ES2221102T3 - Procedimiento de preparacion biotecnologico de delta decalactona y delta dodecalactona. - Google Patents
Procedimiento de preparacion biotecnologico de delta decalactona y delta dodecalactona.Info
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Abstract
LA INVENCION PRESENTA UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE DE DECALACTONA O DE - DODECALACTONA, MEDIANTE LA HIDROGENACION DE 2 - DECEN - 5 - OLIDO Y 2 - DODECEN - 5 - OLIDO, O UN DERIVADO DE LOS MISMOS, POR MEDIO DE UNA BACTERIA CAPAZ DE EFECTUAR DICHA HIDROGENACION, PREFERIBLEMENTE POR MEDIO DE UNA BACTERIA DEL GENERO CLOSTRIDIUM. EN UNA REALIZACION DE LA INVENCION, SE EMPLEA ACIDO 5 - HIDROXI - 2 - DECENOICO O ACIDO 5 - HIDROXI - 2 DODECENOICO, COMO SUSTRATO EN LA REACCION DE HIDROGENACION.
Description
Procedimiento de preparación biotecnológico de
\delta decalactona y \delta dodecalactona.
La presente invención se refiere al campo de la
biotecnología. Más en particular, se refiere a un nuevo
procedimiento para la preparación de
\delta-decalactona y
\delta-dodecalactona por hidrogenación de las
correspondientes lactonas insaturadas o un derivado de las mismas
utilizando bacterias, en particular bacterias pertenecientes al
género
Clostridium.
Clostridium.
La \delta-decalactona y la
\delta-dodecalactona son compuestos aromatizantes
muy apreciados. Se encuentran en pequeñas cantidades en productos
lácteos tales como mantequilla, y suponen una contribución
importante al sabor típico de estos productos. Como consecuencia de
las bajas cantidades en las que se encuentran de forma natural y de
sus características organolépticas tan apreciadas, que son buscadas
en particular para conferir el sabor natural de la mantequilla y
otros productos lácteos a la margarina y al yogur, existe la
necesidad de procedimientos capaces de proporcionar cantidades
industriales de estas lactonas, y con una calidad que cumpla la
legislación relativa a productos alimenticios.
La técnica anterior describe procedimientos para
la producción de estas lactonas, ya sea por síntesis orgánica o por
procedimientos biotecnológicos. En el contexto de la presente
invención, se pueden citar tres referencias que describen la
preparación biotecnológica de \delta-decalactona y
\delta-dodecalactona.
El procedimiento descrito en la solicitud de
Patente europea EP-A-409321 consiste
en una \beta-oxidación de hidroxi ácidos grasos
que se encuentran en la naturaleza en forma de sus ésteres en las
raíces o tubérculos de ciertas plantas, como Ipomoea y
Convolvulus. Se describe la utilización de varias levaduras,
hongos y bacterias para efectuar la
\beta-oxidación, perteneciendo los microorganismos
preferidos a la especie de Saccharomices cerevisiae. Los
hidroxi ácidos obtenidos se transforman en
\delta-decalactona y
\delta-dodecalactona.
Otras dos referencias describen la utilización de
2-decen-5-olida o,
respectivamente,
2-dodecen-5-olida,
como substrato. Dichas lactonas se pueden aislar del aceite de
corteza del árbol tropical Cryptocarya massoia, y su
hidrogenación da por resultado las deseadas lactonas saturadas.
La solicitud de Patente europea
EP-A-425 001 describe la preparación
de \delta-decalactona y
\delta-dodecalactona por una reacción de
hidrogenación utilizando determinadas levaduras, de las que las más
preferidas pertenecen a la especie Saccharomices
cerevisiae
Así mismo, la solicitud de Patente europea
EP-A-577 describe la hidrogenación
de 2-decen-5-olida y
2-dodecen-5-olida a
\delta-decalactona y
\delta-dodecalactona, pero utilizando
microorganismos diferentes de los citados en la solicitud antes
citada. Los mejores resultados se obtienen de nuevo con una levadura
perteneciente al género Saccharomices, en particular
Saccharomyces delbrueckii.
