CN114874966A - 一种高产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用 - Google Patents

一种高产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产3′‑唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。本发明以甘油为碳源，乳糖为底物，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，过表达glmM、glmU、glmS*，引入外源neuBCA途径，筛选新的α2,3‑SiaT并对其进行改造，鉴定和表征,进一步提高3′‑SL的产量。此外，还使得到的大肠杆菌工程菌株在5L发酵罐条件下分批补料38.5h可积累31.4g/L的3′‑SL，对于工业化生产3′‑SL具有重要意义。

Description

一种高产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种高产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
母乳富含唾液酸(SA)，通常与母乳低聚糖和糖缀合物结合，在HMO中，约10–30％的低聚糖是唾液酸化的。唾液酸化HMO约占总HMO的13％，其中3'-唾液酸乳糖(3'-SL)是两种典型的唾液酸化HMO之一，约占总HMO的2％。作为一种功能性营养成分，唾液酸化母乳低聚糖(HMO)已被证明通过促进益生菌生长和代谢、抑制病原体粘附、诱导肠上皮分化、促进肠道成熟和优化免疫功能，调节肠道微生物生态系统。这些特性在调节肠道微生物生态系统和预防新生儿炎症性疾病的发生方面起着关键作用。此外，最近的一些研究也支持唾液酸化HMO对新生儿骨骼和大脑发育的促进作用。
3'-唾液酸乳糖为α2,3唾液酸糖基转移酶催化一分子唾液酸和一分子乳糖脱水缩合而成。
唾液酸化乳糖的合成方法主要有两种：一种是化学合成法，涉及到保护和去保护等步骤，步骤复杂，分离纯化困难，且成本较高，不适合规模化生产。另一种合成方法为微生物发酵合成法，其中全细胞生物酶法以丙酮酸和乙酰氨基葡萄糖为原料，价格昂贵，且神经氨酸醛缩酶会催化神经氨酸的可逆分解，反应结束后残留大量的丙酮酸致使产物分离遇到困难，使得转化率低。相比之下，微生物从头合成法由于底物廉价，引入外源合成步骤，底物和酶的特异性高，不需要额外提供昂贵的辅因子，更适合大规模的工业化生产。
2002年，Priem等人首次报道了代谢工程菌株发酵生物合成3'-唾液酸乳糖。用敲除lacZ(编码β-半乳糖苷酶)的大肠杆菌JM107，过表达N.meningitidis来源的neuA和nst(编码α2,3-siaT)，敲除nanA，阻断Neu5Ac水解。以甘油为碳源，外源添加唾液酸和乳糖为底物，高密度培养22h获得的3'-唾液酸乳糖的胞外和胞内部分产量分别为1.1和1.5g/L。通过将C.jejuni ATCC 43438来源的neuB、neuC和neuA与N.meningitidis来源的3'-唾液酸乳糖转移酶基因nst异源共表达，构建了一个替代的3'-唾液酸乳糖合成途径，实现了从UDP-GlcNAc到CMP-Neu5Ac的级联反应。缺失lacZ、lacA、nanK、nanE、nanT和nanA的大肠杆菌DH1最终衍生菌株，在仅添加甘油和乳糖的情况下，在高密度培养下共产生25g/L 3'-唾液酸乳糖(胞内+胞外)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌弱化了基因组上编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ、编码N-乙酰神经氨酸裂解酶的基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运体的基因nanT、编码N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK中的至少一种。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌弱化了lacZ，或弱化了lacZ和nanA，或弱化了lacZ、nanA和nanT，或弱化了lacZ、nanA和nanK，或弱化了lacZ、nanA、nanT和nanK。
在一种实施方式中，所述nanA基因的NCBI登录号为AAC76257；所述nanT基因的NCBI登录号为AAC76256；所述nanK基因的NCBI登录号为AAC76254；所述lacZ基因的NCBI登录号为AAC73447。
在一种实施方式中，所述弱化包括敲除或降低基因的表达。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种实施方式中，在大肠杆菌基因组上的recA基因处整合编码α2,3唾液酸转移酶的基因Vs16，recA基因的NCBI登录号为AAC75741。
在一种实施方式中，所述Vs16基因的NCBI登录号为AAC44541。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还包括如(a)和/或(b)：
(a)表达了编码乙酰神经氨酸合成酶的基因neuB、编码N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因neuC和编码CMP-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuA；
(b)表达了编码α2,3唾液酸转移酶的基因。
在一种实施方式中，(a)中，还可以表达单拷贝或双拷贝的编码磷酸葡萄糖胺变位酶的基因glmM和表达双拷贝neuA。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还可以携带重组质粒pRSF-MUS*。
在一中实施方式中，利用pETDuet-1质粒表达neuB、neuC、neuA、glmM，利用pCDFDuet-1质粒表达编码α2,3唾液酸转移酶的基因。
在一种实施方式中，neuB、neuC、neuA、glmM分别位于pETDuet-1质粒的两个多克隆位点MCS1或MCS2。
