BE1021047B1 - Actinobacillus succinogenes genetiquement modifiee et son utilisation pour la production d'acide succinique - Google Patents

Abstract

Actinobacillus succinogenes génétiquement modifiée et son utilisation pour la production d'acide succinique La présente invention concerne des souches bactériennes génétiquement modifiées, plus particulièrement des souches de Actinobacillus succinogenes, qui peuvent produire des quantités accrues d'acide succinique, tout en produisant peu ou pas d'autres acides organiques, incluant l'acétate, le formate et le lactate, et alcools. L'invention fournit également des procédés pour la production d'acide succinique dans des conditions anaérobies à l'aide de ces souches bactériennes génétiquement modifiées. L'invention fournit également des procédés permettant de modifier génétiquement Actinobacillus succinogenes sur la base de la compétence naturelle et de la double recombinaison homologue.

Description

Actinobacillus succinogenes génétiquement modifiée et son utilisation pour la production d’acide succinique

Domaine de l’invention

La présente invention concerne le domaine du génie métabolique des bactéries. En particulier, la présente invention concerne des souches bactériennes génétiquement modifiées, plus particulièrement des souches de Actinobacillus succinogenes, et leur utilisation dans des procédés pour la production d’acide succinique dans des conditions anaérobies. L’invention fournit également des procédés pour modifier génétiquement Actinobacillus succinogenes.

Etat de l’art L’acide succinique et ses dérivés ont des applications industrielles étendues en raison de leur utilisation en tant que précurseur de produits chimiques de commodité dans les industries alimentaire, pharmaceutique, cosmétique, textile, des détergents et des polymères. L’acide succinique est généralement produit au départ de ressources fossiles. Cependant, depuis ces dernières années, il y a un intérêt grandissant pour la production de cet acide par fermentation.

Les bactéries disponibles qui permettent d’obtenir du succinate par fermentation sont réparties en deux groupes. Dans le premier groupe, on retrouve les bactéries qui sont connues pour produire naturellement du succinate en métabolisant le glucose, comme Pasteurellaceae (Actinobacillus succinogenes et Mannheimia succiniciproducens), Anaerobiospirillum succiniciproducens et Corynebacterium glutamicum. Bien que les rendements soient intéressants, la fermentation n’est pas homo-succinique et d’autres acides sont également produits (formate, acétate, lactate). Dans le second groupe, on retrouve les Escherichia coli recombinants. Escherichia coli ne produit pas naturellement du succinate, mais des stratégies de modifications génétiques ont été décrites afin d’optimiser la production de l’acide succinique.

Dans la plupart des cas et quel que soit la souche bactérienne, la stratégie principale pour optimiser la production de l’acide succinique est de modifier génétiquement la souche afin de bloquer les voies de production des métabolites secondaires issus de la voie du C3, à savoir le lactate (inactivation de lactate déshydrogénase (ldh)), l’éthanol (inactivation d’alcool déshydrogénase (adh)) et l’acétate (inactivation d’acétate kinase (ack) et/ou de phosphotransacétylase (pta)) (demandes de brevet WO 2011/063157, US 2008/293112, WO 2005/052135, US 2003/0175903, US 2010/0159542, KR20080031504, WO 2010/115067). D’autre part, la surexpression d’une ou des enzymes intervenant dans la production de succinate via la voie réductrice du cycle de Krebs (TCA) est également souvent envisagée (malate déshydrogénase (mdh), fumarase (fin) et fumarate réductase (frd)) (demandes de brevet WO 2011/063157, JP2005095169, KR20080031504). La surexpression des enzymes pyruvate carboxylase (pc) et phosphoénol pyruvate carboxykinase (pepck) sont également proposées à de nombreuses reprises afin de favoriser le flux métabolique vers le TCA plutôt que vers la voie du C3 (demandes de brevet US 2003/0087381, JP2005095169, WO 2010/115067).

Cependant même en réorientant principalement les flux vers le TCA, le rendement théorique de production reste faible en raison de l’obligation de maintenir la balance rédox. Par conséquent, différentes publications sont consacrées aux solutions permettant d’équilibrer la balance rédox. Une première solution est l’activation du cycle du glyoxylate (demandes de brevet US 2007/0184539, US 2010/0159543, WO 2010/115067). Une solution alternative consiste à bloquer le cycle du glyoxylate et à favoriser la production d’acide succinique via simultanément les voies oxydative et réductrice du TCA (demandes de brevet WO 2011/063157). Une autre solution est d’insérer un gène codant pour une «formate déshydrogénase (fdh)-NAD dépendante » hétérologue provenant de Candida boidinii (demande de brevet US 2003/0175903).

Enfin, la modification de la phosphotransacétylase (pts) et la Zwischenferment (zwf) est également citée pour augmenter la production d’acide succinique (demandes de brevet WO 2005/052135, US 2008/0305533).

Malgré les tentatives décrites ci-dessus, il demeure nécessaire dans l’art de perfectionner la production d’acide succinique bactérien, plus particulièrement d’accroître la production d’acide succinique, tout en maintenant la production d’autres acides organiques et/ou alcools à un faible niveau.

Actinobacillus succinogenes est l’un des producteurs de succinate naturel les plus connus. Par conséquent et aussi parce qu’elle utilise une grande variété de substrats (incluant le glucose, le cellobiose, le lactose, le xylose, l’arabinose et le fructose), et parce qu’elle a une grande tolérance aux concentrations élevées de sels de succinate, elle peut être appropriée pour la production industrielle de succinate. Des tentatives pour améliorer la production de succinate par A. succinogenes ont été freinées par le manque d’outils génétiques pour modifier A. succinogenes. Le brevet US 7,163,812 fournit un moyen de construire une A. succinogenes recombinante capable de surproduire du succinate, en utilisant un plasmide. Cependant, il reste nécessaire dans l’art de disposer d’outils permettant de modifier génétiquement A. succinogenes, plus particulièrement des outils qui permettent de multiples modifications dans un seul bagage génétique.

Description sommaire de l’invention

Les présents inventeurs ont découvert par le biais d’expériences et de tests intensifs un procédé permettant de modifier génétiquement Actinobacillus succinogenes sur la base de sa compétence naturelle à prélever un ADN dans son environnement et à intégrer l’ADN dans son génome par le biais d’une double recombinaison homologue. En élargissant ces découvertes, les inventeurs ont réalisé que les souches bactériennes, en particulier Actinobacillus succinogenes, peuvent être modifiées par génie génétique pour produire de l’acide succinique à une concentration élevée, tout en produisant peu ou pas d’autres acides organiques et/ou alcools (tels que, par exemple, le pyruvate, le formate, l’acétate, l’alcool) par le biais de la réduction de l’activité de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl) et des malates déshydrogénases (mdh), traitant ainsi un ou plusieurs des problèmes de l’art antérieur mentionnés ci-dessus.

La stratégie de l’invention se démarque des stratégies proposées dans l’art. D’une part, l’activité des enzymes intervenant dans la production de l’acétate ne sont pas modifiée (pas de knock-out de l’acétate kinase (ack) et/ou phosphotransacétylase (pta)) et d’autre part, l’activité des malates déshydrogénases (mdh) est réduite.

Par conséquent, dans un aspect l’invention fournit une souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production d’un succinate, ladite souche bactérienne comprenant une activité réduite de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl) et des malates déshydrogénases (mdh).

Dans un aspect connexe, l’invention fournit un procédé pour la production d’acide succinique dans des conditions anaérobies, dans lequel la souche bactérienne génétiquement modifiée telle qu’elle est enseignée ici est utilisée.

Un autre aspect de l’invention concerne un procédé permettant de modifier génétiquement A. succinogenes comprenant l’étape a) consistant à incuber des cellules de A. succinogenes compétentes avec une chimère d’acide nucléique.

