ES2700274T3 - Microorganismos y métodos para producir oligosacáridos sialilados y que contienen N-acetilglucosamina - Google Patents

Abstract

Un método para producir un oligosacárido sialilado en una bacteria que comprende: proporcionar una bacteria, comprendiendo dicha bacteria una sialil-transferasa exógena, una ruta catabólica de ácido siálico deficiente, una capacidad sintética de ácido siálico, un gen de lactosa permeasa funcional y una mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, tal que la bacteria produce al menos 10% más UDP-GlcNAc que una bacteria natural; y cultivar dicha bacteria en presencia de lactosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos y métodos para producir oligosacáridos sialilados y que contienen N-acetilglucosamina Campo de la invención

La invención proporciona composiciones y métodos para producir oligosacáridos purificados; en particular, ciertos oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina y/o sialilados que se encuentran típicamente en la leche humana.

Antecedentes de la invención

La leche humana contiene un conjunto diverso y abundante de oligosacáridos neutros y ácidos (oligosacáridos de la leche humana, hMOS). Muchas de estas moléculas no son utilizadas directamente por los bebés en su nutrición, pero, sin embargo, tienen un papel fundamental en el establecimiento de un microbioma intestinal sano, en la prevención de enfermedades y en la función inmunológica. Antes de la invención, la capacidad de producir hMOS de forma económica a gran escala era problemática. Por ejemplo, la producción de hMOS a través de la síntesis química se ha visto limitada por problemas estéreo-específicos, disponibilidad de precursores, impurezas del producto y alto costo general. Como tal, existe una necesidad apremiante de nuevas estrategias para fabricar grandes cantidades de hMOS a bajo costo para una variedad de aplicaciones comerciales.

Sumario de la invención

La invención presenta métodos eficientes y económicos para producir oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina y/o sialilados.

La invención proporciona un método para producir un oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina en una bacteria que comprende los siguientes pasos: proporcionar una bacteria que comprenda una UDP-GlcNA:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógena, una permeasa de lactosa funcional, y una mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produzca al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa; y cultivo de la bacteria en presencia de lactosa. El oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina se recupera entonces de la bacteria o de un sobrenadante de cultivo de la bacteria.

La invención proporciona además un método para producir un oligosacárido sialilado en una bacteria que comprende los siguientes pasos: proporcionar una bacteria que comprenda un gen de sialil-transferasa exógeno, una vía catabólica deficiente en ácido siálico, una capacidad sintética de ácido siálico y un gen funcional de permeasa lactosa, y una mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produzca al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa; y el cultivo de la bacteria en presencia de lactosa. El oligosacárido sialilado se recupera de la bacteria o de un sobrenadante de cultivo de la bacteria. Específicamente, una capacidad sintética de ácido siálico comprende la expresión de CMP-Neu5Ac sintetasa exógena, una sintasa de ácido siálico exógena y una UDP-GlcNAc-2-epimerasa exógena, o una variante funcional o su fragmento.

En ambos métodos para producir oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina y/o sialilados, la bacteria comprende además la capacidad de aumentar la producción de UDP-GlcNAc. Por "mayor capacidad de producción" se entiende que la bacteria huésped produce más del 10%, 20%, 50%, 100%, 2 veces, 5 veces, 10 veces o más de un producto que la bacteria nativa, endógena. Por lo tanto, la bacteria sobreexpresa el regulador endógeno positivo de la síntesis de UDP-GlcNAc nagC. Por ejemplo, la bacteria sobreexpresa el gen nagC de Escherichia coli. Además, la bacteria sobreexpresa el gen glmS de Escherichia coli (L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa), o sobreexpresa el gen glmY de Escherichia coli (un regulador positivo de la traducción de glmS), o alternativamente sobreexpresa el gen glmZ de Escherichia coli (otro regulador de traducción positivo de glmS, glmY y glmZ se describen en Reichenbach et al, Nucleic Acids Res 36, 2570-80 (2008)). Alternativamente, la bacteria sobreexpresa cualquier combinación de tales enfoques además de nagC. Por ejemplo, la bacteria sobreexpresa nagC y glmS. Alternativamente, la bacteria sobreexpresa nagC y glmY. Alternativamente, la bacteria sobreexpresa nagC y glmZ. Los métodos también incluyen la sobreexpresión de cualquier variante o fragmento funcional de nagC, glmS, glmY y glmZ y cualquier combinación de los mismos. Por "sobreexpresión" se entiende que la transcripción del gen o el producto genético codificado es 10%, 20%, 50%, 2 veces, 5 veces, 10 veces o más que el nivel expresado o producido por el nativo correspondiente, o el gen endógeno natural.

La descripción detalla la manipulación de genes y rutas dentro de bacterias tales como la enterobacteria Escherichia coli K12 (E. coli) que conduce a un alto nivel de síntesis de hMOS. Otras cepas de E. coli adecuadas para su uso en la presente invención incluyen E. coli MG1655, E. coli W3110, E. coli DHSaE, E. coli B, E. coli C y E. coli W. Varias especies bacterianas son adecuadas para su uso en los métodos de biosíntesis de oligosacáridos, por ejemplo, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Citrobacter freundii, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum o Xanthomonas campestris. Las bacterias del género Bacillus son adecuadas para su uso, incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus y Bacillus circulans. De manera similar, las bacterias de los géneros, Lactobacillus y Lactococcus se modifican utilizando los métodos descritos, incluidos, entre otros, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii y Lactococcus lactis. Streptococcus thermophiles y Proprionibacterium freudenreichii también son especies bacterianas adecuadas para la invención. También se incluyen cepas, modificadas como se describe, de los géneros Enterococcus (p. ej., Enterococcus faecium y Enterococcus thermophiles), Bacteroides (p. ej., Bacteroides caccae, Bacteroides cellulosilyticus, Bacteroides dorei, Bacteroides eggerthii, Bacteroides finegoldii, Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides ovatus, Bacteroides salyersiae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus y Bacteroides xylanisolvens), Bifidobacterias (p. ej., Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, y Bifidobacterium bifidum), Parabacteroides (p. ej., Parabacteroides distasonis, Parabacteroides goldsteinii, Parabacteroides johnsonii y Parabacteroides merdae), Prevotella (p. ej., Prevotella copri), Sporolactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp., y Pseudomonas (p. ej., Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas aeruginosa). Las bacterias que comprenden las características descritas en el presente documento se cultivan en presencia de lactosa, y se recupera un oligosacárido sialilado o que contiene N-acetilglucosamina, ya sea de la propia bacteria o de un sobrenadante de cultivo de la bacteria. El oligosacárido sialilado o que contiene N-acetilglucosamina se purifica para su uso en productos terapéuticos o nutricionales, o las bacterias se usan directamente en dichos productos.

La bacteria de la presente invención comprende una capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobrexpresión de nagC, tal que la bacteria produce al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria natural. Además, la bacteria comprende un gen de p-galactosidasa endógeno eliminado o inactivado (es decir, no funcional). Por ejemplo, el gen de la p-galactosidasa comprende un gen lacZ de E. coli (por ejemplo, el Número de Acceso de GenBank V00296.1 (GI: 41901)). El gen lacZ endógeno de la E. coli se elimina o se inactiva funcionalmente, pero de tal manera que la expresión del gen de la lactosa permeasa (lacY) cadena abajo permanece intacta, es decir, un gen funcional de la lactosa permeasa también está presente en la bacteria. Por eliminado se entiende que una parte o la secuencia de codificación completa está ausente, de manera que no se produce ningún producto genético. Un gen "inactivado" no produce un producto genético que funcione como el gen nativo, natural o endógeno. Por ejemplo, la actividad funcional de un producto génico de p-galactosidasa inactivado se reduce al 10%, 20%, 50% o 100%, 1 vez, 2 veces, 5 veces o 10 veces menos que la actividad funcional del producto génico endógeno, nativo o de origen natural.

El gen de la lactosa permeasa es un gen endógeno de la lactosa permeasa o un gen exógeno de la lactosa permeasa. Por ejemplo, el gen de la lactosa permeasa comprende un gen lacY de E. coli (por ejemplo, Número de Acceso de GenBank V00295.1 (GI:41897)). Muchas bacterias poseen la capacidad inherente de transportar la lactosa desde el medio de crecimiento a la célula, utilizando una proteína de transporte que es un homólogo de la permeasa de la lactosa de E. coli (por ejemplo, como se encuentra en Bacillus licheniformis), o un transportador que es un miembro de la ubicua familia de transporte de azúcar PTS (por ejemplo, como se encuentra en Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus). Para bacterias que carecen de una capacidad inherente para transportar lactosa extracelular al citoplasma celular, esta capacidad se confiere por un gen transportador de lactosa exógeno (por ejemplo, lacY de E. coli) proporcionado en construcciones de ADN recombinante, y se suministra en un vector de expresión de plásmido o como genes exógenos integrados en el cromosoma huésped.

Para la producción de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina, la bacteria comprende, además de la capacidad de producción de ^u D^p-GI^cNAC, un gen de UDP-GlcNAc exógeno:Gala/p-R p-3-N-acetilglucosaminiltransferasa o una variante funcional o su fragmento. Este gen UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógeno se obtiene de una cualquiera de diversas fuentes, por ejemplo, el gen LgtA descrito de N. meningitides (SEQ ID NO: 16 Acceso de la proteína del Genbank AAF42258.1) o N. gonorrhoeae (Acceso de la proteína del Genbank ACF31229.1). Además, se compara un gen de lactosa permeasa funcional. Opcionalmente, un gen de glicosiltransferasa exógeno adicional se coexpresa en la bacteria que comprende una UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógena. Por ejemplo, un gen de la p-1,4-galactosiltransferasa se coexpresa con el gen UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa. Este gen de la p-1,4-galactosiltransferasa exógeno se obtiene de una cualquiera de diversas fuentes, por ejemplo, la descrita de N. meningitidis, el gen LgtB (Acceso de la proteína del Genbank AAF42257.1), o de H. pylori, el gen Lex2B (SEQ ID NO: 17 Acceso de la proteína del Genbank NP_207619.1). Opcionalmente, el gen de glicosiltransferasa exógeno adicional coexpresado en la bacteria que comprende un gen de UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógena es un gen de p-1,3-galactosiltransferasa, por ejemplo, que se describe en O55:H7 de E. coli, el gen WbgO (SEQ ID NO: 18 Acceso de la proteína del Genbank YP_003500090.1), o de H. pylori, el gen jhp0563 (Acceso de la proteína del Genbank AEZ55696.1). Las variantes y fragmentos funcionales de cualquiera de las enzimas descritas anteriormente también están incluidas en la presente invención.

En una realización, los oligosacáridos que contienen N-acteilglucosamina producidos por los métodos descritos en este documento incluyen Lacto-N-triosa 2 (LNT2), Lacto-N-tetraosa (LNT), Lacto-N-neotetraosa (LNnT), Lacto-N-fucopentaosa I (LNF I), Lacto-N-fucopentaosa II (LNF II), Lacto-N-fucopentaosa III (LNF III), Lacto-N-fucopentaosa V (LNF V), Lacto-N-difucohexaosa I (LDFH I), Lacto-N-difucohexaosa II (LDFH II), y Lacto-N-neodifucohexaosa II (LFNnDFH II).

Para la producción de sialil-oligosacáridos, la bacteria comprende un gen exógeno de sialil-transferasa. Por ejemplo, el gen de sialil-transferasa exógeno codifica a(2,3) sialil-transferasa o el gen de sialil-transferasa exógeno codifica a(2,6) sialil-transferasa o el gen de sialil-transferasa exógeno codifica a(2,8) sialiltransferasa. Los genes de sialiltransferasa exógenos se obtienen de una cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, las descritas de N. meningitidis, N. gonorrhoeae, y de varios organismos del género Photobacterium. Ejemplos de a(2,8) sialiltransferasas, útiles para la producción de ácido polisialico, por ejemplo, se encuentran en Campylobacter jejuni (CstII: ADN52706) y Neisseria meningitides (o siaD: AAA20478).

Las bacterias utilizadas en el presente documento para producir hMOS están modificadas por ingeniería genética para comprender un aumento de la acumulación de lactosa intracelular (en comparación con el tipo natural) y para comprender la actividad de UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa y/o sialil-transferasa. Opcionalmente, también comprenden la actividad de p-1,4-galactosiltransferasa o p-1,3-galactosiltransferasa, y/o la actividad de a-1,2-, a-1,3- y/o a-1,4-fucosiltransferasa. En algunos casos, la bacteria comprende además un gen funcional de E. coli lacZ+ de tipo natural insertado en un gen endógeno, por ejemplo, el gen lon en E. coli o el gen thyA en E. coli. De esta manera, la bacteria comprende además una mutación en un gen lon o una mutación en el gen thyA. En estos casos, el gen lacZ endógeno de la E. coli se elimina o se desactiva funcionalmente, pero de tal manera que la expresión del gen de la lactosa permeasa (lacY) cadena abajo permanece intacta. El organismo así manipulado mantiene la capacidad de transportar la lactosa desde el medio de crecimiento y de desarrollar una acumulación de lactosa intracelular para usar como un aceptor de azúcar en la síntesis de oligosacáridos, al tiempo que mantiene un bajo nivel de actividad de beta-galactosidasa intracelular útil para una variedad de fines. Por ejemplo, la invención también incluye: a) métodos para el marcado fenotípico de un locus genético en una célula huésped con p-galactosidasa negativa utilizando un inserto del gen de p-galactosidasa (p. ej., LacZ) diseñado para producir un nivel bajo, pero fácilmente detectable, de la actividad de la p-galactosidasa, b) métodos para detectar fácilmente la contaminación por bacteriófagos líticos en las series de fermentación mediante la liberación y detección de p-galactosidasa citoplásmica en el medio de cultivo celular, y c) métodos para agotar un cultivo bacteriano de lactosa residual al final de las series de producción. a), b) y c) se logran utilizando un inserto génico de pgalactosidasa funcional (por ejemplo, lacZ) cuidadosamente diseñado para dirigir la expresión de un nivel bajo, pero detectable, de la actividad de p-galactosidasa en una célula huésped de p-galactosidasa negativa. La bacteria opcionalmente comprende además una mutación en un gen lacA. Preferiblemente, la bacteria acumula un aumento de la acumulación de lactosa intracelular y produce un bajo nivel de beta-galactosidasa. Una acumulación intracelular aumentada es cuando la concentración de lactosa en la bacteria huésped es al menos 10%, 20%, 50%, 2 veces, 5 veces o 10 veces más alta que la de la bacteria nativa o de origen natural.

En un aspecto, el oligosacárido de la leche humana producido por bacterias modificadas genéticamente comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa y un ácido nucleico exógeno que codifica p-1,4-galactosiltransferasa es lacto-N-neotetraosa (LNnT). En otro aspecto, el oligosacárido de la leche humana producido por bacterias modificadas genéticamente comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa y un ácido nucleico exógeno que codifica p-1,3-galactosiltransferasa es lacto-N-tetraosa (LNT).

En este documento se describen composiciones que comprenden una célula bacteriana que produce el oligosacárido de la leche humana LNnT (lacto-N-neotetraosa), en donde la célula bacteriana comprende una UDP-GlcNAc exógena:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa y un ácido nucleico exógeno que codifica una p-1,4-galactosiltransferasa. La célula bacteriana puede ser E. coli. El gen UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógeno se obtiene de una cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, el gen LgtA descrito de N. meningitides. El gen de la p-1,4-galactosiltransferasa exógeno se obtiene de una cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, la descrita de N. meningitidis, el gen LgtB, o de H. pylori, el gen jhp0765.

La bacteria comprende una producción incrementada de UDP-GlcNAc. El medio para lograr esto es mediante la sobreexpresión de un regulador endógeno positivo de la síntesis de UDP-GlcNAc; es decir, la sobreexpresión del gen nagC de Escherichia coli. En un aspecto, esta sobreexpresión de nagC se logra proporcionando copias adicionales del gen nagC en un vector plasmídico o integrando copias adicionales del gen nagC en el cromosoma de la célula huésped. Alternativamente, la sobreexpresión se logra modulando la fuerza de la secuencia de unión al ribosoma que dirige la traducción nagC o modulando la fuerza de la transcripción nagC que dirige el promotor. Además, la acumulación intracelular de UDP-GlcNAc puede mejorarse por otros medios, por ejemplo, por la sobreexpresión del gen glmS de Escherichia coli (L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa), o alternativamente por la sobreexpresión del gen glmY de Escherichia coli (un regulador de traducción positivo de glmS), o alternativamente mediante la sobreexpresión del gen glmZ de Escherichia coli (otro regulador de traducción positivo de glmS), o alternativamente utilizando simultáneamente una combinación de enfoques. En una realización preferida, por ejemplo, los genes nagC (SEQ ID NO: 19 Acceso de la proteína del Genbank BAA35319.1) y glmS (SEQ ID NO: 20 Acceso de la proteína del Genbank NP_418185.1) que codifican las secuencias proporcionadas en el presente documento se sobreexpresan simultáneamente en la misma célula huésped para aumentar la acumulación intracelular de UDP-GlcNAc. Otros componentes del metabolismo de UDP-GlcNAc incluyen: (GlcNAc-1-P) N-acetilglucosamina-1-fosfato; (GlcN-1-P) glucosamina-1-fosfato; (GlcN-6-P) glucosamina-6-fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; y (Fruc-6-p) fructosa-6-fosfato. Las bacterias que comprenden las características descritas en el presente documento se cultivan en presencia de lactosa, y se recupera la lacto-N-neotetraosa, ya sea de la propia bacteria (es decir, mediante lisis) o a partir de un sobrenadante de cultivo de la bacteria.