在一种实施方式中，pETDuet-1质粒的MCS1插入neuB、neuC、neuA串联表达的基因序列neuBCA，或pETDuet-1质粒的MCS2插入neuBCA，或pETDuet-1质粒的MCS2插入neuB、neuC串联表达的基因序列neuBC，MCS1插入neuA，或pETDuet-1质粒的MCS1插入neuB、neuC、neuA串联表达的基因序列neuBCA，MCS2插入neuA，或pETDuet-1质粒的MCS2插入neuB、neuC、neuA串联表达的基因序列neuBCA，MCS1插入neuA，或pETDuet-1质粒的MCS1插入neuB、neuC、neuA串联表达的基因序列neuBCA，MCS2插入glmM，或pETDuet-1质粒的MCS2插入neuB、neuC、neuA串联表达的基因序列neuBCA，MCS1插入glmM。
在一种实施方式中，编码α2,3唾液酸转移酶的基因位于pCDFDuet-1质粒的多克隆位点MCS1。
在一种实施方式中，所述编码α2,3唾液酸转移酶的基因包括来自于Neisseriameningitidis MC58的基因nst，来自Pasteurella multocida Pm70的基因Pm0188，来自Vibrio sp.JT-FAJ-16的基因Vs16，来自Photobacterium sp.JT-ISH-224的基因Ps224。
在一种实施方式中，neuB、neuC和neuA串联表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，neuB、neuC串联表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述neuA的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述neuB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述neuC的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，所述glmM的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，所述nst的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Pm0188的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Vs16的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Ps224的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第二个目的是提供一种提高大肠杆菌3′-唾液酸乳糖生产能力的方法，所述方法为以大肠杆菌为出发菌株，弱化了基因组上编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ、编码N-乙酰神经氨酸裂解酶的基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运体的基因nanT和编码N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK，在大肠杆菌基因组上的recA基因处整合编码α2,3唾液酸转移酶的基因Vs16，表达编码乙酰神经氨酸合成酶的基因neuB、编码N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因neuC和编码CMP-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuA、编码磷酸葡萄糖胺变位酶的基因glmM和编码α2,3唾液酸转移酶的基因，携带重组质粒pRSF-MUS*。
在一种实施方式中，neuB、neuC、neuA、glmM位于pETDuet-1质粒上，编码α2,3唾液酸转移酶的基因位于pCDFDuet-1质粒上。
本发明的第三个目的是提供一种生产3′-唾液酸乳糖的方法，所述方法为以甘油和乳糖为底物，利用所述重组大肠杆菌进行发酵生产。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种于发酵培养基中，培养至OD600为0.6～0.8，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM并同时添加乳糖至终浓度为5g/L，后在25℃、200rpm下培养不少于72h；
或者，将所述重组大肠杆菌接种于含有发酵培养基的发酵罐中，培养至菌体OD600达到13～15，添加IPTG至终浓度为0.2mM并同时添加乳糖至终浓度为20g/L。
在一种实施方式中，甘油维持在终浓度10-20g/L，乳糖维持在终浓度不低于5g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有甘油15～20g/L，磷酸二氢钾10～15g/L，磷酸氢二氨3.0～5.0g/L，柠檬酸1.0～2.0g/L，七水硫酸镁1.0～2.0g/L和微量金属元素5～10ml/L。
在一种实施方式中，所述微量金属元素中含有硫酸亚铁10～15g/L，七水硫酸锌2～3g/L，无水硫酸铜1.0g/L，一水硫酸锰0.35g/L，十水硼酸钠0.23g/L，钼酸铵0.11g/L，二水氯化钙2.0g/L。
本发明提供了所述重组大肠杆菌在在医药、食品和化工领域中的应用。
本发明提供了所述重组大肠杆菌菌株在制备生产3′-唾液酸乳糖及其衍生产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种高效生产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株，通过通路强化优化前体的供应，筛选高效的α2,3-唾液酸转移酶，并将其整合至工程化大肠杆菌的基因组中，应用于发酵生产3′-唾液酸乳糖(图1)。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产3′-唾液酸乳糖的能力为4.51g/L，在5L发酵罐中，3′-唾液酸乳糖的产量达到31.4g/L，具备工业应用的前景。
附图说明
图1为3'-唾液酸乳糖代谢通路图；
图2为产物3'-唾液酸乳糖标样和产物样品液相图和质谱图；
图3为5L发酵罐中3'-唾液酸乳糖的发酵产量结果图；
具体实施方式
1、以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。
2、质粒构建
3、质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。
