CN107267575B - 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法 - Google Patents

微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和D‑氨基葡萄糖盐的方法。该方法主要通过提高微生物中N‑乙酰‑D‑氨基甘露糖‑6‑磷酸异构酶的作用，以更高效率和更高产量生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐。

Description

微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐 的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域。具体地说，本发明涉及微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖以及进一步制备D-氨基葡萄糖盐的方法。
背景技术
N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-glucosamine，NAG或GlcNAc)，又称N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰葡糖胺，是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要生理功能。N-乙酰-D-氨基葡萄糖在临床上可用于：增强人体免疫系统的功能；抑制恶性肿瘤或纤维细胞的生长；有效治疗各种炎症；作为糖尿病患者低热量甜味剂和婴幼儿食品添加剂等。水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖可用于生产D-氨基葡萄糖盐酸盐，后者可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品补充剂，是目前壳多糖保健食品系列中第三代保健功能性食品添加剂。此外，N-乙酰-D-氨基葡萄糖在医药行业中是合成抗癌药物氯脲霉素的主要原料；作为生化试剂还可用作抗细菌感染的免疫佐剂和人体抗流感病毒的活化剂。
当今世界各地，有大量患者忍受不同程度关节炎痛苦，仅美国就有3300万人忍受骨关节炎及关节疼痛，我国有1.5亿人以上。由于D-氨基葡萄糖产品在关节炎及关节疼痛的治疗与保健方面具有特别功效，因而得到广泛应用，已成为目前国外市场非常重要的原料药品种。
N-乙酰-D-氨基葡萄糖据认为具有与D-氨基葡萄糖相似的效果，已知摄取N-乙酰-D-氨基葡萄糖能诱导产生新的软骨，并阻止骨关节炎的发作，或在一些病例中，用来治疗骨关节炎。由于D-氨基葡萄糖有苦味，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖有蔗糖50％的甜味，并且很容易被摄取，因此，N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为D-氨基葡萄糖的替代物质已引起关注。
目前，国内外氨基葡萄糖的来源主要以生物提取为主。生物提取主要是从虾蟹壳中提取甲壳素或壳聚糖，再经浓盐酸水解制备，或用柠檬酸渣经酸碱提取而得。年生产量在2万吨左右。但是，用虾蟹壳提取时，每获得1吨产品将产生大量废渣和100吨以上废水；用柠檬酸渣提取时，每获得1吨产品将产生30-50吨废酸渣，是高污染工艺，在许多地方已禁止使用。而且，来自水产品壳提取的氨基葡萄糖对许多有水产品过敏的患者不适宜，有水产品过敏的人使用后可能会造成严重的过敏问题，甚至危及生命。此外，生物提取纯化工艺复杂，产品有鱼腥味，不稳定。另外，由于环境污染，从虾蟹壳中提取得到的氨基葡萄糖不可避免的受到重金属污染。
因此，生物提取方法生产氨基葡萄糖，从数量和质量上都难以满足人们的需求，须开辟新的替代方法。若采用化学合成方法来制备，更存在如下三个缺点：生产成本高；严重的环境污染；有安全性隐患。该方法目前国内外已不采用。相比较而言，微生物发酵法生产氨基葡萄糖是一条良好的途径，微生物发酵法是以葡萄糖和无机盐为原料，选用优良菌种进行液体发酵，并经分离、浓缩、纯化直接生产氨基葡萄糖。生产过程中无有害气体产生。发酵法生产的氨基葡萄糖无鱼腥味，生产不受资源限制。而且利用代谢工程进行菌种改良，产量高，工业化大生产潜力大。因此，微生物发酵法生产氨基葡萄糖在技术工艺上有重大变革，替代传统的生物提取，不仅在成本方面占有优势，在减少三废污染方面也具有一定的环保贡献。
微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖常规方法包括：涉及用微生物产生的酶降解来自虾壳原料产生的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US5998173，“Process for producing N-acetyl-D-glucosamine”)；用微生物(木霉菌)产生的酶酶解或用酸部分水解纯化来自真菌渣(如柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣)的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US20030073666A1，“N-acetyl-D-glucosamine andprocess for producing N-acetyl-D-glucosamine”)；用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源，不需要来自真菌渣或虾壳产生的甲壳素和壳多糖寡糖为碳源，发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US20110059489A1，“Method for fermentative production of N-acetyl-D-glucosamine by microorganism”)；通过培养绿藻病毒(Chlorovirus)感染的小球藻细胞或者导入了源自绿藻病毒的基因的重组大肠杆菌来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，JP2004283144A，“Method for producing glucosamine and N-acetylglucosamine”)；使用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵生产D-氨基葡萄糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法(例如，US6,372,457，“Process and materialsfor production of glucosamine”；WO2004/003175，“Process and materials forproduction of glucosamine and N-acetylglucosamine”)。
用微生物或微生物产生的酶来降解源自甲壳类动物如蟹、虾类的壳的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，较为传统，存在产量低、成本高和动物源不足等问题。通过培养用绿藻病毒感染的小球藻细胞生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，涉及压碎细胞获取N-乙酰-D-氨基葡萄糖的步骤，存在操作复杂等问题。用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，具有不需要使用来自甲壳类动物壳或真菌渣产生的甲壳素或壳多糖寡糖等碳源的优点，但木霉菌等真菌发酵温度低(27℃)、时间长(10天)、产量偏低(15mg/ml)，从而存在生产周期长、成本高、易污染杂菌等缺点，严重限制了该方法的工业化应用。
显然，针对氨基葡萄糖不断增长的市场需求，用遗传修饰的微生物生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，是实现大规模工业化生产的一条有应用前景的重要方法。而新的遗传修饰的微生物可通过基因重组、基因转移、基因突变、基因删除、基因超表达、代谢途径改变等许多方式获得。
美国专利US6,372,457中公开了通过微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法和材料。该发明包括用于该发明生产氨基葡萄糖之方法的遗传修饰的微生物，以及重组核酸分子和由所述重组核酸分子产生的蛋白质。该发明所述遗传修饰的微生物，主要针对能提高氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的遗传修饰，包括多种基因突变或氨基酸缺失和取代。但该专利未涉及通过内源性氨基葡萄糖-6-磷酸合酶基因启动子更换或缺失等改变，导致氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的提高或降低。另外，该专利主要通过氨基葡萄糖-6-磷酸合酶的遗传修饰生产的目的产物仅为D-氨基葡萄糖，未涉及N-乙酰-D-氨基葡萄糖生产。而且，由于D-氨基葡萄糖在发酵液中很不稳定，降解产物可能对微生物有毒性，这种通过遗传修饰生产D-氨基葡萄糖的方式，其产量很低，实际应用存在局限性。
WO2004/003175中公开了用于生产D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生物合成方法。该方法通过发酵基因修饰微生物以产生氨基葡萄糖和/或N-乙酰-D-氨基葡萄糖。该发明还公开了用于生产氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的基因修饰微生物。此外，该发明还描述了回收通过发酵法生产的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，包括产生高纯度N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法。该发明还公开了由N-乙酰-D-氨基葡萄糖生产D-氨基葡萄糖的方法。该发明所述遗传修饰的微生物,主要针对增加氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰。酵母氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因(GNA1)在大肠杆菌中表达可将氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化为乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸，在先前的文献中也已有报道和证实(MioT1,Yamada-Okabe T,Arisawa M,Yamada-Okabe H:Saccharomyces cerevisiae GNA1,anessential gene encoding a novel acetyltransferase involved in UDP-N-acetylglucosamine synthesis,J Biol Chem.,1999Jan 1；274(1):424-9.)。
发明内容
本发明针对N-乙酰-D-氨基葡萄糖的代谢途径，采用新的遗传修饰方法改造微生物，并利用该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。
具体而言，本发明通过提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase，NanE)的作用，加强微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸(N-acetyl-D-mannosamine-6-phosphate，ManNAc-6-P)转变为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate，GlcNAc-6-P)，排出细胞外成为N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。
本发明在上述内容的基础上还进一步涉及如下内容中的一种或多种：
1.通过提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(D-Glucosamine-6-phosphatedeaminase，NagB)的作用，优选同时降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase，GlmS，又称作L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶，L-glutamine:D-fructose-6-phosphate aminotransferase)的作用，加强微生物中葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate，Glc-6-P)氨基化为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)。D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)所催化的反应是可逆的，氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)所催化的反应虽是不可逆的，但有严重的产物抑制问题，当NagB催化的反应向由Glc-6-P生成GlcN-6-P的方向进行时，其和GlmS功能相同，可替代GlmS，而且无产物抑制问题。提高NagB的作用，加快NagB催化反应向由Glc-6-P生成GlcN-6-P的方向进行，优选同时降低GlmS的作用，减弱GlmS的产物抑制问题，达到增加GlcN-6-P的目的，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。
2.通过提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphatesynthase，GlmS，又称作L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶，L-glutamine:D-fructose-6-phosphate aminotransferase)的作用，并同时降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(D-Glucosamine-6-phosphate deaminase，NagB)的作用，加强微生物中葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate，Glc-6-P)氨基化为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)。D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)所催化的反应是可逆的，当NagB催化的反应向由GlcN-6-P生成Glc-6-P的方向进行时，其和GlmS功能相反，会抵消GlmS的作用。降低NagB的作用，阻止NagB催化反应向由GlcN-6-P生成Glc-6-P的方向进行，并同时超表达GlmS，加快GlmS催化Glc-6-P氨基化为GlcN-6-P，达到增加GlcN-6-P的目的，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。
3.通过提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(UDP-N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase，WecB)的作用，加强微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖(UDP-N-acetyl-D-glucosamine，UDP-GlcNAc)转变为N-乙酰-D-氨基甘露糖(N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc)，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。
4.降低微生物中与目标产物再次被摄入细胞内或有益中间产物被降解相关的酶或者蛋白的作用，提高微生物中糖转化率和N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐。包括但不限于如下内容中的一种或多种：
(1)降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(Mannose transporter EIIM，P/IIIMan，ManXYZ)的作用，阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)等己糖转运回细胞内降解。
(2)降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(N-acetylneuraminate lyase，NanA)的作用，阻止微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖(N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc)降解。
(3)降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase，NagA)的作用，阻止微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate，GlcNAc-6-P)转变为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)。
(4)降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(N-acetylglucosaminespecific enzyme IINag，NagE)的作用，阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)被转入微生物细胞内降解。
(5)通过提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(phosphoglucosamine mutase，GlmM)的作用，加强微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸(D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)转变为D-氨基葡萄糖-1-磷酸(D-glucosamine-1-phosphate，GlcN-1-P)。
(6)通过提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(bifunctional N-acetyl glucosamine-1-phosphate uridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyl transferase，GlmU)的作用，加强微生物中D-氨基葡萄糖-1-磷酸(D-glucosamine-1-phosphate，GlcN-1-P)转变为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸(N-acetyl-D-glucosamine-1-phosphate，GlcNAc-1-P)，并进一步转变为UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖(UDP-N-acetyl-D-glucosamine，UDP-GlcNAc)。
根据本发明的一个实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
优选，进一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。
在本发明中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰选自a)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的酶活性增加；和/或b)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的作用，可以通过筛选编码具有N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选NanE基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：17的下述位置处的取代中的一种或两种：第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的核酸序列为SEQ ID NO：26；所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的氨基酸序列为SEQ ID NO：27。
在另一个方面，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)具有与SEQ IDNO：17的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)具有酶活性。
在另一个方面中，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)具有SEQ IDNO：17的氨基酸序列。
在另一个方面，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
(1)包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；
(2)包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；
(3)包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。
在上述第(1)个方面中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰选自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的酶活性增加；和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的作用，可以通过筛选编码具有D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选NagB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的酶活性的遗传修饰。
在另一个方面，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
在本发明中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的酶活性降低；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的表达减少，包括但不限于：编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(2)个方面中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的酶活性增加；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的作用，可以通过筛选编码具有氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选GlmS基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的酶活性的遗传修饰。
在另一个方面，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
在本发明中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰选自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的酶活性降低；和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的表达减少，包括但不限于：编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(3)个方面中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰选自a)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的酶活性增加；和/或b)微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的作用，可以通过筛选编码具有UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选WecB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的核酸序列含有至少一种增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：43的下述位置处的取代中的一种或多种：第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代；更优选，编码所述UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的核酸序列为SEQ ID NO：49；所述UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的氨基酸序列为SEQ ID NO：50。
在另一个方面，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)具有与SEQ IDNO：43的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)具有酶活性。
在另一个方面中，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)具有SEQ IDNO：43的氨基酸序列。
在另一个方面，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
(1)包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰；
(2)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰；