Description sommaire des dessins FIG 1. Représentation schématique de la stratégie de construction des fragments d’ADN linéaire faisant appel au clonage des fragments PCR dans le vecteur pNZ5319. En brèf, des PCR sont réalisées sur l’ADN génomique de A. succinogenes afin d’amplifier un fragment, préférentiellement un fragment de 1,5 kb, en aval et un fragment, préférentiellement un fragment de 1,5 kb, en amont du locus cible. Celles-ci sont réalisées en utilisant une polymérase hautement fidèle et des amorces conçues de façon à introduire le premier ou le dernier codon du gène à modifier et une séquence USS (Uptake Signal Sequence) qui est connue d’intervenir dans la compétence naturelle sur ce fragment aval et amont, respectivement. Les fragments sont ensuite clonés dans le vecteur pNZ5319 en utilisant les sites de restriction à bout droit Swal ou Pmel et Ecll36II respectivement. Le vecteur ingénié final est finalement restreint par l’enzyme de restriction à bout collant Xbal de façon à obtenir le fragment d’ADN linéaire. FIG 2. Représentation schématique de la stratégie de construction des fragments d’ADN linéaire faisant appel à l’assemblage des fragments PCR par PCR de recouvrement. En brèf, des PCR sont réalisées sur l’ADN génomique de A. succinogenes afin d’amplifier un fragment, préférentiellement un fragment de 1,5 kb, en aval et un fragment, préférentiellement un fragment de 1,5 kb, en amont du locus cible. Celles-ci sont réalisées en utilisant une polymérase hautement fidèle et des amorces conçues de façon à introduire le premier ou le dernier codon du gène à modifier et la séquence complémentaire permettant de faire la PCR de recouvrement sur ce fragment aval et amont, respectivement. Une PCR est également sur le vecteur PNZ5319 en utilisant des amorces qui amplifient la cassette lox66-P$2-Cat-lox71 avec les séquences complémentaires nécessaires à la PCR de recouvrement en bordure du fragment. Les trois produits PCR sont mélangés ensemble à des concentrations équimolaires et assemblés en réalisant une PCR de recouvrement avec les amorces en bordure. FIG 3. Représentation schématique de la stratégie de remplacement d’un gène cible par la cassette lox66-?22-cat-lox71 qui est ensuite excisée par recombinaison site spécifique Cre en laissant une signature lox72. FIG 4. Courbes de production en acide succinique de la souche sauvage Actinobacillus succinogenes 130Z (130Z), de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et pfl (ALPKO), de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et mdh (ALMKO) et de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh, mdh et pfl (ALMPKO). FIG 5. Courbes de production en acide acétique et acide formique de la souche sauvage Actinobacillus succinogenes 130Z (130Z), de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et pfl (ALPKO), de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et mdh (ALMKO) et de la souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh, mdh et pfl (ALMPKO). FIG 6. Stratégie de remplacement du promoteur constitutif par le promoteur P32 via une double recombinaison homologue suivit d’une recombinaison site spécifique. La double recombinaison homologue permet l’insertion de la cassette (P32-lox66-Cat-lox71) à la place du promoteur constitutif. Ensuite, la recombinaison site spécifique permet d’enlever le gène de résistance au chloramphénicol via les 2 sites lox. FIG 7. Représentation schématique de la stratégie pour obtenir le vecteur pNZP32. Le site lox66 est supprimé du vecteur pNZ5319 en faisant une restriction avec les enzymes Swal et Nrul. Le vecteur est facilement religué sur lui-même après élimination du fragment contenant le site lox66. Ensuite, le site lox66 est réintroduit dans le vecteur sans le site lox66 (pNZLox-7) entre le promoteur P32 et le gène de résistance au chloramphénicol par PCR en utilisant les amorces pNZLox66f4 et pNZLox66r5 . Le fragment PCR obtenu est ligué sur lui-même pour obtenir le vecteur final pNZP32.

Description détaillée de l’invention

Telles qu’elles sont utilisées ici les formes au singulier « un », « une » et « le/la » incluent à la fois les référents singulier et pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire.

Les termes « comprenant », « comprend » et « composé(e) de » tels qu’ils sont utilisés ici sont synonymes de « incluant », « inclut » ou « contenant », « contient » et sont inclusifs ou ouverts et n’excluent pas des constituants, éléments ou étapes de procédé supplémentaires non énumérés. Les termes englobent également « consistant en » et « consistant essentiellement en ». L’énumération des fourchettes numériques par les extrêmes inclut tous les nombres et fractions subsumés au sein des fourchettes respectives, ainsi que les extrêmes énumérés.

Le terme « environ » tel qu’il est utilisé ici lorsqu’il est fait référence à une valeur mesurable telle qu’un paramètre, une quantité, une durée et similaire, est censé englober les variations de et à partir de la valeur spécifiée, en particulier des variations de +/- 10% ou moins, de préférence +/- 5 % ou moins, plus préférablement +/- 1 % ou moins, et toujours plus préférablement +/- 0,1 % ou moins de et à partir de la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations sont appropriées pour être réalisées dans l’invention divulguée. Il convient de comprendre que la valeur à laquelle le modificateur « environ » se réfère est elle-même aussi spécifiquement, et de préférence, divulguée.

Tandis que le terme « un(e) ou plusieurs », tel qu’un ou plusieurs constituants d’un groupe de constituants, est clair en soi, au moyen d’une exemplification supplémentaire, le terme englobe entre autres une référence à Tun quelconque desdits constituants, ou à Tun quelconque de deux ou plus desdits constituants, tels que, par exemple, Tun quelconque > 3, > 4, > 5, > 6 ou > 7 etc. desdits constituants, et jusqu’à la totalité desdits constituants.

Tous les documents cités dans le présent mémoire descriptif sont incorporés ici à titre de référence dans leur intégralité.

Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la divulgation de l’invention, incluant les termes techniques et scientifiques, ont la signification communément admise par l’homme du métier auquel l’invention appartient. A titre d’informations complémentaires, des définitions de termes peuvent être incluses afin de mieux apprécier l’enseignement de la présente invention.

Comme mentionné ci-dessus, les présents inventeurs ont réalisé une nouvelle stratégie pour obtenir une souche bactérienne qui produit de l’acide succinique à une concentration élevée, tout en produisant peu ou pas d’autres acides organiques et/ou alcools (tels que, par exemple, le pyruvate, le formate, l’acétate, l’alcool) par le biais de la réduction de l’activité de l’alcool déshydrogénase, des lactates déshydrogénases, de la pyruvate formate lyase et/ou des malates déshydrogénases.

Par conséquent, un premier aspect de la présente invention concerne une souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production d’acide succinique, dans laquelle la souche bactérienne comprend ou consiste en une activité réduite d’au moins 3 enzymes choisies dans le groupe constitué par : l’alcool déshydrogénase (adh), les lactates déshydrogénases (ldh), la pyruvate formate lyase (pfl) et les malates déshydrogénases (mdh).

Dans des modes de réalisation préférés, la souche bactérienne génétiquement modifiée comprend ou consiste en une activité réduite de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl) et des malates déshydrogénases (mdh).

Le terme « activité réduite » est destiné ici à indiquer l’activité d’une protéine, en particulier une activité enzymatique, qui est au moins une réduction de 75 % de l’activité de la protéine par rapport à l’activité d’une protéine dans une souche bactérienne de type sauvage correspondante. De préférence, au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %, tels que par exemple 96%, 97%, 98%, 99%, ou plus préférablement, 100% (c’est-à-dire l’inactivation) de réduction de l’activité de la protéine sont atteints. L’activité de la protéine peut être réduite par des inhibiteurs, par mutation (par exemple des mutations ponctuelles de résidus critiques) ou par suppression de l’expression ou de la traduction du gène (par exemple la méthylation de la séquence promotrice) et similaire. De préférence, l’activité réduite de la protéine est obtenue par le biais d’une disruption du gène codant.

Par conséquent, dans des modes de réalisation préférés, la souche bactérienne génétiquement modifiée comprend ou consiste en une disruption d’au moins 3 gènes choisies dans le groupe constitué par : adh, Idh, pfl et mdh, de préférence une disruption des gènes adh, Idh, pfl et mdh.

Les termes « disruption », « suppression » et « régulation négative » sont synonymes et désignent ici les mutations du gène, incluant les régions codantes ainsi que les régions régulatrices, telles que, par exemple, le promoteur, causant une activité réduite, de préférence l’inactivation, du gène par rapport au gène natif, c’est-à-dire non muté ou de type sauvage. Le terme « activité du gène » doit être compris ici comme englobant la transcription et la traduction du gène, ainsi que l’activité du produit génétique, par exemple une protéine. Un gène peut être complètement (c’est-à-dire à 100 %) inactivé par knock-out, retrait ou délétion de la totalité de la séquence génomique. L’utilisation d’une mutation de changement de phase, l’insertion d’un codon d’arrêt prématuré, de mutations ponctuelles de résidus critiques, de délétions ou d’insertions et similaires peuvent inactiver complètement (c’est-à-dire à 100 %) le produit génétique.

De préférence, le gène codant est délété. Par conséquent, dans des modes de réalisation préférés, la souche bactérienne génétiquement modifiée comprend ou consiste en une délétion d’au moins 3 gènes choisies dans le groupe constitué par : adh, Idh, pfl et mdh, de préférence une délétion des gènes adh, Idh, pfl et mdh.

Dans des modes de réalisation préférés, la souche bactérienne appartient à la famille des Pasteurellaceae, plus préférablement au genre Actinobacillus, encore plus préférablement à l’espèce Actinobacillus succinogenes.

Actinobacillus succinogenes est une bactérie à Gram négative, facultativement anaérobie, pléomorphe. Elle appartient à la famille des Pasteurellaceae qui, en plus de Actinobacillus, inclut les genres Mannheimia, Haemophilus, et Pasteurella.

Un exemple non limitatif de Actinobacillus succinogenes est la souche 130Z de A. succinogenes, qui a été isolée à partir de panse de bovin, telle qu’elle est disponible auprès de Γ American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro d’accession ATCC55618.

Dans des modes de réalisation préférés, la souche bactérienne est la souche 130Z de A. succinogenes. D’autres modes de réalisation concernent une souche 130Z de A. succinogenes génétiquement modifiée, dans laquelle d’au moins 3 gènes choisies dans le groupe constitué par : adh, Idh, pfl et mdh, ont été délétés, de préférence une souche 130Z de A. succinogenes génétiquement modifiée dans laquelle les gènes adh, Idh, pfl et mdh ont été délétés. Une telle souche 130Z de A. succinogenes génétiquement modifiée peut être obtenue par les procédés permettant de modifier génétiquement Æ succinogenes tels qu’ils sont enseignés ici.

Dans des modes de réalisation préférés, l’invention concerne une souche 130Z de A. succinogenes génétiquement modifiée telle qu’elle est déposée conformément au Traité de Budapest auprès de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) — Laboratorium voor Microbiologie - Bacteriënverzameling, (BCCM/LMG) (Université de Gand, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) le 11 janvier 2013 sous le numéro d’accession LMG P-27390.

Dans d’autres modes de réalisation, l’invention concerne une souche 130Z de A. succinogenes génétiquement modifiée telle qu’elle est déposée conformément au Traité de Budapest auprès de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) - Laboratorium voor Microbiologie - Bacteriënverzameling, (BCCM/LMG) (Université de Gand, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) le 11 janvier 2013 sous le numéro d’accession LMG P-27388 ou LMG P-27389.