4、菌落PCR，核酸琼脂糖凝胶电泳，蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，热击转化，电转化和感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据MolecuLar Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。
5、大肠杆菌感受态的制备：TAKARA试剂盒。
6、下述实施例中涉及的培养基如下：
(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
(2)LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。
(3)发酵培养基：20g/L甘油，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。
6、3'-唾液酸乳糖发酵过程及检测：
(1)3'-唾液酸乳糖摇瓶发酵过程：将构建的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，得到种子液，将种子液以400μL的接种量接入20mL发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至OD600为0.8，加入终浓度为0.5mM IPTG，同时加入5g/L乳糖，25℃，200rpm继续诱导培养72h。取1mL发酵液，10,000rpm，离心10min，取上清，用于HPLC测定。
7、HPLC检测条件：通过高效液相色谱(HPLC)系统(Waters e2695)和Aminex HPX-87H色谱柱对样品中的甘油进行分析。流动相：0.5mmol/L H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：60℃；进样量：10μL。
通过高效液相色谱(HPLC)系统(Waters e2695)和ZorbaxNH2色谱柱对样品产物3'-SL进行分析。流动相：50％乙腈，2mM MgCl2，10mM H3PO4；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL。
实施例1：宿主的敲除及整合
利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21中lacZ、nanA、nanT、和nanK，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用引物lacZ-UH-F/R和lacZ-DH-F/R，通过PCR分别扩增出lacZ的上下游片段，胶回收。再分别以lacZ上下游片段为模板，采用lacZ-UH-F-in/lacZ-DH-R-in引物通过重叠PCR得到完整的敲除lacZ的上下游同源臂片段，胶回收DNA片段。
(2)以原始pTargetF质粒为模板，lacZ-N20-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与lacZ序列互补的N20序列，得到带有靶向lacZ的pTargetF质粒。PCR产物采用Dpn I去除模板DNA后，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。
(3)带有靶向lacZ的pTargetF质粒为模板，使用lacZ-Z-F/R为引物扩增相应的载体片段，通过Gibson组装将载体片段与敲除lacZ的上下游同源臂片段进行组装pTargetT-lacZ质粒。
(4)取pCas质粒及大肠杆菌BL21感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5μL质粒pTargetT-lacZ加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴20min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mL LB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200μL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜至长出大肠杆菌BL21/pCas的单菌落。
(5)挑取大肠杆菌BL21/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为10mM/L的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21/pCas感受态。
(6)将300ngpTargetT-lacZ质粒，电转至步骤(4)的大肠杆菌BL21/pCas感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，PCR验证lacZ敲除效果，lacZ敲除的即为阳性克隆菌落。
(7)将步骤(6)得到的阳性克隆菌落挑至4mL LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和30mg/L卡那霉素，30℃培养8-16h，以去除pTargetT-lacZ质粒，再在42℃培养12h，去除pCas质粒。得到敲除lacZ的EZ菌株。
利用相同的方法，依次将菌株中的nanA、nanT、nanK敲除，得到相应的EZA、EZAT、EZAK、EZATK四种大肠杆菌BL21敲除菌株。
整合基因的步骤与敲除基因的步骤相同，将Vs16基因插入recA基因的上下游同源臂之间，构建得到基因组整合Vs16基因的大肠杆菌EZAKS。
整合基因的步骤与敲除基因的步骤相同，将Vs16基因插入recA基因的上下游同源臂之间，构建得到用于基因组整合的pTargetT-Vs16质粒，Vs16基因整合到EZAK的recA位点得到菌株EZAKS。
表1宿主敲除及整合所用引物
Figure BDA0003695465340000031
Figure BDA0003695465340000041
Figure BDA0003695465340000051
表2敲除及整合构建宿主
Figure BDA0003695465340000052
实施例2：重组载体的构建
重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表3)：
将基因neuBCA(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)构建至表达载体pETDuet-1的NcoI和BamH I位点之间形成重组质粒pET-1BCA；