(3)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰；
(4)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰；
(5)包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰；
(6)包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰。
在上述第(1)个方面中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰包括但不限于：编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(2)个方面中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰包括但不限于：编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(3)个方面中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰包括但不限于：编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(4)个方面中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰包括但不限于：编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在上述第(5)个方面中，提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的作用，可以通过筛选编码具有磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选GlmM基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的核酸序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的酶活性的遗传修饰。
在另一个方面，重组核酸分子中编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
在上述第(6)个方面中，提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰选自a)微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的酶活性增加；和/或b)微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)被过量表达。
本领域技术人员可以理解，为提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的作用，可以通过筛选编码具有双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选GlmU基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的核酸序列含有至少一种增加双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的酶活性的遗传修饰。
在另一个方面，重组核酸分子中编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因拷贝数增加。
在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。
在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。
本发明进一步涉及如下优选的实施方案：
1.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰。
2.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
3.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
4.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰。
5.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰；和
B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。
在上述优选的实施方案中，进一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。
在上述优选的实施方案中，所述微生物进一步包含：至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰；至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰；至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰；和至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰。
在上述任意实施方案的一个方面中，上述任意重组核酸分子的表达是可诱导的，包括但不限于被乳糖诱导，例如，通过在培养液中添加乳糖等可实现被乳糖诱导表达。
本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规发酵培养基。在一个方面中，发酵培养基中包含碳源。在另一个方面中，发酵培养基中包含氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源和氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐。
本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种碳源均可用于本发明，包括有机碳源和/或无机碳源。优选，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种。优选，碳源的浓度维持在约0.1％-约5％。本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种氮源均可用于本发明，包括有机氮源和/或无机氮源。优选，氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种。
优选，本发明采用补料发酵法。根据本发明的一个方面，补糖液包含葡萄糖和核糖，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，核糖浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，核糖浓度为5％-7％(w/v)；根据本发明的另一个方面，补糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为2％-3％(w/v)；根据本发明的另一个方面，补糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10％-85％(w/v)，核糖浓度为0.5％-15％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为0.5％-15％(w/v)，进一步优选，葡萄糖浓度为55％-75％(w/v)，核糖浓度为5％-7％(w/v)，葡萄糖酸盐浓度为2％-3％(w/v)。优选，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。
在优选的实施方案中，在约20℃-约45℃进行所述培养步骤，进一步优选，在约33℃-约37℃进行所述培养步骤。
在优选的实施方案中，在约pH4.5-约pH8.5进行所述培养步骤。在一个方面中，在约pH6.7-约pH7.2进行所述培养步骤。
本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规方法收集N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。优选，可以从发酵培养基中的胞外产物中收集N-乙酰-D-氨基葡萄糖。进一步优选，该收集步骤包括选自如下的步骤：(a)从去除微生物的发酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖；(b)从去除微生物的发酵液中结晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
根据本发明，收集步骤进一步包括将发酵液脱色的步骤。脱色步骤可以包括但不限于在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行，脱色包括活性炭处理和/或色谱脱色。所述色谱脱色包括使所述发酵液与离子交换树脂接触的步骤，离子交换树脂包括但不限于阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂，例如使发酵液与阴离子和阳离子交换树脂的混合床接触。
根据本发明，可以通过使N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐，所述盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐等。例如，可以在酸性和加热条件下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐，优选，在30％-37％盐酸溶液中、60℃-90℃下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐酸盐；也可以在UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖，并进一步成盐。
根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰。上文已经对这一遗传修饰进行了详细描述。
根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
(1)包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；
(2)包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；
(3)包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。上文已经对这些遗传修饰进行了详细描述。
根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
(1)包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰；
(2)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰；
(3)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰；
(4)包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰；
(5)包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)作用的遗传修饰；
(6)包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GlmU)作用的遗传修饰。上文已经对这些遗传修饰进行了详细描述。
本发明进一步涉及如下优选的实施方案：
1.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰。
优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰。
2.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰。
3.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。
4.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。
优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰。
5.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)作用的遗传修饰；至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)作用的遗传修饰。
在上述优选的实施方案中，所述微生物进一步包含：至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(ManXYZ)作用的遗传修饰；至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶(NanA)作用的遗传修饰；至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)作用的遗传修饰；和至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(NagE)作用的遗传修饰。
根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及一种具有更高酶活性的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)，其具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。本发明进一步涉及编码上述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶(NanE)的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：26所示的核酸序列。本发明进一步涉及包含上述核酸分子的载体。本发明进一步涉及包含上述载体的微生物。本发明进一步涉及基因组中包含上述核酸分子的微生物。
在本发明中，微生物可以是任意的微生物(例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物)。在优选的实施方案中，微生物包括但不限于细菌、酵母或真菌。优选，所述的微生物选自细菌或酵母。进一步优选，细菌包括但不限于选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌；更优选，细菌包括但不限于选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。进一步优选，酵母包括但不限于选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属(Phaffia)的酵母；更优选，酵母包括但不限于选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。优选，所述的微生物为真菌；进一步优选，真菌包括但不限于选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌；更优选，真菌包括但不限于选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W，最优选K-12。尽管大肠杆菌作为优选的微生物且用作本发明各种实施方案的实例，但是应理解在本发明方法中可以使用产生N-乙酰-D-氨基葡萄糖且可以通过遗传修饰以提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的任意其它微生物。用于本发明的微生物也可以称作生产生物体。
在本发明中，术语N-乙酰-D-氨基葡萄糖可以称作2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。术语N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分别缩写为GlcNAc、GlcNAc-6-P和GlcNAc-1-P。N-乙酰-D-氨基葡萄糖也缩写为NAG。与N-乙酰-D-氨基葡萄糖和衍生物类似，术语D-氨基葡萄糖、D-氨基葡萄糖-6-磷酸和D-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分别缩写为GlcN、GlcN-6-P和GlcN-1-P。类似地，术语N-乙酰-D-氨基甘露糖、N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸可以分别缩写为ManNAc、ManNAc-6-P、Glc、Glc-6-P、Fru-6-P。
术语提高微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性增加和/或该酶被过量表达，从而提高了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。
术语降低微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性降低和/或该酶的表达减少，从而降低了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。
术语酶活性增加是指酶催化一定化学反应的能力增加。其涵盖了在酶受产物抑制作用和酶对底物亲合力不变的情况下酶自身催化化学反应的能力增加，和/或由于酶受产物抑制作用降低导致和/或酶对底物亲合力增加所导致的酶催化化学反应的能力增加。术语酶受产物抑制作用降低是指催化反应的酶的活性受其终产物特异抑制作用而降低。术语酶对底物亲合力增加是指酶对所催化的底物的亲合力增加。
图1以大肠杆菌为例解释了本发明公开的用于大规模生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的氨基糖代谢途经中遗传修饰的主要方面。就图1而言，粗体箭头表示本发明涉及的通过遗传改造产生和/或增加代谢流量。图1公开了数种用于合成N-乙酰-D-氨基葡萄糖的不同方法，包括对NanE的修饰，可进一步包括对NagB、GlmS、WecB或其组合的修饰，还可以进一步包括对ManXYZ、NanA、NagA、NagE、GlmM、GlmU或其组合的修饰。本领域技术人员可以理解，其它微生物具有类似的糖代谢途经，且在这类途经中基因和蛋白质具有类似的结构和功能。因此，本发明所讨论的除适用于大肠杆菌外同样适用于其它微生物且其它微生物显然包括在本发明中。
本领域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名称，这取决于该酶来源于什么样的微生物。下面是本文涉及的许多酶的可选名称和来自一些生物体的编码这类酶的具体基因名称。这些酶的名称可以互换使用或如果合适用于给定的序列或生物体，但本发明意图包括来自任意生物体的指定功能的酶。
例如，本文一般称作“N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶”的酶催化由N-乙酰-D-氨基甘露糖磷酸化为N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P。来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶一般称作NanK。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。
本文一般称作“N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶”的酶催化由N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P转变为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-P。来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶一般称作NanE。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶具有由SEQ ID NO：16表示的核酸序列编码、由SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列。
本文一般称作“UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶”的酶催化由UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖转变为N-乙酰-D-氨基甘露糖。来自大肠杆菌的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶一般称作WecB。来自各种生物体的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有由SEQ ID NO：42表示的核酸序列编码、由SEQ ID NO：43表示的氨基酸序列。
本文一般称作“D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶”的酶催化D-氨基葡萄糖-6-磷酸和水形成葡萄糖-6-磷酸和铵的可逆反应。该酶也称作D-氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、GlcN6P脱氨酶、磷酸D-氨基葡萄糖异构酶、磷酸D-氨基葡萄糖异构酶、D-氨基葡萄糖磷酸酯脱氨酶和2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸乙酮醇异构酶(脱氨)。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。在大肠杆菌和其它细菌中，该酶一般称作NagB。
本文一般称作“D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶”的酶催化由葡萄糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成D-氨基葡萄糖-6-磷酸和谷氨酸。该酶也称作D-氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基转移酶(异构化)、磷酸己糖氨基转移酶、D-果糖-6-磷酸转酰胺酶、D-氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶(形成谷氨酰胺)、L-谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转酰胺酶和GlcN6P合酶。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。来自大肠杆菌和其它细菌的D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶一般称作GlmS。
本文一般称作“N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶”的酶将N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸水解成D-氨基葡萄糖-6-磷酸和乙酸酯。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的称作NagA。
本文一般称作“N-乙酰神经氨酸裂解酶”的酶催化N-乙酰-D-氨基甘露糖降解为N-乙酰神经氨酸。来自各种生物体的N-乙酰神经氨酸裂解酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸裂解酶称作NanA。
本文一般称作“磷酸葡糖胺变位酶”的酶催化D-氨基葡萄糖-6-磷酸转化为D-氨基葡萄糖-1-磷酸。来自各种生物体的磷酸D-氨基葡萄糖变位酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。该酶在大肠杆菌和其它细菌的磷酸葡糖胺变位酶一般称作GlmM。
本文一般称作“D-氨基葡萄糖-1-磷酸N-乙酰转移酶”的酶将D-氨基葡萄糖-1-磷酸和乙酰辅酶A转化成N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸，并释放CoA。作为一种双功能酶，它还具有N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的功能，也称作UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖二磷酸化酶，将N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸进一步转化为UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-1-磷酸N-乙酰转移酶和N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。该酶在大肠杆菌和其它细菌中称作GlmU。
“Trc启动子”经过巧妙的设计可用于原核表达，例如大肠杆菌表达系统。Trc启动子是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了的Trcpromoter具有SEQ ID NO：28表示的核苷酸序列。
正如WO2004/003175发明公开的，D-氨基葡萄糖在用于大肠杆菌生长的一般pH范围内极不稳定。D-氨基葡萄糖和/或其降解产物对菌株产生毒性作用。甚至当在进行细胞接种前将浓度低至20g/L的D-氨基葡萄糖在培养基(pH7.0)中预保温3.5小时的时候也观察到毒性。毒性至少部分是由于起始pH为7.0的培养基中的D-氨基葡萄糖降解产物所致。GlcN在较低pH条件下更为稳定，D-氨基葡萄糖在pH4.7以下不会降解。但是，大肠杆菌在低于6-7的pH条件下生长缓慢。因此，在相对低pH下在发酵罐内进行D-氨基葡萄糖生产的方案难以施行。
根据本发明，在细胞内将由D-氨基葡萄糖-6-P(GlcN-6-P)在GlmM和GlmU催化生成UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，在UDP-N-乙酰-氨基葡萄糖-2-异构酶(wecB)催化下变成N-乙酰基-D-氨基甘露糖(ManNAc)，通过超表达NanE，进一步转变为N-乙酰基-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)，在磷酸酶作用下去磷酸化，排出细胞外成为N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)。本发明的方法，避免了D-氨基葡萄糖的生成，从而避免了D-氨基葡萄糖和/或其降解产物对菌株产生毒性作用。