También dentro de la invención se encuentra una bacteria aislada de E. coli como se describe anteriormente y se caracteriza porque comprende un gen de p-galactosidasa endógeno eliminado o inactivado, un gen lacA inactivado o eliminado, y un gen funcional de lactosa permeasa (lacY).

En el presente documento también se describen composiciones que comprenden una célula bacteriana que produce el oligosacárido de la leche humana 6'-SL (6'-sialil-lactosa), en donde la célula bacteriana comprende un gen de sialil-transferasa exógeno que codifica a(2,6) sialil-transferasa. La célula bacteriana puede ser E. coli. El gen de sialil-transferasa exógeno utilizado para la producción de 6'-SL se obtiene de una cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, las descritas de diversos organismos del género Photobacterium. En otro aspecto más, el oligosacárido de la leche humana producido por bacterias modificadas genéticamente que comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica una a(2,3) sialiltransferasa es el 3'-SL (3'-sialil-lactosa). El gen de la sialiltransferasa exógeno utilizado para la producción de 3'-SL se obtiene de una cualquiera de varias fuentes, por ejemplo, las descritas a partir de N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

Además, la bacteria contiene una vía catabólica deficiente en ácido siálico. Por "vía catabólica del ácido siálico" se entiende una secuencia de reacciones, generalmente controlada y catalizada por enzimas, que resulta en la degradación del ácido siálico. Una vía catabólica del ácido siálico ejemplar en Escherichia coli se describe en este documento. En la ruta catabólica del ácido siálico descrita en el presente documento, el ácido siálico (Neu5Ac; ácido N-acetilneuramínico) se degrada por las enzimas NanA (ácido N-acetilneuramínico liasa) y NanK (N-acetilmanosamina quinasa) y NanE (N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa), todas codificadas en el operón nanATEK-yhcH, y reprimidas por NanR (http://ecocyc.org/ECOLI). Una vía catabólica deficiente de ácido siálico se diseña en Escherichia coli por medio de una mutación en nanA endógena (N-acetilneuraminato liasa) (por ejemplo, Número de Acceso de GenBank D00067.1 (GI:216588)) y/o genes de nanK (N-acetilmanosamina quinasa) (por ejemplo, Número de acceso del GenBank (aminoácido) BAE77265.1 (GI:85676015), y/o nanE (N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa, GI: 947745). Opcionalmente, el gen nanT (transportador de N-acetilneuraminato) también está inactivado o mutado. Otros intermedios del metabolismo del ácido siálico incluyen: (ManNAc-6-P) N-acetilmanosamina-6-fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; (GlcN-6-P) glucosamina-6-fosfato; y (Fruc-6-p) fructosa-6-fosfato. En algunas realizaciones preferidas, nanA está mutada. En otras realizaciones preferidas, nanA y nanK están mutados, mientras que nanE sigue siendo funcional. En otra realización preferida, nanA y nanE se mutan, mientras que nanK no se ha mutado, inactivado o eliminado. Una mutación es uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico que codifica el producto genético de nanA, nanK, nanE y/o nanT. Por ejemplo, la mutación puede ser 1,2, 5, 10, 25, 50 o 100 cambios en la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, la nanA, nanK, nanE y/o nanT está mutada por una mutación nula. Las mutaciones nulas, como se describen en este documento, abarcan sustituciones, adiciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos que causan una pérdida de la función de la enzima (es decir, una actividad reducida o nula) o una pérdida de la enzima (es decir, ningún producto genético). Por eliminado se entiende que la región de codificación se elimina en su totalidad o en parte de manera que no se produce ningún producto genético. Por inactivado se entiende que la secuencia de codificación se ha alterado de tal manera que el producto génico resultante es funcionalmente inactivo o codifica un producto génico con menos del 100%, 80%, 50% o 20% de la actividad del producto genético endógeno nativo o natural. Un gen o proteína "no mutada" no difiere de una secuencia codificante nativa, natural o endógena en 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ó 500 codones más, o en la correspondiente secuencia de aminoácidos codificada.

Además, la bacteria (por ejemplo, E. coli) también comprende una capacidad sintética de ácido siálico. Por ejemplo, la bacteria comprende una capacidad sintética de ácido siálico a través de la provisión de una 2-epimerasa UDP-GlcNAc exógena (por ejemplo, neuC de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO: 13, GenBank AAK91727.1; GI:15193223) o equivalente (por ejemplo, E. coli S88 neuC GenBank YP_002392936.1; GI:218560023), una Neu5Ac sintasa (por ejemplo, neuB de C. jejuni (SEQ ID NO: 14 AAK91726.1GenBank GI:15193222) o equivalente, (por ejemplo, Flavobacterium limnosediminis sintasa del ácido siálico, GenBank GI:559220424), y/o una CMP-Neu5Ac sintetasa (por ejemplo, neuA de C. jejuni (SEQ ID NO: 15 GenBank AAK91728.1; GI:15193224) o equivalente , (p. ej Vibrio brasiliensis CMP-ácido siálico sintasa, GenBank GI:493937153). También se describen variantes funcionales y fragmentos.

La bacteria de la presente invención, que comprende una capacidad sintética de ácido siálico, tiene una producción mayor de UDP-GlcNAc por la sobrexpresión del regulador endógeno positivo de la síntesis de UDP-GlcNAc, nagC. Un medio ejemplar para lograr esto es, p. ej., mediante la sobreexpresión simultánea de los genes nagC y glmS de Escherichia coli. Esta sobreexpresión de nagC y glmS se logra proporcionando copias adicionales de los genes nagC y glmS en un vector plasmídico, o integrando copias adicionales de los genes nagC y glmS en el cromosoma de la célula huésped. Alternativamente, la sobreexpresión se logra mediante la modulación de la fuerza de la secuencia de unión al ribosoma que dirige nagC (descrito por Sleight et al, Nucleic Acids Res. Mayo 2010; 38 (8): 2624-2636) y/o la traducción de nagC y glmS, o mediante la modulación de la fuerza del promotor/es que dirige la transcripción de nagC y glmS (Sleight et al, Nucleic Acids Res. Mayo 2010; 38 (8): 2624-2636).

Las bacterias que comprenden las características descritas en el presente documento se cultivan en presencia de lactosa y, en el caso en que las células comprendan una a(2,6) sialiltransferasa (por ejemplo, Photobacterium spp JT-ISH-224 (SEQ ID NO: 21 Acceso de la proteína del Genbank BAF92026.1), se recupera 6'-sialil-lactosa, ya sea de la propia bacteria o de un sobrenadante de cultivo de la bacteria. En el caso en que las células comprendan una a(2,3) sialiltransferasa, (por ejemplo, Neisseria meningitidis 1st (Acceso de la proteína del Genbank NP273962.1) 3' sialilactosa se recupera de la propia bacteria (por ejemplo, por lisis de la bacteria) o a partir de un sobrenadante de cultivo de la bacteria.

También, dentro de la invención, se encuentra una bacteria aislado de E. coli que comprende (a) un gen de pgalactosidasa endógeno eliminado o inactivado, un gen de sialil-transferasa exógeno, una vía catabólica deficiente de ácido siálico, una capacidad sintética de ácido siálico, un gen de permeasa de lactosa funcional y una capacidad de producción de UDP-GlcNAc aumentada que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produce al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa, por ejemplo, dicha bacteria comprende además un gen de p-galactosidasa recombinante que proporciona un nivel bajo, pero detectable, de actividad de pgalactosidasa; o (b) un gen UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa exógeno, un gen funcional de la lactosa permeasa y un aumento de la capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produce al menos el 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa.

Se describe un oligosacárido purificado que contiene N-acetilglucosamina o sialilado producido por los métodos descritos anteriormente. Un oligosacárido purificado, por ejemplo, 6'-SL, es uno que es al menos 90%, 95%, 98%, 99% o 100% (p/p) del oligosacárido deseado en peso. La pureza se evalúa mediante cualquier método conocido, por ejemplo, cromatografía de capa fina u otras técnicas electroforéticas o cromatográficas conocidas en la técnica. Se describe un método para purificar un oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina o sialilado producido por la bacteria de ingeniería genética descrita anteriormente, método que consiste en separar el oligosacárido sialilado o que contiene N-acetilglucosamina deseado (por ejemplo, 6'-SL) de contaminantes en un extracto o lisado de células bacterianas, o un sobrenadante de cultivo de células bacterianas. Los contaminantes incluyen el ADN bacteriano, las proteínas y los componentes de la pared celular, y los caramelos de azúcar amarillo/marrón algunas veces formados en reacciones químicas espontáneas en el medio de cultivo.

Los oligosacáridos se purifican y se usan en una serie de productos para el consumo humano y animal, como los animales de compañía (perros, gatos) y el ganado (bovino, equino, ovino, caprino o porcino, así como las aves de corral). Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende 6'-sialil-lactosa purificada (6'-SL) y un excipiente es adecuada para la administración oral. Grandes cantidades de 6'-SL se producen en huéspedes bacterianos, por ejemplo, una bacteria de E. coli que comprende una sialiltransferasa heteróloga, por ejemplo, una a(2,6) sialiltransferasa heteróloga. Una bacteria de E. coli que comprende una acumulación citoplásmica mejorada de cada uno de los siguientes: lactosa y CMP-Neu5Ac, es útil en tales sistemas de producción. En el caso de la lactosa, las vías metabólicas y los genes endógenos de E. coli se manipulan de manera que se genere un aumento de las concentraciones citoplásmicas de lactosa, en comparación con los niveles encontrados en E. coli de tipo natural. Por ejemplo, las bacterias contienen al menos un 10%, 20%, 50%, 2 *, 5 *, 10 * o más de los niveles en una bacteria de tipo natural correspondiente que carece de las modificaciones genéticas descritas anteriormente. En el caso de CMP-Neu5Ac, los genes de catabolismo Neu5Ac endógenos están inactivados y los genes de biosíntesis de CMP-Neu5Ac exógenos introducidos en E. coli dan como resultado la generación de una acumulación citoplásmica de CMP-Neu5Ac que no se encuentra en la bacteria de tipo natural.

Un método para producir una composición farmacéutica que comprende una hMOS purificada se lleva a cabo cultivando la bacteria descrita anteriormente, purificando la hMOS producida por la bacteria y combinando la hMOS con un excipiente o vehículo para producir un suplemento dietético para administración oral. Estas composiciones son útiles en métodos para prevenir o tratar enfermedades entéricas y/o respiratorias en bebés y adultos. Por consiguiente, las composiciones se administran a un sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad de este tipo usando métodos conocidos de terapia clínica.

La invención prevé aumentar, en E. coli, la concentración intracelular del nucleótido azúcar uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc). Esto se logra mediante la sobreexpresión del regulador positivo endógeno bifuncional de la síntesis de UDP-GlcNac y del represor del catabolismo de glucosamina y N-acetilglucosamina, nagC, opcionalmente de forma simultánea con el gen que codifica L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, glmS.

La invención también proporciona un aumento de la concentración intracelular de lactosa en E. coli, para células cultivadas en presencia de lactosa, mediante el uso de manipulaciones de genes endógenos de E. coli implicados en la importación, exportación y catabolismo de la lactosa. En particular, en el presente documento se describen métodos para aumentar los niveles de lactosa intracelular en E. coli genéticamente diseñados para producir un oligosacárido de la leche humana mediante la incorporación de una mutación lacA en la E. coli modificada genéticamente. La mutación lacA evita la formación de acetil-lactosa intracelular, que no solo elimina esta molécula como contaminante de las purificaciones posteriores, sino que también elimina la capacidad de E. coli para exportar el exceso de lactosa de su citoplasma, lo que facilita enormemente las manipulaciones intencionadas de la acumulación de lactosa intracelular de E. coli.

También se describen células huésped bacterianas con la capacidad de acumular un depósito de lactosa intracelular mientras que simultáneamente se poseen niveles bajos y funcionales de actividad citoplásmica de p-galactosidasa, por ejemplo, como lo proporciona la introducción de un gen recombinante funcional de E. coli lacZ, o por un gen de la p-galactosidasa de cualquiera de una serie de otros organismos (por ejemplo, el gen lac4 de Kluyveromyces lactis (por ejemplo, Número de Acceso de GenBank M84410.1 (GI:173304)). Los niveles bajos y funcionales de pgalactosidasa citoplásmica incluyen niveles de actividad de p-galactosidasa de entre 0,05 y 200 unidades, por ejemplo, entre 0,05 y 5 unidades, entre 0,05 y 4 unidades, entre 0,05 y 3 unidades, o entre 0,05 y 2 unidades (para una definición estándar véase: Miller JH, laboratorio CSH. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; 1972). Sin embargo, este bajo nivel de actividad de p-galactosidasa citoplasmática, aunque no es lo suficientemente alto como para disminuir significativamente la acumulación de lactosa intracelular, es muy útil para tareas tales como el marcado fenotípico de loci genéticos deseables durante la construcción de fondos de células huésped, para la detección de la lisis celular debida a contaminaciones de bacteriófagos no deseados en los procesos de fermentación, para la eliminación fácil de la lactosa residual no deseada al final de las fermentaciones, o para fines de control de calidad de la fermentación durante el proceso (es decir, como un fenotipo no estándar, la provisión de un fenotipo débil lacz ayuda en las evaluaciones de pureza del cultivo).

Los métodos para purificar un oligosacárido sialilado o que contiene N-acetilglucosamina producido por los métodos de la invención o descritos se llevan a cabo uniendo el oligosacárido de un lisado de células bacterianas o de un sobrenadante de cultivo de células bacterianas de la bacteria a una columna de carbono, y luego eluyendo de la columna. Los oligosacáridos purificados que contienen N-acetilglucosamina o sialilados se producen mediante los métodos de la invención o descritos en el presente documento.

Se describe un vector, por ejemplo, un vector que contiene un ácido nucleico. El vector puede incluir además uno o más elementos reguladores, por ejemplo, un promotor heterólogo. Los elementos reguladores pueden unirse operativamente a un gen de proteína, a un gen de proteína de fusión o a una serie de genes unidos a un operón para expresar la proteína de fusión. Para mantener estable el vector plasmídico dentro de la célula, se incluye un marcador seleccionable dentro de su secuencia, como un gen de resistencia a los antibióticos o un gen que complemente una auxotrofía nutricional de la bacteria huésped. Por ejemplo, en E. coli, una deficiencia de timidina causada por un defecto cromosómico en el gen de la timidilato sintasa (thyA) puede complementarse con una copia de tipo natural transmitida por el plásmido del gen thyA (M. Belfort, GF Maley, F. Maley, Proceedings of the National Academy of Sciences 80, 1858 (1983)). Alternativamente, una deficiencia de adenina causada por una deficiencia cromosómica en el gen de la adenilosuccinato sintetasa (purA) (S.A. Wolfe, J. M. Smith, J. Biol Chem 263, 19147-53 (1988)) puede complementarse con una copia de purA de tipo natural de plásmido. Se pueden utilizar dos vectores de plásmidos simultáneamente dentro de la misma célula bacteriana empleando marcadores seleccionables separados, por ejemplo, un plásmido que utilice la selección de thyA y uno que utilice la selección de purA, y utilizando dos replicones de plásmidos compatibles, por ejemplo, en E. coli. Los dos dichos replicones compatibles comprenden el replicón ColE1 (pUC) y el replicón p15A (pAcYc) (RE Bird, J Bacteriol 145, 1305-9 (1981)). En otro aspecto más, la invención comprende una célula recombinante aislada, por ejemplo, una célula bacteriana que contiene la(s) molécula(s) de ácido nucleico mencionada(s) o vector(es). Las secuencias de ácido nucleico pueden integrarse opcionalmente en el genoma.

Se describe un método para tratar, prevenir o reducir el riesgo de infección en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una composición que comprende un oligosacárido de leche humana, purificado a partir de un cultivo de una cepa recombinante de la presente invención, en donde el hMOS se une a un patógeno y en el que el sujeto está infectado o en riesgo de infección con el patógeno. La infección puede estar causada por un virus tipo Norwalk o Campylobacter jejuni. El sujeto es preferiblemente un mamífero que necesita tal tratamiento. El mamífero es, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo o un cerdo. Por ejemplo, las composiciones se formulan en piensos para animales (por ejemplo, peletes, croquetas, puré) o complementos alimenticios para animales de compañía, por ejemplo, perros o gatos, así como ganado o animales criados para el consumo de alimentos, por ejemplo, ganado vacuno, ovejas, cerdos, gallinas y cabras. Preferiblemente, el hMOS purificado puede formularse en un polvo (por ejemplo, polvo de fórmula infantil o polvo de suplemento nutricional para adultos, cada uno de los cuales se mezcla con un líquido como agua o zumo antes del consumo) o en forma de tabletas, cápsulas o pastas o se incorpora como componente en productos lácteos como la leche, cremas, quesos, yogures o kéfir, o como componente en cualquier bebida, o se combina en una preparación que contiene cultivos microbianos vivos destinados a servir como probióticos, o en preparaciones prebióticas destinadas a mejorar el crecimiento de microorganismos benéficos ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, el azúcar purificado (por ejemplo, LNnT o 6'-SL) se puede mezclar con un Bifidobacterium o Lactobacillus en una composición nutricional probiótica (es decir, las bifidobacterias son componentes beneficiosos de una flora intestinal normal y también se sabe que utilizan hMOS para el crecimiento).

Todos los genes descritos en el presente documento también incluyen una descripción de los productos génicos codificados correspondientes. Como tales, los usos de genes exógenos como se describen en este documento abarcan ácidos nucleicos que codifican las secuencias de productos génicos descritos en este documento. El experto en la materia podría generar fácilmente secuencias de ácido nucleico que codifiquen las secuencias de proteínas descritas en este documento e introducir dichas secuencias en vectores de expresión para llevar a cabo la presente invención.