Hay que mencionar que los procedimientos
mencionados antes tienen la desventaja de que se obtiene una baja
concentración del producto final, en el intervalo de aproximadamente
1,5 g/litro, y tienen un rendimiento volumétrico extremadamente
bajo, que comprende entre aproximadamente 0,01 y 0,09
g/litro.hora.
Ahora, los autores de la presente invención han
descubierto un procedimiento para la preparación de a
\delta-decalactona y
\delta-dodecalactona que permite la producción de
las citadas lactonas en grandes cantidades y con un mayor
rendimiento. El citado procedimiento comprende la hidrogenación de
2-decen-5-olida o
2-dodecen-5-olida, o
un derivado de la misma, por una bacteria capaz de efectuar la
citada hidrogenación. Según un modo de realización preferido, la
citada bacteria es una bacteria anaerobia, en particular del género
Clostridium.
Los procedimientos conocidos de las técnicas
anteriores se llevan a cabo en condiciones aerobias. En el modo de
realización preferido de la invención, los autores de la presente
invención utilizan bacterias anaerobias, y la reacción de
hidrogenación se lleva a cabo bajo condiciones que excluyen oxígeno
La reacción de hidrogenación de ácidos carboxílicos insaturados en
condiciones anaerobias, utilizando determinadas cepas de
Clostridium, ha sido estudiada por Simon y col. [véase
Angew. Chem. Edición Internacional 24 (1985), p. 539]. Ese
mismo autor ha podido identificar, en ciertas cepas del género
Clostridium, la enzima
2-enoato-reductasa, a la que
atribuye la actividad encontrada, por ejemplo catalizar la
hidrogenación de ácidos carboxílicos insaturados en la posición
\alpha,\beta. Sin embargo, en estas técnicas anteriores no se
hace mención alguna de que sean útiles tales bacterias para
convertir los substratos de la presente invención.
Las bacterias pertenecientes al género
Clostridium serán a su vez un catalizador microbiano
apropiado para la hidrogenación de lactonas insaturadas según la
presente invención. Como ejemplos de las citadas especies de
bacterias, hay que citar Clostridium tyrobutyricum, Clostridium
pasteurianum, Clostridium beijierincki, Clostridium
acetobutyricum, Clostridium oceanium, Clostridium sticklandii y
Clostridium thermobutyricum.
De las especies citadas antes, se prefiere la
utilización de las cepas Clostridium tyrobutyricum
I-775, Clostridium tyrobutyricum
I-776 Clostridium tyrobutyricum CNRZ 556,
Clostridium pasteurianum DSM 525, Clostridium beijierincki
DSM 6422 y Clostridium acetobutyricum DSM 792, siendo los
preferidos en primer lugar Clostridium tyrobutyricum
I-776, Clostridium tyrobutyricum
I-775 y Clostridium tyrobutyricum CNRZ
556.
En un modo de realización de la invención, se
emplean
2-decen-5-olida y
2-dodecen-5-olida
como substratos en la reacción de hidrogenación con una bacteria
apropiada. En otro modo de realización se emplean ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico
como substrato en el procedimiento de la invención, generalmente en
la forma de sus sales.
Los autores de la presente invención han
encontrado que, dependiendo de las condiciones de reacción, por
ejemplo, el pH y las bacterias utilizadas para una reacción de
hidrogenación, puede ser preferido utilizar la lactona como tal o la
sal del correspondiente ácido como substrato sobre el que actúa la
bacteria.
Las sales de los hidroxi ácidos se pueden obtener
de 2-decen-5-olida o
2-dodecen-5-olida
por la acción de una base apropiada. Como una alternativa, se puede
utilizar una enzima, por ejemplo una lipasa, con el propósito de
abrir el ciclo de la lactona. También son apropiadas, con este mismo
fin, otras enzimas, conocidas por los especialistas en esta
técnica.
