CN106190938B - 一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’-唾液乳糖的方法 - Google Patents

一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’-唾液乳糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3'‑唾液乳糖的方法，其名称为E.coli‑XYY，它具有3'‑唾液乳糖的合成途径，同时也公开了构建的方法。本发明同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产3'‑唾液乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。本发明构建的重组大肠杆菌具有很好的应用前景，为生物法生成3'‑唾液乳糖提供了新的思路。

Description

一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’-唾液乳糖的方法
技术领域
本发明涉及一种利用重组大肠杆菌合成3’-唾液乳糖的方法，属于代谢工程领域。
背景技术
母乳中包含婴儿生长和发育所必须的营养物质，但是它同时也含有传统营养物质中所没有的物质，这些物质对身体是有益的。其中一些物质就是人乳寡糖（HMOs）。唾液乳糖是常见的人乳寡糖，具有抗黏附，维持肠道微生物组成及糖组修饰等功能, 在营养和药用方面，也是很有前途的寡糖。
唾液乳糖，如3'-唾液乳糖在糖组修饰方面起着重要的作用，调节肠内上皮细胞表面多糖的表达，调节大多数病原菌和共生菌的黏附位点。暴露在3’-唾液乳糖的情况下，CaCo-2细胞可以改变其细胞表面多糖组成，3’-唾液乳糖是母乳中一种主要的成分。因为暴露在3'-唾液乳糖的情况下，细胞表面α2-3和α2-6连接的唾液酸残基明显的减少。在细菌和宿主相互作用的情况下，为了评估这些细胞表面糖组变化的重要性，Angeloni等对肠道致病性大肠杆菌的黏附是否改变进行了评估。肠道致病性大肠杆菌黏附到宿主肠上皮细胞表面的多糖上。事实上，3’-唾液乳糖在上皮细胞表面糖组中引起了的变化，这种变化导致肠道致病性大肠杆菌的黏附于对照组相比，减少了90%。这些结果表明，低聚糖如3'-唾液乳糖对宿主和细菌的相互作用的调节存在新的机制。另外，据报道，研究表明，含有3'-SL的奶会通过集群梭菌属IV的细菌影响肠内定植。
目前，3’-唾液乳糖的生产方法主要为化学法，化学法生产存在诸多弊端，如合成步骤过多，生成的产物较多，副产物复杂，其反应液对环境产生污染等，通过生物法来制备3’-唾液乳糖越来越受到研究者的关注。
本发明中构建的重组工程菌实现了3’-唾液乳糖的生物合成，为生物法探索生成目标代谢产物提供了新思路。
发明内容
本发明通过构建一株重组大肠杆菌，实现了从乳糖到3’-唾液乳糖的生物合成。所采取的技术方案如下：
本发明的第一个目的在于提供了一种利用乳糖合成3’-唾液乳糖的重组大肠杆菌。其特征在于，具有3’-唾液乳糖的合成途径。名称为E.coli-XYY。同时过表达乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸转移酶基因（lst），并敲除Neu5Ac转运子（nanT），Neu5Ac醛缩酶基因（nanA），N-乙酰甘露糖胺激酶基因（nanK），N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因（nanE），葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因（nagB），N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因（nagA）和β-半乳糖苷酶基因（lacZ）。
所述CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA，基因登录号GI：7152208; 乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，基因登录号GI：7152206；N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC，基因登录号GI：7152210；β-半乳糖苷透性酶基因lacY，基因登录号GI：949083；来源于大肠杆菌。所述唾液酸转移酶基因（lst），基因登录号GI：325207958来源于脑膜炎奈瑟菌。所述具有3'-唾液乳糖合成途径，是指过表达CMP-乙酰神经氨酸合成酶，乙酰神经氨酸合成酶，N-乙酰葡萄糖胺异构酶，β-半乳糖苷透性酶和唾液酸转移酶。
本发明第二个目的在于提供了大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤如下：
1）分别制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）的重组质粒，含有β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重组质粒，含有唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；
2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coliBL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以pKD3为模板，分别扩增带有Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA，Neu5Ac转运子nanT基因，β-半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；
4) 先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化同一个基因的抗性敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；
5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；
6) 以步骤5所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；
7) 将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌；
其中所述构建Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，Neu5Ac转运子nanT的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4 所示；构建葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；构建β-半乳糖苷酶基因lacZ的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQID NO.9-SEQ ID NO.12所示；
本发明第三个目的在于提供了采用所获得的大肠杆菌基因工程菌E.coli-XYY进行发酵合成3'-唾液乳糖，培养基和发酵方法如下：
LB培养基（1L）:Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast Extract（酵母提取物）：5g，NaCl（氯化钠）：5g。若配置固体培养基，则再加入15g Agar（琼脂）。