La expresión "sustancialmente puro", en referencia a un polipéptido, polinucleótido u oligosacárido dado significa que el polipéptido, polinucleótido u oligosacárido está sustancialmente libre de otras macromoléculas biológicas. El polipéptido, polinucleótido u oligosacárido sustancialmente puro es al menos un 75% (por ejemplo, al menos 80, 85, 95 ó 99%) puro en peso seco. La pureza se puede medir mediante cualquier método estándar calibrado apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía en capa fina (TLC) o análisis por HPLC.

Se describen polinucleótidos, polipéptidos y oligosacáridos que se purifican y/o se aíslan. Purificado define un grado de esterilidad que es seguro para la administración a un sujeto humano, por ejemplo, que carece de agentes infecciosos o tóxicos. Específicamente, como se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico, polinucleótido, polipéptido, proteína u oligosacárido "aislada" o "purificada", está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Por ejemplo, las composiciones de hMOS purificadas tienen al menos un 60% en peso (peso seco) del compuesto de interés. La preparación puede tener al menos el 75%, al menos el 90%, y al menos el 99% en peso del compuesto de interés. La pureza se mide mediante cualquier método estándar calibrado apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía en capa fina (TLC) o análisis por HPLC. Por ejemplo, una "proteína purificada" se refiere a una proteína que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los que está naturalmente asociada. La proteína puede constituir al menos 10, 20, 5070, 80, 90, 95, 99-100% en peso seco de la preparación purificada.

Por "ácido nucleico aislado" se entiende un ácido nucleico que está libre de los genes que lo flanquean en el genoma natural del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. El término cubre, por ejemplo: (a) un ADN que forma parte de una molécula de ADN genómico natural, pero no está flanqueado por las dos secuencias de ácido nucleico que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que ocurre naturalmente (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de manera tal que la molécula resultante no sea idéntica a ningún vector natural o ADN genómico; (c) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que forma parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen además moléculas producidas sintéticamente, así como cualquier ácido nucleico que se haya alterado químicamente y/o que tenga estructuras modificadas. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado es un polinucleótido de ADNc o ARN purificado.

Un "promotor heterólogo", cuando está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico, se refiere a un promotor que no está asociado naturalmente con la secuencia de ácido nucleico.

El término "sobreexpresar", como se usa en este documento, se refiere a que la transcripción del gen o al producto genético codificado tiene 10%, 20%, 50%, 2 veces, 5 veces, 10 veces o más que el nivel expresado o producido por un gen nativo, natural o endógeno en una bacteria en la que ocurre naturalmente. Por ejemplo, la bacteria huésped descrita en el presente documento está diseñada para sobreexpresar una transcripción génica exógena o un producto génico codificado de UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa, nagC, glmS, glmY, glmZ, una sialil-transferasa, una p-galactosiltransferasa, una a-fucosiltransferasa, CMP-Neu5Ac sintetasa, una ácido sialico sintasa o una UDP-GlcNAc 2-epimerasa, es decir, un gen o producto génico con una secuencia correspondiente a la de una bacteria distinta de la bacteria huésped.

Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan en este documento, se refieren a la administración de un agente o formulación a un individuo clínicamente sintomático afectado por una afección, trastorno o enfermedad adversos, a fin de lograr una reducción en la severidad y/o frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o su causa subyacente, y/o facilitar la mejora o la reparación del daño. Los términos "prevenir" y "prevención" se refieren a la administración de un agente o composición a un individuo clínicamente asintomático que es susceptible a una condición, trastorno o enfermedad adversa en particular y, por lo tanto, se relaciona con la prevención de la aparición de síntomas y/o o su causa subyacente.

Por las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" de una formulación o componente de formulación se entiende una cantidad no tóxica pero suficiente de la formulación o componente para proporcionar el efecto deseado.

La expresión de transición "que comprende", que es sinónimo de "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por", es inclusiva o abierta y no excluye elementos o pasos de métodos no citados adicionales. Por el contrario, la frase de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en la reivindicación. La frase de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados "y aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción y de las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente cualquier experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puedan usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto con todas las patentes y solicitudes de patentes extranjeras publicadas citadas en este documento, las presentaciones de Genbank y NCBI indicadas por el número de acceso citado en este documento y la literatura científica publicada en este documento, la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es un esquema que muestra las rutas metabólicas y los cambios introducidos en ellas para diseñar la síntesis de 2'-fucosil-lactosa (2'-FL) en Escherichia coli (E. coli). Específicamente, se ilustran la ruta de la síntesis de lactosa y la ruta de la síntesis de GDP-fucosa. En la vía de la síntesis de GDP-fucosa: manA = fosfomanosa isomerasa (PMI), manB = fosfomanomutasa (PMM), manC = manosa-1-fosfato guanililtransferasa (GMP), gmd = GDP-manosa-4,6-deshidratasa, fcl = GDP-fucosa sintasa (GFS), y AwcaJ = UDP-glucosa transferida portadora lipídica de glucosa. Fig. 2 es un esquema que muestra las rutas metabólicas involucradas en la síntesis de UDP-GlcNAc (uridina difosfato N-acetilglucosamina) y catabolismo de la glucosamina y N-acetilglucosamina en E. coli. En el esquema: (GlcNAc-1-P) N-acetilglucosamina-1-fosfato; (GlcN-1-P) glucosamina-1-fosfato; (GlcN-6-P) glucosamina-6-fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; y (fruc-6-P) fructosa-6-fosfato; glmS (L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa), glmM (fosfoglucosamina mutasa), glmU (N-acetil glucosamina-1-fosfato uridiltransferasa y glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa fusionada), nagC (activador transactivo bifuncional/proteína represora), nagA (N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa) y nagB (glucosamina-6-fosfato desaminasa), nagE (transportador de N-acetilglucosamina) y manXYZ (transportador de glucosamina).

Fig. 3 es un esquema que muestra las rutas metabólicas y un ejemplo (que utiliza deleciones nanT, nanA y nanK) de los cambios introducidos en ellos para diseñar la síntesis de 6'-sialil-lactosa (6'-SL) en E. coli. Las abreviaturas incluyen: (Neu5Ac) ácido N-acetilneuramínico, ácido siálico; (AnanT) transportador del ácido N-acetilneuramínico mutado; (AnanA) liasa del ácido N-acetilneuramínico mutada; (ManNAc) N-acetilmanosamina; (AnanK) N-acetilmanosamina quinasa mutada; (nanE) epimerasa de N-acetilmanosamina-6-fosfato de tipo natural; (ManNAc-6-P) N-acetilmanosamina-6-fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; (GlcN-6-P) glucosamina-6-fosfato; (Fruc-6-P) Fructosa-6-fosfato; (neuA), sintetasa del ácido CMP-N-acetilneuramínico; (CMP-Neu5Ac) ácido CMP-N-acetilneuramínico; (neuB), sintasa del ácido N-acetilneuramínico; (neuC) UDP-GlcNAc-2-epimerasa; y (UDP-GlcNAc) uridina difosfato N-acetilglucosamina.

Fig. 4 es un esquema que ilustra la nueva configuración de genes diseñados en el locus thyA de Escherichia coli en cepas utilizadas para producir oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina.

Fig. 5 es un mapa de plásmido de pG292, que expresa el gen de la p (1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa de N. meningitidis lgtA.

Fig. 6 es un mapa plasmídico de pG221, que expresa, como un operón, el gen lgtA de p (1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa de N. meningitidis y el gen de E. coli O55:H7 wbgO p (1,3)-galactosiltransferasa.

Fig. 7 es un mapa plasmídico de pG222, que expresa, como un operón, el gen lgtA de N. meningitidis p (1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa y el gen 4GalT (jhp0765) p (1,4)-galactosiltransferasa de H. pylori.

Fig. 8 ilustra esquemáticamente las reacciones enzimáticas necesarias para producir a partir de la lactosa, a través del trisacárido intermedio lacto-N-triosa 2 (LNT2), los dos oligosacáridos de la leche humana: Lacto-N-tetraosa (LNT) y Lacto-N-neotetraosa (LNnT). Se presenta un cromatograma de capa fina (a la izquierda) de muestras de medio de cultivo tomadas de cultivos de E. coli a pequeña escala y que demuestran la síntesis de LNT2, LNT y LNnT. Se presenta un segundo cromatograma de capa fina (a la derecha) de muestras de medio de cultivo tomadas de un cultivo de biorreactor de E. coli de 15 L que demuestra la síntesis de LNnT.

Fig. 9 es un mapa plasmídico de pG317, un vector de baja copia que se expresa como un operón, bajo el control del promotor lac de E. coli, los genes neuB, neuC y neuA del Campylobacter jejuni ATCC43438, que codifican la N-acetilneuraminato sintasa, UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa, y N-acetilneuraminato citidililtransferasa, respectivamente.

Fig. 10 es un mapa plasmídico de pG315, un vector de copias múltiples que expresa un gen que codifica una sialiltransferasa a(2,6) de Photobacterium spp JT-ISH-224, bajo el control del promotor lac de E. coli.

Fig. 11 es una fotografía de un cromatograma de capa fina que muestra 6'-SL en medio de cultivo producido por la cepa E547 de E. coli (AnanRATEK), que contiene plásmidos que expresan una a(2,3) sialiltransferasa bacteriana y neuA, neuB y neuC. La Fig. 11 también muestra un análisis de TLC de sobrenadantes de cultivos de dos fermentaciones que producen 6'-sialilactosa (6'-SL). Las muestras a la izquierda de la figura se toman de una fermentación de una cepa de E. coli que contiene pG315 (que lleva un RBS fuerte frente al gen de la a(2,6) sialiltransferasa en el vector). Las muestras a la derecha de la figura se toman de una fermentación de una cepa de E. coli que contiene una variante cercana de pG315 que porta un RBS más débil frente al gen de la a(2,6) sialiltransferasa.

Fig. 12 es un mapa plasmídico de pG345, un vector de copias múltiples que expresa un gen que codifica una a(2,6) sialiltransferasa de Photobacterium spp JT-ISH-224, bajo el control de un sitio de unión ribosómico más débil (SEQ ID NO: 8) y el promotor lac de E. coli.

Fig. 13 es un esquema que muestra las rutas metabólicas y un segundo ejemplo (que utiliza deleciones nanT, nanA y nanE) de los cambios introducidos en ellos para diseñar la síntesis de 6'-sialil-lactosa (6'-SL) en E. coli. Las abreviaturas incluyen: (Neu5Ac) ácido N-acetilneuramínico, ácido siálico; (AnanT) transportador del ácido N-acetilneuramínico mutado; (AnanA) liasa del ácido N-acetilneuramínico mutada; (ManNAc) N-acetilmanosamina; (nanK) N-acetilmanosamina quinasa de tipo natural; (AnanE) N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa mutada; (ManNAc-6-P) N-acetilmanosamina-6-fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; (GlcN-6-P) glucosamina-6-fosfato; (Fruc-6-P) Fructosa-6-fosfato; (neuA), sintetasa del ácido CMP-N-acetilneuramínico; (CMP-Neu5Ac) ácido CMP-N-acetilneuramínico; (neuB), sintasa del ácido N-acetilneuramínico; (neuC) UDP-GlcNAc-2-epimerasa; y (UDP-GlcNAc) uridina difosfato N-acetilglucosamina.

Fig. 14 ilustra el análisis de TLC de sedimentos celulares y/o sobrenadantes de tres experimentos de fermentación a escala piloto que usan tres cepas de E. coli que llevan varias combinaciones de mutaciones nan.

Fig. 15 es un esquema que ilustra la ubicación de la eliminación del gen realizada dentro del operón nan de E. coli para generar el locus mutante [nanR+, nanA, nanT, nanE, nanK+] de las cepas E1017 y E1018.

Fig. 16 es una gráfica de la curva de crecimiento de la densidad celular de cuatro cultivos de E680 transformados con pG292, inducidos o no inducidos por la adición de triptófano, y en presencia o ausencia de lactosa en el medio de crecimiento. Se observa abundante lisis celular en los cultivos que contienen lactosa.

Fig. 17 es un mapa plasmídico de pG356, que expresa, como un operón, los genes glmS y nagC de E. coli. pG356 tiene un origen de replicación p15A y marcadores seleccionables tanto ampC como purA.

Fig. 18 es una traza de parámetros de fermentación y un análisis del sobrenadante del cultivo de TLC (para la producción de LNnT) de un cultivo de biorreactor de 1,5 l de E796 transformado con pG222.

Fig. 19 es una traza de parámetros de fermentación y un análisis del sobrenadante del cultivo de TLC (para la producción de LNnT) de un cultivo de biorreactor de 1,5 l de E866 transformado con pG222 y pG356.

Descripción detallada de la invención

En este documento se describen construcciones genéticas y métodos para la producción de oligosacáridos de leche humana (hMOS) que contienen N-acetilglucosamina y sialiloligosacáridos. Con el fin de producir tanto hMOS que contengan N-acetilglucosamina como que contengan sialilo, se necesita aprovechar la acumulación celular de ^u DP-GlcNAc. Hacerlo puede ser difícil, ya que UDP-GlcNAc es un metabolito esencial para las bacterias (usado para fabricar la pared celular). Las construcciones, composiciones y métodos de la invención o como se describen superan las dificultades del pasado al mejorar la acumulación de UDP-GlcNAc, una estrategia que representa una ventaja en la producción de ambas clases de hMOS. Otras distinciones sobre los enfoques anteriores representan mejoras y/o confieren ventajas sobre las estrategias anteriores.

hMOS

Los glicanos de la leche humana, que comprenden tanto oligosacáridos (hMOS) como sus glicoconjugados, desempeñan un papel importante en la protección y el desarrollo de los lactantes humanos y, en particular, en el tracto gastrointestinal (GI) infantil. Los oligosacáridos de leche que se encuentran en varios mamíferos difieren mucho, y su composición en humanos es única (Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48: 69-86; Newburg D. S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501: 3-10). Además, los niveles de glucano en la leche materna cambian a lo largo de la lactancia y también varían ampliamente entre individuos (Morrow A. L. et al., 2004 J Pediatr, 145: 297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11: 365-372). Anteriormente, una exploración completa de los roles de hMOS estaba limitada por la incapacidad de caracterizar y medir adecuadamente estos compuestos. En los últimos años se han desarrollado métodos cuantitativos sensibles y reproducibles para el análisis de hMOS neutros y ácidos (Erney, R., Hilty, M., Pickering, L., Ruiz-Palacios, G., y Prieto, P. (2001) Adv Exp Med Biol 501, 285-297. Bao, Y., y Newburg, D. S. (2008) Electrophoresis 29, 2508-2515). Se han identificado aproximadamente 200 oligosacáridos distintos en la leche humana, y las combinaciones de un pequeño número de epítopos simples son responsables de esta diversidad (Newburg DS, 1999 Curr_Med Chem, 6: 117-127; Ninonuevo M. et al., 2006 J Agric Food Chem, 54: 7471-74801). Los hMOS se componen de 5 monosacáridos: D-glucosa (Glc), D-galactosa (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), L-fucosa (Fuc) y ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico, Neu5Ac, NANA). Los hMOS generalmente se dividen en dos grupos según sus estructuras químicas: compuestos neutros que contienen Glc, Gal, GlcNAc y Fuc, unidos a un núcleo de lactosa (Galp1-4Glc), y compuestos ácidos que incluyen los mismos azúcares y, a menudo, las mismas estructuras del núcleo, más NANA (Charlwood J. y otros, 1999 Anal_Biochem, 273: 261-277; Martin-Sosa y otros, 2003 J Dairy Sci, 86: 52-59; Parkkinen J. y Finne J., 1987 Methods Enzymol, 138: 289-300; Shen Z. et al., 2001 J Chromatogr A, 921: 315-321). Aproximadamente el 70-80% de los oligosacáridos en la leche humana están fucosilados. Una proporción más pequeña de los oligosacáridos en la leche humana está sialilada, o está fucosilada y sialilada.

Curiosamente, los hMOS, como clase, sobreviven de manera muy eficiente a través del intestino de los bebés, en función de su transporte deficiente a través de la pared intestinal y de su resistencia a la digestión por las enzimas intestinales humanas (Chaturvedi, P., Warren, CD, Buescher, CR, Pickering, LK y Newburg, DS Adv Exp Med Biol 501, 315-323 (2001)). Una consecuencia de esta supervivencia en el intestino es que los hMOS pueden funcionar como prebióticos, es decir, están disponibles para servir como una fuente de carbono abundante para el crecimiento de microorganismos comensales del intestino residentes (Ward, RE, Niñonuevo, M., Mills, Da , Lebrilla, CB y German, JB (2007) Mol Nutr Food Res 51, 1398-1405). Recientemente, hay un creciente interés en el papel de la dieta y los agentes prebióticos en la determinación de la composición de la microflora intestinal, y en la comprensión del vínculo entre la microflora intestinal y la salud humana (Roberfroid, M., Gibson, GR, Hoyles, L., McCartney, AL, Rastall, R., Rowland, I., Wolvers, D., Watzl, B., Szajewska, H., Stahl, B., Guarner, F., Respondek, F., Whelan, K., Coxam, V., Davicco, MJ, Léotoing, L., Wittrant, Y., Delzenne, NM, Cani, PD, Neyrinck, AM y Meheust, A. (2010) Br J Nutr 104 Suppl 2, S1-63).