Les souches bactériennes génétiquement modifiées telles qu’elles sont enseignées ici peuvent comprendre en outre une activité réduite et/ou une surexpression d’une ou plusieurs autres enzymes métaboliques.

Le terme « surexpression » est destiné ici à indiquer l’activité d’une protéine, en particulier une activité enzymatique, qui est au moins une augmentation de 150% de l’activité de la protéine par rapport à l’activité de la protéine dans une souche bactérienne de type sauvage correspondante.

Une protéine, en particulier une enzyme, peut être surexprimée par des activateurs, en supprimant des inhibiteurs, par mutation (par exemple des mutations se traduisant par une forme plus active de la protéine ou une forme qui est résistante aux inhibiteurs), ou en supprimant des répresseurs, ajoutant de multiples copies du gène ou ajoutant un gène hétérologue, ou régulant à la hausse le gène endogène (par exemple en ajoutant un puissant promoteur, tel que par exemple le promoteur P32).

Dans les exemples, les souches bactériennes génétiquement modifiées telles qu’elles sont enseignées ici peuvent comprendre en outre une surexpression d’une ou plusieurs enzymes du cycle TCA, plus préférablement des enzymes de la voie oxydative du cycle TCA, telles que par exemple la citrate lyase (cil), l’aconitase (acn), l’isocitrate déshydrogénase (idh), la complexe a-cétoglutarate déshydrogénase (ogdc) et la succinate synthase (sucs). Par exemple, la souche bactérienne génétiquement modifiée peut comprendre ou consister en une activité réduite de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl) et de la malate déshydrogénase (mdh) et une surexpression de la citrate lyase (cil) et/ou de 1’ aconitase (acn) et/ou de 1’ isocitrate déshydrogénase (idh) et/ou de la complexe a-cétoglutarate déshydrogénase (ogdc) et/ou de la succinate synthase (sucs).

Dans d’autres exemples, la souche bactérienne génétiquement modifiée peut comprendre en outre une surexpression d’une ou plusieurs enzymes du cycle du glyoxylate telles que, par exemple, la citrate lyase (cil), l’aconitase (acn), l’isocitrate lyase (ici) et la malate synthase (ms), et de préférence une activité réduite d’une ou plusieurs enzymes du cycle TCA. Par exemple, la souche bactérienne génétiquement modifiée peut comprendre ou consister en une activité réduite de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl), de la malate déshydrogénase (mdh) et une surexpression de la citrate lyase (cil) et/ou de 1’ aconitase (acn) et/ou de l’isocitrate lyase (ici) et/ou de la malate synthase (ms), et de préférence une activité réduite de l’isocitrate déshydrogénase (idh) et/ou de la complexe α-cétoglutarate déshydrogénase (ogdc) et/ou de la succinate synthase (sucs).

Un autre objet de l’invention présentée ici est de fournir une méthode de culture d’une souche bactérienne mutante en condition anaérobie en réacteur qui permet de produire de succinate en concentrations élevées, de préférence tout en maintenant la concentration des autres acides organiques et/ou alcools à un faible niveau.

Par conséquent, dans un autre aspect, la présente invention concerne un procédé pour la production d’acide succinique dans des conditions anaérobies à l’aide d’une souche bactérienne génétiquement modifiée telle qu’elle est enseignée ici.

Les termes « succinate » et « acide succinique » sont utilisés ici de manière interchangeable. L’acide succinique est également appelé acide butanedioïque (C4H6O4). Chimiquement, le succinate correspond à un sel ou un ester de l’acide succinique. Par conséquent, succinate et acide succinique désignent le même composé, qui peut être présent sous l’une ou l’autre des deux formes en fonction du pH de la solution.

La production d’acide succinique telle qu’elle est enseignée ici peut être réalisée par fermentation d’une source de glucides. Le terme « fermentation » est destiné ici à indiquer la conversion d’une source de glucides, de préférence un sucre tel que, par exemple, le glucose, le fructose ou le sucrose, en alcools et/ou acides organiques, de préférence l’acide succinique, à l’aide de micro-organismes, de préférence une souche bactérienne génétiquement modifiée telle qu’elle est enseignée ici, dans des conditions anaérobies.

Dans des modes de réalisation préférés, le procédé pour la production d’acide succinique comprend les étapes consistant à : a) cultiver la souche bactérienne génétiquement modifiée telle qu’elle est enseignée ici dans des conditions anaérobies ; b) fournir une source de glucides ; c) laisser la souche bactérienne métaboliser la source de glucides ; et d) isoler l’acide succinique de la culture.

Les bactéries génétiquement modifiées peuvent être cultivées dans une fiole, un bioréacteur, un réacteur à fonctionnement discontinu ou un bioréacteur chemostat pour obtenir l’acide succinique.

La culture des bactéries dans des conditions anaérobies peut être obtenue en cultivant les bactéries dans un milieu de culture anaérobie saturé en CO2. Le pH peut être maintenu pendant la culture en ajoutant au milieu de culture un agent tampon, par exemple MgC03, et en arrosant la culture avec du CO2.

De préférence, la source de glucides est un sucre. Des exemples non limitatifs des sucres appropriés comprennent les monosaccharides, tels que, par exemple le glucose, le fructose, le xylose ou l’arabinose, ou les disaccharides, tels que, par exemple le sucrose, le lactose, le cellobiose.

De tels procédés utilisant une souche bactérienne génétiquement modifiée telle qu’elle est enseignée ici peuvent garantir un rendement de production élevé d’acide succinique, tandis que la production d’autres acides organiques et/ou alcools est maintenue à un minimum.

Comme mentionné plus haut, les présents inventeurs ont également mis au point un procédé pour modifier génétiquement Actinobacillus succinogenes, qui est basé sur la compétence naturelle.

Les termes « compétence » et « compétent », et similaires, désignent ici l’aptitude d’une cellule, de préférence une cellule bactérienne, à prélever un ADN extracellulaire dans son environnement. Le terme englobe la compétence naturelle et la compétence artificielle. On entend par « compétence naturelle » l’aptitude génétiquement spécifiée d’une cellule, de préférence une cellule bactérienne, à réaliser ce prélèvement d’ADN. La compétence naturelle peut se produire de manière spontanée dans la nature ainsi que dans des conditions de laboratoire, dans lesquelles la compétence naturelle peut être induite ou encore être accrue. On entend par « compétence artificielle » le fait de rendre une cellule, de préférence une cellule bactérienne, temporairement perméable à un ADN extracellulaire.

Par conséquent, un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour la modification génétique de A. succinogenes comprenant l’étape a) consistant à incuber des cellules de A. succinogenes compétentes avec une chimère d’acide nucléique.

Des conditions d’incubation appropriées, qui permettent le prélèvement de la chimère d’acide nucléique dans les cellules, comprennent, par exemple, l’incubation de cellules de A. succinogenes compétentes avec entre environ 1 ng/ml et environ 1 pg/ml d’ADN, tel qu’environ 10 ng/ml, environ 50 ng/ml, environ 100 ng/ml, environ 200 ng/ml ou environ 500 ng/ml d’ADN, à environ 37°C entre environ 5 min et environ 1 heure, de préférence entre environ 10 min et environ 30 min, plus préférablement pendant environ 15 min. De préférence, les cellules sont agitées pendant l’incubation, comme, par exemple, à environ 100 rpm.

Les présents inventeurs ont mis au point un protocole pour induire la compétence naturelle dans A. succinogenes. En particulier, ils ont découvert que la compétence peut être induite en transférant des cellules à croissance exponentielle dans un milieu synthétique auquel il manque de nombreux composants nécessaires à une croissance durable, incluant les sucres, les nucléotides et les cofacteurs (c’est-à-dire le milieu de compétence), tels que par exemple le milieu M-IV. La composition du milieu M-IV est décrite dans Poje and Redfield (2003. Methods Mol. Med. 71: 57-70), qui est spécifiquement incorporé ici à titre de référence. Sans souhaiter se limiter à la théorie, la culture de A. succinogenes dans un tel milieu de compétence peut mettre un terme à la division cellulaire et induire l’expression de gènes responsables du prélèvement d’ADN dans les cellules.

Dans des modes de réalisation préférés des procédés enseignés ici, les cellules de A. succinogenes compétentes peuvent être obtenues par l’incubation de cellules de A. succinogenes à croissance exponentielle dans un milieu de compétence, de préférence le milieu M-IV, entre environ 60 min et environ 120 min, de préférence entre environ 60 min et environ 100 min, comme, par exemple, pendant environ 60 min, 70 min, 80 min, 90 min ou 100 min, plus préférablement pendant environ 100 min. De préférence, les cellules sont agitées pendant l’incubation, comme, par exemple, à environ 100 rpm. De préférence, les cellules sont incubées à une température d’environ 37°C.

La chimère d’acide nucléique à faire prélever par les cellules de A. succinogenes compétentes est de préférence une chimère d’ADN. La chimère d’acide nucléique peut se présenter sous une forme linéaire ou sous une forme circulaire.

Un exemple non limitatif d’une chimère d’ADN circulaire est un plasmide. Des exemples non limitatifs de plasmides appropriés pour être utilisés dans A. succinogenes incluent pLGZ920, pLGZ921 et pLGZ922 comme le décrit le brevet US 7,163,812.

Dans des modes de réalisation préférés, la chimère d’acide nucléique est un ADN linéaire.

Les procédés de production d’ADN linéaire sont bien connus de l’homme du métier et peuvent inclure, par exemple, mais sans limitation, le clonage dans un vecteur, tel que par exemple un plasmide, ou une réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Dans un exemple, l’ADN linéaire peut être obtenu par clonage dans le plasmide pNZ5319 (Fig. 1). Dans un autre exemple, l’ADN linéaire peut être obtenu par PCR de recouvrement (Fig. 2).