Es posible también utilizar como substrato un
éster apropiado del 5-hidroxi ácido
\alpha,\beta-insaturado, por ejemplo un éster de
un alcohol de 1 carbono a 4 carbonos. Estos ésteres se obtienen por
lo general por transesterificación. Métodos de esterificación
apropiados son los conocidos por cualquier especialista en estas
técnicas, comprendiendo estos métodos, por ejemplo, la
esterificación química (utilizando, por ejemplo, el respectivo
alcohol y un catalizador ácido) y la esterificación biotecnológica
(utilizando una enzima, por ejemplo una lipasa) de la
2-decen-5-olida ó
2-dodecen-5-olida o
la sal del correspondiente ácido.
La reacción de hidrogenación de la
2-decen-5-olida ó la
2-dodecen-5-olida o,
respectivamente, la sal o el éster del ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico,
tendrá lugar en un medio que tiene un pH comprendido entre
aproximadamente 4,5 y 8,5, preferiblemente comprendido entre
aproximadamente 6,5 y 7,0. El pH se puede ajustar utilizando
solución de NH_{4}OH, que tiene la ventaja de satisfacer la
necesidad de nitrógeno de los microorganismos. Si es necesario, se
añade una solución tampón al medio de reacción para mantener el pH a
un valor constante.
Cuando se utilizan los 5-hidroxi
ácidos \alpha,\beta-insaturados o,
respectivamente, sus correspondientes sales, como producto de
partida, se obtendrán, como función de las condiciones de reacción
elegidas, en particular el pH, la sal del 5-hidroxi
ácido saturado, el ácido libre, incluso la lactona saturada, o una
mezcla que contiene dos o tres de estos productos. Al final de la
reacción, el producto bruto se puede transformar fácilmente en las
lactonas por acidificación de la solución que da lugar a una
ciclación espontánea.
En el caso de utilizar los ésteres de los
5-hidroxi ácidos
\alpha,\beta-insaturados, los ésteres saturados
obtenidos se saponifican por adición de un ácido y también es
observada la ciclación antes mencionada.
El procedimiento de la presente invención queda
explicado en el siguiente esquema para el caso particular de la
utilización de bacterias del género Clostridium:
\newpage
R^{1} = H, alquilo de
C_{1}-C_{4}
\hskip0.7cmR = n-C_{5}H_{11} ó n-C_{7}H_{15}
En técnicas anteriores, no se encuentra mención
alguna a la utilización de bacterias del género Clostridium
para la hidrogenación de
2-decen-5-olida o
2-dodecen-5-olida.
Además, no ha sido ni descrito ni sugerido en ningún lugar el
empleo de bacterias para hidrogenar ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico.
En particular, no ha sido descrito o sugerido en ningún lugar el
empleo de bacterias del género Clostridium con este
propósito. Los autores de la presente invención han descubierto
ahora que, según la invención, es posible llevar a cabo con éxito
esta reacción biocatalítica y, en particular, obtener grandes tasas
de rendimiento y altas concentraciones de los productos deseados,
más altas que las observadas anteriormente. Esto es un resultado
inesperado. Un efecto muy conocido es que estas lactonas, que son
componentes del aceite esencial de la planta Cryptocarya
massoia, son probablemente la razón para la toxicidad de este
aceite esencial frente a un buen número de microorganismos. La
toxicidad de estas lactonas ha sido además invocada como razón de
las bajas velocidades de conversión en la reacción de hidrogenación
de estas lactonas utilizando los microorganismos descritos en las
solicitudes de Patente EP-A-425 001
y EP-A-577 463, incluso si los
substratos
2-decen-5-olida y
2-dodecen-5-olida se
emplean a muy bajas concentraciones.
Los autores de la presente invención han
establecido ahora que, sorprendentemente, según el procedimiento de
la presente invención, se pueden emplear altas concentraciones de
las lactonas insaturadas sin intoxicación de los microorganismos,
resultando velocidades de conversión claramente más altas que las
obtenidas con las levaduras o los hongos descritas en técnicas
anteriores. Más sorprendente ha sido incluso encontrar que hay
bacterias, en particular las utilizadas en la presente invención,
que son capaces de reducir tanto la lactona (quedando intacto el
anillo lactónico) como el correspondiente hidroxi ácido
\alpha,\beta-insaturado o, respectivamente, su
sal o éster (con el anillo lactónico que se rompe). Se ha encontrado
que las velocidades de conversión eran de un orden similar de
magnitud en ambos casos. A la vista del efecto bien conocido de que
incluso cambios mínimos en la estructura del substrato pueden tener
un efecto muy importante sobre la reactividad del microorganismo en
reacciones microbiológicas, los resultados obtenidos eran totalmente
inesperados.