Varios glicanos de la leche humana poseen homología estructural con los receptores celulares para los enteropatógenos, y cumplen funciones en la defensa de los patógenos al actuar como "señuelos" de los receptores moleculares. Por ejemplo, las cepas patógenas de Campylobacter se unen específicamente a los glucanos en la leche humana que contiene el epítopo H-2, es decir, 2'-fucosil-N-acetillactosamina o 2'-fucosillactosa (2'-FL); la unión de Campylobacter y la infectividad son inhibidas por 2'-FL y otros glicanos que contienen este epítopo H-2 (Ruiz-Palacios, GM, Cervantes, LE, Ramos, P., Chavez-Munguia, B., y Newburg, DS (2003) J Biol Chem 278, 14112­ 14120). De manera similar, algunos patógenos diarreogénicos de E. coli son fuertemente inhibidos in vivo por hMOS que contiene restos de fucosa unidos por 2'. Varias cepas principales de calicivirus humanos, especialmente los norovirus, también se unen a los glucanos fucosilados unidos por 2', y esta unión es inhibida por los glucanos fucosilados unidos por enlaces 2' de la leche humana. El consumo de leche humana con altos niveles de estos fucosiloligosacáridos ligados en 2' se ha asociado con un menor riesgo de norovirus, Campylobacter, ST de diarrea asociada a E. coli y diarrea de moderada a grave de todas las causas en una cohorte mexicana de niños lactantes (Newburg DS et al., 2004 Glycobiology, 14: 253-263; Newburg DS et al., 1998 Lancet, 351: 1160-1164).

También se sabe que varios agentes patógenos utilizan glicanos sialilados como sus receptores anfitriones, como la influenza (Couceiro, JN, Paulson, JC & Baum, LG Virus Res 29, 155-165 (1993)), parainfluenza (Amonsen, M., Smith, DF, Cummings, RD y Air, GM J Virol 81, 8341-8345 (2007) y rotovirus (Kuhlenschmidt, TB, Hanafin, WP, Gelberg, HB y Kuhlenschmidt, MS Adv Exp Med Biol 473, 309-317 (1999)). El epítopo sialil-Lewis X es usado por Helicobacter pylori (Mandavi, J., Sondén, B., Hurtig, M., Olfat, FO, y col. Science 297, 573-578 (2002)), Pseudomonas aeruginosa (Scharfman, A., Delmotte, P., Beau, J., Lamblin, G., y otros, Glycoconj J 17, 735-740 (2000)), y algunas cepas de norovirus (Rydell, GE, Nilsson, J., Rodriguez-Díaz, J., Ruvoen-Clouet, N., et al. Glycobiology 19, 309-320 (2009)).

El nucleótido azúcar uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) es un intermediario metabólico clave en las bacterias, donde participa en la síntesis y el mantenimiento de la envoltura celular. En todas las clases bacterianas conocidas, UDP-GlcNAc se usa para elaborar peptidoglicanos (mureína); un polímero que comprende la pared celular bacteriana cuya integridad estructural es absolutamente esencial para el crecimiento y la supervivencia. Además, las bacterias gramnegativas utilizan UDP-GlcNAc para la síntesis de lípido A, un componente importante de la membrana celular externa. Por lo tanto, para las bacterias, la capacidad de mantener una acumulación intracelular adecuada de UDP-GlcNAc es crítica.

La biosíntesis de ciertos oligosacáridos de la leche humana (hMOS) se ha logrado en cepas modificadas por ingeniería genética de la bacteria, Escherichia coli K12. Como se describe en este documento, hMOS fucosilados simples, p. ej. la 2'-fucosillactosa (2'-FL), la 3-fucosillactosa (3-FL) y la lactodifucotetraosa (LDFT) se producen de manera eficiente por la E. coli viva mediante la mejora artificial de las reservas intracelulares existentes de GDP-fucosa (el nucleótido donante de azúcar) y la lactosa (el azúcar aceptante), y para usar estas reservas mejoradas como sustratos para fucosiltransferasas recombinantes heterólogas (Figura 1). Dado que ni las reservas de lactosa ni de GDP-fucosa son esenciales para la supervivencia de E. coli, la biosíntesis de hMOS fucosilado simple se logra con buenos rendimientos sin consecuencias negativas sobre el crecimiento o la viabilidad de la bacteria huésped. Sin embargo, para sintetizar hMOS más complejos en E. coli, se requiere el uso de la reserva bacteriana crítica de UDP-GlcNAc, con los consiguientes impactos potenciales en la viabilidad celular.

La reserva de UDP-GlcNAc en E. coli se produce a través de la acción combinada de tres genes glmS, glmS (L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa), glmM (fosfoglucosamina mutasa) y el glmU bifuncional (N-acetil glucosamina-1-fosfato uridiltransferasa y glucosamina-1-fosfato acetil transferasa fusionadas) (Figura 2). Estos tres genes dirigen un flujo constante de carbono a UDP-GlcNAc, un flujo que se origina con fructosa-6-fosfato (una molécula abundante del metabolismo central de energía). La expresión de los genes glm está bajo control positivo por la proteína activadora de la transcripción, NagC.

Cuando E. coli encuentra glucosamina o N-acetil-glucosamina en su ambiente, estas moléculas se transportan a la célula a través de proteínas de transporte de membrana específicas y se usan para complementar el flujo de carbono a la reserva de UDP-GlcNAc o, alternativamente, son consumidos para generar energía, bajo la acción de los productos génicos del operón nag (es decir, nagA [N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa] y nagB [glucosamina-6-fosfato desaminasa]). En contraste con los genes glm, la expresión de nagA y nagB están bajo el control transcripcional negativo, pero por la misma proteína reguladora que los genes glm, es decir, NagC. NagC es, por lo tanto, bifuncional, capaz de activar la síntesis de UDP-GlcNAc, mientras que al mismo tiempo reprime la degradación de la glucosamina-6-fosfato y la N-acetilglucosamina-6-fosfato.

La unión de NagC a secuencias de ADN reguladoras específicas (operadores), ya sea que dicha unión resulte en la activación o represión de genes, es sensible a las fluctuaciones en el nivel citoplásmico del inductor y metabolito de molécula pequeña, GlcNAc-6-fosfato. Las concentraciones intracelulares de GlcNAc-6-fosfato aumentan cuando la N-acetilglucosamina está disponible como una fuente de carbono en el medio ambiente y, por lo tanto, en estas condiciones, la expresión de los genes glm (esenciales para mantener la reserva vital de UDP-GlcNAc) disminuiría, a menos que se ponga en juego un mecanismo compensatorio. E. coli mantiene un nivel básico de síntesis de UDP-GlcNAc a través de la expresión continua de nagC dirigida por dos promotores constitutivos, ubicados dentro del gen nagA en sentido ascendente. Este nivel constitutivo de la expresión de nagC se complementa aproximadamente tres veces en condiciones en las que se induce el operón degradante de nag y, de este modo, E. coli garantiza un nivel adecuado de expresión del gen glm en todas las condiciones, incluso cuando se utiliza N-acetilglucosamina como fuente de carbono.

Muchos hMOS incorporan GlcNAc en sus estructuras directamente, y muchos también incorporan ácido siálico, un azúcar cuya síntesis implica el consumo de UDP-GlcNAc (FIG. 3, FIG. 13). Por lo tanto, la síntesis de muchos tipos de hMOS en E. coli diseñada por ingeniería genética conlleva el riesgo significativo de una reducción del rendimiento del producto y de la viabilidad celular comprometida que resulta del agotamiento de la reserva de UDP-GlcNAc de la bacteria. Una forma de abordar este problema durante la síntesis por ingeniería de hMOS que contiene GlcNAc o ácido siálico es aumentar la reserva de UDP-GlcNAc mediante la sobreexpresión simultánea de nagC, o preferiblemente mediante la sobreexpresión simultánea de nagC y glmS.

Si bien los estudios sugieren que los glicanos de la leche humana podrían usarse como prebióticos y como agentes antimicrobianos antiadherentes, la dificultad y el costo de producir cantidades adecuadas de estos agentes de una calidad adecuada para el consumo humano ha limitado sus pruebas a gran escala y su utilidad percibida. Lo que se ha necesitado es un método adecuado para producir los glicanos apropiados en cantidades suficientes a un costo razonable. Antes de la invención, hubo intentos de usar varios enfoques sintéticos distintos para la síntesis de glicanos. Los nuevos enfoques químicos pueden sintetizar oligosacáridos (Flowers, HM Methods Enzymol 50, 93­ 121 (1978); Seeberger, PH Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003)), pero los reactivos para estos métodos son caros y potencialmente tóxicos (Koeller, KM & Wong, CH Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)). Enzimas expresadas a partir de organismos modificados (Albermann, C., Piepersberg, W. y Wehmeier, UF Carbohydr Res 334, 97-103 (2001); Bettler, E., Samain, E., Chazalet, V., Bosso, C., y otros, Glycoconj J 16, 205-212 (1999); Johnson, KF Glycoconj J 16, 141-146 (1999); Palcic, MM Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Wymer, N. & Toone, EJ Curr Opin Chem Biol 4, 110-119 (2000) proporcionan una síntesis precisa y eficiente (Palcic, MM Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999)); Crout, D. H. y Vic, G. Curr Opin Chem Biol 2, 98-111 (1998)), pero el alto costo de los reactivos, especialmente los nucleótidos de azúcar, limita su utilidad para la producción a gran escala y bajo costo. Los microbios han sido diseñados genéticamente para expresar las glicosiltransferasas necesarias para sintetizar los oligosacáridos de la reserva innata de bacterias de los azúcares de nucleótidos (Endo, T., Koizumi, S., Tabata, K., Kakita, S. y Ozaki, A. Carbohydr Res 330, 439-443 (2001); Endo, T., Koizumi, S., Tabata, K. y Ozaki, A. Appl Microbiol Biotechnol 53, 257-261 (2000); Endo, T. y Koizumi, S. Curr Opin Struct Biol 10, 536-541 (2000); Endo, T., Koizumi, S., Tabata, K., Kakita, S. y Ozaki, A. Carbohydr Res 316, 179-183 (1999); Koizumi, S., Endo, T., Tabata, K. y Ozaki, A. Nat Biotechnol 16, 847-850 (1998)). Sin embargo, los bajos rendimientos generales del producto y la alta complejidad del proceso han limitado la utilidad comercial de estos enfoques.

Antes de la invención, que permite la producción barata de grandes cantidades de hMOS neutros y ácidos, no había sido posible investigar completamente la capacidad de esta clase de molécula para inhibir la unión de patógenos, o incluso explorar su gama completa de potenciales funciones adicionales.

Antes de la invención, las síntesis químicas de hMOS eran posibles, pero estaban limitadas por problemas de estéreo-especificidad, disponibilidad de precursores, impurezas del producto y alto costo general (Flowers, HM Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger, PH Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003); Koeller, KM & Wong, CH Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)). Además, antes de la invención, también eran posibles las síntesis enzimáticas in vitro, pero estaban limitadas por un requisito de precursores costosos de nucleótido-azúcar. La invención supera los inconvenientes de estos intentos previos al proporcionar nuevas estrategias para fabricar grandes cantidades de oligosacáridos de la leche humana para usar como suplementos dietéticos. La invención hace uso de una bacteria diseñada por ingeniería genética E. coli (u otra bacteria) diseñada para producir oligosacáridos sialilados en niveles comercialmente viables, por ejemplo, los métodos de la invención, o como se describen, permiten la producción de 3'-SL a > 50 g/L en biorreactores.

Variantes y fragmentos funcionales.

La presente invención presenta la introducción de genes exógenos en bacterias para manipular las vías para aumentar las reservas de UDP-GlcNAc, para producir oligosacáridos sialilados y para producir oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina. En cualquiera de los métodos de la invención, o como se describen, los genes o productos génicos pueden ser variantes o fragmentos funcionales de los mismos.

Una variante de cualquiera de los genes o productos genéticos descritos en este documento puede tener 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos descritas en el presente documento. La expresión "% de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia, según lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Por ejemplo, el % de identidad es relativo a la longitud total de las regiones codificantes de las secuencias que se comparan, o la longitud de un fragmento particular o dominio funcional del mismo.

Las variantes, como se describen, también incluyen homólogos, ortólogos o parálogos de los genes o productos génicos, como se describen, que conservan la misma función biológica que los genes o productos génicos especificados en el presente documento. Estas variantes se pueden usar indistintamente con los genes enumerados en estos métodos. Tales variantes pueden demostrar un porcentaje de homología o identidad, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad en dominios conservados importantes para la función biológica, tal como en un dominio funcional, por ejemplo, un dominio catalítico.

Para la comparación de secuencias, una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, las coordenadas de la subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula luego el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados. El porcentaje de identidad se determina utilizando BLAST y PSI-BLAST (Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215: 3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25:17, 3389-402). Para la búsqueda de PSI-BLAST, se emplean los siguientes parámetros ejemplares: (1) El umbral esperado era 10; (2) El costo de la brecha era Existencia: 11 y Extensión: 1; (3) La matriz empleada fue BLOSUM62; (4) El filtro para regiones de baja complejidad estaba "activado".

Los cambios pueden introducirse por mutación en la secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de cualquiera de los genes o productos genéticos descritos en el presente documento, lo que lleva a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína o enzima codificada, sin alterar la capacidad funcional de la proteína o enzima. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden realizarse en la secuencia de cualquiera de las secuencias expresamente descritas en este documento. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo en una posición en la secuencia que se puede alterar de la secuencia de tipo natural del polipéptido sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo en una posición que se requiere para la actividad biológica. Por ejemplo, no es probable que los residuos de aminoácidos que se conservan entre los miembros de una familia de proteínas sean susceptibles de mutación. Sin embargo, otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, aquellos que están mal conservados entre los miembros de la familia de proteínas) pueden no ser tan esenciales para la actividad y, por lo tanto, es más probable que sean susceptibles de alteración. Por lo tanto, se describen moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas o enzimas descritas en el presente documento que contienen cambios en los residuos de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento que no son esenciales para la actividad.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína homóloga a cualquiera de los genes descritos en el presente documento puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente, de manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. en la proteína codificada.

Se pueden introducir mutaciones en una secuencia de ácido nucleico de modo que la secuencia de aminoácidos codificada se altera mediante técnicas estándar, como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se realizan en uno o más restos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Ciertos aminoácidos tienen cadenas laterales con más de una característica clasificable. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, triptófano, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, tirosina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido dado se reemplaza con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de una secuencia de codificación dada, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para determinar la actividad biológica del polipéptido dado para identificar mutantes que retienen la actividad. A la inversa, la invención también proporciona variantes con mutaciones que mejoran o aumentan la actividad biológica endógena. Después de la mutagénesis de la secuencia de ácido nucleico, la proteína codificada puede expresarse mediante cualquier tecnología recombinante conocida en la técnica y puede determinarse la actividad de la proteína. El experto en la materia puede medir fácilmente un aumento, disminución o eliminación de una actividad biológica dada de las variantes descritas como se describe, es decir, midiendo la capacidad para mediar en la modificación, síntesis o degradación de los oligosacáridos (a través de la detección de los productos).

También se describen fragmentos funcionales de los genes o productos génicos como se describe en el presente documento. Un fragmento, en el caso de estas secuencias y todas las demás que se proporcionan en este documento, se define como una parte del todo que es menor que el todo. Además, un fragmento varía en tamaño desde un solo nucleótido o aminoácido dentro de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos hasta unos pocos nucleótidos o aminoácidos que la secuencia completa de polinucleótidos o polipéptidos. Finalmente, un fragmento se define como cualquier porción de una secuencia completa de polinucleótidos o polipéptidos que es intermedia entre los extremos definidos anteriormente.

Por ejemplo, los fragmentos de cualquiera de las proteínas o enzimas descritas en este documento o codificadas por cualquiera de los genes descritos en este documento pueden ser de 10 a 20 aminoácidos, de 10 a 30 aminoácidos, de 10 a 40 aminoácidos, de 10 a 50 aminoácidos, de 10 a 60 aminoácidos, de 10 a 70 aminoácidos, 10 a 80 aminoácidos, 10 a 90 aminoácidos, 10 a 100 aminoácidos, 50 a 100 aminoácidos, 75 a 125 aminoácidos, 100 a 150 aminoácidos, 150 a 200 aminoácidos, 200 a 250 aminoácidos, 250 a 300 aminoácidos, 300 a 350 aminoácidos, 350 a 400 aminoácidos, 400 a 450 aminoácidos, o de 450 a 500 aminoácidos. Los fragmentos abarcados en la presente invención comprenden fragmentos que retienen fragmentos funcionales. Como tales, los fragmentos pueden retener los dominios catalíticos que se requieren o son importantes para la actividad funcional. Los fragmentos pueden determinarse o generarse utilizando la información de secuencia en el presente documento, y los fragmentos pueden probarse para determinar la actividad funcional utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, la proteína codificada se puede expresar mediante cualquier tecnología recombinante conocida en la técnica y se puede determinar la actividad de la proteína. La función biológica de dicho fragmento puede medirse midiendo la capacidad para sintetizar o modificar un sustrato oligosacárido o, por el contrario, para catabolizar un sustrato oligosacárido.

Ejemplo 1. Ingeniería de E. coli para generar cepas huésped para la producción de oligosacáridos de leche humana que contienen N-acetilglucosamina

El protótrofo de E. coli K12, W3110, se eligió como fondo progenitor para la biosíntesis de hMOS. Esta cepa había sido modificada previamente en el locus ampC por la introducción de un constructo represor PtroB-cI+ inducible por triptófano (McCoy, J. y Lavallie, E. Current protocols in molecular biology/edited by Frederick M. Ausubel et al., (2001)), que permite la producción económica de proteínas recombinantes del promotor del fago A PL (Sanger, F., Coulson, AR, Hong, ^g F, Hill, DF y Petersen, GB J Mol Biol 162, 729-773 (1982)) mediante la inducción con concentraciones milimolares de triptófano (Mieschendahl, M., Petri, T. & Hanggi, U. Nature Biotechnology 4, 802-808 (1986)). La cepa G1724, un derivado de E. coli W3110 que contiene la construcción del represor PtrpB-cI+ inducible por triptófano en ampC, se usó en la base para otras manipulaciones de la cepa de E. coli.