因此，本发明的有益效果在于：本发明证实可通过微生物发酵方法直接生产完全天然的N-乙酰-D-氨基葡萄糖；该生产新方法无重金属污染风险，无抗生素、药物残留风险，生产不受原料供应影响，可长期稳定生产，且产量高、成本低；所生产的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖产品具有非动物源性，不使用虾壳的甲壳素，使用葡萄糖等碳源发酵，属于素食产品，且无水产品过敏源。
将本文引述或描述的各公开文献和参考文献的全部内容引入本文作为参考。
附图说明
图1大肠杆菌中N-乙酰-D-氨基葡萄糖生物合成途径和代谢工程策略图
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，实施例中使用的原料和试剂均为市售商品。
下面是本发明涉及和/或所述的各种基因修饰微生物的目录。
Figure BDA0001262629800000201
Figure BDA0001262629800000211
实施例1
本实施例描述了构建阻断与N-乙酰-D-氨基葡萄糖被摄入及有益中间产物被降解有关的代谢途径的大肠杆菌突变株
所述生产菌株的亲本菌株是AT-001(Escherichia coli ATCC 27325)，属于大肠杆菌K-12衍生株，来自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
阻断菌种对N-乙酰-D-氨基葡萄糖摄入及中间代谢产物降解，可以减少代谢过程中的损耗，增加目标产物(N-乙酰-D-氨基葡萄糖)的积累。
构建这种突变型宿主菌株，可通过将其染色体基因组上manXYZ、nanA、nagA和nagE基因序列完全或部分删除，使其功能失效，从而使N-乙酰-D-氨基葡萄糖累积。
这种染色体上基因序列删除，可以采用Red重组技术完成。Red重组是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rac噬菌体RecE/RecT系统介导的DNA同源重组技术。通过该技术可以简单、快速地对任意大的DNA分子进行插入、敲除、突变等多种修饰。Red重组技术简单地说，首先向菌体中转入带有表达重组酶基因的pKD46质粒，然后电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆，最后，将重组后菌种中抗性基因消除。
以下描述了具体的操作过程：
1、删除manXYZ基因序列
甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman(mannose transporter EIIM，P/IIIMan，ManXYZ)可以用作N-乙酰-D-氨基葡萄糖的第二转运蛋白，能将N-乙酰-D-氨基葡萄糖等己糖转运入细胞，从而使排出胞外并积累的目标产物运回胞内降解。将manXYZ基因序列删除，可以阻止细胞外N-乙酰-D-氨基葡萄糖被转运回细胞内降解。
(1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
1)PCR扩增fKanrf片段
fKanrf片段，即FRT-Kanr-FRT片段，是指将卡拉霉素抗性基因(Kanr)的两端装有FLP重组酶特异性识别的FRT位点碱基序列。
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
2)PCR扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段
设计同源臂引物：根据manXYZ序列SEQ ID No.4，设计删除manXYZ序列的同源臂正向引物(manXYZKO-F)SEQ ID No.5，反向引物(manXYZKO-R)SEQ ID No.6。
模板：扩增的fKanrf PCR片段。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-001菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
pKD46载体是带有表达Red重组酶基因的质粒，表达Exo、Bet和Gam三基因片段，3个基因置于阿拉伯糖启动子下，经L-阿拉伯糖诱导就可以大量表达。为达到通过Red重组修饰染色体上目标基因的目的，有必要将pKD46质粒转化到大肠杆菌中。
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli ATCC 27325菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。其中，0.1M CaCl2的制备：用无水CaCl2配1M的CaCl2，用蒸气压力为15lbf/in2的高压灭菌20min，分装1.5ml于-20℃保存，用时融化后按1:10比例稀释配成0.1M的CaCl2。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46Escherichia coli ATCC 27325菌种AT-001接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(1)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-002-01(AT-001，△manXYZ::fKanrf)。
(3)抗性基因的消除
为便于后续工作，可消除所获得菌种(阳性克隆)中的抗性基因。消除抗性基因可借助pCP20质粒完成。pCP20是带有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因的质粒，热诱导后可表达FLP重组酶，该酶可特异性识别FRT位点，通过重组可将FRT位点间的序列删除，只保留一个FRT位点。
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-002-02(AT-001，△manXYZ)。
2、删除nanA基因序列
N-乙酰神经氨酸裂解酶(N-acetylneuraminate lyase，NanA)能够将微生物中的N-乙酰-D-氨基甘露糖(ManNAc)降解成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)。将nanKETA操纵子中的nanA基因序列删除，可以阻止N-乙酰-D-氨基甘露糖(ManNAc)降解成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)。
(1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据nanE-nanK前段nanA序列SEQ ID No.7，设计nanA序列删除的同源臂引物：正向引物(nanAKO-F)SEQ ID No.8，反向引物(nanAKO-R)SEQ ID No.9。
模板：扩增的fKanrf PCR片段。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-002-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-002-02(AT-001，△manXYZ)菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46Escherichia coli菌种AT-002-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(1)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-003-01(AT-002-02，△nanA::fKanrf)。
(3)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-003-02(AT-002-02，△nanA)。
3、删除nagA基因序列
N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶(N-acetylglucosamine-6-phosphatedeacetylase，NagA)能将微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)转变为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN-6-P)。将nag操纵子(nagE-nagBACD)中的nagA基因序列删除，可以阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)转变为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN-6-P)。
(1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，Escherichia coli str.K-12 N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA序列SEQ ID No.10，设计nagA序列删除的同源臂引物：正向引物(nagAKO-F)SEQ ID No.11，反向引物(nagAKO-R)SEQ ID No.12。
模板：扩增的fKanrf PCR片段。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-003-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-003-02(AT-002-02，△nanA)菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46Escherichia coli菌种AT-003-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(1)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-004-01(AT-003-02，△nagA::fKanrf)。
(3)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-004-02(AT-003-02，△nagA)。
4、删除nagE基因序列
将N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag(N-acetyl-glucosamine-specific enzymeIINag，NagE)的基因序列nagE删除，可阻止细胞外GlcNAc被转运回细胞内降解。
(1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，Escherichia coli str.K-12 nagB启动子和nagE基因序列SEQ ID No.13，设计删除nagE基因序列的同源臂正向引物(nagEKO-F1)SEQ ID No.14，反向引物(nagEKO-R1)SEQ ID No.15。
模板：扩增的fKanrf PCR片段。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-004-02(AT-003-02，△nagA)菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46 Escherichia coli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(1)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-005-01(AT-004-02，△nagE::fKanrf)。
(3)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-005-02(AT-004-02，△nagE)。
实施例2
本实施例描述了N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶(NanE)的基因nanE的克隆和大肠杆菌中转化nanE/pTrc99A质粒，以及ptrc-nanE基因盒向大肠杆菌染色体中的整合。
1、nanE基因的克隆、在大肠杆菌中转化nanE/pTrc99A质粒及其对N乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
扩增Escherichia coli NanE(N-acetylmannosamine-6-phosphate epimerase，N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶)的基因nanE，置于Trc启动子控制下转化菌种，使之过量表达，能够加强N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸(ManNAc-6-P)转化为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)。
1)大肠杆菌nanE基因的克隆
根据NCBI查找U00096，获得Escherichia coli nanE基因核苷酸序列SEQ IDNo.16，其氨基酸序列SEQ ID No.17。
设计引物：正向引物(nanE-F)SEQ ID No.18，反向引物(nanE-R)SEQ ID No.19。
模板：AT-001(Escherichia coli ATCC 27325)基因组。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物大小：690bp。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
将所获得的PCR扩增片段和pUC57-T载体连接并测序鉴定，获得nanE/pUC57。
2)将nanE基因置于Trc启动子控制下的质粒构建及转化
①质粒构建：扩增质粒nanE/pUC57，分别用Nco I和HindIII酶切质粒nanE/pUC57和载体pTrc99A，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收nanE片段和pTrc99A片段，用T4 DNA连接酶，16℃将连接过夜，并鉴定，得到nanE/pTrc99A质粒。
②感受态制备：首先，将保存于-20℃的AT-005-02菌液，按1:50-100接种于10mlLB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
③质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl nanE/pTrc99A质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。得到重组菌nanE/pTrc99A(AT-005-02)
3)nanE/pTrc99A质粒转化对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
将重组菌nanE/pTrc99A(AT-005-02)和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。LB液体培养基成分：5g/l酵母粉,10g/l蛋白胨,10g/l NaCl。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
①N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量的HPLC法测定
缓冲液：将3.5g磷酸氢二钾加入1L容量瓶中，加水足以溶解，加0.25mL氨水，再加水稀释混匀，用磷酸调pH到7.5，以水定容。
流动相：乙腈：缓冲液(75:25)。
稀释液：乙腈和水(50:50)。
标准溶液：1.0mg/mL USP N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准品(RS)溶于稀释液中。
样品溶液：1.0mg/mL N-乙酰-D-氨基葡萄糖样品溶于稀释液中。
液相条件：
型号：LC
检测器：UV 195nm
色谱柱：4.6-mm×15-cm；3-μm packing L8
流速：1.5ml/min
柱温：35℃
进样体积：10μL
②M9培养液的配制
先配制5×M9培养基：将在约800ml双蒸水(ddH2O)中加入64g Na2HPO4·7H2O、15gKH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl，溶解后，加水至1000ml。121℃灭菌30分钟。再分别配制1MMgSO4、1M CaCl2、20％葡萄糖，并单独灭菌。然后按表1配制M9培养液，其中，1000×微量元素溶液按表2配制。
表1.M9培养液成分
成分 用量(ml/L)
5×M9 200
1M MgSO<sub>4</sub> 2
1M CaCl<sub>2</sub> 0.1
20％葡萄糖 20
1000×微量元素溶液 1
ddH<sub>2</sub>O 至1000
pH 6.9
表2.1000×微量元素溶液成分
成分 用量(g/L)
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.01
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.01
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.033
Fe SO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.50
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.38
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.01
NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.01
pH 3
③nanE/pTrc99A质粒转化对摇瓶发酵N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
摇瓶发酵产量情况见表3。结果表明：对照菌种AT-005-02产量很低，未检出，而nanE基因在Trc启动子控制下过量表达的重组菌nanE/pTrc99A(AT-005-02)产量明显提高。
表3.重组菌nanE/pTrc99A(AT-005-02)摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-005-02(AT-004-02，△nagE)(对照) 未检出
nanE/pTrc99A(AT-005-02) 1.3±0.3
2、pTrc-nanE基因盒向大肠杆菌染色体中整合
以nagE基因位点为pTrc-nanE基因盒在染色体上的整合位点。为达到pTrc-nanE基因盒向大肠杆菌染色体中的整合，首先，扩增带Trc启动子的nanE片段pTrc-nanE，以及两侧带有FLP重组酶识别位点(FRT位点)的卡拉霉素抗性基因片段：FRT-Kanr-FRT(fKanrf)，并拼接。然后，再一次设计删除nagE基因序列同源臂的引物，并以pTrc-nanE和fKanrf拼接的片段为模板，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
具体操作过程如下：
(1)PCR扩增pTrc-nanE片段
模板：nanE/pTrc99A。
设计引物：正向引物(Trcff-F)SEQ ID No.20，反向引物(Trcff-R)SEQ ID No.21。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
产物大小：0.86kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(2)PCR扩增fKanrf片段
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(3)扩增与pTrc-nanE对接的fKanrf
设计引物：正向引物(fKanf-F)SEQ ID No.22，反向引物(fKanf-R)SEQ ID No.23。
模板：fKanrf。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
二次扩增的fKanrf大小：1.3kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(4)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：再一次设计删除nagE基因序列同源臂的正向引物(nagEKO-F2)SEQ ID No.24，反向引物(nagEKO-R2)SEQ ID No.25。
模板：pTrc-nanE PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+pTrc-nanE-fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(5)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-004-02菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46Escherichia coli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(4)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-030-01(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanE-fKanrf)。
(6)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-030-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanE)。
3、pTrc-nanE基因盒整合对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
将在染色体nagE基因位点上整合有pTrc-nanE基因盒的重组菌AT-030-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表4。结果表明：对照菌种AT-001、AT-005-02产量很低，未检出，而pTrc-nanE基因盒整合重组菌产量明显提高，且较未整合的重组菌nanE/pTrc99A(AT-005-02)产量亦有明显提高。
表4.pTrc-nanE基因盒整合重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-001(对照) 未检出
AT-005-02(AT-004-02，△nagE)(对照) 未检出
nanE/pTrc99A(AT-005-02) 1.2±0.3
AT-030-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanE) 2.5±0.5
实施例3
本实施例描述筛选突变的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶(NanE)的基因，所述基因编码酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶。
为了进一步提高生产菌株中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成量，筛选编码具有酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶的基因突变体。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因，以便在PCR产物中得到高频突变。
具体操作过程如下：
1、易错PCR扩增大肠杆菌N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶基因nanE
利用Taq DNA聚合酶不具有3'-5'校对功能的性质，在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中，dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L；dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库；模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。
易错PCR反应体系(50μl)：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，正向引物(nanE-F，SEQ ID No.18)1μl，反向引物(nanE-R，SEQ ID No.19)1μl，DNA模板(nanE/pUC57)0.1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，ddH2O 32.4μl。
PCR程序：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45个循环；最后75℃延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物(产物大小：0.7kb)；取5μl产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。
2、构建N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶的基因突变体库
将上述PCR产物经限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切消化后，与用Nco I和Hind III内切酶消化的pTrc99A质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌AT-005-02，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。
3、筛选高酶活突变体
从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆350株，以野生型NanE/pTrc99A(AT-005-02)为对照，分别接种至含50μg/mL青霉素(Amp)的5ml LB培养基中，37℃、150rpm培养18h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4℃下重悬于1ml PBS(pH值7.5，10mmol/L)溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min，离心取上清作为酶粗提液，进行酶活测定。
