de chaque gène. La succession de chaque phase codante intercalée par une séquence RBS est construite par insertion successive dans un vecteur pZAl l (Expressys) qui contient un promoteur PLtetO-1, une origine de réplication moyenne pl5A, et un gène de résistance à l'ampicilline.
Tableau 10 : Références des gènes
Figure imgf000034_0001
Tableau 11 : Composition des cassettes d'expression sur les plasmides
Figure imgf000034_0002
Tableau 12: Séquences intercistroniques "ribosome binding site" (RBS)
Nom Séquences RBS
A (SEQ ID N°5) AGGAGGTTTGGA
B (SEQ ID N°6) AACAAAATGAGGAGGTACTGAG
C (SEQ ID N°7) AAGTTAAGAGGCAAGA
D (SEQ ID N°8) TTCGCAGGGGGAAG
E (SEQ ID N°9) TAAGCAGGACCGGCGGCG
F (SEQ ID N°10) CACCATACACTG Plusieurs souches sont réalisées en électroporant les différents vecteurs présentés selon le plan ci-dessus :
EQ.EC 020-»(EQ.EC 003+ pZAl l) : MG1655 AsucA Aedd-eda
EQ.EC 021 (EQ.EC 004+ pEQEC005) : MG1655 AsucA Aedd-eda -talAr.kan (RuBisCO) EQ.EC 022 (EQ.EC 004+ pEQEC006) : MG1655 AsucA Aedd-eda talAr. kan (RuBisCO+PRK)
EQ.EC 024 (EQ.EC 003+ pEQEC008) : MG1655 AsucA Aedd-eda AtalArkan (PRK)
Les clones sont sélectionnés sur milieu LB supplémenté par 100 mg/L d'ampicilline. Après obtention d'une quantité de biomasse suffisante, des cultures d'un volume supérieur ou égal à 50 mL en Erlenmeyer de 250ml minimum sont ensemencées afin d'effectuer l'adaptation de la souche à l'utilisation de l'ingénierie PRK/RuBisCO. Cette adaptation est effectuée sur le milieu de culture LB avec 2 g/L de glucose, et un apport en C02 exogène de 1 atmosphère à 37°C comme décrit ci-dessus. e) Production de glutamate Pour la production de glutamate, les cellules issues de 500ml de culture en LB sont inoculées dans 20ml de milieu MS (40 g/L de glucose, 1 g/L MgS04".7H20, 20 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 10 mg/L FeS04.7H20, 10 mg/L MnS04.7H20, 2 g/L d'extrait de levure, 30 g/L de CaCO3, 100 mg/L d'ampicilline à une pression 0.1 atmosphère de C02.
Le glutamate et le glucose résiduels sont mesurés avec un bio analyseur (Sakura seiki). Le rendement carbone Yp/S est calculé en gramme de glutamate produit par gramme de glucose consommé. Ce rendement augmente de 8% chez les souches EQ.EC 022 (RuBisCO+PRK), par comparaison avec les souches contrôles EQ.EC 020 (vide), EQ.EC 021 (RuBisCO seule). La souche contrôle EQ.EC 024 (PRK seule) n'est pas viable.
Exemple 4 : Amélioration de la production de PHB chez C. necator a) Inhibition de la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates L'augmentation du pouvoir réducteur peut aussi améliorer de manière intéressante le rendement de voies métaboliques déjà existantes. C'est le cas pour la souche bactérienne Ralstonia eutropha ATCC 17699 (Cupriavidus necator) qui produit naturellement du polyhydroxybutyrate (PHB). Cette bactérie est capable de se développer aussi bien en conditions d'autotrophie que d'hétérotrophie.
La délétion, selon l'invention, du gène tal (Transaldolase M F_00492) permet de concentrer le flux métabolique sur la voie oxydative des pentoses phosphates, en augmentant le pool de nucléotides réduits NADPH, permettant ainsi d'augmenter le rendement de production de PHB, mais aussi d'utiliser la voie de la glycolyse. Cette souche Cuprividus necator (R. eutropha H16) possède un mega plasmide pHGl et deux chromosomes. La délétion du gène tal est réalisée en générant un vecteur contenant un gène suicide SacA pour les bactéries gram négatives, comme décrit dans Quandt et al. et Lindenkamp et al. (Quandt et al., Gene. 1993 May 15; 127(1): 15-21 ; Lindenkamp et al., Appl Environ Microbiol. 2010 Aug;76(16):5373-82 ; Lindenkamp et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Aug;78(15):5375-83).