M9培养基（1L）：Na2HPO4·7H2O（七水合磷酸氢二钠）：12.8g，KH2PO4（磷酸二氢钾）3g，NaCl（氯化钠）：0.5g，NH4Cl（氯化铵）2g，MgSO4·7H2O（七水合硫酸镁）0.25g，YeastExtract（酵母提取物）2g，Glycerol（甘油）：20g。
将所得基因工程菌在5mL含有卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml的LB培养基中37℃，220rpm/min培养12h，转入M9培养基，M9培养基在使用前加入卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml），37℃，培养月3h左右，加入IPTG（IPTG 0.2mM）,并转入25℃培养，培养约2h后，加入乳糖，继续培养4h后，取样。该方法的具体步骤如下：
1）制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；
2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；
3）分别构建Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，Neu5Ac转运子基因nanT，4个基因的带有同源臂的抗性消除片段，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB， N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA，2个基因的带有同源臂的抗性消除片段，β-半乳糖苷酶基因lacZ的带有同源臂的抗性消除片段；
4）先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化一个基因带有同源臂的抗性消除片段，获得缺失一个基因的重组菌；
5）将步骤4）所获得的缺失一个基因的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；
6）以步骤5）所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤4）和步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤4）和步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤2）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；
7）将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌；
8）利用步骤7）所得的重组大肠杆菌合成3'-唾液乳糖；
所述任一大肠杆菌工程菌在生产3'-唾液乳糖中的应用，也在本发明的保护范围之内。所述应用的步骤如下：
1） 活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2） 将步骤1）获得的种子液与含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180rpm~220rpm/min,培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM~0.3mM, 然后转入20~25℃，180rpm~220rpm/min,补加乳糖继续培养4~6h；发酵生产3'-唾液乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖。
本发明公开的构建重组大肠杆菌生物合成3'-唾液乳糖的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌具有以葡萄糖为碳源发酵合成3'-唾液乳糖的特点，发酵4h，可以得到2~4g/L的3'-唾液乳糖。
（2）本发明建立了一条3'-唾液乳糖的合成途径，本发明同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产3'-唾液乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。
附图说明
图1是质粒pCOLADuet-1-neuA-neuB-neuC的图谱，用来过表达3'-唾液乳糖合成途径中的neuA、neuB, neuC基因；
图2是质粒pET-Duet1-lacY的图谱，用来过表达3'-唾液乳糖合成途径中的lacY基因；
图3是质粒pCDF-Duet-1-lst的图谱，用来过表达3’-唾液乳糖合成途径中的lst基因；
图4是敲除nanA nanT nanE nanK 4个基因后的PCR验证产物的电泳图；（图中，M:Marker；泳道1-2分别为：阴性对照,（nanA -T-E-K)；
图5是敲除nagA nagB基因后的PCR验证产物的电泳图；（图中，M:Marker；泳道1-2分别为：阴性对照（nagA-B）；
图6是敲除lacZ基因后的PCR验证产物的电泳图； （图中，M:Marker；泳道1-2分别为：阴性对照 lacZ）；
图7是本发明中构建的合成3'-唾液乳糖的代谢途径；
图8是ESI-MS检测重组菌株发酵液，其中655.15为目的产物3'-唾液乳糖。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。以下实施例中所用的材料、试剂、仪器和方法未经特殊说明均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得；例如Tryptone(胰蛋白胨)，Yeast Extract（酵母提取物），Agar（琼脂）；卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素，E.coliDH5α等等。
本发明中质粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Catalog NO.：B518191），切胶回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式胶回收试剂盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的连接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的扩增使用fermentas公司的pfu DNApolymerase（Catalog NO.：EP0571）,PCR质粒模板的消化使用fermentas公司的FalstDigelst KpnI（Catalog NO.：FD0524），BamHI（Catalog NO.：FD0054） NcoI（Catalog NO.：FD0574）BglII（Catalog NO.：FD0083）E.coli电击转化实验使用Bio-Rad的电转仪（CatalogNO.：165-2100）。细菌基因组提取使用北京康为世纪生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒（Catalog NO.：CW0552S）
实施例1
基因的获取：
本实施例中，获取来源于大肠杆菌的CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA（基因登录号 GI:7152208）,乙酰神经氨酸合成酶基因neuB（基因登录号 GI:7152206）, N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC（基因登录号 GI:7152210），β-半乳糖苷透性酶基因lacY(基因登录号 GI:949083)的基因序列。获取来源于Neisseria meningitidis的lst基因（基因登录号GI:325207958）