Lorsque la chimère d’acide nucléique a été prélevée par les cellules de A. succinogenes compétentes, la chimère d’acide nucléique ou un fragment de celle-ci peut être incorporé dans l’ADN génomique par recombinaison ou un plasmide peut être établi, ce qui se traduit ainsi par des cellules de A. succinogenes qui ont changé de phénotype.

Le terme « transformation » désigne de manière générale le processus d’altération génétique d’une cellule résultant du prélèvement d’ADN exogène dans son environnement. Dans le contexte de la présente invention, l’ADN exogène englobe la chimère d’acide nucléique qui est incubée avec les cellules de A. succinogenes compétentes.

Par conséquent, les « cellules transformées » telles qu’elles sont utilisées ici désignent des cellules de A. succinogenes génétiquement altérées ou modifiées en raison du prélèvement de la chimère d’acide nucléique tel qu’il est enseigné ici.

Lorsqu’elle est modifiée de manière appropriée, la chimère d’acide nucléique ou un fragment de celle-ci peut être inséré dans l’ADN génomique (c’est-à-dire l’intégration) des cellules de A. succinogenes compétentes qui ont prélevé ladite chimère d’acide nucléique par double recombinaison homologue.

Le terme « recombinaison homologue » désigne de manière générale un type de recombinaison génétique dans lequel des séquences nucléotidiques sont échangées entre deux molécules d’ADN identiques, similaires ou homologues. Dans le contexte de la présente invention, des séquences nucléotidiques sont échangées entre la chimère d’acide nucléique et l’ADN génomique, de préférence l’ADN chromosomique, des cellules de A. succinogenes compétentes qui ont prélevé ladite chimère d’acide nucléique. Le terme « recombinaison non homologue » désigne de manière générale un type de recombinaison génétique entre des molécules d’ADN qui ne contiennent aucune homologie de séquence.

La recombinaison homologue peut être préférée parce que la recombinaison homologue permet de savoir où se produira la recombinaison dans l’ADN génomique .

Afin que la recombinaison homologue se produise, la chimère nucléique doit comprendre au moins une séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes. Il sera compris par l’homme du métier qu’il n’est pas nécessaire d’avoir une identité de 100 % afin d’obtenir une recombinaison homologue. Un pourcentage d’identité entre les séquences nucléotidiques d’environ 90 % sera suffisant. Par exemple, les séquences nucléotidiques peuvent être au moins identiques à 91 %, par exemple au moins identiques à 92 %, de préférence au moins identiques à environ 93 %, par exemple au moins identiques à 94 %, plus préférablement au moins identiques à environ 95 %, par exemple au moins identiques à 96 %, encore plus préférablement au moins identiques à environ 97 %, par exemple au moins identiques à 98 %, et le plus préférablement au moins identiques à 99 %. Lesdites séquences nucléotidiques doivent également avoir une longueur suffisante pour permettre une recombinaison homologue. Cette longueur doit être d’au moins environ 200 pb, par exemple elle peut varier entre 200 pb et 2000 pb, de préférence entre 1000 pb et 1500 pb.

Dans certains modes de réalisation, la chimère d’acide nucléique comprend au moins deux de ces séquences nucléotidiques essentiellement homologues aux séquences du génome de A. succinogenes, ce qui permet qu’une double recombinaison homologue ait lieu.

De préférence, les séquences nucléotidiques sont essentiellement homologues aux séquences du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible. De tels procédés peuvent être appropriés pour remplacer une séquence cible ou pour déléter une séquence cible.

Dans des modes de réalisation préférés, la chimère d’acide nucléique comprend une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, lesdites séquences nucléotidiques étant capables d’une recombinaison homologue avec lesdites séquences de A. succinogenes lorsque ladite chimère d’acide nucléique est introduite dans lesdites cellules de A. succinogenes.

Tel qu’il est utilisé ici, le terme « séquence cible » désigne une séquence présente dans le génome de A. succinogenes qui doit être génétiquement modifiée, incluant le remplacement et la délétion. La séquence cible peut être une séquence fonctionnelle, telle que, par exemple, un promoteur ou une autre séquence régulatrice, ou une séquence codante, ainsi qu’une séquence non fonctionnelle.

Dans des modes de réalisation préférés, la séquence cible code pour une fonctionnalité non souhaitée, telle que, par exemple, l’alcool déshydrogénase (adh), les lactates déshydrogénases (ldh), la pyruvate formate lyase (pfl), les malates déshydrogénases (mdh), l’isocitrate déshydrogénase (idh), la complexe a-cétoglutarate déshydrogénase (ogdc), ou la succinate synthase (sucs), plus préférablement adh, ldh, pfl ou mdh.

Dans d’autres modes de réalisation, le procédé comprend en outre l’étape consistant à sélectionner les cellules transformées à la suite de l’étape a).

Afin de permettre la sélection des cellules de A. succinogenes transformées, la chimère d’acide nucléique comprend de préférence une cassette d’expression comprenant un gène codant pour un marqueur de sélection et des séquences régulatrices fonctionnelles dans les cellules de A. succinogenes qui y sont liées de manière opérationnelle, entre, telles que par exemple flanquées au niveau de ses côtés 5’ et 3’ par, lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques.

Tel qu’il est utilisé ici, le terme « cassette d’expression » indique un fragment d’une chimère d’acide nucléique qui comprend un ou plusieurs gènes dont l’expression est recherchée et des séquences régulatrices qui y sont liées de manière opérationnelle.

Le terme « séquence régulatrice » tel qu’il est utilisé ici indique un élément nécessaire pour l’expression d’une séquence, par exemple un gène, qui y est liée de manière opérationnelle. La nature précise des séquences régulatrices peut varier entre les environnements d’expression, mais inclut typiquement un promoteur et un facteur de terminaison de transcription, et facultativement un amplificateur.

Une « liaison opérationnelle » » telle qu’elle est utilisée ici est une liaison dans laquelle des séquences régulatrices et des séquences recherchées pour être exprimées sont reliées de manière à permettre ladite expression. Par exemple, des séquences telles que, par exemple, un promoteur et un cadre ouvert de lecture, peuvent être dites liées de manière opérationnelle si la nature de la liaison entre lesdites séquences : (1) ne se traduit pas par l’introduction d’une mutation de changement de phase, (2) n’interfère pas avec l’aptitude du promoteur à diriger la transcription du cadre ouvert de lecture, (3) n’interfère pas avec l’aptitude du cadre ouvert de lecture à être transcrit à partir de la séquence promotrice.

Par exemple, la chimère d’acide nucléique peut comprendre un gène de résistance aux antibiotiques, conférant une résistance aux antibiotiques aux cellules de A. succinogenes transformées. La sélection de cellules de A. succinogenes transformées, c’est-à-dire des « transformés », peut alors être obtenue par le biais de la culture des cellules de A. succinogenes dans un milieu sélectif comprenant un milieu de culture auquel on a jouté l’antibiotique. Typiquement, le milieu sélectif comprend l’antibiotique à une concentration suffisante pour tuer ou pour empêcher la croissance des cellules de A. succinogenes qui n’ont pas prélevé la chimère d’acide nucléique, c’est-à-dire les cellules de A. succinogenes non transformées.

De préférence, les colonies de transformés sont recueillies, lesquelles peuvent avantageusement permettre de vérifier l’introduction de la chimère d’acide nucléique ou d’un fragment de celle-ci dans l’ADN génomique, de préférence T ADN chromosomique, par exemple, par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Par conséquent, dans d’autres modes de réalisation, les procédés tels qu’ils sont enseignés ici comprennent en outre une étape consistant à recueillir les cellules transformées à la suite de la sélection. Dans d’autres modes de réalisation encore, les procédés tels qu’ils sont enseignés ici comprennent en outre les étapes consistant à recueillir les cellules transformées et à vérifier l’incorporation de la chimère d’acide nucléique ou d’un fragment de celle-ci dans l’ADN génomique, de préférence l’ADN chromosomique, des cellules de A. succinogenes à la suite de la sélection.

Dans des modes de réalisation préférés, la chimère d’acide nucléique comprend la cassette lox66-?i2-Cat-lox71 du plasmide pNZ5319 entre, telle que par exemple flanquée au niveau de ses côtés 5’ et 3’, une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, lesdites séquences nucléotidiques étant capables d’une recombinaison homologue avec lesdites séquences de A. succinogenes lorsque ladite chimère d’acide nucléique est introduite dans lesdites cellules de A. succinogenes.

Tel qu’il est utilisé, le plasmide pNZ5319 indique le vecteur de mutagenèse décrit dans Lambert et al. (2007. Appl. Environm. Microbiol. 73: 1126-1135), qui est incorporé spécifiquement ici à titre de référence.

Dans d’autres exemples, la chimère d’acide nucléique comprend la cassette Yyi-lox66-Cat-lox71 entre, telle que par exemple flanquée au niveau de ses côtés 5’ et 3’, une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, lesdites séquences nucléotidiques étant capables d’une recombinaison homologue avec lesdites séquences de A. succinogenes lorsque ladite chimère d’acide nucléique est introduite dans lesdites cellules de A. succinogenes.

Les termes « Cat » et « CmR » tels qu’ils sont utilisés ici sont synonymes et désignent ici un gène de résistance au chloramphénicol.

Le terme « P32 » indique le promoteur P32.

Les cassettes lox66-Pyi-Cat-lox71 et Yyi-lox66-Cat-lox71 comprennent 2 variants mutants de loxP, c’est-à-dire lox66 et lox71.