N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶的活性检测：以N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸(ManNAc-6-P)转化为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)多少为依据，也就是N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸减少为测定标记。酶活单位定义：在酶促反应条件下，每分钟减少相当于1μmol N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸所需的酶量，定义为一个酶活力单位(IU)。具体操作如下：首先，制备作为底物的同位素标记的ManNAc-6-P。配制总体积225ul反应液，含ManNAc激酶(NanK)粗酶液(含1-5mg蛋白)，20mM ATP二钠盐,60mM Tris-HCl,pH8.1，20mMMgCl2和5mM ManNAc，50nCi[14C]ManNAc。37℃下孵育30min。加350ul乙醇终止反应。产物用水洗脱，冻干。其次，制备总体积26.5ul反应液为酶活测定体系，其中含1mM同位素标记的ManNAc-6-P，37mM Tris-HCl，pH 8.0和19mM MgCl2。37℃下，孵育30min后，反应液煮3min，然后加0.1体积的碱性磷酸酶缓冲液调节pH和20单位碱性磷酸酶。37℃下，孵育1小时后，取样品加入干层析纸上，用1％四硼酸钠预浸。所用溶剂体系为醋酸乙脂：异丙醇：吡啶：水(50：22：14：14)。带放射性化合物用纸色谱分离。用液相闪烁计数仪测定其放射性强度，根据ManNAc-6-P转化为GlcNAc-6-P的多少，计算N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶的活性单位。
结果表明：最高突变体菌株的酶活为72IU/ml，对照菌株的酶活为9.5IU/ml。通过易错PCR对NanE进行改造，获得酶活力大大提高的突变株。挑选该酶活性最高的突变体菌株，提取质粒测序。结果表明：该N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶突变体基因序列如SEQID No.26所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示。与野生型的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶基因序列比对，共发生了3处碱基点突变：198C/T，397T/C，559T/C；致氨基酸2处错义突变，其突变点分别为：C133R(第133位半胱氨酸变为精氨酸)，Y187H(第187位酪氨酸变为组氨酸)。将该突变基因命名为nanEM。
4、pTrc-nanEM基因盒向大肠杆菌染色体nagE基因位点上整合
以nagE基因位点为pTrc-nanEM基因盒在染色体上的整合位点。为达到pTrc-nanEM基因盒向大肠杆菌染色体中的整合，首先，扩增带Trc启动子的nanEM片段pTrc-nanEM，以及两侧带有FLP重组酶识别位点(FRT位点)的卡拉霉素抗性基因片段：FRT-Kanr-FRT(fKanrf)，并拼接。然后，再一次设计删除nagE基因序列同源臂的引物，并以pTrc-nanEM和fKanrf拼接的片段为模板，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
具体操作过程如下：
(1)PCR扩增pTrc-nanEM片段
模板：nanEM/pTrc99A。
设计引物：正向引物(Trcff-F)SEQ ID No.20，反向引物(Trcff-R)SEQ ID No.21。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
产物大小：0.86kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(2)PCR扩增fKanrf片段
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(3)扩增与pTrc-nanEM对接的fKanrf
设计引物：正向引物(fKanf-F)SEQ ID No.22，反向引物(fKanf-R)SEQ ID No.23。
模板：fKanrf。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
二次扩增的fKanrf大小：1.3kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(4)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：再一次设计删除nagE基因序列同源臂的正向引物(nagEKO-F2)SEQ ID No.24，反向引物(nagEKO-R2)SEQ ID No.25。
模板：pTrc-nanEM PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+pTrc-nanEM-fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(5)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-004-02菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46Escherichia coli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(4)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-031-01(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanEM-fKanrf)。
(6)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-031-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanEM)。
5、pTrc-nanEM基因盒整合对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
将在染色体nagE基因位点上整合有pTrc-nanEM基因盒的重组菌AT-031-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表5。结果表明：对照菌种AT-005-02产量很低，未检出，突变的pTrc-nanEM基因盒整合重组菌AT-031-02产量明显提高，且较未突变的对照菌种AT-030-02产量亦有明显提高。
表5.pTrc-nanEM基因盒整合重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-005-02(AT-004-02，△nagE)(对照) 未检出
AT-030-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanE) 2.6±0.5
AT-031-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-nanEM) 5.9±0.8
以上结果显示：不仅N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶超表达可明显提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，通过易错PCR技术筛选突变体也可大大提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，这是由于所获得的该异构酶突变体酶活性增加所致。
实施例4
本实施例描述整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株，其中将氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的基因glmS和/或D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)的基因nagB的内源性天然启动子更换和/或删除对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。
1、将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，进一步删除glmS基因内源性天然启动子，对整合有pTrc-NanEM盒的大肠杆菌菌株N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。
(1)将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子
将nag调节子(nagE-nagBACD)中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(D-glucosamine-6-phosphate deaminase，NagB)基因启动子删除，更换成Trc启动子。D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(D-Glucosamine-6-phosphate deaminase，NagB)所催化的反应是可逆的，过量表达nagB，加快NagB的正向催化反应，达到增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN-6-P)目的。
首先，扩增Trc启动子片段与fKanrf片段，并拼接。然后，设计同源臂引物，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
a)扩增Trc启动子序列
根据公开信息，查得Trc启动子序列：SEQ ID No.28。
设计引物：正向引物(KanTrcRed-F)SEQ ID No.29，反向引物(KanTrcRed-R)SEQID No.30。
模板：pTrc99A
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
产物大小：166bp。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
b)扩增两侧带有FLP重组酶识别位点(FRT位点)的卡拉霉素抗性基因：fKanrf
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
c)扩增与Trc启动子对接的fKanrf
设计引物：正向引物(fKanfRed-F1)SEQ ID No.31，反向引物(fKanfRed-R1)SEQID No.32。
模板：fKanrf。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
二次扩增的fKanrf大小：1.3kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
d)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，Escherichia coli str.K-12nagB启动子序列和nagE基因序列SEQ ID No.13，设计删除nagB启动子同源臂的正向引物(nagBKO-F1)SEQ ID No.33，反向引物(nagBKO-R1)SEQ ID No.34。
模板：Trc启动子PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+Trc启动子+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
e)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-031-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-032(AT-031-02，△nagB promotor::Trc promoter)。
(2)删除glmS基因内源性天然启动子
删除氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase，glmS)基因启动子序列。氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)又称L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶(L-glutamine：D-fructose-6-phosphate aminotransferase)，能够催化葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)氨基化为D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN-6-P)，但有严重的产物抑制问题，将其启动子序列删除，使该酶丧失表达，可解除GlcN-6-P的产物抑制。
首先，扩增fKanrf片段，然后，设计同源臂引物，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段
1)扩增两侧带有FLP重组酶识别位点(FRT位点)的卡拉霉素抗性基因：fKanrf
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
2)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，Escherichia coli str.K-12L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶(GlmS)基因启动子序列SEQ ID No.35，设计glmS基因启动子序列删除的同源臂正向引物(ProglmsKO-F)SEQ ID No.36，反向引物(ProglmsKO-R)SEQ IDNo.37。
模板：fKanrf PCR片段。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
3)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-032菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-033(AT-032，△glmS promotor)。
(3)将nagB启动子更换为更高表达水平的启动子及进一步删除glmS启动子对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
对整合有pTrc-nanEM盒的菌株，将nagB启动子更换为更高表达水平的启动子，以及进一步删除glmS启动子的重组菌做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表6。结果表明：将nagB启动子更换为Trc启动子的重组菌对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量明显增加，进一步删除glmS启动子后N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量有更大提高。
表6.更换nagB启动子以及进一步删除glmS启动子的重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-031-02(对照) 6.0±0.9
AT-032(AT-031-02，△nagB promotor::Trc promoter) 9.3±0.9
AT-033(AT-032，△glmS promotor) 12.0±1.1
2、将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子，进一步删除nagB基因内源性天然启动子，对整合有pTrc-NanEM盒的大肠杆菌菌株N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。
(1)将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子
将L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶(L-glutamine：D-fructose-6-phosphateaminotransferase)基因启动子序列更换为Trc启动子序列。L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶又称氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase，GlmS)，将其启动子序列更换为Trc启动子序列，可过量表达glmS，加快GlmS催化功能，达到增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN-6-P)目的。
首先，扩增Trc启动子序列片段与fKanrf片段，并拼接。然后，设计同源臂引物，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
1)扩增Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据glmS基因启动子序列SEQ ID No.35，设计更换为Trc启动子的同源臂正向引物(ProglmspTrc-F)SEQ ID No.38，反向引物(ProglmspTrc-R)SEQ IDNo.39。
模板：Trc启动子PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+Trc启动子+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-031-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-034(AT-031-02，△glmS promotor::Trc promoter)。
(2)删除NagB基因内源性天然启动子
将nag调节子(nagE-nagBACD)中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(D-glucosamine-6-phosphate deaminase，NagB)基因启动子序列删除，使nagB失去功能，可消除NagB逆向催化功能，减少GlcN-6-P生成Glc-6-P。
首先，扩增fKanrf片段，然后，设计同源臂引物，制备Red重组打靶用线性DNA全长片段。
1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据nagB启动子和nagE基因序列SEQ ID No.13，设计删除nagB启动子序列的同源臂正向引物(NagBKO-F2)SEQ ID No.40，反向引物(NagBKO-R2)SEQ IDNo.41。
模板：fKanrf PCR片段
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-034菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-035(AT-034，△nagB promotor)。
(3)将glmS启动子更换为更高表达水平的启动子及进一步删除nagB启动子对N-乙酰氨基葡萄糖产量的影响
对整合有pTrc-nanEM盒的菌株，将glmS启动子更换为更高表达水平的启动子，以及进一步删除nagB启动子的重组菌做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表7。结果表明：将glmS启动子更换为Trc启动子的重组菌对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量增加效果不明显，但同时删除nagB启动子后N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量较对照菌种有明显提高。
表7.更换glmS启动子以及进一步删除nagB启动子的重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-031-02(对照) 5.9±1.0
AT-034(AT-031-02，△glmS promotor::Trc promoter) 6.2±1.1
AT-035(AT-034，△nagB promotor) 9.9±1.0
实施例5
本实施例描述整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株，其中过量表达UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因wecB及其对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。
将大肠杆菌UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶(UDP-N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase，WecB)基因wecB，置于Trc启动子控制下转化菌种，或将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，使之过量表达，可加强UDP-GlcNAc(UDP-N-acetyl glucosamine，UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖)变成ManNAc(N-Acetyl-D-mannosamine，N-乙酰-D-氨基甘露糖或N-乙酰-D-甘露糖胺)。
1、用wecB/pTrc99A质粒转化整合有pTrc-NanEM盒的大肠杆菌株菌
(1)扩增大肠杆菌wecB基因，并插入pTrc99A
根据NCBI查找大肠杆菌wecB基因核苷酸序列SEQ ID No.42，其氨基酸序列SEQ IDNo.43。
设计引物：正向引物(TrcwecB-F)SEQ ID No.44，反向引物(TrcwecB-R)SEQ IDNo.45。
模板：AT-001(Escherichia coli ATCC 27325)基因组。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物大小：1.13Kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
将所获得的PCR扩增片段和载体pTrc99A分别用Nco I和Hind III酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收wecB片段和pTrc99A片段，用T4DNA连接酶，16℃连接过夜，并鉴定，得到wecB/pTrc99A质粒。
(2)用wecB/pTrc99A质粒转化整合有pTrc-NanEM盒的大肠杆菌菌株
(1)感受态制备：首先，将保存于-20℃重组菌AT-031-02菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
(2)质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl wecB/pTrc99A质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性克隆备用。
所获得菌种编号：AT-036(AT-031-02，wecB/pTrc99A)。
2、将整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌中，wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子
首先，扩增Trc启动子序列片段与fKanrf片段，并拼接。然后，设计同源臂引物，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
(1)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，获得Escherichia coli UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶(wecB)基因启动子的核苷酸序列SEQ ID No.46，设计更换为Trc启动子的同源臂正向引物(ProwecBpTrc-F)SEQ ID No.47，反向引物(Pro wecBpTrc-R)SEQ IDNo.48。
模板：Trc启动子PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+fKanrf+Trc启动子+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(2)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-031-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-037(AT-031-02，△wecB promotor::Trc promoter)。
3、整合有pTrc-NanEM盒的重组菌，转化有wecB/pTrc99A质粒和更换wecB启动子为Trc启动子对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。
对整合有pTrc-nanEM盒的菌株，过量表达wecB的菌株(包括转化有wecB/pTrc99A的菌株和更换wecB启动子为Trc启动子)产生的重组菌，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的M9培养液250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表8。结果表明：与对照菌种AT-031-02相比，转化wecB/pTrc99A质粒对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量有明显提高，更换wecB启动子为Trc启动子的重组菌对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量有更大的提高。
表8.转化wecB/pTrc99A质粒或更换wecB启动子为Trc启动子的重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-031-02(对照) 6.0±1.0
AT-036(AT-031-02，wecB/pTrc99A) 10.3±1.1
AT-037(AT-031-02，△wecB promotor::Trc promoter) 13.2±1.1
实施例6
本实施例描述整合有pTrc-nanEM盒，并将glmS基因和nagB基因的内源性天然启动子更换和/或删除的大肠杆菌菌株，转化wecB/pTrc99A质粒或将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