实施例2
重组质粒的制备
使用设计的引物F1，R1对实施例1中获得的来源于大肠杆菌的CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA，乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NcoI和BamHI进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NcoI和BamHI双酶切的质粒pCOLADuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在卡纳霉素板上进行筛选，获得重组质粒pCOLADuet-1-neuBAC。
使用设计的引物F2，R2对实施例1中获得的来源于Neisseria meningitidis的lst基因进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NcoI和BamHI进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NcoI和BamHI双酶切的质粒pCDFDuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pCDFDuet-1-lst。
使用设计的引物F3，R3对实施例1中获得的来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用KpnI和BglII进行双酶切，酶切后的片段与同样经过KpnI和BglII双酶切的质粒pETDuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在氨苄青霉素板上进行筛选，获得重组质粒pETDuet-1-lacY。
实施例3
基因的敲除
本实施例使用λRed重组系统敲除E.coliBL21(DE3)的多个基因，该方法每敲除一个基因都进行抗性的消除。下面以lacZ基因为例，详细阐述基因敲除的步骤，其余6个基因的敲除与此相同。在NCBI中查找E.coliBL21lacZ基因的核苷酸序列，设计lacZ基因的缺失引物和鉴定引物。lacZ基因的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ IDNO.12 所示；
实施例4
缺失型E.coliBL21(DE3) ∆7的构建
4.1质粒pSim的转化
挑取-80℃冻存的野生型E.coliBL21(DE3)在无抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，接种至5mL LB培养基中，37℃，220rpm/min，过夜培养。第二天按1%的接种量，转接至200ml的LB培养基中。37℃，220rpm/min，培养至OD600约为0.6~0.8，冰浴20min，5500rpm，5min，收集菌体于已灭菌的50ml离心管中，4℃，5500rpm，离心5min，弃上清，用50ml冰浴过的无菌的10%甘油重悬菌体，4℃，5500rpm，再离心5min，重复上述操作3次，最后一次，利用弃上清时的残余液体重悬菌体，取80μL于至新的无菌EP管中。-80℃冻存。
将-80℃冻存的感受态细胞置于冰中融化10min，加入1μL的pSim质粒，混匀后加入电击杯中，冰浴2min，1.8KV电击转化，电击后立即加入1ml的LB培养基，30℃，220rpm/min复苏20min，取适量菌液涂布于灭瘟素平板上（灭瘟素浓度200μg/ml），30℃倒置过夜培养，第二天长出的单克隆即是携带pSim质粒的E.coliBL21(DE3)。
4.2 目的基因的敲除
4.2.1同源重组片段的制备
以pKD3质粒为模板，使用引物SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10进行PCR扩增，切胶纯化回收，获得两端含有lacZ同源臂的敲除片段lacZ-Fragment I。
4.2.2 第一步同源重组（lacZ-Fragment I的转化）
挑取携带pSim质粒的E.coliBL21(DE3)单克隆接种至5ml LB培养基中，37℃，220rpm/min，过夜培养。第二天按1%的接种量，转接至200ml的LB培养基中。37℃，220rpm/min，培养至OD600约为0.6~0.8，将菌液转至42℃水浴摇床中，150rpm/min，20min，然后冰浴20min，4℃，5500rpm/min，离心5min，收集菌体于已灭菌的50ml离心管中，4℃，5500rpm，离心5min，弃上清，用50ml冰浴过的无菌的10%甘油重悬菌体，4℃，5500rpm，再离心5min，重复上述操作3次，最后一次，利用弃上清时的残余液体重悬菌体，取80μL于至新的无菌EP管中，加入4μLlacZ-Fragment I片段，混匀后加入电击杯中，冰浴2min，1.8KV电击转化，电击后立即加入1ml的LB培养基，37℃，180rpm/min，培养2h，取适量菌液涂布于抗性平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，PCR鉴定出lacZ基因被lacZ-Fragment I替换的正确克隆，即E.coliBL21（DE3） ∆lacZ。
4.3 基因缺失后抗性的消除
4.3.1E.coli BL21 (DE3) ∆lacZ菌株感受态细胞的制备
挑取E.coliBL21 (DE3) ∆lacZ单克隆接种至5ml的LB培养基中，按照上面步骤制备感受态，电转pCP20质粒，电击后立即加入1ml的LB培养基，30℃，180rpm/min，培养20min，取适量菌液涂布于氨苄青霉素平板上（氨苄青霉素浓度100 μg/ml），30℃过夜培养。第二天挑取单克隆至5ml的LB培养基中（氯霉素浓度25μg/ml），30℃，180rpm/min, 培养10h，转移至新的液体培养基，不加抗生素，42℃，培养6h后，稀释涂板，37℃，倒置过夜培养，第二天挑单克隆，分别在无抗板和氯霉素板上进行影印。氯霉素板上未长，但是无抗板对应位置上长出的单克隆，即为抗性消除成功的阳性克隆，进一步通过PCR验证。
4.4 剩余6个基因的敲除
剩余6个基因的敲除原理和步骤与lacZ相同，以敲除了lacZ基因的菌株为基础，通过重复实验步骤中的4.2和4.3，可依次将全部7个基因敲除，最终构建出缺失的E.coliBL21(DE3) ∆7。
图4为野生型E.coliBL21(DE3)和E.coli BL21 (DE3) ∆7的PCR验证结果，两组结果使用相同的鉴定引物，图4中泳道2的条带泳道1的条带相比，出现了显著的减小，表明相应目的基因已经被成功敲除。pSim质粒为温度敏感型质粒，培养温度高于30℃的条件下，质粒将会丢失，因此，在将pSim质粒转入E.coliBL21(DE3)后，菌株将一直在30℃条件下培养，以防止pSim质粒的丢失。
实施例5
产3'-唾液乳糖E.coliBL21 (DE3) ∆7菌株的构建
以敲除7个基因的E.coliBL21 (DE3)∆7菌株为基础，制备感受态细胞（方法参照实验步骤4.1），将pETDuet-1-lacY，pCDFDuet-1-lst，pCOLADuet-1-neuBAC转入，在LB平板（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml）上筛选正确的克隆。经双酶切验证得到携带整个3'-唾液乳糖合成途径的菌株E.coliBL21(DE3) ∆7/3'-SL。得到2~4g/L的3'-唾液乳糖，图7为本发明中合成3'-唾液乳糖的代谢途径。