将基因neuBCA(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)构建至表达载体pETDuet-1的NdeI和Mfe I位点之间形成重组质粒pET-2BCA；
将基因neuA(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)构建至表达载体pETDuet-1的NcoI和BamH I位点之间，将基因neuBC(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)构建至表达载体pETDuet-1的Nde I和Mfe I位点之间形成重组质粒pET-1A2BC。
分别以pET-1BCA和pET-2BCA为模板，构建双拷贝neuA的质粒pET-1BCA2A和pET-1A2BCA。
分别以pET-1BCA和pET-2BCA为模板，构建过表达基因glmM的质粒pET-1BCA2M、pET-1M2BCA。
将基因nst(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)构建至表达载体pCDFDuet-1的MCS1形成重组质粒pCD-NST。
将基因Ps224(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)构建至表达载体pCDFDuet-1的MCS1形成重组质粒pCD-Ps224。
将基因Pm0188(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)构建至表达载体pCDFDuet-1的MCS1形成重组质粒pCD-Pm0。
将基因Vs16(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)构建至表达载体pCDFDuet-1的MCS1形成重组质粒pCD-Vs16。
表3构建质粒所用引物
Figure BDA0003695465340000053
Figure BDA0003695465340000061
表4重组表达载体的构建
Figure BDA0003695465340000062
Figure BDA0003695465340000071
实施例3：重组菌株发酵生产3′-唾液酸乳糖
将pET-1BCA和pCD-NST、pCD-Pm0、pCD-tPm0、pCD-Pm0M、pCD-Vs16、pCD-tVs16、pCD-Ps224七种质粒之一同时导入实施例1中构建的宿主EZAK得到重组菌EZAK1、EZAK2、EZAK3、EZAK4、EZAK5、EZAK6、EZAK7，摇瓶发酵72h后唾液酸乳糖最高产量为2.62g/L。
将pET-1A2BC、pET-1BCA、pET-2BCA、pET-1BCA2M、pET-1M2BCA、pET-1BCA2A、pET-1A2BCA其中之一、pRSF-MUS*质粒和pCD-Vs16，三质粒同时导入宿主EZAK，得到重组菌EZAK8～EZAK14，其中，EZAK8的3′-唾液酸乳糖产量最高，质粒组合为pRSF-MUS*、pET-1A2BCA和pCD-Vs16，摇瓶发酵72h后3′-唾液酸乳糖最高产量为3.19g/L。
为了验证基因组整合Vs16基因的效果，将pET-1BCA、pET-2BCA和pET-1BCA2A各自分别与pCD-Vs16和pRSF-MUS*的组合质粒同时导入实施例1构建的宿主EZAKS，得到重组菌ES1～ES10，其中，3′-唾液酸乳糖产量最高的菌株为ES2，摇瓶发酵72h后3′-唾液酸乳糖最高产量为4.51g/L，3′-唾液酸乳糖的液相色谱和质谱结果如图2所示。
表5所用的菌株及相应的产量
Figure BDA0003695465340000072
实施例4：高效生产3′-唾液酸乳糖工程菌的5L发酵罐生产
为了进一步验证3′-唾液酸乳糖合成方法的有效性，提高3′-唾液酸乳糖的产量。将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养10-12h，得到种子液，将种子液以10％(v/v)的接种量接种到工作体积为5L的发酵培养基中，发酵罐发酵温度37℃，搅拌转速350-900rpm，通气量0.5-2vvm，pH＝6.8(补加氨水自动控制)。OD600为13-15时，加入终浓度为10g/L乳糖和终浓度为0.2mM的IPTG，发酵罐温度降至25℃。后续通过补料保证甘油维持在终浓度10-20g/L，乳糖维持在终浓度不低于5g/L，维持菌体的生长以及3′-唾液酸乳糖的合成。培养整个过程达到38.5h后，菌体OD600达到140，3′-唾液酸乳糖的产量达到最高，达到31.4g/L(图3)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产3′-唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用
<130> BAA220808A
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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ttctacacct tcgatcgtgt taaccagggt gaacgtaacg cggttagcct gctgaaagaa 120
aaactgttca acgaagaagg tgaaccggtt aacctgatct tctgctacac catcctgcag 180
atgaaagttg cggaacgtat catggcgcag cacccgggcg aacgcttcta cgttgttctg 240
atgtctgaaa accgtaacga aaaatacgat tactatttca accagatcaa agataaagcg 300
gaacgtgcgt acttcttcca cctgccgtac ggcctgaaca aatctttcaa cttcatcccg 360
actatggcgg aactgaaagt taaatctatg ctgctgccga aagtgaaacg tatctacctg 420
gcgagcctgg aaaaagttag catcgcggcg ttcctgagca cctacccgga tgcggaaatc 480