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes du gène tal sont clonés par restriction selon la procédure décrite dans Lindenkamp et al. (Appl Environ Microbiol. 2012 Aug;78(15):5375-83) dans le plasmide pjQ200mpl8Tc. Le plasmide modifié pjQ200mpl8Tc: :Ato est alors transformé dans une souche d'E. coli S 17-1, par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Et le transfert du matériel génétique est fait par conjugaison en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de Ralstonia Eutropha sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S 17- 1 et la sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30°C, en présence de 10% sucrose à titre de sélection (Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr; 158(l):43-8.) et validé sur un milieu minéral contenant 25μg/ml tetracycline.
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_002 obtenue est donc délétée pour le gène tal. EQCN_010 : H16 Mal b) Inactivation de la voie métabolique d'Entner-Dourdorojf
Deux amplicons PCR correspondants aux régions adjacentes des gènes edd et eda (en amont d'edd et en aval d'eda) sont clonés par restriction selon la procédure décrite dans Srinivasan et al. (Appl Environ Microbiol. 2002 Dec;68(12):5925-32) dans le plasmide pJQ200mpl8Cm. Le plasmide modifié pJQ200mpl8Cm::Aedd-eda est alors transformé dans une souche d'E. coli S 17- 1, par transformation par la méthode du chlorure de calcium. Et le transfert du matériel génétique est fait par conjugaison, en déposant sur gélose un point de dépôt de culture de Ralstonia Eutropha EQCN_010 sur une boite contenant un tapis cellulaire de bactéries S 17- 1 et la sélection se fait sur milieu NT (Nutrient browth) à 30°C, en présence de 10% sucrose à titre de sélection (Hogrefe et al., J Bacteriol. 1984 Apr; 158(l):43-8.) et validé sur un milieu minéral contenant 50μg/ml chloramphenicol.
Les délétions sont validées par génotypage et séquençage. La souche EQCN_003 obtenue est donc délétée pour le gène tal. EQCN_011 : H16 Atal Aedd-eda c) Production de PHB en bioréacteur
L'inoculum issu d'un stock congelé est étalé sur milieu solide à raison de 50 à 100 μΐ^ issus d'un cryotube mis en incubation à 30°C pendant 48 à 96h, en présence de glucose. L'expression des gènes codant pour la RuBisCO et la PRK sont maintenus chez C. necator en conditions aérobies hétérotrophes (Rie Shimizu et al., Sci Rep. 2015; 5: 11617. Published online 2015 Jul 1.). Les cultures en mode batch effectuées en erlenmeyers (10 mL dans 50 mL, puis 50 mL dans 250 mL) sont réalisées avec le milieu de culture approprié, en glucose 20 g/L et un apport de C02 exogène de 10% en incubateur agité (100-200 RPM, 30°C), avec une inoculation minimale
Figure imgf000037_0001
La souche d'intérêt EQCN_011 améliorant le rendement de production de PHB est comparée à une souche H16 de référence accumulant naturellement du PHB en conditions hétérotrophes en présence d'une limitation nutritionnelle.
La productivité des souches est comparée en bioréacteurs. Les cultures effectuées en bioréacteurs sont ensemencées à partir de chaînes d'amplification solide et/ou liquide en erlenmeyers, dans les conditions décrites précédemment. Les bioréacteurs, de type My-control (Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands) de 750 ml ou Biostat B (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany) de 2,5 L sont ensemencés à une concentration minimale équivalente à
Figure imgf000037_0002
L'accumulation de PHB est découplée de la croissance. La culture est régulée à 30°C, l'aération est maintenue entre 0, 1 VVM (volume gaz/volume liquide/min) et 1 VVM, afin de maintenir une concentration minimale en oxygène dissous supérieur à 20% (30°C, 1 bar). L'agitation est adaptée en fonction de l'échelle du bioréacteur utilisé. Le débit de gazage en entrée est constitué d'air éventuellement supplémenté en CO2. La supplémentation en CO2 est comprise entre 1 et 10%. Le pH est régulé à 7, par ajout d'une solution d'ammoniaque à 14 ou 7 %. Le mode de culture en fed-batch permet un apport en substrat carboné non limitant associé à une limitation en phosphore ou en azote, en conservant un ratio carbone/phosphore ou carbone/azote constant.