La biosíntesis de hMOS requiere la generación de un reserva celular mejor de lactosa. Esta mejora se logró en la cepa G1724 mediante varias manipulaciones del cromosoma usando la recombinación A Red (Court, DL, Sawitzke, JA y Thomason, LC Annu Rev Genet 36, 361-388 (2002)) y la transducción de fagos generalizada P1 (Thomason, LC, Costantino, N. & Court, DL Mol Biol, Capítulo 1, Unidad 1.17 (2007)). La capacidad de la cepa huésped de E. coli para acumular lactosa intracelular se diseñó por primera vez mediante la eliminación simultánea del gen endógeno de p-galactosidasa (lacZ) y el gen represor del operón de lactosa (lacI). Durante la construcción de esta deleción, el promotor laclq se colocó inmediatamente cadena arriba del gen de la lactosa permeasa, lacY. La cepa modificada mantiene así su capacidad para transportar lactosa desde el medio de cultivo (a través de LacY), pero se elimina para la copia de tipo natural del gen lacZ (p-galactosidasa) responsable del catabolismo de la lactosa. Por lo tanto, se crea una reserva de lactosa intracelular cuando la cepa modificada se cultiva en presencia de lactosa exógena.

Una modificación adicional útil para aumentar la acumulación citoplásmico de lactosa libre (y, por lo tanto, el rendimiento final de hMOS) es la incorporación de una mutación lacA. LacA es una acetiltransferasa de lactosa que solo es activa cuando se acumulan altos niveles de lactosa en el citoplasma de E. coli. La alta osmolaridad intracelular (p. ej., causada por una alta acumulación de lactosa intracelular) puede inhibir el crecimiento bacteriano, y la E. coli ha desarrollado un mecanismo para protegerse de la alta osmolaridad intracelular causada por la lactosa al "marcar" el exceso de lactosa intracelular con un grupo acetilo utilizando LacA, y luego expulsando activamente la acetil-lactosa de la célula (Danchin, A. Bioessays 31, 769-773 (2009)). La producción de acetil-lactosa en E. coli diseñada para producir oligosacáridos de la leche humana es, por lo tanto, indeseable: reduce el rendimiento general. Además, la acetil-lactosa es un producto secundario que complica los esquemas de purificación de oligosacáridos. La incorporación de una mutación lacA resuelve estos problemas, ya que llevar una deleción del gen lacA hace que la bacteria sea incapaz de sintetizar acetil-lactosa.

Se introdujo una mutación thyA (timidilato sintetasa) eliminando casi por completo el gen thyA y reemplazándolo por un gen de E. coli lacZ+ funcional insertado, de tipo natural, pero sin promotor, que portaba el sitio de unión del ribosoma 2.8 (SEQ ID NO: 10) (AthyA::(2.8RBS lacZ+, kan1")). Se usó la recombinación A Red para realizar la construcción. La Fig. 4 ilustra la nueva configuración de genes así diseñados en el locus thyA. Se describe la secuencia completa de ADN de la región, con anotaciones en formato GenBank. La secuencia de ADN genómico que rodea la inserción lacZ+ en la región thyA se establece en la SEQ ID NO: 1.

El defecto thyA puede complementarse en trans suministrando un gen thyA de tipo natural en un plásmido multicopia (Belfort, M., Maley, G. F. & Maley, F. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80, 1858 (1983)). Esta complementación se usa en el presente documento como un medio de mantenimiento del plásmido (eliminando la necesidad de un esquema de selección de antibióticos más convencional para mantener el número de copias del plásmido).

El genotipo de la cepa E680 se da a continuación. E680 incorpora todos los cambios descritos anteriormente y es una cepa hospedadora adecuada para la producción de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina.

F'402 proA+B+, Placlq-lacY, A(lacI-lacZ)158, AlacA398/araC, Agpt-mhpC, AthyA::(2.8RBS lacZ+, KAN), rpoS+, rph+, ampC::(Ptrp T7g10 RBS-AcI+, CAT)

E796 es una cepa similar a E680 y porta una mutación thyA (timidilato sintetasa), introducida eliminando casi por completo el gen thyA y reemplazándolo por un gen de E. coli lacZ+ insertado, funcional, pero sin promotor, pero que lleva el sitio de unión del ribosoma 0.8 (SeQ ID NO: 11) [AthyA::(0.8RBS lacZ+, KAN)]. El genotipo de la cepa E796 se da a continuación. E796 incorpora todos los cambios descritos anteriormente y es una cepa hospedadora adecuada para la producción de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina.

F'402 proA+B+, Placlq-lacY, A(lacI-lacZ)158, AlacA398/araC, Agpt-mhpC, AthyA::(2.8RBS lacZ+, KAN), rpoS+, rph+, ampC::(Ptrp T7g10 RBS-AcI+, CAT)

E866 es una cepa similar a E796 y es útil para la selección de plásmidos duales. E866 también tiene una mutación thyA (timidilato sintetasa), introducida al eliminar casi por completo el gen thyA y reemplazarlo por un gen de E. coli lacZ+ funcional insertado, de tipo natural, pero sin promotor, y que lleva el sitio de unión al ribosoma 0.8 (SEQ ID NO: 11) [AthyA::(0.8RBS lacZ+)]. Además de la eliminación de thyA, E866 también conlleva una eliminación del gen purA. El genotipo de la cepa E866 se da a continuación. E866 incorpora todos los cambios descritos anteriormente y es una cepa hospedadora adecuada para la producción de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina. F'402 proA+B+, Placlq-lacY, A(lacI-lacZ)158, AlacA398/araC, Agpt-mhpC, AthyA::(0.8RBS lacZ+), rpoS+, rph+, ampC::(Ptrp T7g10 RBS-AcI+, CAT), ApurA727::KAN

Ejemplo 2. Producción de oligosacáridos de leche humana que contienen N-acetilglucosamina en E. coli: Lacto-N-tetraosa (LNT) y Lacto-N-neotetraosa (LNnT)

El primer paso en la síntesis (a partir de un precursor de lactosa) tanto de Lacto-N-tetraosa (LNT) como de Lacto-N-neotetraosa (LNnT) es la adición de un residuo de p(1,3)N-acetilglucosamina a la lactosa, utilizando una p(1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa heteróloga para formar Lacto-N-triosa 2 (LNT2). El plásmido pG292 (ColE1, thyA+, bla+, PL-lgtA) (SEQ ID NO: 2, FIG. 5) porta el gen lgtA p(1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa de N. meningitidis y puede dirigir la producción de LNT2 en la cepa de E. coli E680 en condiciones de cultivo apropiadas. pG221 (ColE1, thyA+, bla+, PL-lgtA-wbgO) (SEQ ID NO: 3, FIG. 6) es un derivado de pG292 que transporta (dispuesto como un operón) tanto el gen de lgtA p(1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa de N. meningitidis como el gen de wbgO p(1,3)-galactosiltransferasa de E. coli O55:H7. pG221 dirige la producción de LNT en la cepa de E. coli E680 en condiciones de cultivo apropiadas. pG222 (ColE1, thyA+, bla+, PL-IgtA-4GalT) (SEQ ID NO: 4, FIG. 7) es un derivado de pG292 que transporta (dispuesto como un operón) tanto el gen de lgtA p(1,3)-N-acetilglucosaminiltransferasa de N. meningitidis como el gen 4GalT (jhp0765) p(1,4)-galactosiltransferasa de H. pylori. pG222 dirige la producción de LNnT en la cepa de E. coli E680 en condiciones de cultivo apropiadas.

La adición de triptófano al medio de crecimiento que contiene lactosa de cultivos de cualquiera de las cepas derivadas de E680 transformadas con los plásmidos pG292, pG221 o pG222 conduce, para cada combinación particular de E680/plásmido, a la activación del triptófano del hospedador de E. coli, utilización del represor TrpR, la subsiguiente represión de PtrpB y la consiguiente disminución de los niveles citoplásmicos de cI, lo que resulta en una des-represión de P^l, expresión de lgtA, lgtA+wbgO, o IgtA+4GalT, respectivamente, y la producción de LNT2, LNT o LNnT, respectivamente.

Para la producción de LNT2, LNT o LNnT en cultivos de laboratorio a pequeña escala (<100 ml), las cepas se cultivaron a 30°C en un medio selectivo que carecía tanto de timidina como de triptófano hasta la fase exponencial temprana (p. ej., sales M9, glucosa al 0,5%, 0,4% de casaminoácidos). Luego se agregó lactosa a una concentración final de 0,5 o 1%, junto con triptófano (200 pM final) para inducir la expresión de las respectivas glicosiltransferasas, impulsadas por el promotor P^l. Al final del período de inducción (~ 24 h), se realizó un análisis de TLC en partes alícuotas del medio de cultivo libre de células. La Fig. 8 ilustra esquemáticamente las reacciones enzimáticas necesarias para producir, a partir de la lactosa, a través del trisacárido intermedio lacto-N-triosa 2 (LNT2), los dos oligosacáridos de la leche humana; Lacto-N-tetraosa (LNT) y Lacto-N-neotetraosa (LNnT). Se presenta un cromatograma de capa fina (a la izquierda) de muestras de medio de cultivo tomadas de cultivos de E.

coli a pequeña escala y que demuestran la síntesis de LNT2, LNT y LNnT (utilizando cultivos de E680 inducidos que contienen lactosa transformados con pG292, pG221 o pG222, respectivamente). Se presenta un segundo cromatograma de capa fina (a la derecha) de muestras de medio de cultivo tomadas de un cultivo de biorreactor E680/pG222 de 15 L de E. coli y que demuestra la síntesis de LNnT (así como el hMOS de mayor peso molecular, Lacto-N-neohexaosa, LNnH ).

Aunque los resultados anteriores demuestran claramente cómo es posible sintetizar oligosacáridos que contienen GlcNAc (es decir, LNT2, LNT y LNnT) en E. coli modificada, la FIG. 14 ilustra un problema serio al tratar de usar la reserva de UDP-GlcNAc de E. coli durante tales síntesis. En la Fig. 14 se cultivaron cuatro cultivos separados de E680, transformados con pG292, en presencia y en ausencia de lactosa, y con la expresión de LgtA, se indujo y no se indujo por adición de triptófano. Se puede ver claramente que se produce una lisis celular masiva en los cultivos donde está presente la lactosa, es decir, en aquellos cultivos en los que LgtA reduce la acumulación celular de UDP-GlcNAc agregando GlcNAc a la lactosa (y haciendo LNT2). Al hacerlo, la UDP-GlcNAc se desvía de la biosíntesis de la pared celular hacia la biosíntesis de hMOS y resulta en lisis celular. Esta lisis puede controlarse fácilmente no solo por la caída precipitada en la densidad del cultivo como se ve en la figura, sino también por la aparición de ADN en el medio de cultivo.

Ejemplo 3. El aumento de la acumulación de UDP-GlcNAc celular previene la lisis celular durante la biosíntesis de LNnT en E. coli modificada

Para examinar el impacto de la mejora de la acumulación celular de UDP-GlcNAc de E. coli durante la síntesis de hMOS que contiene N-acetilglucosamina, se construyó el plásmido p15A de replicón pG356 (Figura 19 y SEQ ID NO: 12). pG356 transporta un replicón p15A (compatible con los replicones ColE1), marcadores seleccionables purA y ampC, y un operón sintético (bajo el control del promotor pL) que lleva el glmS de E. coli (que codifica L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa) y nagC (que codifica el activador/represor transcripcional bifuncional de los operones glm y nag). Cuando pL está activo en las cepas que llevan el plásmido pG356, aumenta la acumulación de UDP-GlcNAc. La cepa E796 (ver ejemplo 1) se transformó con pG222 (FIG. 7), y la cepa E866 (ver ejemplo 1) se transformó con pG222 (FIG. 7) y pG356 (FIG. 19). (Las cepas E796 y E866 son isogénicas excepto por la mutación purA encontrada en E866 que se usa para la retención del plásmido pG356). Se realizaron corridas de fermentación idénticas de 1.5 L en cada una de las cepas transformadas. Se siguió la densidad óptica de los cultivos y la biosíntesis de LNnT, junto con los parámetros de fermentación estándar. Como puede verse en la fig.

18, el cultivo E796/pG222 produjo LNnT, pero se lisó cuando la densidad celular alcanzó 75 OD600, y alcanzó una densidad celular final al final de la fermentación de solo 50 OD600. En contraste (Figura 19) con el cultivo E866/pG222+pG356 (donde la expresión de los genes glmS y bagC mejora la acumulación intracelular de UDP-GlcNAc), también se produjo LNnT, pero sin lisis celular observada. En este cultivo, la densidad celular al final de la fermentación alcanzó 108 OD600, más del doble de la densidad alcanzada para E796/pG222.

Ejemplo 4. Producción de 6'-sialil-lactosa (6'-SL) por E. coli diseñada por ingeniería (AnanRATEK)

Para la producción de 6'-sialil-lactosa, se diseñó Escherichia coli GI724 (ATCC55151) con un conjunto de mutaciones que causaban la acumulación citoplásmica del precursor de lactosa no acetilado y prevenían la degradación del ácido N-acetil-5-neuramínico (Figura 3). En particular, se eliminaron los genes lacZ (pgalactosidasa) y lacA (lactosa acetil transferasa) del operón lac, dejando el represor Laclq y la permeasa LacY completamente funcionales. La permeasa LacY puede ser activada por promotores débiles (por ejemplo, lac8) o fuertes (por ejemplo, Ptac). El operón nan completo (nanRATEK; genes estructurales y reguladores involucrados en la degradación del ácido neuramínico) se eliminó en este ejemplo. Las manipulaciones del genoma de E. coli se lograron utilizando una combinación de técnicas genéticas moleculares estándar, específicamente la recombinación de lambda-Red, los intercambios de alelos con vectores de suicidio de selección positiva y las transducciones P1 (Figura 3). El genotipo huésped de la cepa E781, adecuado para la producción de hMOS sialilados, se presenta a continuación:

ampC::( Ptrp-AcI+), laclq lacPL8, AnanRATEK471, AlacZ690, AlacA 745

Para producir 6'-sialil-lactosa, la acumulación celular de UDP-GlcNAc se debe convertir en el precursor activado de azúcar-nucleótido, CMP-NeuAc, que, a su vez, puede funcionar como una molécula donante para un aceptor de azúcar (es decir, lactosa) en una reacción catalizada por sialiltransferasa (figura 3). Para este propósito, se expresaron de forma constitutiva tres genes de Campylobacter jejuni ATCC43438, que codificaban i) UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa (NeuC), ii) N-acetilneuraminato sintasa (NeuB), y iii) N-Acetilneuraminato citidliltransferasa (NeuA), en la cepa de E. coli diseñada anteriormente, junto con un gen que codificaba una a(2,6) sialiltransferasa de Photobacterium spp JT-ISH-224 (SEQ ID NO: 21 Acceso de la proteína del Genbank BAF92026). Los genes neu se expresaron a partir de un vector plasmídico de bajo número de copias (pG317, Figura 9, SEQ ID NO: 5) que llevaba un promotor lac constitutivo (pBBR1 ori, cat+, Plac), mientras que el gen de la a(2,6)sialiltransferasa fue expresado a partir de un vector plasmídico de alto número de copias (pG315, Figura 10, SEQ ID NO: 6) que llevaba un promotor lac constitutivo (ColE1 ori, bla+, Plac). Para evitar la síntesis de productos secundarios, la expresión relativa para el gen de la a(2,6)sialiltransferasa en comparación con los genes neu se modula mediante la ingeniería de diferentes sitios de unión ribosómica (RBS) que proporcionan diversos grados de eficiencia de la traducción cadena arriba del gen de la a(2,6)sialiltransferasa. Las cepas diseñadas se cultivaron a alta densidad en fermentadores a escala piloto utilizando una estrategia de lote a lote de alimentación. La Fig. 11 es un análisis de TLC de sobrenadantes de cultivos de dos fermentaciones de este tipo, con muestras a la izquierda de la figura tomadas de una fermentación de una cepa que contiene pG315 (y, por lo tanto, que lleva el RBS presentado en la SEQ ID NO: 7 frente al gen de a(2,6)sialiltransferasa en el vector). Las muestras a la derecha de la figura se toman de una fermentación de una cepa que contiene una variante cercana de pG315 (pG345, FIG. 12, SEQ ID NO: 9, que lleva el RBS más débil presentado en la SEQ ID NO: 8 delante del gen de a(2,6)sialiltransferasa y reemplazando el RBS presentado en la SEQ ID NO: 7). En ambos casos, el precursor de lactosa se añadió a una densidad celular de 50 OD⁶⁰⁰ y la conversión eficiente a productos finales se logró en las 48 horas posteriores a la adición de lactosa. El rendimiento final de 6'SL se incrementó cuando se utilizó el plásmido con el RBS más débil cadena arriba del gen de la a(2,6)sialiltransferasa y, además, el nivel del producto secundario KDO-lactosa se redujo significativamente al usar este RBS más débil. La identidad de la 6'-SL purificada mediante cromatografía en columna de carbón activado se confirmó mediante espectrometría de masas ESI y RMN.