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ttcagcgtta acggtaccat caaacgtaac ttcgcgcgta tgatgatcgg tgactggagc 600
atcgcgaaaa cccgtaacgc gtccgatgaa cactacacca tcttcaaagg tctgaaaaac 660
atcatggatg atggtcgtcg taaaatgacc tatctgccgc tgttcgacgc gagcgaactg 720
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accctgagct ggagcaaaac cattaccctg tatctggatc cggcgagcct gccggcgctg 120
aatcagctga tggattttac gcagaacaac gaagataaaa cccatccgcg catttttggc 180
ctgagccgct ttaaaattcc ggataacatt attacgcagt atcagaacat tcattttgtg 240
gaactgaaag ataaccgccc gaccgaagcg ctgtttacca ttctggatca gtatccgggc 300
aacattgaac tggatattca tctgaacatt gcgcatagcg tgcagctgat tcgcccgatt 360
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ggctgcaaca acgataacag caccacgacc aacaataacg cgattgaaat ttatgtggat 120
cgcgcgaccc tgccgaccat tcagcagatg accaaaattg tgagtcagaa aacgagcaac 180
aaaaaactga ttagttggag ccgctatccg attaccgata aaagcctgct gaaaaaaatt 240
aacgcggaat tttttaaaga acagtttgaa ctgaccgaaa gcctgaaaaa cattatttta 300
agtgaaaata ttgataacct gattattcat ggcaacaccc tgtggagcat tgatgtggtg 360
gatattatta aagaagtgaa cctgctgggc aaaaacattc cgattgaact gcatttttat 420
gatgatggca gcgcggaata tgtgcgcatt tatgaattta gcaaactgcc ggaaagcgaa 480
cagaaatata aaacgagcct gagcaaaaat aatattaaat ttagcattga tggcaccgat 540
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catatgctgc gcgcggatat ttttgatacc accctgaaaa ttaacccgct gcgcgaactg 660
ctgagcaaca acattaaaca gatgaaatgg gactatttca aagattttaa ctataaacaa 720
aaagatattt tttatagcct gaccaacttt aacccgaaag aaattcaaga agattttaac 780
aaaaacagca ataaaaactt catttttatt ggcagcaaca gcgcgaccgc gaccgcggaa 840
gaacagatta acattattag cgaagcgaaa aaagaaaaca gcagcattat taccaatagt 900
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gaacagatgg cgatcatccg tggtaacaac gaaagcaaaa aagcggcgaa acaggaacag 840
gttaccatcg atttcgcgtt cgcgagcgtg gtttctatca aagacatcaa aaaaggtgaa 900
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gttctgagca tggataacat ctgggttaaa cgtccgggtc tgggtggtat cagcgcggcg 960
gaattcgaaa acatcctggg caaaaaagcg ctgcgtgata tcgaaaacga cgcgcagctg 1020
agctatgaag atttcgcatg aagaaaatcc tgttcatcac cggcagccgc gcggattaca 1080
gcaaaatcaa atctctgatg taccgtgtgc agaacagcag cgaattcgaa ctgtacatct 1140
tcgcgaccgg catgcacctg tccaaaaact tcggctacac cgttaaagaa ctgtacaaaa 1200
acggcttcaa aaacatctac gaattcatca actacgataa atactaccag accgataaag 1260
cgctggcgac caccatcgac ggtttctctc gttacgccaa cgaactgaaa ccggatctga 1320
tcgtggtgca cggcgaccgc atcgaaccgc tggctgcggc gatcgtgggc gcgctgaaca 1380
acatcctggt tgctcacatc gaaggtggcg aaatctccgg caccatcgac gatagcctgc 1440
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gtctgatgca gctgggcgaa gatgaaaaaa gcatcttcat catcggctct ccggacctgg 1560
aactgctgaa cgataacaaa atctctctga gcgaagcgaa aaaatattac gacatcaact 1620
acgaaaacta cgcgctgctg atgttccacc cggtgaccac cgaaatcacc tccatcaaaa 1680
accaggcgga taacctggtt aaagcgctga tccagtccaa caaaaactac atcgtgatct 1740