实施例6
E.coli BL21 ∆7/3'-SL菌株3'-唾液乳糖合成的验证
将菌株接种至5mL的LB培养基中（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml，链霉素50μg/ml），37℃，220rpm/min，过夜培养。第二天按1%的接种量转接至优化的M9培养基中，OD600约为0.6时诱导（IPTG浓度0.2mM），转至25℃，诱导2h后，加入2mL乳糖，约4h后取样，4℃，7000rpm/min，离心10min，将上清与沉淀分开。上清过0.22μm滤膜。通过ESI-MS和高效液相色谱检测。
沉淀首先用灭菌水悬浮，4℃，7000rpm/min，离心10min，重复一次，然后采取反复冻融来破碎细胞，破碎后，4℃，5100rpm/min，离心25min，
离心，将上清转移至10mL的离心管中，过0.22μm滤膜，通过ESI-MS检测。
3'-唾液乳糖的检测：ESI-MS，
仪器：Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer (ThermoElectron,CA)
离子化模式：电喷雾负离子模式;
电喷雾范围：400-700m/z;
干燥器温度：220℃；
喷雾压力：45psi；
毛细管电压：4500V;
进样量：0.2mL/min;
碰撞气体为氮气，辅助气体为氦气；
高效液相检测
色谱柱：Venusil C18柱（5μm particle size，4.6 by 250mm）;
流动相：10% 乙腈， 90% 三乙胺冰醋酸（pH 6.0）;
流速：0.6mL/min;
进样量5μL。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的范围和精神。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3'-唾液乳糖的方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctggtataac aggtataaag gtatatcgtt tatcagacaa gcatcacttc agaggtattt 60
gtcttgagcg attgtgtagg 80
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcgtcctgt aacgcaggat gtaacccagc agacggtaat gactgtactt cacccatcac 60
ttaacggctg acatgggaa 79
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtatggggt gttgcttaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgtaattc gtaacgaccc 20
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttacgctta aagatgccta atccgccaac ggcttacatt ttacttattg aggtgaatag 60
tcttgagcga ttgtgtagg 79
<210> 6
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgttttacg agatcaacat tacctatctg agcttgtccg cctggtgtca tactttctcc 60
ttaacggctg acatgggaa 79
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatcaggtcg gattgacgcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caatcaggcg ataaaccgcc 20
<210> 9
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccgt 60
gtaggctgga gctgcttcg 79
<210> 10
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttatttttga caccagacca actggtaatg gtagcgaccg gcgctcagct ggaattccgc 60
atatgaatat cctccttag 79
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctggcacgac aggtttcc 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgtagccaaa tcgggaaaa 19

Claims (2)

1.一种催化乳糖合成3'-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）分别制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）的重组质粒，含有β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重组质粒，含有唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；
2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coliBL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以pKD3为模板，分别扩增带有Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA，Neu5Ac转运子nanT基因，β-半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；
4) 先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化Neu5Ac醛缩酶基因nanA的抗性敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；
5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；
6) 以步骤5所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；
7) 将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌。
2.权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，Neu5Ac转运子nanT的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4 所示；构建葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；构建β-半乳糖苷酶基因lacZ的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示。
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