Utilizando el procedimiento de la invención, los
autores de la presente invención pudieron obtener con éxito
5-decalactona y 5-dodecalactona a
concentraciones de hasta 13 g/litro y productividades volumétricas
que pueden alcanzar 1g/litro.hora.
Las lactonas se pueden utilizar como tales en la
reacción de la invención, por ejemplo en estado puro o como se
encuentran en el extracto de Massoia. Cuando se prefiere
utilizar los substratos en forma de sal de ácido
5-hidroxi decenoico ó 5-hidroxi
dodecenoico, un método conveniente para obtenerlos es el señalado a
continuación.
Se calienta la lactona deseada a 60ºC y después
se valora lentamente con solución de NaOH hasta apertura completa
del anillo. La sal de sodio así obtenida se emplea entonces
directamente para la reacción de bioconversión.
Según un modo de realización preferido de la
reacción de la invención, es ventajoso someter las bacterias a una
etapa de crecimiento o cultivo antes de la adición al substrato.
En general, el medio de cultivo para estas
bacterias contiene extracto de levadura,
(NH_{4})_{2}SO_{4}, KH_{2}SO_{4}, MgSO_{4} y
FeSO_{4}. A veces es necesario añadir vitaminas, como biotina o
p-aminobenzoato. La temperatura favorable al proceso
de crecimiento está comprendida entre 25ºC y 37ºC. Como fuente de
carbono, se puede utilizar glucosa, que se mantiene a una
concentración comprendida entre aproximadamente 5 y 50 g/litro,
preferiblemente aproximadamente 20 g/litro por la adición de una
solución concentrada de glucosa. La esterilidad y la anaerobiosis
del sistema se mantienen por utilización de materiales apropiados;
al comienzo, se purgan las fases líquidas y gaseosas del cultivo con
nitrógeno. Se agita el medio de reacción.
En una operación típica, se mantienen
4-5 ml del medio de cultivo del microorganismo en
tubos de cultivo bajo condiciones anaerobias a -40ºC. Se descongela
uno de los tubos y se utiliza para inocular un frasco de penicilina
que contiene 50 ml de medio. Al cabo de 48 horas de cultivo, se
puede utilizar el inóculo para sembrar un bioreactor de 2 litros o
dos frascos de 1 litro que contienen 800 ml del medio. Estos últimos
pueden utilizarse a su vez, después de otras 24 horas de
crecimiento, para sembrar un bioreactor que tiene un volumen de 15
litros.
La etapa de cultivo puede, naturalmente,
omitirse, lo que da lugar a un tiempo de conversión más
prolongado.
La biotransformación está terminada cuando el
potencial redox del medio comienza a crecer rápidamente, o cuando no
se observa más desprendimiento de mezcla de H_{2}/CO_{2}. La
mezcla se acidifica entonces a un pH de 2 - 3. El producto de la
biotransformación se aisla entonces por métodos tradicionales, por
ejemplo por extracción, para lo que puede utilizarse éter
diisopropílico. Las emulsiones formadas por la abundancia de biomasa
se pueden destruir por centrifugación. Como el éter también contiene
ácido butírico producido por el Clostridium, se lava con
solución de una base débil, por ejemplo solución acuosa saturada de
NaHCO_{3}. El disolvente se seca con un agente apropiado, por
ejemplo sulfato de sodio anhidro, luego se evapora, y el producto
que queda se destila. De esta forma, se obtienen un producto del 99%
de pureza.