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acccgcgttt caaactgttc ccgtcgctgc gtttcgaata cttcatcacc ctgctgaaaa 1860
acgccgattt catcatcggc aacagctctt gcatcctgaa agaagcgctg tacctgaaaa 1920
ccgcgggcat cctggttggt tctcgccaga acggtcgtct gggtaacgaa aacaccctga 1980
aagttaacgc gaacagcgac gaaatcctga aagcgatcaa caccatccac aaaaaacagg 2040
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agagcggcga cttcttcaaa ctgagcaccc agaaagtgtt caaagatatc aaataa 2156
<210> 7
<211> 1236
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgggcatgc tggtgttttg caaaaaaatg ttttttagcg tgtttattag cctgatgatt 60
ctgggcggct gcaacagcga tagcaaccat aacaacagcg atggcaacat taccaaaaac 120
aaaaccattg aagtgtatgt ggatcgcgcg accctgccga ccattcagca gatgacgcag 180
attattaacg aaaacagcaa caacaaaaaa ctgattagct ggagccgcta tccgattaac 240
gatgaagaac tgctggaaag tattaacggc agctttttta aaaacaacag cgaactgatt 300
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accctgtggg cggcggatgt ggtgaacatt attaaaagca ttgaagcgtt tggcaaaaaa 420
accgaaatcg aactgaattt ttatgatgat ggcagcgcgg aatatgtgcg cctgtatgat 480
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tttaaaacct ttaacagtca gcagaaagat aaattttata actttaccgg ctttaacccg 780
gatgaaatta tggaacagta taaagcgagc ccgaacaaaa actttatttt tgtgggcacc 840
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attccgtttg aagcgctgat tatgaccgat gcgctgccgg atgcggtggg cggcatgggc 1080
agcagcgtgt tttttagcct gccgaacacc gtggaaaaca aatttatttt ttataaaagc 1140
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<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgagtaatc gtaaatattt cggtaccgat gggattcgtg gtcgtgtagg ggatgcgccg 60
atcacacctg attttgtgct taagctgggt tgggccgcgg gtaaagtgct ggcgcgccac 120
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gcatcgcata acccgttcta cgataatggc attaaattct tctctatcga cggcaccaaa 360
ctgccggatg cggtagaaga ggccatcgaa gcggaaatgg aaaaggagat cagctgcgtt 420
gattcggcag aactgggtaa agccagccgt atcgttgatg ccgcgggtcg ctatatcgag 480
ttttgcaaag ccacgttccc gaacgaactt agcctcagtg aactgaagat tgtggtggat 540
tgtgcaaacg gtgcgactta tcacatcgcg ccgaacgtgc tgcgcgaact gggggcgaac 600
gttatcgcta tcggttgtga gccaaacggt gtaaacatca atgccgaagt gggggctacc 660
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gacggcgatg gcgatcgcgt gattatggtt gaccatgaag gcaataaagt cgatggcgat 780
cagatcatgt atatcatcgc gcgtgaaggt cttcgtcagg gccagctgcg tggtggcgct 840
gtgggtacat tgatgagcaa catggggctt gaactggcgc tgaaacagtt aggaattcca 900
tttgcgcgcg cgaaagtggg tgaccgctac gtactggaaa aaatgcagga gaaaggctgg 960
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gcagtaaaag ccgtttaa 1338
<210> 9
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<210> 10
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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aaactgagca cccagaaagt gttcaaagat atcaaataa 1119