Un site loxP indique de manière générale une séquence nucléotidique de 34 pb (c’est-à-dire SEQ ID NO : 29 : ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT) qui est reconnue par la Cre recombinase, et qui comprend une séquence intercalaire principale asymétrique de 8 pb et des séquences flanquantes palindromiques de 13 pb, également appelées répétitions inversées. La Cre recombinase est une protéine de 38 kDa qui appartient à la famille de recombinases site spécifiques que sont les intégrases. Elle catalyse la recombinaison indépendante des cofacteurs entre deux de ses sites de reconnaissance loxP, indépendamment du fait que ces sites loxP soient ou non intramoléculaires ou intermoléculaires. Le système Cre-lox permet d’exciser les séquences entre lesdits sites loxP.

Tels qu’ils sont utilisés ici, lox66 (c’est-à-dire SEQ ID NO : 30 : T ACCGTT CGT AT A AT GT AT GCT AT ACG A AGTT AT) et lox71 (c’est-à-dire SEQ ID NO : 31 : AT AACTT CGT AT AAT GT ATGCT AT ACG AACGGT A) indiquent des sites loxP mutants comprenant une mutation dans une des répétitions inversées. La recombinaison de lox66 et lox71 se traduit par un site lox72 double mutant (c’est-à-dire SEQ ID NO : 32 : TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA) qui a une affinité de liaison pour Cre fortement réduite. Cela permet des cycles consécutifs de transformation, de recombinaison et d’excision, ce qui se traduit par de multiples modifications dans un seul bagage génétique.

La sélection de transformés qui ont prélevé l’acide nucléique comprenant la cassette lox66-l*32-Cat-lox71 du plasmide pNZ5319 ou la cassette P32-lox66-Cat-lox71 peut être réalisée en cultivant les cellules sur un milieu sélectif comprenant du chloramphénicol.

Lors de la transformation des cellules de A. succinogenes avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-?i2-Cat-lox71 du plasmide pNZ5319 entre une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, ladite séquence cible peut être remplacée par la séquence de la chimère d’acide nucléique entre lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques par une double recombinaison homologue, laissant ainsi la cassette lox66-?i2-Cat-lox71 dans l’ADN génomique (Fig. 3).

Lors de la transformation des cellules de A. succinogenes avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette P32-lox66-Cat-lox71 entre une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, ladite séquence cible peut être remplacée par la séquence de la chimère d’acide nucléique entre lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques par une double recombinaison homologue, laissant ainsi la cassette P32-lox66-at-lox71 dans l’ADN génomique (Fig. 6).

La séquence nucléotidique entre les sites lox peut par la suite être excisée dans l’ADN génomique par la Cre recombinase, laissant ainsi le site double mutant lox72 dans l’ADN génomique (Fig. 3).

Par conséquent, dans d’autres modes de réalisation, les procédés tels qu’ils sont enseignés ici comprennent en outre les étapes consistant à : b) sélectionner des cellules recombinantes en cultivant les cellules sur un milieu comprenant du chloramphénicol ; et c) fournir la Cre recombinase.

Les cellules de A. succinogenes recombinantes peuvent être dotées de la Cre recombinase par transformation avec une deuxième chimère d’acide nucléique permettant l’expression de la Cre recombinase. Une chimère d’acide nucléique appropriée peut inclure un plasmide codant pour la Cre recombinase, tel que, par exemple, le plasmide pGhostCre tel qu’il est décrit dans Fontaine et al. (2010. Appl. Environ. Microbiol. 76: 7870-7877), qui est spécifiquement incorporé ici à titre de référence.

Dans des modes de réalisation préférés, une Cre recombinase est fournie en transformant les cellules recombinantes avec un plasmide codant pour la Cre recombinase.

La transformation des cellules recombinantes avec ladite deuxième chimère d’acide nucléique codant pour la Cre recombinase, en particulier un plasmide codant pour la Cre recombinase, peut être réalisée par exemple par électroporation ou transformation par compétence naturelle. De préférence, la transformation avec la deuxième chimère d’acide nucléique codant pour la Cre recombinase est réalisée par électroporation. La transformation des cellules de A. succinogenes par électroporation peut se faire en faisant passer une décharge de haute tension à travers une suspension de cellules comprenant la deuxième chimère d’acide nucléique.

De préférence, ladite deuxième chimère d’acide nucléique codant pour la Cre recombinase, en particulier un plasmide codant pour la Cre recombinase, comprend en outre un gène codant pour un marqueur de sélection, par exemple un gène de résistance aux antibiotiques, afin de permettre la sélection des cellules transformées avec ladite deuxième chimère d’acide nucléique. La sélection des cellules recombinantes qui ont été transformées avec ladite deuxième chimère d’acide nucléique peut ensuite être obtenue par exemple en cultivant les cellules transformées sur un milieu sélectif comprenant l’antibiotique.

De préférence, l’excision de la séquence nucléotidique entre les sites lox dans l’ADN génomique est vérifiée dans les colonies de transformés sélectionnées, par exemple par PCR, facultativement combinée à une analyse de séquences des produits d’amplification.

Le système Cre-lox de transformation des cellules de A. succinogenes avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-P22-CatAoxl1 ou la cassette V22-lox66-Cat-lox71, la sélection des cellules recombinantes sur la base de leur résistance au chloramphénicol acquise et l’excision de la séquence nucléotidique entre les sites lox dans l’ADN génomique avec la Cre recombinase permet de multiples modifications génétiques de multiples séquences cibles. Etant donné que le système Cre-lox laisse les cellules de A. succinogenes mutantes ayant un site mutant lox72 avec une affinité de liaison réduite pour la Cre recombinase dans leur ADN génomique, le système Cre-lox peut être répété à l’aide d’une deuxième chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-P22-Cat-lox71 ou une cassette P32-lox66-Cat-lox71. En répétant de manière consécutive les étapes a) à c) des procédés divulgués ici pour chaque séquence cible à modifier génétiquement, de multiples modifications génétiques des séquences cibles peuvent être obtenues.

Par conséquent, dans d’autres modes de réalisation, un procédé est fourni pour modifier génétiquement des cellules de A. succinogenes, dans lequel ladite modification génétique comprend de multiples modifications génétiques des séquences cibles et dans lequel le procédé comprend en outre l’étape d) consistant à répéter les étapes a) à c) pour chaque séquence cible.

Dans certains modes de réalisation des présents procédés, la modification génétique peut comprendre une délétion d’une séquence cible du génome de A. succinogenes. Pour obtenir une délétion d’une séquence cible, les cellules de A. succinogenes peuvent être transformées avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-P22-Cat-lox71 flanquée au niveau de ses côtés 5’ et 3’ par une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence cible essentiellement homologue à une séquence du génome deÆ succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 3’.

Dans certains modes de réalisation des présents procédés, la modification génétique peut comprendre un remplacement d’une séquence cible par le fragment de la chimère d’acide nucléique entre la première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 5’ et la deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 3’. Pour obtenir un tel remplacement, les cellules de A. succinogenes peuvent être transformées avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-V^2-Cat-lox71 entre une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 3’. Dans des exemples, la chimère d’acide nucléique peut en outre comprendre une séquence nucléotidique fournissant une fonctionnalité souhaitée, par exemple une propriété souhaitée ou une production d’un produit souhaité, entre lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques, laissant les cellules mutantes avec ladite séquence nucléotidique fournissant une fonctionnalité souhaitée insérée dans l’ADN génomique. Ladite séquence nucléotidique fournissant une fonctionnalité souhaitée peut être un ou plusieurs gènes, incluant des gènes homologues ainsi que des gènes hétérologues, et des séquences régulatrices fonctionnelles dans les cellules de A. succinogenes qui y sont liées de manière opérationnelle, ou une séquence régulatrice, telle que par exemple un promoteur puissant (par exemple le promoteur P32) et similaire. Le remplacement d’une séquence cible, en particulier le replacement d’un promoteur d’un gène cible par le promoteur P32, peut également être obtenu par transformer les cellules de A. succinogenes avec une chimère d’acide nucléique comprenant la cassette P32-lox66-Cat-lox71 entre une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant la séquence cible au niveau de son côté 3’.

Dans des modes de réalisation préférés, la modification génétique comprend la délétion des gènes adh, Idh, pfl et mdh.

Dans certains exemples, la modification génétique peut comprendre la délétion des gènes adh, Idh, pfl et mdh et le remplacement des promoteurs cil et/ou acn et/ou idh et/ou ogdc et/ou sucs par le promoteur P32.

Dans d’autres exemples, la modification génétique peut comprendre la délétion des gènes adh, Idh, pfl et mdh, le remplacement des promoteurs cil et/ou acn par le promoteur P32, et l’insertion des gènes ici et ms hétérologues, par exemple à partir de B. Coagulons, et de préférence la délétion des gènes idh et/ou ogdc et/ou sucs.

Exemples

Exemple 1 : Construction du fragment d’ADN linéaire PKO

Afin d’inactiver le gène codant pour un pyruvate formate lyase (pfl) par recombinaison homologue, un fragment d’ADN linéaire permettant de faire l’échange du gène est construit de la manière suivante, basée sur le clonage dans le vecteur pNZ5319 tel décrit dans Lambert et al. (2007. Appl. Environna. Microbiol. 73: 1126-1135), qui est incorporé spécifiquement ici à titre de référence (Fig. 1).