Ejemplo 5. Producción de 6'-sialil-lactosa (6'-SL) por E. coli diseñada. (AnanA, AnanATE)

Para la producción de 6 'sialil-lactosa, se diseñó Escherichia coli GI724 (ATCC55151) con un conjunto de mutaciones que causaban la acumulación citoplásmica del precursor de lactosa no acetilada y que prevenían la degradación del ácido N-acetil-5-neuramínico (Figura 13). En particular, se eliminaron los genes lacZ (pgalactosidasa) y lacA (lactosa acetil transferasa) del operón lac, dejando el represor Laclq y la permeasa LacY completamente funcionales. La permeasa LacY puede ser activada por promotores débiles (por ejemplo, lac8) o fuertes (por ejemplo, Ptac). Si bien todo el operón nan (nanRATEK; genes estructurales y reguladores implicados en la degradación del ácido neuramínico) se puede eliminar para suprimir el catabolismo del ácido neuramínico como en el Ejemplo 4, también son adecuadas eliminaciones menores que abarcan solo los genes nanA, o nanA, nanT y nanE, o nanA y nanE. En todos los casos en los que se mutó el gen nanE, los últimos 104 bp del gen nanE se dejaron intactos para permitir la transcripción/traducción imperturbada de nanK cadena abajo, aunque son posibles otras longitudes de la secuencia nanE residual. Las manipulaciones del genoma de E. coli se lograron utilizando una combinación de técnicas genéticas moleculares estándar, específicamente la recombinación de lambda-Red, los intercambios de alelos con vectores suicidas de selección positiva y las transducciones P1 (Figura 13). Los genotipos hospedadores de las cepas E971, E1017 y E1018, adecuados para la producción de hMOS sialilados con diversos rendimientos y purezas, se presentan a continuación:

ampC::(Ptrp-AcI+), laclq lacPL8, AnanA::kanR, AlacZ690, AlacA::scar,

ampC::(Ptrp-AcI+), laclq lacPL8, AnanATE::kanR::nanK+, AlacZ690, AlacA::scar y

ampC::(Ptrp-AcI+), laclq lacPL8, AnanATE::cicat::nanK+, lacz690 AlacA::scar, respectivamente.

Para producir 6'-sialil-lactosa, la acumulación celular UDP-GlcNAc se debe convertir en el precursor activado de azúcar-nucleótido, CMP-NeuAc, que, a su vez, puede funcionar como una molécula donante para un aceptor de azúcar (es decir, lactosa) en una reacción catalizada por sialiltransferasa (figura 13). Para este propósito, se expresaron de forma constitutiva tres genes de Campylobacter jejuni ATCC43438, que codificaban i) UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa (NeuC), ii) N-acetilneuraminato sintasa (NeuB), y iii) N-Acetilneuraminato citidililtransferasa (NeuA), en la cepa de E. coli diseñada anteriormente, junto con un gen que codificaba una a(2,6) sialiltransferasa de Photobacterium spp JT-ISH-224. Los genes neu se expresaron a partir de un vector plasmídico de bajo número de copias (pG317, Figura 9, SEQ ID NO: 5) que llevaba un promotor lac constitutivo (pBBR1 ori, cat+, Plac), mientras que el gen de la a(2,6) sialiltransferasa fue expresado desde el RBS débil de la SEQ ID NO: 8 en un vector plasmídico de alto número de copias (pG345, Figura 12, SEQ ID NO: 9) que lleva un promotor lac constitutivo (ColE1 ori, bla , Plac). Las cepas diseñadas se cultivaron a alta densidad en fermentadores a escala piloto utilizando una estrategia de lote a lote de alimentación. La Fig. 14 es un análisis de TLC de gránulos de cultivo o sobrenadantes de tres de tales fermentaciones. El panel A muestra la producción y acumulación de 6'SL en las células de tres fondos genéticos (solo se muestran las mutaciones nan relevantes para las cepas E971, E1017 y E1018), el panel B y C muestran la producción y acumulación de 6'SL en el medio extracelular (sobrenadantes) en las cepas E971, E1017 y E1018 (solo se muestran las mutaciones nan relevantes) con rendimientos volumétricos máximos estimados de 15 g por litro de sobrenadante. En todos los casos, el precursor de lactosa se agregó a una densidad celular de 40 OD⁶⁰⁰ y la conversión en estado estacionario a productos finales se logró en aproximadamente 90 horas a partir de la adición de lactosa (EFT es el tiempo de fermentación transcurrido).

Las diversas secuencias presentadas en este documento se enumeran a continuación.

SEQ ID NO: 1

>E680_thyA::2.8RBS_lacZ cepa de Escherichia coli

CGGIIAXGCCAGIIGGCAXCXXCACGIAAAXAGAGCAAAXAGXCCCGCGCCIGGCTGGCG GTTTGCCATAGCCGTTGCGACTGCTGCCAGTATTGCCAGCCATAGAGTCCACTTGCGCTT AGCATGACCAAAATCAGCATCGCGACCAGCGTTTCAATCAGCGTATAACCACGTTGTGTT TTCATGCCGGCAGTATGGAGCGAGGAGAAAAAAAGACGAGGGCCAGTTTCTATTTCTTCG GCGCATCTTCCGGACTATTTACGCCGTTGCAGGACGTTGCAAAATTTCGGGAAGGCGrCT CGAAGAATTTAACGGAGGGTAAAAAAACCGACGCACACTGGCGTCGGCTCTGGCAGGATG T T T C G T A A T T A G A T A G C C A C C G G C G C T T T attaaacctactA T G A C C A T G A T T A C G G A T T CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATC GCCXTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC GCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTrGCCTGGTTTCCGGCAC CAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCG TCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATC CCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCA CATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCG TTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTC GTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGG TGATGGTGCTGCGCXGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGA GCGGCAXIIXCCGXGACGXCXCGXXGCXGCAXAAACCGACXACACAAAICAGCGAXXICC AXGXXGCCACXCGCXTTAATGAXGATXXCAGCCGCGCXGXACXGGAGGCXGAAGXXCAGA XGXGCGGCGAGXXGCGXGACXACCXACGGGXAACAGXXXCXXXAXGGCAGGGTGAAACGC AGGXCGCCAGCGGCACCGCGCCIXXCGGCGGXGAAAXXAXCGAXGAGCGXGGIGGXXAXG

c c g a x c g c g x c a c a c x a c g x c x g a a c g x c g a a a a c c c g a a a c x g x g g a g c g c c g a a a x c c CGAAXCXCXAXCGXGCGGXGGXXGAACXGCACACCGCCGACGGCACGCXGAXIGAAGCAG AAGCCTGCGAXGTCGGTXTCCGCGAGGTGCGGAXTGAAAAXGGTCTGCTGCTGCTGAACG GCAAGCCGXXGCXGAXTCGAGGCGXXAACCGXCACGAGCAXCAXCCXCXGCAIGGXCAGG ICAXGGAIGAGCAGACGAXGGXGCAGGAXAXCCXGCXGAXGAAGCAGAACAACXXXAACG CCGXGCGCXGXXCGCAXXATCCGAACCAXCCGCXGXGGTACACGCTGXGCGACCGCXACG GCCXGXATGXGGTGGAXGAAGCCAAXAXXGAAACCCACGGCAXGGTGCCAAIGAAXCGXC IGACCGAIGAXCCGCGCXGGCXACCGGCGAXGAGCGAACGCGXAACGCGAAXGGXGCAGC GCGAXCGIAAXCACCCGAGXGXGAXCAXCXGGXCGCXGGGGAAXGAAXCAGGCCACGGCG CXAAXCACGACGCGCXGXAXCGCXGGAXCAAAXCXGXCGAXCCIXCCCGCCCGGXGCAGX AIGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGAXAXXAXXIGCCCGAIGIACGCGCGCG TGGAXGAAGACCAGCCCXXCCCGGCXGTGCCGAAATGGICCAXCAAAAAATGGCXIXCGC IACCXGGAGAGACGCGCCCGCXGAXCCXXXGCGAAXACGCCCACGCGAXGGGIAACAGXC TTGGCGGTXTCGCXAAAXACTGGCAGGCGTTXCGTCAGXAXCCCCGXXXACAGGGCGGCX TCGXCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCXGATTAAATATGAXGAAAACGGCAACCCGTGGT CGGCXXACGGCGGXGAXXXXGGCGAXACGCCGAACGAXCGCCAGXXCXGXAXGAACGGXC IGGXCXXIGCCGACCGCACGCCGCAXCCAGCGCXGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGX TXXXCCAGXXCCGXTTAXCCGGGCAAACCATCGAAGXGACCAGCGAATACCIGXXCCGXC AXAGCGAIAACGAGCXCCXGCACXGGAXGGXGGCGCXGGAXGGXAAGCCGCXGGCAAGCG GXGAAGXGCCXCXGGAXGXCGCXCCACAAGGXAAACAGXXGAXXGAACXGCCIGAACXAC CGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACXCIGGCXCACAGXACGCGXAGIGCAACCGAACGCGA CCGCAXGGXCAGAAGCCGGGCACAXCAGCGCCXGGCAGCAGXGGCGXCXGGCGGAAAACC ICAGXGIGACGCTCCCCGCCGCGXCCCACGCCAXCCCGCAXCTGACCACCAGCGAAAXGG AXTXXXGCAXCGAGCXGGGXAAXAAGCGXXGGCAAXXXAACCGCCAGXCAGGCXXTCXXX CACAGAIGXGGAIXGGCGAXAAAAAACAACXGtXGACGCCGCXGCGCGAICAGXXCACCC GTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATXGACCCTAACGCCT GGGXCGAACGCXGGAAGGCGGCGGGCCAXXACCAGGCCGAAGCAGCGXXGXIGCAGXGCA CGGCAGAIACACXXGCXGAXGCGGXGCXGAXXACGACCGCXCACGCGXGGCAGCAXCAGG GGAAAACCIXAXXXAXCAGCCGGAAAACCXACCGGAXXGAXGGXAGXGGXCAAAXGGCGA IXACCGXIGAXGIXGAAGXGGCGAGCGAXACACCGCAXCCGGCGCGGAIIGGCCXGAACX GCCAGCTGGCGCAGGXAGCAGAGCGGGXAAACXGGCXCGGAIXAGGGCCGCAAGAAAACX ATCCCGACCGCCITACXGCCGCCXGXTXXGACCGCXGGGAXCXGCCAXXGICAGACAXGX AXACCCCGXACGXCIXCCCGAGCGAAAACGGXCXGCGCXGCGGGACGCGCGAAXXGAAXX AIGGCCCACACCAGXGGCGCGGCGACIICCAGXXCAACAXCAGCCGCXACAGICAACAGC AACXGAXGGAAACCAGCCAXCGCCAXCXGCXGCACGCGGAAGAAGGCACAXGGCXGAAXA TCGACGGTXXCCAXAXGGGGAXTGGXGGCGACGACTCCXGGAGCCCGXCAGXAXCGGCGG AAXXCCAGCXGAGCGCCGGXCGCXACCAXXACCAGXXGGXCXGGXGXCAAAAAXAAGCGG CCGCtTTATGXAGGCTGGAGCIGCTXCGAAGTXCCXATACXXXCXAGAGAATAGGAACXX CGGAATAGGAACXXCAAGAXCCCCXXAXXAGAAGAACXCGXCAAGAAGGCGAIAGAAGGC GAXGCGCIGCGAAXCGGGAGCGGCGAXACCGXAAAGCACGAGGAAGCGGXCAGCCCATXC GCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGC CACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCtGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATT C GGCAAGCAGGCAT CGCCAT GGGTCAC GAC GAGAT CCTCGCCGTCG GGCAT GCGCG C C T T GAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTG ATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTG GTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGAT GGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCC CAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAAC GCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACC GGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGC GGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCA AGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCC TGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCAT CCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGG TTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGC TACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATT CATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGTTCCGCTTCCTTTAGCA GCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTGCGGCAGCGTGAGCTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTAT ACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGAACTGCAGGTCGACGGATCCCCGGAATCATGGTTCC TCAGGAAACGTGTTGCTGTGGGCTGCGACGATATGCCCAGACCATCATGATCACACCCGC GACAATCATCGGGATGGAAAGAATTTGCCCCATGCTGATGTACTGCACCCAGGCACCGGT AAACTGCGCGTCGGGCTGGCGGAAAAACTCAACAATGATGCGAAACGCGCCGTAACCAAT CAGGAACAAACCTGAGACAGCTCCCATTGGGCGrGGTTTACGAATATACAGGTTGAGGAT AATAAACAGCACCACACCTTCCAGCAGCAGCTCGTAAAGCTGTGATGGGTGGCGCGGCAG CACACCGTAAGTGTCGAAAATGGATTGCCACTGCGGGTTGGTTTGCAGCAGCAAAATATC TTCTGTACGGGAGCCAGGGAACAGCArGGCAAACGGGAAGTTCGGGTCAACGCGGCCCCA CAATTCACCGTTAATAAAGTTGCCCAGACGCCCGGCACCAAGACCAAACGGAATGAGTGG TGCGATAAAATCAGAGACC T GGAAGAAGGAACGTTTAGTACGGCGGGCGAAGATAAT CAT CACCACGATAACGCCAATCAGGCCGCCGTGGAAAGACATGCCGCCGTCCCAGACACGGAA CAGATACAGCGGATCGGCCATAAACTGCGGGAAATTGTAGAACAGAACATAACCAATACG TCCCCCGAGGAAGACGCCGAGGAAGCCCGCATAGAGTAAGTTTTCAACTTCATTTTTGGT CCAGCCGCTGCCCGGACGATTCGCCCGTCGTGTTGCCAGCCACATTGCAAAAATGAAACC CACCAGATACATCAGGCCGTACCAGTGAAGCGCCACGGGTCCTATTGAGAAAATGACCGG ATCAAACTCCGGAAAATGCAGATAGCrACTGGTCATCTGTCACCACAAGTTCTTGTTATT TCGCTGAAAGAGAACAGCGATTGAAATGCGCGCCGCAGGTTTCAGGCGCTCCAAAGGTGC GAATAATAGCACAAGGGGACCTGGCTGGTTGCCGGATACCGTTAAAAGATATGTATA

SEQ ID NO: 2

>pG292, secuencia completa.

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA CAGCTTGrCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAggcg CCTCCTCAACCTGTATATTCGTAAACCACGCCCAATGGGAGCTGTCTCAGGTTTGTTCCT GATTGGTrACGGCGCGTTTCGCATCATIGTTGAGITTTTCCGCCAGCCCGACGCGCAGTT TACCGGTGCCTGGGTGCAGTACATCAGCATGGGGCAAATTCTTTCCATCCCGATGATTGT CGCGGGTGTGATCATGATGGTCTGGGCATATCGTCGCAGCCCACAGCAACACGTTTCCTG AGGAACCATGAAACAGTATTTAGAACTGATGCAAAAAGTGCTCGACGAAGGCACACAGAA AAACGACCGTACCGGAACCGGAACGCTTTCCATTTTTGGTCATCAGATGCGTTTTAACCT GCAAGATGGATTCCCGCTGGTGACAACTAAACGTTGCCACCTGCGTTCCATCATCCATGA ACTGCTGTGGTTTCTGCAGGGCGACACTAACATTGCTTATCTACACGAAAACAATGTCAC CATCTGGGACGAATGGGCCGATGAAAACGGCGACCTCGGGCCAGTGTATGGTAAACAGTG GCGCGCCTGGCCAACGCCAGATGGTCGTCATATTGACCAGATCACTACGGTACTGAACCA GCTGAAAAACGACCCGGATTCGCGCCGCATTATTGTTTCAGCGTGGAACGTAGGCGAACT GGATAAAATGGCGCTGGCACCGTGCCATGCATTCTTCCAGTTCTATGTGGCAGACGGCAA ACTCTCTrGCCAGCTTTATCAGCGCTCCTGTGACGTCTTCCTCGGCCTGCCGrTCAACAT TGCCAGCrACGCGTTATTGGTGCATATGATGGCGCAGCAGTGCGATCTGGAAGTGGGTGA TTTTGTCrGGACCGGTGGCGACACGCATCTGTACAGCAACCATATGGATCAAACTCATCT GCAATTAAGCCGCGAACCGCGTCCGCTGCCGAAGTTGATTATCAAACGTAAACCCGAATC CATCTTCGACTACCGTTTCGAAGACTTTGAGATTGAAGGCTACGATCCGCATCCGGGCAT TAAAGCGCCGGTGGCTATCTAATTACGAAACATCCTGCCAGAGCCGACGCCAGTGTGCGT C G G TXTTTTIA CCCTCCG TTA AA XTCTTCG AG ACGCCTTCCCGA AggcgccA TTCG CCA T TCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGC TGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGT CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACTGCTCACAAGAAAAAAGGCACGT CATCTGACGTGCCTTTTTTATTTGTACTACCCTGTACGATTACTGCAGGTCGACTCTAGA TGCATGCTCGAGTCAACGGTTTTTCAGCAATCGGTGCAAAATGCCGAAGTATTGCCTCAA GGTAAACAGCCGCCGCATCCTGCCGTCTGCCGCAAAATCCAGCCACGCGCCGGCGGGCAG CGTGTCCGTCCGTTTGAAGCATTGGTACAAAAACCGGCGGGCGCGTTCAAAATCTTCTTC CGGCAAATGTTTCTCCAGCAATTCATACGCTACTGCTTTTATTTGGCGGTATICAAGGCT GTCGAACCGGGTTTTAAAACCCATAGACTGCAAAAAATCGTTTCTGGCGGTTTTTTGGAT GCCTTGCGCGATTTCGTGTTGGCGGATGCTGTATTTGGATGAAACCTGATTGGCGTGAAG GCGGTATTTGACCAAGGCTTCGGGATAATAAGCCAGCCTGCCCAATTTGCTGACATCGTA CCAAAATTGGTAATCTTCCGCCCAATCCCGCTCGGTGTTGTAACGCAAACCGCCGTCAAT GACGCTGCGCCTCATAATCATCGTGTTGTTGTGTATGGGGTTGCCGAAAGGGAAAAAGTC GGCAATGTCTTCGTGTCGGGTCGGTTTTTTCCAAATTTTGCCGTGTTCGTGGTGCCGCGC CAGCCGGTTGCCGTCCTTTTCTTCCGACAAAACTTCCAGCCACGCACCCATCGCGATGAT GCTGCGGTCTTTTTCCATCTCACCCACGATTTTCTCAATCCAGTCGGGGGCGGCAATATC GTCTGCATCGGTGCGCGCAATATATTCCCCCCCCCCCCCCGACTTTGCCAATTCATCCAG CCCGAIGTTTAAAGAGGGAATCAGACCGGAATTGCGCGGCTGCGCGAGGATGCGGATGCG GCCGTCCTGTTCTTGGAAACGCTGGGCAAXGGCAAGCGTACCGXCCGTCGAGCCGTCATC GACAATCAAAATATCCAAGITGCGCCAAGTTIGATXCACGACGGCGGCIAATGAXTGGGC GAAAXATTTTTCTACGXTGTAGGCGCAAATCAATACGCTGACXAAAGGCTGCAAXTTATT C X C C C G A IA G G C A C G A X G C C G IC X G A A G G C X X C A G A C G G C A X A IG ta ta tc tc c ttc ttg aaXXCXAACAAXXGAXXGAAXGXAXGCAAAXAAAXGCAXACACCAXAGGXGXGGXXXAAX XXGAXGCCCXXXXXCAGGGCXGGAAXGXGXAAGAGCGGGGXXAXXXAXGCXGXXGXXXXX TXGXXACTCGGGAAGGGCXXXACCXCTXCCGCAIAAACGCXXCCAXCAGCGXTXAXAGXT AAAAAAAICXXXCGGAACXGGXXXXGCGCXXACCCCAACCAACAGGGGAXIXGCXGCXXI CCAXXGAGCCXGXXTCXCXGCGCGACGXXCGCGGCGGCGXGXXXGXGCAXCCAXCXGGAT TCXCCXGICAGXXAGCXXXGGTGGXGIGXGGCAGXXGXAGTCCXGAACGAAAACCCCCCG CGAXXGGCACAXXGGCAGCXAAXCCGGAAXCGCACXXACGGCCAAXGCXXCGIXXCGXAX CACACACCCCAAAGCCXXCXGCXXXGAAXGCXGCCCXXCTTCAGGGCXXAAXIXXXAAGA GCGICACCXXCAXGGXGGXCAGIGCGTCCIGCTGAXGXGCXCAGXAXCACCGCCAGXGGI ATTTATGTCAACACCGCCAGAGAXAArTXATCACCGCAGATGGTTATCTGTArGXTTTTT AXAXGAATXXAXXXTXXGCAGGGGGGCAXXGXXTGGXAGGXGAGAGAXCAAXTCXGCAXX AAXGAAXCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGXXIGCGXAXIGGGCGCXCXXCCGCXXCCT CGCXCACXGACXCGCXGCGCXCGGXCGXXCGGCXGCGGCGAGCGGXAXCAGCXCACXCAA AGGCGGXAAXACGGXXAXCCACAGAAICAGGGGAXAACGCAGGAAAGAACAXGXGAGCAA AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGXAAAAAGGCCGCGXXGCXGGCGXXXXXCCAXAGGC TCCGCCCCCCXGACGAGCAXCACAAAAAXCGACGCXCAAGXCAGAGGXGGCGAAACCCGA CAGGACXAXAAAGAIACCAGGCGXXXCCCCCXGGAAGCXCCCXCGXGCGCXCICCXGXXC CGACCCTGCCGCTXACCGGATACCIGTCCGCCXTICTCCCXTCGGGAAGCGTGGCGCTIT CXCAXAGCXCACGCTGXAGGXAXCXCAGXXCGGTGXAGGXCGXXCGCXCCAAGCXGGGCX GXGXGCACGAACCCCCCGXICAGCCCGACCGCXGCGCCIXAXCCGGIAACIAICGXCIXG AGXCCAACCCGGTAAGACACGACXXAICGCCACIGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTA GCAGAGCGAGGXAXGXAGGCGGXGCXACAGAGXTCXXGAAGXGGXGGCCXAACXACGGCX ACACXAGAAGGACAGXAXXXGGXAXCIGCGCXCIGCXGAAGCCAGXXACCXXCGGAAAAA GAGXXGGXAGCXCXXGAXCCGGCAAACAAACCACCGCXGGXAGCGGXGGXXXXXXXGXXX GCAAGCAGCAGAXXACGCGCAGAAAAAAAGGAXCXCAAGAAGAXCCXXXGAXCXXXXCXA