1、对整合有pTrc-nanEM盒，并将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除glmS基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株，转化wecB/pTrc99A质粒
制备感受态，将wecB/pTrc99A质粒用CaCl2转化法转化到整合有pTrc-NanEM盒，并将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除glmS基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株AT-033中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-038(AT-033，wecB/pTrc99A)。
2、对整合有pTrc-nanEM盒，并将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除glmS基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株，将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-033菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-039(AT-033，△wecB promotor::Trc promoter)。
3、对整合有pTrc-nanEM盒，并将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除nagB基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株，转化wecB/pTrc99A质粒
制备感受态，将wecB/pTrc99A质粒用CaCl2转化法转化到整合有pTrc-nanEM盒，并将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除nagB基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株AT-035中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-040(AT-035，wecB/pTrc99A)。
4、对整合有pTrc-nanEM盒并将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除nagB基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株，将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-035菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
所获得菌种编号：AT-041(AT-035，△wecB promotor::Trc promoter)。
5、整合有pTrc-nanEM盒，并将nagB基因和glmS基因的内源性天然启动子更换和/或删除的大肠杆菌菌株，转化wecB/pTrc99A质粒和将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
对整合有pTrc-nanEM盒，并将glmS基因和nagB基因的内源性天然启动子更换和/或删除后，并转化wecB/pTrc99A质粒或将wecB基因内源性天然启动子更换为Trc启动子，所形成的不同基因型重组菌，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表9。结果表明：与对照菌种AT-033或AT-035相比，转化wecB/pTrc99A质粒使得N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量有明显提高，更换wecB启动子为Trc启动子的重组菌对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量有更大的提高。
表9.转化wecB/pTrc99A质粒或更换wecB启动子为Trc启动子的重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-033(对照) 12.1±1.1
AT-038(AT-033，wecB/pTrc99A) 17.3±1.4
AT-039(AT-033，△wecB promotor::Trc promoter) 21.6±1.8
AT-035(对照) 10.1±1.1
AT-040(AT-035，wecB/pTrc99A) 16.8±1.3
AT-041(AT-035，△wecB promotor::Trc promoter) 20.6±1.5
实施例7
本实施例描述以10L发酵罐生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵试验
以重组工程菌株AT-039作为生产菌种，以10L发酵罐做生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵试验。
1、种子培养
(1)一级种子培养：挑取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于8ml的LB液体培养基中，37℃、225rpm培养8小时。
(2)二级种子培养：取6ml一级种子培养液，接种于含200ml的M9培养液的1000ml摇瓶中，37℃、225rpm培养16小时。至OD600值为6.0-10，约为对数生长中期。
(3)发酵培养基按表10配制，其中，微量元素溶液按表11配制，复合维生素溶液按表12配制。
表10.发酵培养基
成分 用量(/L)
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.30g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.00g
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.10g
NH<sub>4</sub>Cl 0.02g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 0.20g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.60g
聚醚类消泡剂 10ml
微量元素溶液 4ml
复合维生素溶液 4ml
葡萄糖 6.00g
注：
①微量元素溶液单独灭菌后加入，维生素溶液过滤后加入；
②葡萄糖：浓度65％(w/v)，单独灭菌，在接种前加入，葡萄糖加入量：6.0g/L；
③以上合并一起后，用10M NH4OH调pH至7.0；
④发酵培养基在加入葡萄糖之前为基础培养基，基础培养基的初始装液量(培养基的初始体积占发酵罐总容量体积)：50％。
表11.微量元素溶液
Figure BDA0001262629800000461
Figure BDA0001262629800000471
表12.复合维生素溶液
成分 用量(mg/L)
叶酸folic acid 2
维生素B<sub>2</sub> riboflavin 100
维生素B<sub>1</sub> thiamine HCl 1500
烟酸nicotinic acid 500
维生素B<sub>6</sub> pyridoxine HCl 500
泛酸钙Ca-panthothenate 500
生物素biotin 1
维生素B<sub>12</sub> vitamin B<sub>12</sub> 10
2、接种
将二级种子液按40ml/L接种至发酵罐，接种量：2.5-5％(以体积计)，起始OD600为0.3-0.5。
3、工艺参数
利用10L自控发酵罐进行高密度发酵，以机带软件对其进行数据采集，实现计算机在线控制。控制参数为：空气流量按0.5-1vvm.；溶氧≥20％，以增加转速和通气调节；温度37℃；pH值7.0，自动流加饱和氨水以保持恒定。在基础培养基中葡萄糖消耗完，即溶氧回升时开始补糖。补糖速度以控制残糖浓度0.45g/L以下为标准。补糖液葡萄糖为浓度65％(w/v)，并加入2.5％葡萄糖酸钠或6％核糖。60-72h发酵中止。总装液量：75-80％。
4、实例(10L发酵罐)
(1)菌种编号：AT-039。批号：00123。
(2)种子液浓度：OD600为2.8。
(3)基料：4L。
(4)接种量200mL。
(5)补糖速度：控制残糖浓度0.45g/L以下。
(6)补糖液：葡萄糖为浓度65％(w/v)并加入2.5％葡萄糖酸钠。
(7)跟踪指标：检测OD600、残糖含量(发酵液中残存葡萄糖)。
(8)产物：N-乙酰-D-氨基葡萄糖。效价：72小时127.0g/L。
实施例8
本实施例描述N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖盐酸盐分离纯化后处理工艺
1、N-乙酰-D-氨基葡萄糖精制
(1)灭活：发酵液80℃，30min。
(2)固液分离：4000-8000rpm离心，弃菌渣与蛋白，取发酵液。也可以用陶瓷膜过滤。
(3)脱色：产品：水：活性炭＝1：(1.5-3)：(0.01-0.1)，搅拌0.5-5h。
(4)除盐：电渗析除盐。浓室罐装入发酵液初始盐浓度：0.01-0.05mol/L。淡室发酵液流速：40-80L/h，浓室发酵液流速：40-80L/h，单膜对的电压0.5-1.4V。也可以采用阴、阳离子交换树脂除盐。
(5)浓缩：将除盐后发酵液真空条件下(0.095MPa)加热50-80℃，浓缩8-15h，至过饱和，约4-6倍。
(6)结晶：浓缩后的发酵液先25℃水降温至25-35℃，再用0℃水降温1-3h，至0-10℃。加无水乙醇(用量为产品重量5-20倍)，700-1500rpm搅拌15min-1h。
(7)洗涤：加无水乙醇(与产品等量)搅拌10-100rpm，0.5-2h。
(8)烘干：50-100℃，3-10h。纯度：99.96％。总产率为91.5％。
2、D-氨基葡萄糖盐酸盐精制
(1)灭活：发酵液80℃，30min。
(2)固液分离：4000-8000rpm离心，弃菌渣与蛋白，取发酵液。也可以用陶瓷膜过滤。
(3)脱色：产品：水：活性炭＝1：(1.5-3)：(0.01-0.1)，搅拌0.5-5h。
(4)除盐：电渗析除盐。浓室罐装入发酵液初始盐浓度：0.01-0.05mol/L。淡室发酵液流速：40-80L/h，浓室发酵液流速：40-80L/h，单膜对的电压0.5-1.4V。也可以采用阴、阳离子交换树脂除盐。
(5)浓缩：将除盐后发酵液真空条件下(0.095MPa)加热50-80℃，浓缩8-15h，至过饱和，约4-6倍。
(6)水解：浓缩后的发酵液转入搪瓷或玻璃容器中，加入浓盐酸(37％)至终浓度为12-16％，搅匀，70℃保温90min。盐酸可循环套用。
(7)结晶：先25℃水降温至25-35℃，再用0℃水降温1-3h，至4℃。
(8)洗涤：加无水乙醇(与产品等量)搅拌10-100rpm，0.5-2h。离心700-1500rpm，15-60min，得氨基葡萄糖盐酸盐，转化率为89.7％。
(9)溶解：洗涤后的产品溶于水中，水用量约为原发酵液体积。
(10)脱色：加入活性炭(用量为1％)。混合30分钟后。离心700-1500rpm，15-60min。或过滤，得到无色滤液。
(11)重结晶：在50℃与55cmHg真空中对滤液进行真空蒸发至过饱和。加无水乙醇(用量为产品重量5-20倍)，700-1500rpm搅拌15min-1h。
(12)洗涤：加无水乙醇(与产品等量)搅拌10-100rpm，0.5-2h。离心700-1500rpm，15-60min。
(13)烘干：50-100℃，3-10h。纯度：99.92％。总产率为84.3％。
实施例9
本实施例描述筛选突变的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶(WecB)的基因，所述基因编码酶活性增加的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶。
为了进一步提高生产菌株中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成量，筛选编码具有酶活性增加的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶的基因突变体。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因，以便在PCR产物中得到高频突变。
具体操作过程如下：
1、易错PCR扩增大肠杆菌UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶基因wecB
利用Taq DNA聚合酶不具有3'-5'校对功能的性质，在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中，dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L；dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库；模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。
易错PCR反应体系(50μl)：10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，MgCl2(2.5mM)5μl，正向引物(TrcwecB-F，SEQ ID No.44)1μl，反向引物(TrcwecB-R，SEQ IDNo.45)1μl，DNA模板(wecB/pUC57)0.1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，ddH2O 32.4μl。
PCR程序：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45个循环；最后75℃延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物(产物大小：1.13kb)；取5μl产物1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。
2、构建UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶的基因突变体库
将上述PCR产物经限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切消化后，与用Nco I和Hind III内切酶消化的pTrc99A质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌AT-005-02，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。
3、筛选高酶活突变体
从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆640株，以野生型WecB/pTrc99A(AT-005-02)为对照，分别接种至含50μg/mL青霉素(Amp)的5ml LB培养基中，37℃、150rpm培养18h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4℃下重悬于1ml PBS(pH值7.5，10mmol/L)溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min，离心取上清作为酶粗提液，进行酶活测定。
UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶的活性检测：以UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖转化为N-乙酰-D-氨基甘露糖多少为依据。也就是UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖减少为测定标记。酶活单位定义：在酶促反应条件下，每分钟减少相当于1μmol UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位(IU)。具体操作如下：以20ml反应体系为酶活测定体系，其中含45mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)、10mM MgCl2 and 100 nCi of UDPGlcNAc及5mg粗酶液。酶活反应在37℃水浴中进行孵育30min。加乙醇终止反应。带放射性化合物用纸色谱分离。用液相闪烁计数仪测定其放射性强度。所用溶剂体系为正丙醇：1M醋酸钠，pH 5.0：水(7：1：2)。根据UDPGlcNAc转化为ManNAc的多少，计算UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶的活性单位。
结果表明：最高突变体菌株的酶活为653IU/ml，对照菌株的酶活为21.0IU/ml。通过易错PCR对WecB进行改造，获得酶活力大大提高的突变株。挑选该酶活性最高的突变体菌株，提取质粒测序。结果表明：该UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶突变体基因序列如SEQID No.49所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.50所示。与野生型的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶基因序列比对，共发生了5处碱基点突变：101G/C，433C/G，677G/T，734T/G，1038T/C；致氨基酸4处错义突变，其突变点分别为：C34S(第34位半胱氨酸变为丝氨酸)，H145D(第145位组氨酸变为天冬氨酸)，C226F(第226位半胱氨酸变为苯丙氨酸)，V245G(第245位缬氨酸变为甘氨酸)。将该突变基因命名为wecBM。
4、pTrc-wecBM基因盒向大肠杆菌染色体nagE基因位点上整合
以nagE基因位点为pTrc-wecBM基因盒在染色体上的整合位点。为达到pTrc-wecBM基因盒向大肠杆菌染色体中的整合，首先，扩增带Trc启动子的wecBM片段pTrc-wecBM，以及两侧带有FLP重组酶识别位点(FRT位点)的卡拉霉素抗性基因片段：FRT-Kanr-FRT(fKanrf)，并拼接。然后，再一次设计删除nagE基因序列同源臂的引物，并以pTrc-wecBM和fKanrf拼接的片段为模板，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。
具体操作过程如下：
(1)PCR扩增pTrc-wecBM片段
模板：wecBM/pTrc99A。
设计引物：正向引物(Trcff-F)SEQ ID No.20，反向引物(Trcff-R)SEQ ID No.21。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
产物大小：1.3kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(2)PCR扩增fKanrf片段
设计引物：正向引物(mfKanf-F)SEQ ID No.1，反向引物(mfKanf-R)SEQ ID No.2。
模板：pPic9K。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQ ID No.3。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(3)扩增与pTrc-wecBM对接的fKanrf
设计引物：正向引物(fKanf-F)SEQ ID No.22，反向引物(fKanf-R)SEQ ID No.23。
模板：fKanrf。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
二次扩增的fKanrf大小：1.3kb。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。
(4)制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段
设计同源臂引物：再一次设计删除nagE基因序列同源臂的正向引物(nagEKO-F2)SEQ ID No.24，反向引物(nagEKO-R2)SEQ ID No.25。
模板：pTrc-wecBM PCR片段和二次扩增的fKanrf PCR片段，1：1混合。
PCR反应条件：第一步：94℃变性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环30次；第三步：72℃延伸10min。
扩增产物：同源臂+pTrc-wecBM-fKanrf+同源臂。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到100ng/μl的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。
(5)Red重组操作
首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。
1)转化pKD46质粒
①感受态制备：首先，将保存于-20℃的Escherichia coli AT-004-02菌液，按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中，37℃，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入10ml离心管中，4000g×5min，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮5min。最后，4000g×5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1M CaCl2 5ml悬浮。-4℃静置12小时，自然沉降。
②质粒转化：取自然沉降的菌体250μl，加入5μl pKD46质粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30℃摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆，加入5ml LB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。
2)电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆
①电转感受态的制备：将含pKD46 Escherichia coli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素(Amp)LB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1％的量接种至含有Amp的LB培养基中，30℃培养，待OD600达到0.2左右后，加入0.2％的L-阿拉伯糖，30℃诱导35分钟，直至OD600达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10％甘油洗两次，最后用10％甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。
②电击转化：将2mm电转杯从70％乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4℃预冷30分钟。取90μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl(100ng以上)步骤(4)得到的全长PCR片段(线性DNA)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω，25μF。
③复苏与筛选阳性克隆：加入1ml的LB液体培养基，37℃，100rpm，1小时。然后每200μl涂布一个卡拉霉素(Kan)平板，一共5个。均匀、涂干。30℃培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。
所获得菌种编号：AT-043-01(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecBM-fKanrf)。
按照上述相同的方法，制备菌种AT-042-01(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecB-fKanrf)。
(6)抗性基因的消除
将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高到42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。
所获得菌种编号：AT-043-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecBM)。
按照上述相同的方法，制备菌种AT-042-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecB)。
5、pTrc-wecB、pTrc-wecBM基因盒整合对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响
将在染色体nagE基因位点上整合有pTrc-wecB、pTrc-wecBM基因盒的重组菌AT-042-02、AT-043-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3％接种于含50ml的发酵培养液(M9培养液)250ml摇瓶中。起始OD600约0.5，37℃下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10M NaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65％葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20g/L。发酵结束，取1ml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。
摇瓶发酵产量情况见表13。结果表明：对照菌种AT-005-02产量很低，未检出，突变的pTrc-wecBM基因盒整合重组菌AT-043-02产量明显提高，且较未突变的对照菌种AT-042-02产量亦有明显提高。
表13.pTrc-wecBM基因盒整合重组菌摇瓶发酵产量
菌种 N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量(g/L)
AT-005-02(AT-004-02，△nagE)(对照) 未检出
AT-042-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecB) 7.1±0.8