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2. Le fragment PCR obtenu est introduit dans le vecteur pNZ5319 préalablement restreint par PmeI pour donner pNZ-Pl. SEQ ID NO: 1: 5’- TGTTTATTGCAGTTAACGAT - 3’ SEQ ID NO: 2: 5’- ATTTGACCGCACTTTCATTGTAATACTTCCTTTG - 3’

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4. Le fragment PCR obtenu est introduit dans le vecteur pNZ-PFLl préalablement restreint par Ecll3Lll pour donner pNZ-Pl-2. SEQ ID NO: 3:5’- AAAGT GCGGTC AAATT AATT GGGGT AACGT AAT AA - 3’ SEQ ID NO: 4 : 5’- ACCAGCGGGCGCACGCCGGC - 3’

Le vecteur pNZ-PFLl-2 est finalement restreint avec l’enzyme Xbal pour donner le fragment d’ADN linéaire PKO.

Exemple 2 : Construction du fragment d’ADN linéaire AKO

Afin d’inactiver le gène codant pour une alcool déshydrogénase (adh) par recombinaison homologue, un fragment d’ADN linéaire permettant de faire l’échange du gène est construit de la manière suivante, basée sur la PCR de recouvrement (Fig. 2).

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6. Le fragment PCR obtenu est introduit dans le vecteur pNZ5319 préalablement restreint par Ecl 13611 pour donner pNZ-A2. SEQ ID NO: 5 : 5’- TAAAATCCGGTGCTTGACGGG - 3’ SEQ ID NO : 6 : 5’- AAAGTGCGGTCAAATTAGTTAAATTTTTTCTCTACCGCG - 3’

Une PCR est réalisée en utilisant le vecteur pNZ-A2 comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO : 8 pour donner le fragment d’ADN CmR-A2 SEQ ID NO: 7: 5’- TAAGGAAGATAAATCCCATAAGG - 3’

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 9 pour donner le fragment d’ADN Al. SEQ ID NO: 8 : 5’- CCTTATGGGATTTATCTTCCTTACATAGTTATTCCTCCGGTTT -3’ SEQ ID NO: 9:5’- AACCGACACCGTAGATGTTGT - 3’

Finalement, les fragments d’ADN Al et CmR-A2 sont mélangés ensemble à des concentrations équimolaires et assemblés en réalisant une PCR de recouvrement avec les amorces en bordure (SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 9) pour donner le fragment d’ADN linéaire AKO.

Exemple 3 : Construction du fragment d’ADN linéaire LKO

Afin d’inactiver le gène codant pour une lactate déshydrogénase (Idh) par recombinaison homologue, un fragment d’ADN linéaire permettant de faire l’échange du gène est construit de la manière suivante, basée sur la PCR de recouvrement.

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 11. Le fragment PCR obtenu est introduit dans le vecteur pNZ5319 préalablement restreint par Ecll36ll pour donner pNZ-L2. SEQ ID NO: 10: 5’- GATCTTGCTCATTTACTGCCG - 3’ SEQ ID NO: 11: 5’- AAAGTGCGGTCAAATTAAAGTCTGTTTATAAAAGATAAGCGG -3’

Une PCR est réalisée en utilisant le vecteur pNZ-L2 comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 12 pour donner le fragment d’ADN CmR-L2. SEQ ID NO: 12: 5’- TAAGGAAGATAAATCCCATAAGG - 3’

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 pour donner le fragment d’ADN Ll. SEQ ID NO: 13: 5’- CCTTATGGGATTTATCTTCCTTACATTTTGTTACCTCTTTGTAAAAAG - 3’ SEQ ID NO: 14: 5’- GTTTG A AG ATTT ATT AAT CGTTCCG - 3’

Finalement, les fragments d’ADN LI et CmR-L2 sont mélangés ensemble à des concentrations équimolaires et assemblés en réalisant une PCR de recouvrement avec les amorces en bordure (SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 14) pour donner le fragment d’ADN linéaire LKO.

Exemple 4 : Construction du fragment d’ADN linéaire MKO

Afin d’inactiver le gène codant pour une malate déshydrogénase (mdh) par recombinaison homologue, un fragment d’ADN linéaire permettant de faire l’échange du gène est construit de la manière suivante, basée sur la PCR de recouvrement.

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16. Le fragment PCR obtenu est introduit dans le vecteur pNZ5319 préalablement restreint par pmeI pour donner pNZ-Ml. SEQ ID NO: 15: 5’- GGGGCACCCGGGTGACCGG - 3’ SEQ ID NO: 16: 5’- ATTTGACCGCACTTTCATTTTTGCTCTCCTGTTGG -3 ‘

Une PCR est réalisée en utilisant le vecteur pNZ-Ml comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 17 pour donner le fragment d’ADN Ml-CmR. SEQ ID NO: 17: 5’- TTC ACGTT ACT AA AGGGAAT GTA -3’

Une PCR est réalisée en utilisant l’ADN génomique de A. succinogenes comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19 pour donner le fragment d’ADN M2. SEQ ID NO: 18: 5’-TACATTCCCTTTAGTAACGTGAATAAATTGTTCGTTCCCCTCTG -3’ SEQ ID NO: 19: 5’- ATCGGTGCAATAATACCGGCGG - 3’

Finalement, les fragments d’ADN Ml-CmR et M2 sont mélangés ensemble à des concentrations équimolaires et assemblés en réalisant une PCR de recouvrement avec les amorces en bordure (SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 19) pour donner le fragment d’ADN linéaire MKO.

Exemple 5 : Construction des souches mutantes simples d’Actinobacillus sp. PKO. AKO. LKO. MKO

Actinobacillus succinogenes 130Z est étalée sur le milieu «Brain Heart Infusion Broth » (BHI) (Sigma-Aldrich) et cultivée pendant 15h à 37°C. Une des colonies formées est inoculée dans un milieu liquide contenant 10 ml de BHI et cultivée pendant 12h. Une fraction de cette culture (1%) est prélevée et cultivée pendant 3-4 heures en milieu riche (35 ml BHI) dans un erlen suffisamment large (500 ml) afin de promouvoir l’aération de la culture jusqu’à densité optique d’environ 0,2. Un volume de 10 ml de la culture est prélevé et centrifugé 5 min à 2000xg. Le culot bactérien est lavé avec 10 ml de milieu M-IV (Poje and Redfield, 2003. Methods Mol. Med. 71: 57-70) et finalement remplacé par 10 ml de milieu M-IV maintenu à température ambiante dans un erlen (250 ml). La culture est agitée à 37°C et 100 rpm pendant 100 min. A ce moment, la culture a atteint un niveau maximum de compétence et va le maintenir pour au moins lh à 37°C.

En fonction du gène que l’on désire inactiver, le fragment d’ADN linéaire correspondant construit dans l’exemple 1 à 4 est ajouté à une concentration de 25 ng/ml à 1 ml de cellules compétentes. Les cellules sont incubées avec l’ADN à 37°C et 100 rpm pour 15 min. Il s’agit du temps nécessaire pour l’entrée de l’ADN dans la bactérie et son intégration dans le chromosome par double recombinaison homologue. La culture (100 μΐ) est finalement étalée sur des boites de Pétri contenant soit du BHI (dilution lO^x et 10‘5x), soit du BHI avec le chloramphénicol 5 pg/ml (dilution lx et 10''χ). La résistance à certains antibiotiques nécessite un certain temps d’expression. Dans le cas du chloramphénicol, il faut ajouter une étape avant l’étalement sur boite contenant 5 pg/ml d’antibiotique. Celle-ci consiste à ajouter 2 volumes de BHI au volume de culture et l’incuber à 37°C pendant 90 min. Après étalement, les boites de Pétri sont incubées à 37°C pour 48 h. L’efficacité de compétence des cellules est calculé en divisant le nombre de transformant / ml (calculé à partir du nombre de colonies sur les boites contenant du chloramphénicol) par le nombre total de cellules / ml (calculé à partir du nombre de colonies sur boites BHI). Dans le cas de fragments d’ADN obtenus par clonage dans un vecteur ou par PCR de recouvrement, une efficacité de compétence de 2.10'6 ou 2.10"4 a été obtenue respectivement. Les colonies résistantes au chloramphénicol sont analysées par PCR en utilisant des amorces qui bordent la région dans laquelle le gène a été remplacée. Le fragment d’ADN amplifié est séquencé pour confirmer la présence de la cassette loxóó-Y^-cat-loxJl dans le chromosome.

Afin de confirmer l’inactivation du gène pfl, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante PKO comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 20 et SEQ ID NO: 21. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. SEQ ID NO: 20: 5’- GGG AT CGT CGT CGCTT GCC A - 3’ SEQ ID NO: 21: 5’- TGGAATACTTCCTGACCGCC - 3’

Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit résultant de la PCR pour la souche mutante PKO utilisant les amorces SEQ ID NO: 20 et SEQ ID NO: 21 donne une bande correspondant à une taille de 4265 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 5345 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante PKO est séquencée pour confirmer la présence de la cassette lox66-Pi2-cat-Îox71 à la place du gène pfl dans le chromosome.

Afin de confirmer l’inactivation du gène adh, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante AKO comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 9. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. SEQ ID NO: 22: 5’- TGCCTAAAACGGCGGCGGAGG - 3’

Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit résultant de la PCR pour la souche mutante AKO utilisant les amorces SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 9 donne une bande correspondant à une taille de 4235 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4203 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante AK est séquencé pour confirmer la présence de la cassette lox66-¥yi-cat-lox71 à la place du gène adh dans le chromosome.

Afin de confirmer l’inactivation du gène Idh, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante LKO comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 14. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. SEQ ID NO: 23 : 5’- GGAAGACGGTAACAAAATTTC - 3’

Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit résultant de la PCR pour la souche mutante LKO utilisant les amorces SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 14 donne une bande correspondant à une taille de 4203 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4710 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante LKO est séquencée pour confirmer la présence de la cassette lox66-P32-cat-lox 71 à la place du gène Idh dans le chromosome.