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>pG221, secuencia completa.

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA CAGCTIGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAggcg ccTCCTCA A CCTG TA TA TTCG TA A A CCA CG CCCA A TG G G A G CTG TCTCA G G TTTG TTCCT GATTGGTTACGGCGCGTTTCGCATCATTGTTGAGTTTTTCCGCCAGCCCGACGCGCAGTT TACCGGTGCCTGGGTGCAGTACATCAGCATGGGGCAAATTCTTTCCATCCCGATGATTGT CGCGGGTGTGATCATGATGGTCTGGGCATATCGTCGCAGCCCACAGCAACACGTTTCCTG AGGAACCATGAAACAGTATTTAGAACTGATGCAAAAAGTGCTCGACGAAGGCACACAGAA AAACGACCGTACCGGAACCGGAACGCITTCCATTTTTGGTCATCAGATGCGTTTTAACCT G CA A G A TG G A TTCCCG CTG G TG A CA A CTA A A CG rTG CCA CCTG CG TICCA TCA ICCA rG A ACTGCTGTGGTTTCTGCAGGGCGACACTAACATrGCTTATCTACACGAAAACAATGTCAC CATCTGGGACGAATGGGCCGATGAAAACGGCGACCTCGGGCCAGTGTATGGTAAACAGTG GCGCGCCTGGCCAACGCCAGATGGTCGTCATATTGACCAGATCACTACGGTACTGAACCA GCTGAAAAACGACCCGGATTCGCGCCGCATTATTGTTTCAGCGTGGAACGTAGGCGAACT 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CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCrCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTAC CGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTG TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAG ACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGT AGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACIACGGCTACACTAGAAGGACAGT ATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTAC GCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA GTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCAC CTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTA^ATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAAC TTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATT TCGTTCATCCATAGrTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTT ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTT ATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATC CGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAA TAGTTTGCGCAACGrTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGrCGTTTGG TATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTT GTGCAAAAAAGCGGrTAGCrCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGrTGGCCGC AGTGTTATCACTCArGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGT AAGATGCTTTTCTGrGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGrGTATGCG GCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAAC TTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTT TACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGG AATAAGGGCGACACGGAAArGTTGAArACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATrATTGAAG CATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAA ACAAArAGGGGirCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCAT TATTATCAXGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC SEQ ID NO: 4

>pG222, secuencia completa.

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAggcg ccTCCTCAACCTGTATATTCGTAAACCACGCCCAATGGGAGCTGTCTCAGGTrTGTTCCT GATTGGTTACGGCGCGTTTCGCATCArTGTTGAGTTTITCCGCCAGCCCGACGCGCAGTT XACCGGTGCCTGGGrGCAGTACATCAGCATGGGGCAAArTCTTrCCATCCCGATGATTGT CGCGGGTGTGATCArGATGGrCTGGGCATATCGTCGCAGCCCACAGCAACACGTXTCCrG AGGAACCATGAAACAGTATTTAGAACrGATGCAAAAAGTGCTCGACGAAGGCACACAGAA AAACGACCGTACCGGAACCGGAACGCrTTCCATTTTXGGTCATCAGATGCGirTTAACCT GCAAGATGGATTCCCGCTGGTGACAACTAAACGTTGCCACCTGCGTTCCATCATCCATGA ACTGCTGTGGTTTCTGCAGGGCGACACTAACATTGCTTATCTACACGAAAACAATGTCAC CATCTGGGACGAATGGGCCGATGAAAACGGCGACCTCGGGCCAGTGTATGGTAAACAGTG GCGCGCCTGGCCAACGCCAGATGGTCGTCATAXTGACCAGATCACTACGGTACTGAACCA GCXGAAAAACGACCCGGAXXCGCGCCGCAXXAXXGXXXCAGCGXGGAACGXAGGCGAACX GGATAAAATGGCGCXGGCACCGTGCCAXGCAXXCTTCCAGXXCXAXGXGGCAGACGGCAA 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CACACGCICXXGXAXCXCGXGGXXXXXAXGGCXCAAXGGCXCACXXXXXACACXGGCAXC AXACAAXAAAXGCAXCAAGCGGAXAXAGCCXAACXCXXGGAXGXGXXXXXCXAAAAAAXC CAAGCCCXCXXXAAAAXCCXCXXXCAAGGXXAXAXCGXCXXCXAAAAXACAGAXCGCXXC AXXGAGXICXAXGCAXXXXXCCCACAAGGAAXAAXGACXCGCAXAGCACCCAAGCXCCCC CAAGCXCAXAAACXXCGCAXGGXAXXXXAAAGCGXAAXAAAACXXAGAAACCXCACXGAX GAGAXXGGXXGXAAXCCCCAXGXCXXXGAXGXXXXGCGXGAXGAAAXAAGGGXGXAAAXG CXXXXTCACXAAGGGGXGCAACCCGCCTXCAAAAGXXXIAGAATAAAXCGCAXCAAAAAT XXGCGCXXGGXGGXGGGXGGCAXXGAIGCXAXXGAGXAAAGXXGXGGXGXCXCXAAAAAC TAAACCAAAIGTAICGCACACTXIXXGAXITAAAGAAATGGCAAAAACACGCAtAIGtat atCtCCttCttCTCGAGXCAACGGTXXXXCAGCAAXCGGXGCAAAAXGCCGAAGXATXGC CXCAAGGIAAACAGCCGCCGCAXCCXGCCGXCTGCCGCAAAAXCCAGCCACGCGCCGGCG GGCAGCGTGXCCGTCCGXTXGAAGCAXXGGXACAAAAACCGGCGGGCGCGXTCAAAATCX TCXXCCGGCAAAXGrXXCTCCAGCAAXXCAXACGCTACTGCXXTTATXXGGCGGXATXCA AGGCXGTCGAACCGGGXXTXAAAACCCAXAGACTGCAAAAAAXCGXXXCXGGCGGXTXXT XGGAXGCCXXGCGCGAXXTCGTGXTGGCGGAXGCXGXAXXXGGAXGAAACCXGAXXGGCG TGAAGGCGGXAXTXGACCAAGGCXTCGGGATAAXAAGCCAGCCTGCCCAArXXGCXGACA 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GCTTTCCATTGAGCCTGTTTCTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATC TGGATTCTCCTGTCAGTTAGCTTTGGrGGTGTGrGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACC CCCCGCGATTGGCACATTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTT CGTATCACACACCCCAAAGCCTTCTGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTT TAAGAGCGTCACCTICATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCA GTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAArTrATCACCGCAGATGGTTATCTGTATGT TTTTTATATGAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGATCAATTCT GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCA CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTG AGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCA TAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAA CCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCC TGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGC GCTTTCTCATAGCTCACGCrGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCT GGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCG TCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG GATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTA CGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGG AAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTT TGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTT TTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG ATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAT CTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCrTAATCAGTGAGGCACC TATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGAT AACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCC ACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAG AAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAG AGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGT GGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCG AGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGT TGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTC TCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCrGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC ATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAA TACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG AAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACC CAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAG GCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTT CCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGrTATTGTCTCATGAGCGGATACATATT

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SEQ ID NO: 5

>pG317, secuencia completa.

G TACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCA TAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGA AGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG CGCTCACIGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGC CAAC GCGC GGGGAGAGGC GG T T T GC G TAT TGG GCGCAT G CATAAAAAC TG T T G TAAT T CA TTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGC GGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAG AAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCT GAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTT TAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAA CACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTC CAGAGC GAT GAAAACGT T T CAG T T T GC T CAT G GAAAAC G GTGTAACAAGGG T GAACAC TA TCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAATTCCGGATGAGCATTCATC AGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTC TTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGAC TGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCA 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CGXGXTXTCXGGACGAXGGCGAGCCGXXGGAGCCGCCGACACGGGTCACGCIGCCGCGCC GGXAGCACIXGGGIIGCGCAGCAACCCGXAAGTGCGCXGXICCAGACIAXCGGCXGXAGC CGCCXCGCCGCCCXAXACCXTGXCTGCCXCCCCGCGXTGCGXCGCGGIGCAXGGAGCCGG GCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCICGCTAACGGAITCACCGTITTXAICA GGCXCTGGGAGGCAGAAXAAAXGATCAXAXCGTCAAXTAXXACCTCCACGGGGAGAGCCT GAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCXICCGGTAGTCAAXA AACCGGTAAACCAGCAAIAGACAXAAGCGGCTATXXAACGACCCTGCCCTGAACCGACGA CCGGGTCGAAXXXGCXXXCGAAXXTCXGCCAXTCAXCCGCXXAXTATCACXXAXXCAGGC GXAGCACCAGGCGXXXAAGGGCACCAAXAACTGCCXXAAAAAAAXXACGCCCCGCCCXGC CACXCAXCGCAGXCGGCCTAXXGGTXAAAAAAXGAGCXGAXXXAACAAAAAXXXAACGCG AATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTG CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA CGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTG GCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCG ATACCGTCGACCTCGAGTTAAGTCTCTAATCGATTGTTTTCCAATGGAATGGTTATAAAA TCTTTGGTTTTTAGTCTTGAAAATCTTCTAGGATTTTCTATGTAAGTTTTTGTATAAATA TTATATTGCTTTAATAAATTTAATATATTTTTATTGCATTTTAAGGTTATTTTTTCCATA TCTGTTCAACCTTTTTTAAATCCTCCAAACAGTCAAXATCTAAACTTGAGCTTTCGTCCA TTAAAAAATGCTTGGXTTTGCTTTGTAAAAAGCTAGGATTGTTTAAAAATTCTTTTATCT XXAAAATAXAAAXXGCACCAXXGCXCAXAXAAGXXTXAGGCAAXXXXXGCCXXGGCAXAA AAGGAXAXTCAXCATXACAAAXCCCXGCXAAAXCGCCACAATCAXXACAAACAAAGGCXX XXAGAATTTXATTAICACAXTCGCTTACGCTAATTAGGGCATTTGCATTGCTATTTTXAX AAAGAXTAAAAGCXICAIXAATATGAATATXXGITCTTAGCGGXGAAGTGGGTTGTAAAA AAACTACATCTTCATAAXCXTXATAAAATTTXAGAGCATGXAACAGCACXXTATCGCXTG XGGTAXCAICTIGIGCAAGGCTAAXTGGGCGXTXTAAAATATCAACAITXXGACTTXIIG CATAAXTTAAAAXXTCATCACTATCACTGCTXACAACAACTTTACXAATGCTTTTAGCAT XXAGTGCAGCTIXGAXCGXGXAGTAAAIXAAAGGTTTAITGTTXAAXAAAACCAAATXXI IATTTTTAATACCCITTGAGCCACCACGAGCAGGGATTATTGCTAAGCTCATTTTATATC CXXAAAAACXTIXXGXGXGCTGAGXXIAAAAAAAICTCCGCTTXGXAAAXAXXCAAAAAA TAATTXTGAGCTAXCXAAAAXCTCXAACTTAGCGCTAAATAAAXCXTGTXXTTTATGAAX

a g x g t x a a x a g c x x t x a g x a x x t c a x c a c x a x x x g c a x x a a c t x x x a g t g x a x x t x c a x x GCCAAGXCXXCCAXIXTGXCXXGAGCCAACXAAAATCCCXGCTGXXXXTAAGXATAAGGC CXCTTXTAAAATACAACTXGAATTACCXATXAXAAAAXCAGCAXXXXXTAACAAAGTXAX AAAATACTCAAAXCTAAGCGATGGAAAAAGCXTAAATCTAGGGXTATTTTXAAACTCTTC AXAGCXXXGCAAGAIXAAXXCAAAACCXAAAXCAXTAXXXGGAXAAAXAACAATAXAAXX ITTATTACTTTGIATCAGTGCTTTTACTAAAITGTCTGCTTGAITITTAATGCTAGTAAT TTCAGTTGTAACAGGATGAAACATAAGCAAAGCGTAGTTTTCATAATTTATATCATAATA TTTT TTTGCTTCGCIAAGTGAAATT T TATTATCGTT TAAAAGTTCTAAATCAGGCGAACC IATGATAAAAATAGATTTXXCATCTTCTCCAAGCTGCATTAAACGCCTTXXTGCAAACTC AXCATXTACXAAAXGAAXAXGAGCXAGTXTXGAXATAGCGXGGCGXAAGCXAXCGTCAAT AGTTCCTGAAAXCXCICCGCCTTCAAIATGCGCIACTAAGATAXXAITTAATGCTCCAAC AATAGCTGCTGCIAAAGGCXCAATICIATCXCCATGTACTACGAIIAAAXCAGGTTTXAG CXCATXXGCAXACCTXGAAAAXCCAXCAAXXGXAGTAGCTAAAGCCXXAXCAGTTTGAXA ATATTTATCATAATTTATAAATTCATAAATATTTTTAAAGCCATTTTTATAAAGTTCTTX AACTGTATAGCCAAAATTTTTACTTAAGTGCATTCCTGTTGCAAAGATGTAAAGTTCAAA XXCGCTTGAGTXXXGCACCCXGTACAIIAAAGAXTTAAXCITAGAAXAAXCAGCCCTAGA GCCTGXTATAAAAAGGATTXTTTTCACGCAAAATCCXCATAGCXTAACTGAGCATCAXTI XCTATATCXCTXAAIGCXXXTXTGCCXAAAAXAXTTTCAAATTCAGCCGCACTAATXCCA CCAAGXCCAGGTCTTTTAACCCAAATATTATCCATAGAXAAAACTTCGCCXTTTTTAATA XCXTTAAXGCIAACIACACXXGCAAAGGCAAAAXCAAXIGXAACXIGXTCXXGITIAGCC GCTTTXTIACTIXCAITAXXTCCTCTIATTAXAGCCATXTGCTCACITTGXAXAAITAGC XCXTTXAAAGCCXXIGXAXCCATAGAACAAACXATAXCAGGGCCACXXCXAXGCAXACXA TCAGTAAAATGTCXITCAAGCACACAAGCTCCAAGTACAACTGCACCTAAACACGCAAGA XTATCTGTTGTGXGGTCGCTTAAGCCTACCAXACAAGAAAATTCXXXTTXTAACTCAAGC ATAGCGTTTAATCTTACAAGATTATGCGGGGTTGGGTAAAGATTGGTCGTGTGCATTAAA ACAAAAGGAATTTCATTGTCTAATAAGATTTTTACAGTTGGTTXTATACTTTCAATACTA ITCATTCCTGTGCTAACTATCATAGGCTTTTIAAAGGCTGCTATGTGTTTAATAAGCGGA IAATTAXXACACXCACCXGAACCAAXCXXAAAAGCACXAACTCCCAXATCXXCTAAGCGG ITCGCACCTGCACGAGAAAAAGGTGTGCTAAGAXAAACAAGACCTAATTTTTCTGTGTAT XCTTTAAGTGCTAGCTCAXCTTTATAATCCAAAGCACAXTTTTGCAIAAXCTCATAAATG C X X A TITITG CA IIA CCA G G A A TTA CIIX TX IA G CG G C CTX A CICA ICTCA ICTTC A A CA AXATGAGTITGAXGCITXAXAATCITAGCACCXGCGCTAAAGGCXGCATCXACCATAATX XXAGCXAGXXCXAAACTGCCAXTAXGAIXAAXGCCTATXXCAGGXACGACXAAGGGXGCI IXTTCXTCACTXAXGATTAXAXTTTGIAITXXXATTTCITXCAXIIAXTXXCCTCCTXAG SEQ ID NO: 6