La invención se ilustrará ahora con más detalle
con los siguientes ejemplos en que las temperaturas se indican en
grados centígrados y las abreviaturas tienen el significado
convencional en la técnica. Algunos ejemplos no se realizan en las
condiciones óptimas, lo que explica las bajas conversiones
obtenidas. Cuando la sal del 5-hidroxi ácido
insaturado se utiliza como substrato, el producto bruto obtenido
después de la hidrogenación se citará siempre como ácido
5-hidroxi-2-decanoico
o
5-hidroxi-2-dodecanoico,
aunque el producto puede contener o estar compuesto de la sal o
lactona respectiva, como se especifica de antemano.
Se añadió ácido
5-hidroxi-2-decenoico,
en la forma de una solución de su sal sódica, a un cultivo de
Clostridium tyrobutyricum 1-776 hasta que se
alcanzó una concentración de 0,5 g/l de la citada sal. Después de 24
horas, se observó una conversión de 100% a ácido
5-hidroxi-2-decanoico.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó Clostridium
tyrobutyricum 1-775. La conversión fue del
100%
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó Clostridium
tyrobutyricum CNRZ 556. La conversión fue del 100%.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó Clostridium
pasteuranium DSM 525. La conversión fue del 17%.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó Clostridium
beijerincki DSM 6422. La conversión fue del 12,3%.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó Clostridium
acetobutylicum DSM 792. La conversión fue del 6%.
Se sembró un bioreactor de 2 litros que contenía
1 litro de medio de pH 6 y 35ºC con un inóculo de 50 ml de
Clostridium Tyrobutyricum 1-776. La mezcla se
agitó a 300/min y se mantuvieron estrictas condiciones anaerobias y
estériles. Al cabo de varias horas, cuando el cultivo comenzó a
crecer, lo que quedaba indicado por el desprendimiento de gas desde
la solución, se alimentó el medio con la sal de sodio del ácido
5-hidroxi-2-decenoico.
Al cabo de 52 horas, se obtuvo ácido
5-hidroxi-decanoico en una
concentración de 1,75 g/litro, correspondiente a una conversión del
27%. Se puede obtener \delta-decalactona por
acidificación del producto primario.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 7, con la excepción de que el medio tenía un pH de 7. La
cantidad de
5-hidroxi-2-decanoico
obtenida fue de 4,95 g (conversión del 99%), de donde puede
obtenerse \delta-decalactona por
acidificación.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 8, siendo reemplazada la sal sódica del ácido
5-hidroxi-2-decanoico
por la sal sódica del ácido
5-hidroxi-2-dodecanoico.
Al cabo de 52 horas, se obtuvieron 1,1 g/litro de ácido
5-hidroxi-2-dodecanoico,
correspondiente a una conversión del 57%. El ácido se transformó en
\delta-decalactona por acidificación.
Se sembró un bioreactor de 15 litros que contenía
10 litros de medio con 2 x 800 ml de un inóculo de Clostridium
tyrobutyricum I-776. Se mantuvieron
condiciones anaerobias y estériles estrictas. El pH se mantuvo a
6,5, la temperatura a 35ºC, la velocidad de agitación a 300/min; la
concentración inicial de glucosa era de 90 g/litro. Cuando se agotó
la glucosa (48 horas), se aglomeraron las células por
centrifugación durante 30 minutos a 4ºC, por ejemplo a 10000 x g. La
masa húmeda de células se aglomeró y se colocó en un reactor de 2
litros en condiciones estériles y anaerobias estrictas. Se ajustó
el volumen a un total de 1 litro con una solución tampón de pH 7. El
medio contenía aproximadamente 90 g/l de materia seca. Se añadió
NH_{4}OH para mantener un pH de 7, y se añadió también una
solución de glucosa de 500 g/l, para ajustar la concentración de
glucosa a aproximadamente 20 g/l. Se añadió de forma semicontinua
2-decen-5-olida. Al
cabo de 40 horas, se obtuvo \delta-decalactona en
una concentración de 7 g/litro, que corresponde a una conversión del
72%.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 10, con la excepción de que se añadió la sal de sodio de
ácido
5-hidroxi-2-decenoico.
Al cabo de 22 horas, se obtuvieron 13 g/l de ácido
5-hidroxi-2-decanoico,
que corresponde a una conversión del 100%. El ácido puede
convertirse en \delta-decalactona por
acidificación.