Afin de confirmer l’inactivation du gène mdh, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante MKO comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 24 et SEQ ID NO: 19. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. SEQ ID NO: 24 : 5’- CCATAATACTTCGGCAATATC - 3’

Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit résultant de la PCR pour la souche mutante MKO utilisant les amorces SEQ ID NO: 24 et SEQ ID NO: 19 donne une bande correspondant à une taille de 4278 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4027 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante MKO est séquencée pour confirmer la présence de la cassette loxóó-P^-cat-loxJl à la place du gène mdh dans le chromosome.

Exemple 6 : Construction des souches mutantes multiples dΆctinobacillus sp. ALPKQ1 ALMKO. ALMPKO

Les souches mutantes multiples sont construites par étapes en inactivant successivement un gène à la fois et nécessite l’excision de la cassette de résistante au chloramphénicol (P32-cat) avant l’inactivation du gène suivant.

Pour exciser le marqueur de sélection (P32-cat) du chromosome, le plasmide pGhostCre tel descrit dans Fontaine et al. (2010. Appl Environ Microbiol 76 : 7870-7877), qui est incorporé spécifiquement ici à titre de référence, possédant une origine de réplication thermosensible est électroporé dans les cellules mutantes électrocompétentes préalablement préparées en suivant le protocole décrit dans Frey (1992. Res. Microbiol. 143 : 263-269).

Les cellules de la souche mutante sont étalées sur un milieu BHI et cultivée pendant 15h à 37°C. Une des colonies formées est inoculée dans un milieu liquide contenant 10 ml de BHI et cultivée pendant 12h. Une fraction de cette culture (1%) est prélevée et cultivée pendant 3-4 heures dans 100 ml de BHI jusqu’à densité optique d’environ 0,4 à 0,6. La culture est ensuite centrifugée pendant 15 min à 3100xg pour collecter les cellules. Ensuite, le culot de cellules est lavé 3x dans 10 ml d’une solution de glycérol 10% à 4°C. Les cellules sont finalement concentrées dans un volume de 200 μΐ d’une solution de glycérol 10% et conservées à -80°C. L’électroporation (2,5 kV/cm, 200 Ω et 50 pF) est réalisée avec 50 μΐ de cellules électrocompétentes et 500 ng de plasmide dans une cuvette Gene Puiser 0,1 cm (Bio-Rad). Après 2h d’incubation à 37°c et 180 rpm, les cellules (100 μΐ) sont étalées sur des boites de Pétri contenant du BHI avec de l’érythromycine 50 pg/ml (dilution lx et 10_1x). Après 48h à 72h de croissance, les colonies résistantes à l’érythromycine sont analysées par PCR en utilisant des amorces qui bordent la région dans laquelle le gène a été remplacé. Le fragment d’ADN amplifié est séquencé pour confirmer l’excision du marqueur et la présence du site double mutant lox72.

Afin de confirmer l’excision du marqueur de sélection dans la souche PKO, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 20 et SEQ ID NO: 21. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et la différence de taille du fragment de la souche mutante par rapport à la souche sauvage permet de confirmer l’excision du marqueur de sélection. L’excision du marqueur de sélection est confirmée par le fait que le produit résultant de la PCR utilisant les amorces SEQ ID NO: 20 et SEQ ID NO: 21 donne une bande correspondant à une taille de 2442 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 5346 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante AKO est séquencée pour confirmer l’excision du marqueur et la présence du site double mutant lox72 à la place du gène adh dans le chromosome.

Afin de confirmer l’excision du marqueur de sélection dans la souche AKO, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 20 et SEQ ID NO: 21. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et la différence de taille du fragment de la souche mutante par rapport à la souche sauvage permet de confirmer l’excision du marqueur de sélection. L’excision du marqueur de sélection est confirmée par le fait que le produit résultant de la PCR utilisant les amorces SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 9 donne une bande correspondant à une taille de 3093 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4203 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante AKO est séquencée pour confirmer l’excision du marqueur et la présence du site double mutant lox72 à la place du gène adh dans le chromosome.

Afin de confirmer l’excision du marqueur de sélection dans la souche LKO, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 14. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et la différence de taille du fragment de la souche mutante par rapport à la souche sauvage permet de confirmer l’excision du marqueur de sélection. L’excision du marqueur de sélection est confirmée par le fait que le produit résultant de la PCR utilisant les amorces SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 14 donne une bande correspondant à une taille de 3201 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4710 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante LKO est séquencée pour confirmer l’excision du marqueur et la présence du site double mutant lox72 à la place du gène adh dans le chromosome.

Afin de confirmer l’excision du marqueur de sélection dans la souche MKO, une PCR est réalisée en utilisant l’ADN de la souche mutante comme matrice et les amorces énoncées ci-dessous : SEQ ID NO: 24 et SEQ ID NO: 19. Une PCR est également réalisée sur l’ADN de la souche sauvage avec ces mêmes amorces comme contrôle. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et la différence de taille du fragment de la souche mutante par rapport à la souche sauvage permet de confirmer l’excision du marqueur de sélection. L’excision du marqueur de sélection est confirmée par le fait que le produit résultant de la PCR utilisant les amorces SEQ ID NO: 24 et SEQ ID NO: 19 donne une bande correspondant à une taille de 3135 pb sur gel d’agarose. En parallèle, le produit PCR obtenu pour la souche sauvage donne une bande correspondant à une taille de 4027 pb. La bande ayant la taille attendue sur gel, l’ADN amplifié par PCR pour la souche mutante MKO est séquencée pour confirmer l’excision du marqueur et la présence du site double mutant lox72 à la place du gène adh dans le chromosome.

La dernière étape à réaliser est de faire pousser pendant 10 générations la souche mutante dans un milieu sans pression de sélection (érythromycine) et en augmentant la température pour éliminer le plasmide thermosensible pGhostCre de la souche mutante.

Différents mutants multiples ont été construits avec la méthode décrite ci-dessus. La souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et pfl a été appelée « Actinobacillus sp. ALPKO » et a été déposée sous le numéro d’accession LMG P-27388 le 11 janvier 2013 dans la collection de bactéries BCCM/LMG à l’Université de Gand. La souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh et mdh a été appelée « Actinobacillus sp. ALMKO » et a été déposée sous le numéro d’accession LMG P-273891e 11 janvier 2013 dans la collection de bactéries BCCM/LMG à l’Université de Gand. La souche mutante inactivée au niveau des gènes adh, Idh, mdh et pfl a été appelée « Actinobacillus sp. ALMPKO » et a été déposée sous le numéro d’accession LMG P-27390 le 11 janvier 2013 dans la collection de bactéries BCCM/LMG à l’Université de Gand.

Exemple 7 : Caractéristiques de fermentation de la souche Actinobacillus sp. AT.PKO. ALMKO. ALMPKO

Afin d’examiner les caractéristiques de fermentation des souches mutantes de A. succinogenes sp. ALPKO, ALMKO et ALMPKO construites dans l’exemple 6, les cellules sont cultivées en anaérobie et les produits résultants de la réaction sont analysés par HPLC (Precolonne sugar SH-G (SHOWF6700080), Shodex et Colonne sugar SH1011 (SHOWF6378100), Shodex)

Le procédé de fermentation comprend les étapes suivantes. La souche à tester est étalée sur boite de pétri avec milieu BHI et 5 mg/1 de chloramphénicol dans une étuve avec 5% de CO2, 37°C et 90% d’humidité. Après 24-48 h de croissance sur boite de pétri, une colonie est isolée et inoculée dans 2 mL de milieu de culture anaérobie avec agitation à 200 rpm et à 37 °C. Le milieu de culture anaérobie utilisé est composé de 30-60 g/L glucose, 5 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 1 g/L (NH^SO* 3g/L KH2P04, 1 g/L NaCl, 2 g/L CaCl2.2H20, 0,2 g/L MgCl2.6H20, 0,007 g/L chloramphénicol et 1 % en volume du mix de vitamine (Vit. B12 0,1 mg/L, Vit. B8 Biotine 2 mg/L, Vit. B9 Acide Folique 2 mg/L, Vit. Bl Thiamin 5 mg/L, Vit. B2 Riboflavin 5 mg/L, Vit. B3 Niacin 5 mg/L, Vit. B5 panthothenate 5 mg/L, Vit. Bx p-aminobenzoate 5 mg/L, lipoic acid (cofact.) 5 mg/L, Vit. K 1, naphtoquinone 10 mg/L, Hemin 50 mg/L). Ce milieu est tamponné par du MgCOî (15 g/L) qui est mis au pH de culture contrebalancé par un bullage de C02. Après 24-48 h de culture, les 2 mL de culture sont utilisés pour inoculer à 10 % une fiole contenant 20 mL de milieu anaérobie. En fiole, le milieu est tamponné par une plus forte concentration en MgCC>3 (30 g/L) qui est contrebalancé par une surpression de CO2 dans le headspace de la fiole. Après 18-24 h de culture, les 20 ml de culture sont utilisés pour inoculer à 10 % une fiole contenant 200 mL de milieu anaérobie. Après 18-24 h et après s’être assuré de l’obtention d’une densité optique supérieure à 6, la culture en fiole de 200 ml est utilisée pour inoculer un fermenteur de 2 L de milieu anaérobie. Dans ce cas, la concentration du glucose dans le milieu anaérobie est comprise entre 30-120 g/L. De préférence, le milieu de culture contient 30-40 g/L de glucose en début de fermentation et le substrat est ensuite rajouté au fur et à mesure de la production. Le milieu est tamponné par une forte concentration en MgCOs (100 g/1) qui est contrebalancée par un bullage constant de CO2 à un débit de 0,1-0,3 wm. Des échantillons du milieu de culture sont régulièrement prélevés, centrifugés et le surnageant est dilué lOx avec une solution aqueuse 0.01 N H2SO4 pour permettre l’analyse HPLC.