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌弱化了基因组上编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ、编码N-乙酰神经氨酸裂解酶的基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运体的基因nanT、编码N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还包括如(a)和/或(b)：
(a)表达了编码乙酰神经氨酸合成酶的基因neuB、编码N-乙酰葡萄糖胺异构酶的基因neuC和编码CMP-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuA；
(b)表达了编码α2,3唾液酸转移酶的基因；
(a)中，还可以表达单拷贝或双拷贝的编码磷酸葡萄糖胺变位酶的基因glmM和表达双拷贝neuA。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌基因组上的recA基因处整合编码α2,3唾液酸转移酶的基因Vs16，所述Vs16基因的NCBI登录号为AAC44541。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还可以携带重组质粒pRSF-MUS*。
5.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用pETDuet-1质粒表达neuB、neuC、neuA、glmM，利用pCDFDuet-1质粒表达编码α2,3唾液酸转移酶的基因。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述nanA基因的NCBI登录号为AAC76257；所述nanT基因的NCBI登录号为AAC76256；所述nanK基因的NCBI登录号为AAC76254；所述lacZ基因的NCBI登录号为AAC73447。
7.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述编码α2,3唾液酸转移酶的基因包括来自于Neisseria meningitidis MC58的基因nst，来自Pasteurella multocidaPm70的基因Pm0188，来自Vibrio sp.JT-FAJ-16的基因Vs16，来自Photobacterium sp.JT-ISH-224的基因Ps224。
8.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述neuA的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述neuB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述neuC的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述glmM的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
9.一种生产3′-唾液酸乳糖的方法，其特征在于，所述方法为以甘油和乳糖为底物，利用所述重组大肠杆菌进行发酵生产。
10.权利要求1～8任一项所述重组大肠杆菌在在医药、食品和化工领域中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190938A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 南开大学 一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’‑唾液乳糖的方法
US20210087599A1 (en) * 2017-07-26 2021-03-25 Jennewein Biotechnologie Gmbh Sialyltransferases and their use in producing sialylated oligosaccharides
CN113151133A (zh) * 2021-04-19 2021-07-23 中国科学院合肥物质科学研究院 一种高产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用
CN114350584A (zh) * 2021-12-17 2022-04-15 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190938A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 南开大学 一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3’‑唾液乳糖的方法
US20210087599A1 (en) * 2017-07-26 2021-03-25 Jennewein Biotechnologie Gmbh Sialyltransferases and their use in producing sialylated oligosaccharides
CN113151133A (zh) * 2021-04-19 2021-07-23 中国科学院合肥物质科学研究院 一种高产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用
CN114350584A (zh) * 2021-12-17 2022-04-15 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 高产唾液酸乳糖的工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOSHIMITSU TAKAKURA等: "Molecular Cloning, Expression and Properties of an α/β-Galactoside α2, 3-Sialyltransferase from Vibrio sp. JT-FAJ-16", THE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 142, no. 3, pages 405 *

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