AT-043-02(AT-004-02，△nagE::pTrc-wecBM) 10.9±0.9
以上结果显示：不仅UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶超表达可明显提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，通过易错PCR技术筛选突变体也可大大提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，这是由于所获得的该异构酶突变体酶活性增加所致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序 列 表
<110> 孙镧
<120> 微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法
<150> CN201610208203.9
<160> 50
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtaaaacgac ggccagtgga agttcctata ctttctagag aataggaact tcctcgtgaa 60
gaaggtgttg 70
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaaacagct atgaccatgc ctattccgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt 60
ctgttacatt gcacaagata 80
<210> 3
<211> 1283
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtaaaacgac ggccagtgga agttcctata ctttctagag aataggaact tcctcgtgaa 60
gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca gaaagtgagg 120
gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc 180
tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca 240
aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt 300
gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca 360
atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag 420
gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc 480
cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa 540
gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc ttatgcattt 600
ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa 660
ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa 720
aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa 780
caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttcccgggga 840
tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa 900
gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa 960
cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat 1020
agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag 1080
catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga atatggctca 1140
taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 1200
ttttatcttg tgcaatgtaa cagaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa 1260
taggcatggt catagctgtt tcc 1283
<210> 4
<211> 2699
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 4
gtgaccattg ctattgttat aggcacacat ggttgggctg cagagcagtt gcttaaaacg 60
gcagaaatgc tgttaggcga gcaggaaaac gtcggctgga tcgatttcgt tccaggtgaa 120
aatgccgaaa cgctgattga aaagtacaac gctcagttgg caaaactcga caccactaaa 180
ggcgtgctgt ttctcgttga tacatgggga ggcagcccgt tcaatgctgc cagccgcatt 240
gtcgtcgaca aagagcatta tgaagtcatt gcaggcgtta acattccaat gctcgtggaa 300
acgttaatgg cccgtgatga tgacccaagc tttgatgaac tggtggcact ggcagtagaa 360
acaggccgtg aaggcgtgaa agcactgaaa gccaaaccgg ttgaaaaagc cgcgccagca 420
cccgctgccg cagcaccaaa agcggctcca actccggcaa aaccaatggg gccaaacgac 480
tacatggtta ttggccttgc gcgtatcgac gaccgtctga ttcacggtca ggtcgccacc 540
cgctggacca aagaaaccaa tgtctcccgt attattgttg ttagtgatga agtggctgcg 600
gataccgttc gtaagacact gctcacccag gttgcacctc cgggcgtaac agcacacgta 660
gttgatgttg ccaaaatgat tcgcgtctac aacaacccga aatatgctgg cgaacgcgta 720
atgctgttat ttaccaaccc aacagatgta gagcgtctcg ttgaaggcgg cgtgaaaatc 780
acctctgtta acgtcggtgg tatggcattc cgtcagggta aaacccaggt gaataacgcg 840
gtttcggttg atgaaaaaga tatcgaggcg ttcaagaaac tgaatgcgcg cggtattgag 900
ctggaagtcc gtaaggtttc caccgatccg aaactgaaaa tgatggatct gatcagcaaa 960
atcgataagt aacgtattgt gttgattatc actcagtttt cacacttaag tcttacgtaa 1020
acaggagaag tacaatggag attaccactc ttcaaattgt gctggtattt atcgtagcct 1080
gtatcgcagg tatgggatca atcctcgatg aatttcagtt tcaccgtccg ctaatcgcgt 1140
gtaccctggt gggtatcgtt cttggggata tgaaaaccgg tattattatc ggtggtacgc 1200
tggaaatgat cgcgctgggc tggatgaaca tcggtgctgc agttgcgcct gacgccgctc 1260
tggcttctat catttctacc attctggtta tcgcaggtca tcagagcatt ggtgcaggta 1320
tcgcactggc aatccctctg gccgctgcgg gccaggtact gaccatcatc gttcgtacta 1380
ttaccgttgc tttccagcac gctgcggata aggctgctga taacggcaac ctgacagcga 1440
tttcctggat ccacgtttct tctctgttcc tgcaagcaat gcgtgtggct attccggccg 1500
tcatcgttgc gctgtctgtt ggtaccagcg aagtacagaa catgctgaat gcgattccgg 1560
aagtggtgac caatggtctg aatatcgccg gtggcatgat cgtggtggtt ggttatgcga 1620
tggttatcaa catgatgcgt gctggctacc tgatgccgtt cttctacctc ggcttcgtaa 1680
ccgcagcatt caccaacttt aacctggttg ctctgggtgt gattggtact gttatggcag 1740
tgctctacat ccaacttagc ccgaaataca accgcgtagc cggtgcgcct gctcaggcag 1800
ctggtaacaa cgatctcgat aacgaactgg actaacaggt gagcgaaatg gttgatacaa 1860
ctcaaactac caccgagaaa aaactcactc aaagtgatat tcgtggcgtc ttcctgcgtt 1920
ctaacctctt ccagggttca tggaacttcg aacgtatgca ggcactgggt ttctgcttct 1980
ctatggtacc ggcaattcgt cgcctctacc ctgagaacaa cgaagctcgt aaacaagcta 2040
ttcgccgtca cctggagttc tttaacaccc agccgttcgt ggctgcgccg attctcggcg 2100
taaccctggc gctggaagaa cagcgtgcta atggcgcaga gatcgacgac ggtgctatca 2160
acggtatcaa agtcggtttg atggggccac tggctggtgt aggcgacccg atcttctggg 2220
gaaccgtacg tccggtattt gcagcactgg gtgccggtat cgcgatgagc ggcagcctgt 2280
taggtccgct gctgttcttc atcctgttta acctggtgcg tctggcaacc cgttactacg 2340
gcgtagcgta tggttactcc aaaggtatcg atatcgttaa agatatgggt ggtggcttcc 2400
tgcaaaaact gacggaaggg gcgtctatcc tcggcctgtt tgtcatgggg gcattggtta 2460
acaagtggac acatgtcaac atcccgctgg ttgtctctcg cattactgac cagacgggca 2520
aagaacacgt tactactgtc cagactattc tggaccagtt aatgccaggc ctggtaccac 2580
tgctgctgac ctttgcttgt atgtggctac tgcgcaaaaa agttaacccg ctgtggatca 2640
tcgttggctt cttcgtcatc ggtatcgctg gttacgcttg cggcctgctg ggactgtaa 2699
<210> 5
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgaccattg ctattgttat aggcacacat ggttgggctg cagagcagtt gtaaaacgac 60
ggccagtg 68
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttacagtccc agcaggccgc aagcgtaacc agcgataccg atgacgaaga ggaaacagct 60
atgaccatg 69
<210> 7
<211> 1030
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 7
cacgctttgg tatgaaaatt gtagggtaca gatgcgttta tttcccctca cccggtaggg 60
gcgagcgagg ggaaacaact cacccgcgct cttgcatcaa ctgctgggcc agcgccttca 120
gttctggcag atatttttca tctaccggtc caaacggttt gcggcacagc ggcacagaaa 180
cgacatccat ataatggagg acagttttca ggccgcggaa tacgcccgtt ttgatcagta 240
aatcaatgac tttattgcat tcagtttgca gtttctgcgc ggtctggata tcgccttctt 300
tcagcgcctt aacgatcccc tgatagcgcc agcccatgat gttgtaggta ctgccgatac 360
caccatcagc gcccgccagc agaccagagg cgaagatttc gtcgtaaccg ttatagagca 420
caagatcagg atgttcacga cggatctgct ccatctgata gagatcgcca gaggtctgtt 480
tcagcgcacc tacgccaggc aatgtaacaa gtgtgttgat ctgatccagg gtcagtttta 540
ccccactcag ggctggaatg ttgtacacca ccatcggcaa accatccgcc gaatcaataa 600
ttgcccgata gtgatcgcag tgttcttcaa agctgaaagg atagtagaac ggcgtgacgg 660
cggagacggc atcgaagcca taacgtttag ccgatgccgc aagttgttgg ctttcggcgg 720
tgctgacgca accgacgtgg gcgatgagtt taatcttacc tttcgcctct tcggcgacga 780
tttccagtac ctgttcacgc tcggaaaggc tttgtacaaa ggcctcgccg gtcgaaccac 840
ccacgtataa accgtcgatg ccctgctgaa tattgaactg aaccaggcga cgcagactcg 900
ctttatccag tgcttgttgt tggtcaaaag gagtcaggag tgcagccatt acgccacgta 960
aattcgttgc cataaatacc tctgaagtga tgcttgtctg ataaacgata tacctttata 1020
cctgttatac 1030
<210> 8
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacgctttgg tatgaaaatt gtagggtaca gatgcgttta tttcccctca gtaaaacgac 60
ggccagtg 68
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtataacagg tataaaggta tatcgtttat cagacaagca tcacttcaga ggtatttgga 60
aacagctatg accatg 76
<210> 10
<211> 1200
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 10
tttaaaatcg ggggtcagaa tgtatgcatt aacccagggc cggatcttta ccggccacga 60
atttcttgat gaccacgcgg ttgttatcgc tgatggcctg attaaaagcg tctgtccggt 120
agcggaactg ccgccagaga tcgaacaacg ttcactgaac ggggccattc tctcccccgg 180
ttttatcgat gtgcagttaa acggctgcgg cggcgtacag tttaacgaca ccgctgaagc 240
ggtcagcgtg gaaacgctgg aaatcatgca gaaagccaat gagaaatcag gctgtactaa 300
ctatctgccg acgcttatca ccaccagcga tgagctgatg aaacagggcg tgcgcgttat 360
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gctgaatctg gtaaaaaaag gcacccataa tccgaatttt gtgcgtaagc ctgatgccgc 480
gctggtcgat ttcctgtgtg aaaacgccga cgtcattacc aaagtgaccc tggcaccgga 540
aatggttcct gcggaagtca tcagcaaact ggcaaatgcc gggattgtgg tttctgccgg 600
tcactccaac gcgacgttga aagaagcaaa agccggtttc cgcgcgggga ttacctttgc 660
cacccatctg tacaacgcga tgccgtatat taccggtcgt gaacctggcc tggcgggcgc 720
gatcctcgac gaagctgaca tttattgcgg tattattgct gatggcctgc atgttgatta 780
cgccaacatt cgcaacgcta aacgtctgaa aggcgacaaa ctgtgtctgg ttactgacgc 840
caccgcgcca gcaggtgcca acattgaaca gttcattttt gcgggtaaaa caatatacta 900
ccgtaacgga ctttgtgtgg atgagaacgg tacgttaagc ggttcatcct taaccatgat 960
tgaaggcgtg cgtaatctgg tcgaacattg cggtatcgca ctggatgaag tgctacgtat 1020
ggcgacgctc tatccggcgc gtgcgattgg cgttgagaaa cgtctcggca cactcgccgc 1080
aggtaaagta gccaacctga ctgcattcac acctgatttt aaaatcacca agaccatcgt 1140
taacggtaac gaggtcgtaa ctcaataaga gaaagtatga caccaggcgg acaagctcag 1200
<210> 11
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tttaaaatcg ggggtcagaa tgtatgcatt aacccagggc cggatcttta gtaaaacgac 60
ggccagtg 68
<210> 12
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgagcttgt ccgcctggtg tcatactttc tcttattgag ttacgacctc ggaaacagct 60
atgaccatg 69
<210> 13
<211> 2350
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 13
cgcatcaggc ataaagcaga ttactttttg atttcataca gcggtgtttg acccgccaca 60
atatggccct gagctttaat gatcaagcca ctgaaatcgt cgatattgct gcaaaccacc 120
gggctaatca tcgagcgggc gttagcgttc aggtaatcca gatccatttc cagaatcggt 180
tgccctgcgc ttacctgcgc accctcttcc accagacgtt taaagccttt accttccagc 240
gctacggtgt cgatacccat atggacgacg atctccgcgc ctttttcggt ttccaggcag 300
aacgcgtggt tggtgttgaa gattttcacg attgtccctg cggctggtga tacgacgatt 360
ttatctgtcg gtttcaccgc cacaccgtca cccaccgctt tgctggcgaa tgcttcgtca 420
ggaacctgat ccagtgccac gacatcaccg gtaatcggcg ataccagctc cgcgatagat 480
accgcgtttg gtacagcctg cggttttgct acaggcgcgg cagttgccgg agttgcttca 540
gctgacgcag cggctaccgg accacgggca acgactttct tcatcgcatc gccgatggat 600
tctgctttcg cgccaacaat cacctgaata gtctgtttgt tcagtttcac taccccagaa 660
gcacccagac gtttacacat cgtatcgtta acgcgggcag agtcagccac tgtaaggcgc 720
agacgggtga tacaggcgtc aatcgctttc aggttgtcag tgccgccaac cgcagcaata 780
tagttggttg ccagttgagt cagaccttct tcagtgttgc tgttggcttc ttcagtaacg 840
atctcgtctt ctttatcttc acgacccggc gttttcaggt tgaacatgcg gataaccaaa 900
ctgaacacca cgaagtagat agcgaagaag ataacgccca tcaccagcag catccagacg 960
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gcgtgcagga ggtacagcag cggagcaagg aacatgaaca ggaattccag cggctcagtc 1140
acaccggtca ggaacgcagt aacagcaaca gaaagcagca taccgccaac catcggacga 1200
cgctctttcg gtgctgcgaa gtacatcgcc agcgccgcac ccggcagacc gaacatcatg 1260
atcgggaaga agccggacat gaacatcccc gcggtgccgt caccggcata gaagcggtta 1320
atgtcaccgt ggaaaaccgt acccgccgcg ttggtgaatt caccaatctg gaaccaggcg 1380
atggtgttca gtacctgatg cagaccggtt gggatcagca gacggttgat gaaaccaaag 1440
ataccggaac ccagcgcgcc cgcagaaacg atccactcgc cgcctgcatg gatagcgtgc 1500
tgtaccggcg gccagacgta accaaaaatg gccgccagca ccaggcagaa gaatccggtg 1560
gcaatcggca caaagcgttt gccgccgaag aagctcagga agtccggcag tttaatatcg 1620
gaccaacggt tataggctgc gccaccaacc agaccggtaa tgatacccgc cagtacaccc 1680
atgttaattt ctgggttgat ggtcaccatc gctttggtta acacaaagta acctaccgca 1740
cccgccagcg ccgccgcacc agcgctgtct ttcgaccagc tggatgccac accgatggcg 1800
aagattaatg cgaggttatc aaaaatcgca ccgcccgcct gggcaataaa cgcaacgtta 1860
agtaaatctg gctgaccgaa tcgcagcaac agtgccgcca ccggcagcac cgcgataggg 1920
agctgtaacg ccctaccgag tcgctggaaa aaacctaaaa tattcatctt attcccccta 1980
cgagaaccct atttggctcg tttcaagccg tatttttatt ttgctgcaaa ttgtactgcc 2040
gatgttctgt aatcagattg ttagatcatc tgctacagag tgtgtgaaaa tttaattcgt 2100
atcgcaaatt aaacgcgtgt cttttgtgag ttttgtcacc aaatatcgtt attatcactc 2160
ccttttactg gctaaaccag aaaacttatt ttatcattca aaaaatcagg tcggattgac 2220
gcctgtctgc gcaaatccag gttacgctta aagatgccta atccgccaac ggcttacatt 2280
ttacttattg aggtgaataa tgagactgat ccccctgact accgctgaac aggtcggcaa 2340
atgggctgct 2350
<210> 14
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcatcaggc ataaagcaga ttactttttg atttcataca gcggtgtttg gtaaaacgac 60
ggccagtg 68
<210> 15
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agatgaatat tttaggtttt ttccagcgac tcggtagggc gttacagctg gaaacagcta 60