L'extraction et la quantification du PHB sont réalisées selon la méthode de Brandi et al. (Appl Environ Microbiol. 1988 Aug;54(8): 1977-82.).
Le protocole consiste à rajouter 1ml de chloroforme à 10 mg de cellules lyophilisées suivi d'un ajout de 850 μΐ de méthanol et de 150μ1 d'acide sulfurique. Le mélange est chauffé pendant 2,5 heures à 100°C, refroidi et 500μ1 d'eau sont rajoutés. Les deux phases sont séparées par centrifugation et la phase organique est séchée par l'ajout de sulfate de sodium. Les échantillons sont filtrés et analysés comme décrit par Millier et al. (Appl Environ Microbiol. 2013 Jul;79(14):4433-9). La comparaison des cultures de C. necator sauvage H16 et de la souche EQCN_011 : H16 Atal Aedd-eda, respectivement, montre une augmentation de 2% du rendement de production de PHB (en gramme de PHB par gramme de glucose consommé) en faveur de la souche modifiée selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1- Microorganisme génétiquement modifié exprimant une enzyme RuBisCO et une phosphoribulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans lequel la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates est au moins partiellement inhibée, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à produire une molécule exogène d'intérêt et/ou à surproduire une molécule endogène d'intérêt, autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou phosphoribulokinase (PRK).
2- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1, ledit microorganisme étant génétiquement modifié pour exprimer une enzyme RuBisCO et/ou une PRK recombinantes.
3- Microorganisme génétiquement modifié selon la revendication 1 ou 2, ledit microorganisme étant génétiquement modifié de manière à inhiber la branche non-oxydative de la voie des pentoses phosphates en aval de la production de ribulose-5-phosphate.
4- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'expression du gène codant une transaldolase (E.C.2.2.1.2) et/ou une transketolase
(E.C.2.2.1.1), est au moins partiellement inhibée.
5- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la molécule exogène d'intérêt et/ou la molécule endogène d'intérêt est choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
6- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications précédentes, ledit microorganisme étant une cellule eucaryote, préférentiellement choisie parmi les levures, les champignons, les microalgues, ou une cellule procaryote, préférentiellement une bactérie.
7- Microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications précédentes, ledit microorganisme étant une levure du genre Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée pour exprimer une RuBisCO de type I ou II et une phosporibulokinase (PRK) fonctionnelles, et dans laquelle l'expression des gènes TAL1 et/ou NQM1 est au moins partiellement inhibée.
8- Utilisation d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications précédentes, pour la production ou la surproduction d'une molécule d'intérêt, autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), et préférentiellement choisie parmi les acides aminés, les peptides, les protéines, les vitamines, les stérols, les flavonoïdes, les terpènes, les terpénoïdes, les acides gras, les polyols et les acides organiques.
9- Procédé biotechnologique pour produire au moins une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'un microorganisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 à 8, dans des conditions permettant la synthèse ou la bioconversion, par ledit microorganisme, de ladite molécule d'intérêt, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
10- Procédé biotechnologique selon la revendication 9, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour exprimer au moins une enzyme impliquée dans la bioconversion ou la synthèse de ladite molécule d'intérêt.
11- Procédé biotechnologique selon la revendication 9 ou 10, selon lequel le microorganisme est génétiquement modifié pour inhiber au moins partiellement une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d'intérêt. 12- Procédé de production d'une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), comprenant (i) l'insertion d'au moins une séquence codant une enzyme impliquée dans la synthèse ou la bioconversion de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'une des revendications 1 à 8, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
13- Procédé de production d'une molécule d'intérêt autre qu'une enzyme RuBisCO et/ou une phosphoribulokinase (PRK), comprenant (i) l'inhibition de l'expression d'au moins un gène codant une enzyme impliquée dans la dégradation de ladite molécule d'intérêt dans un microorganisme recombinant selon l'une des revendications 1 à 8, (ii) la culture dudit microorganisme dans des conditions permettant l'expression de ladite enzyme et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite molécule d'intérêt.
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