Se sembró un bioreactor de 15 litros que contenía
10 litros de medio con 2 x 800 ml de un inóculo de Clostridium
tyrobutiricum I-776. Se mantuvieron condiciones
anaerobias y estériles estrictas. El pH se mantuvo a 6,0, la
temperatura a 35ºC, la velocidad de agitación a 300/min; la
concentración inicial de glucosa fue de 90 g/litro. Cuando se agotó
la glucosa (48 horas), se aglomeraron las células por
centrifugación durante 30 minutos a 4ºC, por ejemplo a 10000 x g. La
masa húmeda de las células se aglomeró y colocó en un reactor de 2
litros en condiciones estériles y anaerobias estrictas. Se ajustó
el volumen a un total de 1 litro con una solución tampón de pH 7. El
medio contenía aproximadamente 90 g/l de materia seca. Se añadió
NH_{4}OH para mantener un pH de 7, y se añadió también una
solución de glucosa de 500 g/l, para ajustar la concentración de
glucosa a aproximadamente 40 g/l. Se añadió de forma semicontinua
2-dodecen-5-olida.
Al cabo de 44 horas, se obtuvo
\delta-dodecalactona en una concentración de 9,6
g/litro, que corresponde a una conversión del 99%.
Se repitió el procedimiento descrito en el
Ejemplo 12, con la excepción de que se añadió sal sódica de ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico.
Al cabo de 52 horas, se obtuvieron 5,1 g/litro de ácido
5-hidroxi-2-dodecanoico,
correspondiente a una conversión del 78%. El ácido puede convertirse
en \delta-decalactona por acidificación.
Claims (10)
1. Procedimiento para la preparación de
\delta-decalactona y
\delta-dodecalactona que comprende la
hidrogenación de
2-decen-5-olida y
2-dodecen-5-olida
respectivamente, o ácido
5-hidroxi-2-decenoico
y ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico
respectivamente, o una sal del citado ácido, por una bacteria del
género Clostridium.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, donde se utiliza
2-decen-5-olida ó
2-dodecen-5-olida en
la reacción de hidrogenación.
3. Procedimiento según la reivindicación
1, donde se utiliza ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico,
o una sal de ellos, en la reacción de hidrogenación, y a esta
última sigue la respectiva acidificación del ácido
5-hidroxi-2-dodecanoico
o
5-hidroxi-2-decanoico
obtenidos respectivamente, para proporcionar la correspondiente
lactona.
4. Procedimiento según las
reivindicaciones 1 a 3, donde la bacteria se selecciona del grupo
que consiste en Clostridium tyrobutyricum, Clostridium
pasteurianum, Clostridium beijierincki, Clostridium acetobutyricum,
Clostridium oceanium, Clostridium sticklandii y Clostridium
thermobutyricum.
5. Procedimiento según la reivindicación
4, donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en cepas
de Clostridium tyrobutyricum I-775,
Clostridium tyrobutyricum I-776
Clostridium tyrobutyricum CNRZ 556, Clostridium
pasteurianum DSM 525, Clostridium beijierincki DSM 6422 y
Clostridium acetobutyricum DSM 792.
6. Procedimiento según la reivindicación
5, donde la cepa de bacteria es Clostridium tyrobutyricum
I-775, Clostridium tyrobutyricum
I-776 o Clostridium tyrobutyricum CNRZ
556.
7. Procedimiento según la reivindicación 1
o la 3, donde la citada sal de ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico
se obtiene por tratamiento de
2-decen-5-olida o
2-dodecen-5-olida
con una base o una enzima.
8. Procedimiento según la reivindicación 1
ó 3, donde se emplea un éster de C_{1} a C_{4} de ácido
5-hidroxi-2-decenoico
o de ácido
5-hidroxi-2-dodecenoico
en la reacción de hidrogenación.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde en el curso de la reacción de
hidrogenación, el pH se mantiene a un valor que comprende entre 4,5
y 8,5.
10. Procedimiento según la reivindicación
9, donde el pH se mantiene en un valor comprendido entre 6,5 y
7,0.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH2001/97 | 1997-08-27 | ||
| CH200197 | 1997-08-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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