Comme présenté dans la figure 4, après 48h de culture de la souche A. succinogenes 130Z et des différentes souches mutantes (ALPKO, ALMKO, ALMPKO), il apparaît clairement que la production en acide succinique après 48 h est nettement supérieure pour les mutants ALPKO et ALMPKO que pour la souche sauvage et le mutant ALMKO. D’autre part, la figure 4 montre clairement qu’après 48 h, la production en acide succique par le mutant ALPKO ralentit alors que la production du mutant ALMPKO se poursuit de manière pratiquement constante.

Le mutant ALMPKO présente le profil en métabolites le plus intéressant. En effet, ce mutant ne produit pas d’acide formique et une production en acide acétique nettement plus faible que la souche sauvage et les autres mutants (Tableau 1, Fig.5).

Tableau 1 : Bilan carboné pour la souche sauvage ActmobacUlus succinogenes 130Z et les mutants ALPKO, ALMKO, et ALMPKO.

Comme le montre le tableau 2, les mutants ALPKO et ALMPKO présentent un rendement massique pratiquement semblables et nettement supérieurs à ceux observés pour la souche sauvage et le mutant ALMKO.

Tableau 2 : Rendement massique et productivité moyenne pour la souche sauvage Actinobacillus succinogenes 130Z et les mutants ALPKO, ALMKO, et ALMPKO.

Après 48h, les mutants ALPKO et ALMPKO présentent une productivité pratiquement semblables et nettement supérieurs à ceux observés pour la souche sauvage et le mutant ALMKO (Tableau 2). Cependant, la productivité moyenne calculée sur 72h est nettement supérieure pour le mutant ALMPKO que pour les mutants ALPKO, ALMKO et la souche sauvage.

En conclusion, on observe des différences significatives au niveau du rendement en masse et de la productivité en succinate ainsi que de la concentration entre les différents produits de fermentation parmi la souche sauvage et les mutants ALMKO, ALPKO et ALMPKO. L’invention présentée ici permet de produire de l’acide succinique avec peu d’acétate sans inactiver ou diminuer l’activité des enzymes intervenant dans les voies de production de l’acétate.

Exemple 9 : Construction d’une souche mutante surexprimant un gène cible

La surexpression d’un gène est réalisée grâce à l’insertion du promoteur hétérologue P32. Celui-ci est présent sur le plasmide pNZ5319 dans lequel son rôle est d’exprimer le gène de résistance au chloramphénicol (Cat).

Le promoteur P32 est introduit devant le gène à surexprimer en utilisant une stratégie de remplacement de séquence faisant appel à une double recombinaison homologue suivit d’une recombinaison site spécifique (Fig. 6). La double recombinaison homologue permet l’insertion de la cassette (P^-loxóó-Cat-lox71) à la place du promoteur constitutif. Ensuite, la recombinaison site spécifique permet d’enlever le gène de résistance au chloramphénicol via les 2 sites lox mutants.

Avant d’insérer la cassette (P32-lox66- Cat-lox71) le vecteur pNZ5319 est modifié de façon à déplacer le site lox66 entre le promoteur P32 et le gène de résistance au chloramphénicol Cat (Fig. 7). Le lox66 est supprimé en faisant une restriction avec les enzymes Swal et Nrul. Ces deux enzymes reconnaissent chacune un site de restriction unique à bout droit entourant le site lox66. De cette façon, le vecteur peut être facilement religué sur lui-même après élimination du fragment contenant le site lox66. Le vecteur sans le site lox66 (pNZLox-7) peut facilement être caractérisé par séquençage. Ensuite, le site lox66 est réintroduit entre le promoteur P32 et le gène de résistance au chloramphénicol Cat sur le vecteur pNZLox-7. Cette étape est réalisée grâce aux amorces SEQ ID NO : 25 (pNZLox66f4) et SEQ ID NO : 26 (pNZLox66r5) présentées dans le tableau 3. Avant de religuer le fragment PCR obtenu, il est ré-amplifïer par PCR à l’aide des amorces SEQ ID NO : 27 (pNZP32bl) et SEQ ID NO : 28 (pNZP32b2) présentées dans le tableau 3. De cette façon un linker est ajouté entre le site lox66 générant une structure secondaire des ARN transcrits à partir du promoteur P32 et le site de liaison des ribosomes à l’ARN (RBS) afin d’empêcher que cette structure secondaire masque la séquence de RBS. Le fragment PCR obtenu est ligué sur lui-même pour obtenir le vecteur pNZP32.

Tableau 3 : Nom et séquence des amorces utilisées pour réaliser les PCR pour introduire le site lox66 dans le vecteur pNZLox-7. La séquence du site lox66 est en gras, la séquence du site de liaison des ribosomes à l’ARN du gène de résistance au chloramphénicol est en italique et le codon Start est souligné.

Sur la base de ce plasmide, les fragments d’ADN Up et Down qui entourent le promoteur constitutif du gène à surexprimer sont construits par PCR de recouvrement autour de la cassette P32-lox66- Cat-lox71.

Les souches peuvent être transformées par compétence naturelle et les mutants sélectionnés sur chloramphénicol.

Finalement, le gène de résistance au chloramphénicol est enlevé via recombinaison des 2 sites spécifiques lox66 et lox71.

Claims (17)

1. Revendications

   1. Souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production d’un succinate, ladite souche bactérienne comprenant une activité réduite de l’alcool déshydrogénase (adh), des lactates déshydrogénases (ldh), de la pyruvate formate lyase (pfl) et des malates déshydrogénases (mdh).
2. 2. Souche bactérienne selon la revendication 1, ladite souche bactérienne comprenant une disruption des gènes adh, ldh, pfl et mdh.
3. 3. Souche bactérienne selon la revendication 2, ladite souche bactérienne comprenant une délétion des gènes adh, ldh, pfl et mdh.
4. 4. Souche bactérienne selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, ladite souche bactérienne étant une souche de la famille des Pasteurellaceae, de préférence une souche de l’espèce Actinobacillus, plus préférablement une souche de A. succinogenes, encore plus préférablement une souche 130 Z de A. succinogenes.
5. 5. Souche bactérienne selon la revendication 4, ladite souche bactérienne étant la souche 130 Z de A. succinogenes génétiquement modifiée déposée conformément au Traité de Budapest auprès de la Belgïan Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) - Laboratorium voor Microbiologie - Bacteriënverzameling, (BCCM/LMG) le 11 janvier 2013 sous le numéro d ‘accession LMG P-27390.
6. 6. Procédé pour la production d’acide succinique dans des conditions anaérobies, la souche bactérienne génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 étant utilisée.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver la souche bactérienne génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans des conditions anaérobies ; b) fournir une source de glucides ; c) laisser la souche bactérienne métaboliser la source de glucides ; et d) isoler l’acide succinique de la culture.
8. 8. Procédé permettant de modifier génétiquement A. succinogenes comprenant l’étape a) consistant à incuber des cellules de A. succinogenes compétentes avec une chimère d’acide nucléique.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, les cellules de A. succinogenes compétentes pouvant être obtenues par l’incubation de cellules de A. succinogenes à croissance exponentielle dans un milieu de compétence entre environ 60 min et environ 100 min, de préférence pendant environ 100 min.
10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 ou 9, la chimère d’acide nucléique étant un ADN linéaire.
11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, la chimère d’acide nucléique comprenant une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, lesdites séquences nucléotidiques étant capables d’une recombinaison homologue avec ladite séquence de A. succinogenes lorsque ladite chimère d’acide nucléique est introduite dans lesdites cellules de A. succinogenes ; et de préférence une cassette d’expression comprenant un gène codant pour un marqueur de sélection et des séquences régulatrices fonctionnelles dans les cellules de A. succinogenes qui y sont liées de manière opérationnelle, ladite cassette d’expression étant entre lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, la séquence cible codant pour une fonctionnalité non souhaitée, de préférence l’alcool déshydrogénase (adh), la lactate déshydrogénase (ldh), la pyruvate formate lyase (pfl) ou la malate déshydrogénase (mdh).
13. 13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, la chimère d’acide nucléique comprenant la cassette lox66-Yyi-Cat-lox71 du plasmide pNZ5319 entre une première séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant une séquence cible au niveau de son côté 5’ et une deuxième séquence nucléotidique essentiellement homologue à une séquence du génome de A. succinogenes flanquant ladite séquence cible au niveau de son côté 3’, lesdites première et deuxième séquences nucléotidiques étant capables d’une recombinaison homologue avec ladite séquence de A. succinogenes lorsque ladite chimère d’acide nucléique est introduite dans lesdites cellules de A. succinogenes.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, comprenant en outre les étapes consistant à : b) sélectionner des cellules recombinantes en cultivant les cellules sur un milieu comprenant du chloramphénicol ; et c) fournir la Cre recombinase.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, la Cre recombinase étant fournie par la transformation des cellules recombinantes avec un plasmide codant pour la Cre recombinase.
16. 16. Procédé selon l’une quelconque des revendications 14 à 15, la modification génétique comprenant plusieurs modifications des séquences cibles et comprenant en outre l’étape d) consistant à répéter les étapes a) à c) pour chaque séquence cible.
17. 17. Procédé selon la revendication 16, la modification génétique comprenant les délétions des gènes adh, Idh, pfl et mdh.