tgaccatg 68
<210> 16
<211> 690
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 16
atgtcgttac ttgcacaact ggatcaaaaa atcgctgcta acggtggcct gattgtctcc 60
tgccagccgg ttccggacag cccgctcgat aaacccgaaa tcgtcgccgc catggcatta 120
gcggcagaac aggcgggcgc ggttgccatt cgcattgaag gtgtggcaaa tctgcaagcc 180
acgcgtgcgg tggtgagcgt gccgattatt ggaattgtga aacgcgatct ggaggattct 240
ccggtacgca tcacggccta tattgaagat gttgatgcgc tggcgcaggc gggcgcggac 300
attatcgcca ttgacggcac cgaccgcccg cgtccggtgc ctgttgaaac gctgctggca 360
cgtattcacc atcacggttt actggcgatg accgactgct caacgccgga agacggcctg 420
gcatgccaaa agctgggagc cgaaattatt ggcactacgc tttctggcta taccacgcct 480
gaaacgccag aagagccgga tctggcgctg gtgaaaacgt tgagcgacgc cggatgtcgg 540
gtgattgccg aagggcgtta caacacgcct gctcaggcgg cggatgcgat gcgccacggc 600
gcgtgggcgg tgacggtcgg ttctgcaatc acgcgtcttg agcacatttg tcagtggtac 660
aacacagcga tgaaaaaggc ggtgctatga 690
<210> 17
<211> 229
<212> 氨基酸
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 17
MSLLAQLDQKIAANGGLIVSCQPVPDSPLDKPEIVAAMALAAEQAGAVAIRIEGVANLQATRAVVSVPIIGIVKRDLEDSPVRITAYIEDVDALAQAGADIIAIDGTDRPRPVPVETLLARIHHHGLLAMTDCSTPEDGLACQKLGAEIIGTTLSGYTTPETPEEPDLALVKTLSDAGCRVIAEGRYNTPAQAADAMRHGAWAVTVGSAITRLEHICQWYNTAMKKAVL
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
catgccatgg cttcgttact tgcacaact 29
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cccaagctta tcatagcacc gcctttttca tcgc 34
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ct 22
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cactggccgt cgttttacgc ttctgcgttc tgattt 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaatcagaac gcagaagcgt aaaacgacgg ccagtg 36
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggaaacagct atgaccatg 19
<210> 24
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgcatcaggc ataaagcaga ttactttttg atttcataca gcggtgtttg ttcgtgtcgc 60
tcaaggcgca ct 72
<210> 25
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agatgaatat tttaggtttt ttccagcgac tcggtagggc gttacagctg gaaacagcta 60
tgaccatg 68
<210> 26
<211> 690
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 26
atgtcgttac ttgcacaact ggatcaaaaa atcgctgcta acggtggcct gattgtctcc 60
tgccagccgg ttccggacag cccgctcgat aaacccgaaa tcgtcgccgc catggcatta 120
gcggcagaac aggcgggcgc ggttgccatt cgcattgaag gtgtggcaaa tctgcaagcc 180
acgcgtgcgg tggtgagtgt gccgattatt ggaattgtga aacgcgatct ggaggattct 240
ccggtacgca tcacggccta tattgaagat gttgatgcgc tggcgcaggc gggcgcggac 300
attatcgcca ttgacggcac cgaccgcccg cgtccggtgc ctgttgaaac gctgctggca 360
cgtattcacc atcacggttt actggcgatg accgaccgct caacgccgga agacggcctg 420
gcatgccaaa agctgggagc cgaaattatt ggcactacgc tttctggcta taccacgcct 480
gaaacgccag aagagccgga tctggcgctg gtgaaaacgt tgagcgacgc cggatgtcgg 540
gtgattgccg aagggcgtca caacacgcct gctcaggcgg cggatgcgat gcgccacggc 600
gcgtgggcgg tgacggtcgg ttctgcaatc acgcgtcttg agcacatttg tcagtggtac 660
aacacagcga tgaaaaaggc ggtgctatga 690
<210> 27
<211> 229
<212> 氨基酸
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 27
MSLLAQLDQKIAANGGLIVSCQPVPDSPLDKPEIVAAMALAAEQAGAVAIRIEGVANLQATRAVVSVPIIGIVKRDLEDSPVRITAYIEDVDALAQAGADIIAIDGTDRPRPVPVETLLARIHHHGLLAMTDRSTPEDGLACQKLGAEIIGTTLSGYTTPETPEEPDLALVKTLSDAGCRVIAEGRHNTPAQAADAMRHGAWAVTVGSAITRLEHICQWYNTAMKKAVL
<210> 28
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 60
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt 120
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatg 166
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
catggtcata gctgtttcct tcgtgtcgct caaggcgcac t 41
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
catggtctgt ttcctgtgt 19
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agtgcgcctt gagcgacacg aaggaaacag ctatgaccat g 41
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtaaaacgac ggccagtg 18
<210> 33
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cttattcccc ctacgagaac cctatttggc tcgtttcaag ccgtattttt agtaaaacga 60
cggccagtg 69
<210> 34
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
agcagcccat ttgccgacct gttcagcggt agtcaggggg atcagtctca tggtctgttt 60
cctgtgt 67
<210> 35
<211> 190
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 35
tgaggagata acataatctc cctcccacaa gcagtaacta taaaaataac cccactctct 60
acaaggctcg gggcgcccga aaaaacgggc atacaggttg accgacaacg atataaatcg 120
gaatcaaaaa ctatgtgtgg aattgttggc gcgatcgcgc aacgtgatgt agcagaaatc 180
cttcttgaag 190
<210> 36
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tgaggagata acataatctc cctcccacaa gcagtaacta taaaaataac cccgtaaaac 60
gacggccagt g 71
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cttcaagaag gatttctgct acatcacgtt gcgcgatcgc gccaacaatt ccacacggaa 60
acagctatga ccatg 75
<210> 38
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tgaggagata acataatctc cctcccacaa gcagtaacta taaaaataac gtaaaacgac 60
ggccagtg 68
<210> 39
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
cttcaagaag gatttctgct acatcacgtt gcgcgatcgc gccaacaatt ccacacatgg 60
tctgtttcct gtgt 74
<210> 40
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cttattcccc ctacgagaac cctatttggc tcgtttcaag ccgtattttt agtaaaacga 60
cggccagtg 69
<210> 41
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
agcagcccat ttgccgacct gttcagcggt agtcaggggg atcagtctca tggaaacagc 60
tatgaccatg 70
<210> 42
<211> 1131
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 42
gtgaaagtac tgactgtatt tggtacgcgc ccggaagcca tcaagatggc gccgttggtg 60
catgcgttgg caaaagatcc tttttttgag gctaaagttt gcgtcactgc gcagcatcgg 120
gagatgctcg atcaggtgct gaaactcttt tccattgtac ctgactacga tctcaacata 180
atgcagccag gacagggcct gacagagata acctgtcgga ttctggaagg gctaaaacct 240
attcttgccg agttcaaacc agacgtcgtg ctggttcacg gcgatacgac gacgacgctg 300
gcaaccagcc tggcggcgtt ttatcagcgt attcctgttg gtcacgttga ggctggtctg 360
cgcacgggcg atctctattc gccgtggccg gaagaggcta accgtacatt gaccgggcat 420
ctggcgatgt atcacttctc tccaaccgaa acttcccggc aaaacttgct gcgtgaaaac 480
gttgcggata gccgaatctt cattaccggt aatacagtca ttgatgcact gttatgggtg 540
cgtgaccagg tgatgagcag cgacaagctg cgttcagaac tggcggcaaa ttacccgttt 600
atcgaccccg ataaaaagat gattctggtg accggtcaca ggcgtgagag tttcggtcgt 660
ggctttgaag aaatctgcca cgcgctggca gacatcgcca ccacgcacca ggacatccag 720
attgtctatc cggtgcatct caacccgaac gtcagagaac cggtcaatcg cattctgggg 780
catgtgaaaa atgtcattct gatcgatccc caggagtatt taccgtttgt ctggctgatg 840
aaccacgcct ggctgatttt gaccgactca ggcggcattc aggaagaagc gccttcgctg 900
gggaaacctg tgctggtgat gcgcgatacc actgagcgtc cggaagcggt gacggcgggt 960
acggtgcgtc tggtaggcac ggataagcag cgaattgtcg aggaagtgac gcgtctttta 1020
aaagacgaaa acgaatatca agctatgagc cgcgcccata acccgtatgg tgatggtcag 1080
gcatgctctc gcattctgga agcgttaaaa aataatcgga tatcactatg a 1131
<210> 43
<211> 376
<212> 氨基酸
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 43
MKVLTVFGTRPEAIKMAPLVHALAKDPFFEAKVCVTAQHREMLDQVLKLFSIVPDYDLNIMQPGQGLTEITCRILEGLKPILAEFKPDVVLVHGDTTTTLATSLAAFYQRIPVGHVEAGLRTGDLYSPWPEEANRTLTGHLAMYHFSPTETSRQNLLRENVADSRIFITGNTVIDALLWVRDQVMSSDKLRSELAANYPFIDPDKKMILVTGHRRESFGRGFEEICHALADIATTHQDIQIVYPVHLNPNVREPVNRILGHVKNVILIDPQEYLPFVWLMNHAWLILTDSGGIQEEAPSLGKPVLVMRDTTERPEAVTAGTVRLVGTDKQRIVEEVTRLLKDENEYQAMSRAHNPYGDGQACSRILEALKNNRISL
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
catgccatgg tgaaagtact gactgtattt 30
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cccaagctta ttatagtgat atccgattat t 31
<210> 46
<211> 110
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 46
tgtcgggggg ctgatcgggg ctggtgtcgc attaacccgc cgttgctcga aatagcaaca 60
ctgctgcggt gagcgcaaag gcgctcgccg cttattcgaa gagaatcgat 110
<210> 47
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tgtcgggggg ctgatcgggg ctggtgtcgc attaacccgc cgttgctcga aataggtaaa 60
acgacggcca gtg 73
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
atcgattctc ttcgaataag cggcgagcgc ctttgcgctc accgcagcag catggtctgt 60
ttcctgtgt 69
<210> 49
<211> 1131
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 49
gtgaaagtac tgactgtatt tggtacgcgc ccggaagcca tcaagatggc gccgttggtg 60
catgcgttgg caaaagatcc tttttttgag gctaaagttt ccgtcactgc gcagcatcgg 120
gagatgctcg atcaggtgct gaaactcttt tccattgtac ctgactacga tctcaacata 180
atgcagccag gacagggcct gacagagata acctgtcgga ttctggaagg gctaaaacct 240
attcttgccg agttcaaacc agacgtcgtg ctggttcacg gcgatacgac gacgacgctg 300
gcaaccagcc tggcggcgtt ttatcagcgt attcctgttg gtcacgttga ggctggtctg 360
cgcacgggcg atctctattc gccgtggccg gaagaggcta accgtacatt gaccgggcat 420
ctggcgatgt atgacttctc tccaaccgaa acttcccggc aaaacttgct gcgtgaaaac 480
gttgcggata gccgaatctt cattaccggt aatacagtca ttgatgcact gttatgggtg 540
cgtgaccagg tgatgagcag cgacaagctg cgttcagaac tggcggcaaa ttacccgttt 600
atcgaccccg ataaaaagat gattctggtg accggtcaca ggcgtgagag tttcggtcgt 660
ggctttgaag aaatcttcca cgcgctggca gacatcgcca ccacgcacca ggacatccag 720
attgtctatc cggggcatct caacccgaac gtcagagaac cggtcaatcg cattctgggg 780
catgtgaaaa atgtcattct gatcgatccc caggagtatt taccgtttgt ctggctgatg 840
aaccacgcct ggctgatttt gaccgactca ggcggcattc aggaagaagc gccttcgctg 900
gggaaacctg tgctggtgat gcgcgatacc actgagcgtc cggaagcggt gacggcgggt 960
acggtgcgtc tggtaggcac ggataagcag cgaattgtcg aggaagtgac gcgtctttta 1020
aaagacgaaa acgaatacca agctatgagc cgcgcccata acccgtatgg tgatggtcag 1080
gcatgctctc gcattctgga agcgttaaaa aataatcgga tatcactatg a 1131
<210> 50
<211> 376
<212> 氨基酸
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 50
MKVLTVFGTRPEAIKMAPLVHALAKDPFFEAKVSVTAQHREMLDQVLKLFSIVPDYDLNIMQPGQGLTEITCRILEGLKPILAEFKPDVVLVHGDTTTTLATSLAAFYQRIPVGHVEAGLRTGDLYSPWPEEANRTLTGHLAMYDFSPTETSRQNLLRENVADSRIFITGNTVIDALLWVRDQVMSSDKLRSELAANYPFIDPDKKMILVTGHRRESFGRGFEEIFHALADIATTHQDIQIVYPGHLNPNVREPVNRILGHVKNVILIDPQEYLPFVWLMNHAWLILTDSGGIQEEAPSLGKPVLVMRDTTERPEAVTAGTVRLVGTDKQRIVEEVTRLLKDENEYQAMSRAHNPYGDGQACSRILEALKNNRISL

Claims (165)

1. 一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：
A）在发酵培养基中培养微生物，微生物用包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列含有增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：17的第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代；和
B）收集从培养步骤A）中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
2.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列为SEQ ID NO：26。
3.如权利要求1所述的方法，其中，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因拷贝数增加。
4.权利要求1所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
5.权利要求4所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
（1）包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；
（2）包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；
（3）包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰。
7.如权利要求6所述的方法，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；和/或b）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达。
8.如权利要求7所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
9.如权利要求7所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
10.如权利要求9所述的方法，其中，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。
11.如权利要求10所述的方法，其中，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。
12.如权利要求10所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
13.如权利要求12所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
14.如权利要求7所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
15.如权利要求14所述的方法，其中，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
16.如权利要求15所述的方法，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
17.如权利要求6所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低；和/或b）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少。
18.如权利要求17所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
19.如权利要求18所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
20.如权利要求19所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
21.如权利要求6所述的方法，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加；和/或b）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达。
22.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
23.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
24.如权利要求23所述的方法，其中，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遗传修饰。
25.如权利要求24所述的方法，其中，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷贝数增加。
26.如权利要求24所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
27.如权利要求26所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
28.如权利要求21所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
29.如权利要求28所述的方法，其中，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
30.如权利要求29所述的方法，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
31.如权利要求6所述的方法，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性降低；和/或b）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的表达减少。
32.如权利要求31所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
33.如权利要求32所述的方法，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
34.如权利要求33所述的方法，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
35.如权利要求6所述的方法，其中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰选自a）微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性增加；和/或b）微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶被过量表达。
36.如权利要求35所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
37.如权利要求35所述的方法，其中，微生物用包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列含有增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：43的第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代。
38.如权利要求37所述的方法，其中，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列为SEQ ID NO：49。
39.如权利要求37所述的方法，其中，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因拷贝数增加。
40.如权利要求37所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
41.如权利要求40所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
42.如权利要求35所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
43.如权利要求42所述的方法，其中，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
44.如权利要求43所述的方法，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
45.如权利要求1-44任一项所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
（1）包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰；
（2）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰；
（3）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰；
（4）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰。
46.如权利要求45所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
47.如权利要求46所述的方法，其中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰选自编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
48.如权利要求47所述的方法，其中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman的内源性基因完全缺失，即被删除。
49.如权利要求17所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
50.如权利要求49所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
51.如权利要求50所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶的内源性基因完全缺失，即被删除。
52.如权利要求45所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
53.如权利要求52所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
54.如权利要求53所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶的内源性基因完全缺失，即被删除。
55.如权利要求45所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
56.如权利要求55所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
57.如权利要求56所述的方法，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag的内源性基因完全缺失，即被删除。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。
61.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养步骤A）在20℃-45℃进行。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述培养步骤A）在33℃-37℃进行。
63.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养步骤A）在pH4.5-pH8.5进行。
64.如权利要求63所述的方法，其中，所述培养步骤A）在pH6.7-pH7.2进行。
65.如权利要求1所述的方法，其中，所述培养步骤A）采用补料发酵法。
66.如权利要求65所述的方法，其中，补糖液包含葡萄糖和核糖，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为10%-85%，核糖浓度以重量/体积百分比计为0.5%-15%。
67.如权利要求66所述的方法，其中，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为55%-75%，核糖浓度以重量/体积百分比计为5%-7%。
68.如权利要求65所述的方法，其中，补糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸盐，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为10%-85%，葡萄糖酸盐浓度以重量/体积百分比计为0.5%-15%。
69.如权利要求68所述的方法，其中，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为55%-75%，葡萄糖酸盐浓度以重量/体积百分比计为2%-3%。
70.如权利要求69所述的方法，其中，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。
71.如权利要求65所述的方法，其中，补糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸盐，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为10%-85%，核糖浓度以重量/体积百分比计为0.5%-15%，葡萄糖酸盐浓度以重量/体积百分比计为0.5%-15%。
72.如权利要求71所述的方法，其中，葡萄糖浓度以重量/体积百分比计为55%-75%，核糖浓度以重量/体积百分比计为5%-7%，葡萄糖酸盐浓度以重量/体积百分比计为2%-3%。
73.如权利要求72所述的方法，其中，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。
74.如权利要求1所述的方法，其中，所述收集步骤B）包括（a）从去除微生物的发酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖；和/或（b）从去除微生物的发酵液中结晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述收集步骤B）进一步包括将发酵液脱色的步骤。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述脱色步骤在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行。
77.如权利要求75所述的方法，其中，所述脱色步骤包括活性炭处理和/或色谱脱色。
78.如权利要求1所述的方法，其中，进一步包括C）由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。
80.如权利要求78所述的方法，其中，所述步骤C）在酸性和加热条件下进行或在酶催化下进行。
81.如权利要求80所述的方法，其中，在30%-37%盐酸溶液中、60℃-90℃下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐酸盐。
82.如权利要求80所述的方法，其中，在UDP-3-O-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖，并进一步成盐。
83.一种微生物，该微生物用包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列含有增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：17的第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。
84.如权利要求83所述的微生物，其中，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列为SEQ ID NO：26。
85.如权利要求83所述的微生物，其中，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因拷贝数增加。
86.如权利要求83所述的微生物，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
87.如权利要求86所述的微生物，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
88.如权利要求83所述的微生物，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
（1）包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；
（2）包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；
（3）包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰。
89.如权利要求88所述的微生物，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；和/或b）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达。
90.如权利要求89所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
91.如权利要求89所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
92.如权利要求91所述的微生物，其中，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。
93.如权利要求92所述的微生物，其中，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。
94.如权利要求92所述的微生物，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
95.如权利要求94所述的微生物，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
96.如权利要求89所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
97.如权利要求96所述的微生物，其中，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
98.如权利要求97所述的微生物，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
99.如权利要求88所述的微生物，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低；和/或b）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少。
100.如权利要求99所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
101.如权利要求100所述的微生物，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
102.如权利要求101所述的微生物，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
103.如权利要求88所述的微生物，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加；和/或b）微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达。
104.如权利要求103所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
105.如权利要求103所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
106.如权利要求105所述的微生物，其中，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遗传修饰。
107.如权利要求106所述的微生物，其中，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷贝数增加。
108.如权利要求106所述的微生物，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
109.如权利要求108所述的微生物，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
110.如权利要求103所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
111.如权利要求110所述的微生物，其中，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
112.如权利要求111所述的微生物，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
113.如权利要求88所述的微生物，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性降低；和/或b）微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的表达减少。
114.如权利要求113所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
115.如权利要求114所述的微生物，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
116.如权利要求115所述的微生物，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。
117.如权利要求88所述的微生物，其中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰选自a）微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性增加；和/或b）微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶被过量表达。
118.如权利要求117所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
119.如权利要求117所述的微生物，其中，微生物用包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列含有增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：43的第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代。
120.如权利要求119所述的微生物，其中，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列为SEQ ID NO：49。
121.如权利要求119所述的微生物，其中，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因拷贝数增加。
122.如权利要求119所述的微生物，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。
123.如权利要求122所述的微生物，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
124.如权利要求117所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。
125.如权利要求124所述的微生物，其中，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换。
126.如权利要求125所述的微生物，其中，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。
127.如权利要求83-126任一项所述的微生物，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：
（1）包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰；
（2）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰；
（3）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰；
（4）包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰。
128.如权利要求127所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
129.如权利要求128所述的微生物，其中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰选自编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
130.如权利要求129所述的微生物，其中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，P/IIIman的内源性基因完全缺失，即被删除。
131.如权利要求127所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
132.如权利要求131所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
133.如权利要求132所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶的内源性基因完全缺失，即被删除。
134.如权利要求127所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
135.如权利要求134所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
136.如权利要求135所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶的内源性基因完全缺失，即被删除。
137.如权利要求127所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
138.如权利要求137所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。
139.如权利要求138所述的微生物，其中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINag的内源性基因完全缺失，即被删除。
140.如权利要求83-139中任一项所述的微生物，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
141.如权利要求140所述的微生物，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的。
142.如权利要求141所述的微生物，其中，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。
143.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中，所述微生物为细菌或真菌。
144.如权利要求143所述的方法，其中，细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌。
145.如权利要求144所述的方法，其中，细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。
146.如权利要求145所述的方法，其中，细菌为大肠杆菌。
147.如权利要求146所述的方法，其中，大肠杆菌选自K-12、B和W菌株。
148.如权利要求143所述的方法，其中，所述真菌为酵母，所述酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyces）、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属（Phaffia）的酵母。
149.如权利要求148所述的方法，其中，酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。
150.如权利要求143所述的方法，其中，真菌选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌。
151.如权利要求150所述的方法，其中，真菌选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopusoryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)、间型脉孢霉(Neurosporaintermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。
152.如权利要求83-139中任一项所述的微生物，其中，所述微生物为细菌或真菌。
153.如权利要求152所述的微生物，其中，细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌。
154.如权利要求153所述的微生物，其中，细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。
155.如权利要求154所述的微生物，其中，细菌为大肠杆菌。
156.如权利要求155所述的微生物，其中，大肠杆菌选自K-12、B和W菌株。
157.如权利要求152所述的微生物，其中，所述真菌为酵母，所述酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyces）、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属（Phaffia）的酵母。
158.如权利要求157所述的微生物，其中，酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。
159.如权利要求152所述的微生物，其中，真菌选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌。
160.如权利要求159所述的微生物，其中，真菌选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopusoryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)、间型脉孢霉(Neurosporaintermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。
161.一种具有更高酶活性的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
162.一种编码如权利要求161所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：26所示的核酸序列。
163.一种包含如权利要求162所述核酸分子的载体。
164.一种包含如权利要求163所述载体的微生物。
165.一种基因组中包含如权利要求162所述核酸分子的微生物。
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