>pG315, secuencia completa CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC ATTTTTTA A CCAA TAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAA TCAAAAGAATAGACCGA GATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTC CAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCXATCAGGGCGATGGCCCACXACGTGAACCATCACC CTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAG CCCCCGAITTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAA AGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCAC CACACCCGCCGCGC TTAATGCGCCGC TACAGGGCGCGTCCCATTCGCCAT TCAGGCTGCG CAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGG GGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGXAACGCCAGGGTIXTCCCAGTCACGACGTTG XAAAACGACGGCCAGIGAGCGCGCGXAAXACGACXCACXAXAGGGCGAAXXGGAGCXCCA CCGCGGXGGCGGCCGCXCXAGAACXAGIGGAXCCCXAGACIGCAAXACAAACACCXGXXI CACAAXXXGGCAGAXCAGCCCAAAAAAGXACAXXCXCXICXIXXACAAXACCIAGXXXXA XCAXXACXXGAACXAAAGGACXXCXCAAAGCAGXXXCACGAXCAGXXAXAGXIXCXGXCG AXGTAAAAACXAXAAAXTXAAXTTXXXCAGCXGGXAXCGXGAAAXAXAAAGAGCTCGCXA XACCAGCAACXGCAICAGGAAGCAXAICXGXCAXCAXCAAAACXXCAAAXGAIAXXXXXG AXGGAAXAXCAACCAXXGAAGGAXAGXXXXGCAXXAXXAAXGXAXXAATGAXACCGCCAC CAGGGXGACCXXXGAAGAACAAAXCATAACXAXXGCCXAAAXAAXGXGGGCXCGAXXCAX XAAXXGCAXXAXXAAXGACAXXAAXXXGXXGXXXCGCAXAAXACXCXCXXXCAXGGXXAC CAGCCCAIACAGXCGXACCXGXAAACACAAAGXXXGGIAAAXXAGAXGAAIXAXAXXCAX XXXGXAAXXXXXGXXXGXCAAAAXXAACAAXCGAXAAGAAXAAXXCXXGXXGIXXGCXAX X G A A X IIIIIG A A A C C A IC C C A IX G C A IIIG C X IIA A A C IA IC A C C A A X A IA G IC X C G X A ACXCAXGXAAXGAXGGXXCXAAAGXXAAAXAAXCXXXXCIXAAAAAAXGGXAGXXAGCXG G A IA IA G IX IIIG C C A G IIA X A A A C A G A IG A IG IIC C X G IA IX X G A A G IG IC IIC A X IG A XACCAXXAAXGACAXCCXCAAGAXAAXCTXXACCAAXXXXXAAAXXAXCXGXXXXAXXXA AXGXAXCXCXCCAGXXAXAXAAAXXXACAXAXXCXGCXGAACCAXCAXCAXATAAAXCXA XAXTXGXIACCGXAACGXXAXXAAACGAATXXAATTCXXXIAGTAXTGGCACIAAAXXAI CAAAXGAAXGAGCAGXGXXAGAGCXAAGXXXAACAXXCAAXCXAXGCXXXGXXXGXGCXX GCXTAACAAXXXCXXGXACXAAGXCAGCXGGXGXATGGXIAXXXAXCAAXGCAAACGAXG XAAXAXXXAACXCXXXCAXXXGCXCAXCAGXCGGAACXAXXCXCCCCCAAGCXAXAXAXC XXXGXGCXGXAGGAXXXXCXXCTXCCGAXXXAAXAAXAXCCAXXAGCXGCXGAAGAGXXG GAAGAGAIGCAXGAICAACAXAAACCICIAAAGAXGGAGCCACXACGXXXAAIGXXACXX XXGXXAXAXAXXXXXCACCXXXAXXACTAACACCAXXAAAAXCAAAGCAGXACXXXXCAX CGXCAXCIAAXCGXGGCGCCACXACAGAXAAXGAXAXXGACXCXXXAIXXXGIXCXGXXA AXAGXXGXXGCGXACCACAAGXTXGXACCCAAGAGXGXIIXGXAAAAGAGAIGXXXGAXX G A IT A A X IG G C X C IA A A X X A A C A X A C IC C IC A X C A A X A A IA G X IX X A IT A A IA IC A X III X A A X A A X A G A X X G X G X A X X X X C TTCX G A C A X ggtctgtttcctcCX C G A G G G G G G G CC C G GXACCCAGCXXXXGXXCCC XXXAGXGAGGGX XAAXXGCGCGCXXGGCGXAAXCAXGGXCA XAGCXGXXXCCXGXGXGAAAXXGXXAICCGCXCACAAXXCCACACAACAXACGAGCCGGA AGCAXAAAGXGXAAAGCCXGGGGXGCCXAAXGAGXGAGCXAACXCACAXXAAXXGCGXXG CGCXCAC XGCCCGCIXXCCAGXCGGGAAACC XGXCGXGCCAGCXGCAXXAAIGAAXCGGC CAACGCGCGGGGAGAGGCGGXXXGCGXAXXGGGCGCXCXXCCGCXXCCXCGCXCACXGAC XCGCXGCGCXCGGXCGXXCGGCXGCGGCGAGCGGXAXCAGCXCACXCAAAGGCGGXAAXA CGGXXAXCCACAGAAXCAGGGGAXAACGCAGGAAAGAACAXGXGAGCAAAAGGCCAGCAA AAGGCCAGGAACCGIAAAAAGGCCGCGXXGCXGGCGXXXXXCCAXAGGCXCCGCCCCCCX

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SEQ ID NO: 7

CTCGAGgaggaaacagaccATG

SEQ ID NO: 8

CTCGAGgaaagaggggacaaactagATG

SEQ ID NO: 9

>pG345, secuencia completa

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC ATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGA GATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTC CAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACC CTAATCAAGTTTTTTGGGGrCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAG CCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAA AGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGrGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCAC CACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCrACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCG CAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCrTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGG GGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCA CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCTAGACTGCAATACAAACACCTGTTT CACAATTTGGCAGATCAGCCCAAAAAAGTACATTCTCTTCTTTTACAATACCTAGTTTTA TCATTACTTGAACTAAAGGACTTCTCAAAGCAGTTTCACGATCAGTTATAGTTTCTGTCG ATGTAAAAACTATAAATTTAATTTTTTCAGCTGGTATCGTGAAATATAAAGAGCTCGCTA TACCAGCAACTGCATCAGGAAGCATATCTGTCATCATCAAAACTTCAAATGATATTTTTG ATGGAATATCAACCATTGAAGGATAGTTTTGCATTATTAATGTATTAATGATACCGCCAC CAGGGTGACCTTTGAAGAACAAATCATAACTATrGCCTAAATAATGTGGGCTCGATTCAT TAATTGCATTATTAATGACATTAATTTGTTGTTTCGCATAATACTCTCTTTCATGGTTAC CAGCCCATACAGrCGIACCrGTAAACACAAAGTrTGGTAAATTAGAIGAArTAIATTCAT TTTGTAATTTTTGTTTGTCAAAATTAACAATCGATAAGAATAATTCTTGTTGTTTGCTAT TGAATTTTTTGAAACCATCCCATTGCATTTGCTTTAAACTATCACCAATATAGTCTCGTA ACTCATGTAATGATGGTTCTAAAGTTAAATAATCTTTTCTTAAAAAATGGTAGTTAGCTG GATATAGTTTTTGCCAGTTATAAACAGATGATGTTCCTGTATTTGAAGTGTCTTCATTGA TACCATTAATGACATCCTCAAGATAATCTTTACCAATTTTTAAATTATCTGTTTTATTTA ATGTATCTCTCCAGTTATATAAATTTACATATTCTGCTGAACCATCATCATATAAATCTA TATTTGTTACCGTAACGTTATTAAACGAATTTAATTCTTTTAGTATTGGCACTAAATTAT CAAATGAATGAGCAGTGTTAGAGCTAAGTTTAACATTCAATCTATGCTTTGTTTGTGCTT GCTTAACAATTTCTTGTACTAAGTCAGCTGGTGTATGGTTATTTATCAATGCAAACGATG TAATATTTAACTCTTTCATTTGCTCATCAGTCGGAACTATTCTCCCCCAAGCTATATATC TTTGTGCTGTAGGATTTTCTTCTTCCGATTTAATAATATCCATTAGCTGCTGAAGAGTTG GAAGAGATGCATGATCAACATAAACCrCTAAAGATGGAGCCACTACGTTTAATGTTACTT TTGTTATAIATTrTTCACCrTTATTACTAACACCATTAAAATCAAAGCAGrACITTTCAT CGTCATCTAATCGTGGCGCCACTACAGATAATGATATTGACTCTTTATTTTGTTCTGTTA ATAGTTGTTGCGTACCACAAGTTTGTACCCAAGAGTGTTTTGTAAAAGAGATGTTTGATT GATTAATTGGCTCTAAATTAACATACrCCTCATCAATAATAGTTTTATTAATATCATTTT T A A T A A T A G A T T G T G T A T T T T C T T C T G A C A T c ta g tttg tcccc tc tttcC T C G A G G G G G GGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCA TGGTCATAGCTGTTTCCTGrGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGA GCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCrAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATT GCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGA ATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTC ACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCG GTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGC CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGC CCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGA CTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACC CTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTC TCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAT AGCTCACGCTGTAGGTATCrCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTG CACGAACCCCCCGTrCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGrCrTGAGrCC AACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGA GCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACT AGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAG CAGCAGArTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG TCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAA AGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATA TATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTAICTCAGCG ATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATA CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCG GCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCT GCAACTTrATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGrAAGTAGT TCGCCAGrTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGrGTCACGC TCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGA TCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGrCAGAAGT AAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTC ATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAA TAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCA CATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCA AGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCT TCAGCATCTTTTACrTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCrTTTTCAA TATTATTGAAGCATrTAICAGGGTIATTGTCTCAIGAGCGGATACATATirGAATGTATT TAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC

SEQ ID NO: 10

CTTT attaaacctact ATG

SEQ ID NO: 11

^{í I I k ' l k . :k (. i A \ ( i}

SEQ ID NO: 12

>pEC3'-(T7)GlmS-(T7)NagC-purA_(pG356)

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCG C C actagtG T T G A G G A A A A C G A T T G G C T G A A C A A A A A A C A G A C T G A T C G A G G rC A TT T T T GAGTGCAAAAAGTGCTGIAACTCTGAAAAAGCGATGGTAGAATCCATTTTTAAGCAAACG GTGATTTTGAAAAATGGGTAACAACGTCGTCGTACTGGGCACCCAATGGGGTGACGAAGG TAAAGGTAAGATCGTCGATCTTCTGACTGAACGGGCTAAATATGTTGTACGCrACCAGGG CGGTCACAACGCAGGCCATACTCTCGTAATCAACGGTGAAAAAACCGTTCTCCATCTTAT TCCATCAGGTATTCTCCGCGAGAATGTAACCAGCATCATCGGTAACGGTGTTGTGCTGTC TCCGGCCGCGCTGATGAAAGAGATGAAAGAACTGGAAGACCGTGGCATCCCCGTTCGTGA GCGTCTGCTGCTGTCTGAAGCATGTCCGCTGATCCTTGATTATCACGTTGCGCTGGATAA CGCGCGTGAGAAAGCGCGTGGCGCGAAAGCGATCGGCACCACCGGTCGTGGTATCGGGCC TGCTTATGAAGATAAAGTAGCACGTCGCGGTCTGCGTGTTGGCGACCTTTTCGACAAAGA AACCTTCGCTGAAAAACTGAAAGAAGTGATGGAATATCACAACTTCCAGTTGGTTAACTA CTACAAAGCTGAAGCGGTTGATTACCAGAAAGTTCTGGATGATACGAXGGCTGTTGCCGA CATCCTGACTTCTArGGTGGTTGACGTTTCTGACCTGCTCGACCAGGCGCGTCAGCGTGG CGATTTCGTCATGTTTGAAGGTGCGCAGGGTACGCTGCTGGATATCGACCACGGTACTTA TCCGTACGTAACTTCTTCCAACACCACTGCTGGTGGCGTGGCGACCGGTTCCGGCCTGGG CCCGCGTTATGTTGATTACGTTCTGGGTATCCTCAAAGCTTACTCCACTCGTGTAGGTGC AGGTCCGTTCCCGACCGAACTGTTTGATGAAACTGGCGAGTTCCTCTGCAAGCAGGGTAA CGAATTCGGCGCAACTACGGGGCGTCGTCGTCGTACCGGCTGGCTGGACACCGTTGCCGT TCGTCGTGCGGTACAGCTGAACTCCCTGTCTGGCTTCTGCCTGACTAAACTGGACGTTCT GGATGGCCTGAAAGAGGTTAAACTCTGCGTGGCTTACCGTATGCCGGATGGTCGCGAAGT GACTACCACTCCGCrGGCAGCTGACGACTGGAAAGGTGTAGAGCCGATTTACGAAACCAT GCCGGGCTGGTCTGAATCCACCTTCGGCGTGAAAGATCGTAGCGGCCTGCCGCAGGCGGC GCTGAACTATATCAAGCGTATTGAAGAGCTGACTGGTGTGCCGATCGATATCATCTCTAC CGGTCCGGATCGTACTGAAACCATGATTCTGCGCGACCCGTTCGACGCGTAArTCTGGTA CGCCTGGCAGATATTTTGCCTGCCGGGCGAACAGTGTGATACATTGCTGTGTCGGGTAAG C C A T T A C G C T A T C C G A C A C A G IG T T A A A IC C T C G C T IT IT IC C T T C C C C a g a tC tG G C G C CATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTA TTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACTGCTCACAAGAAA A AA GG CACGTCATCrGACGTGCCTTTTTTATTTGTACIACCCTGTACGATIACTGCAGGT CGACTTAATTTTCCAGCAAATGCTGGAGCAAAATACCGTTGAGCATGGCGCGTTTTACCA GCGCAAAAGCGCCGATTGCCGAGCGGTGATCCAGCrCAGAACGTACCACCGGCAGAirAG TGCGAAACGCCTTCAGCGCCTGGGTATXAATGCAGCTTTCAATAGCAGGGAGCAGCACTT TATCGGCTTCGGTGATTTCACCGGCAATAACAATTTTTTGCGGATTAAATAAGTTGATAG CAATGGCGATGGTTTTACCCAGATGACGACCGACATACTCAATTACTTCCGACGCCAGAC TATCGCCTTTGTTCGCGGCTTTGCAGATAGTTTTGATGGTGCAGTCGTCCAGCGGCACGC GGCTCTGGTAGCCCTGCTTTAACAGATTCAACACCCGTTGTTCAATGGCAGCGTTGGCAG CGATAGTTTCCAGGCAGCCAAAGTIGCCGCAGTGGCAGCGTTCACCCAGCGGTTCGACCT GAATATGGCCAATTrCACCGACGTTGCCGTTGCGGCCAATAAAAATGCGCCCGTTAGAGA TAATCCCGGCCCCGGTTCCGCGATGGACACGCACCAGAATGGAGTCTTCGCAATCCTGAC TTGCACCGAAGTAGrGCTCCGCCAGCGCCAGACTACGGATATCGTGACCAACGAAACAGG TCACTTTAAAACGTrCTTCCAGAGCTTCTACCAGCCCCCAGTTTTCTACCTGAATATGCG GCATGTAATGAATTrTGCCGCTGTCCGGGTCAACAAGCCCTGGCAGGATCACCGAAArCG CGA TCA GCICG CG CAG XIIGCG CX GG IA GCIA TCA AIAA ACIG AG CAA TGG CA ITCAA CA GGGCAXGXXCCAGCGXXXGCXGGGXACGTTCCGGCAGCGGGXAATGXXCXXCXGCCAGCA CTTTGCTGCTGAGATCAAACAGAGTGATGGTGGCGTCATGACGACCAAGCCGXACGCCGA XXGCGXGGAAAT XGCGGGX XXCGGXGACGAXGGAGAXAGCGCGGCGGCCCCCGGTGGAGG CCTGCTGATCAACTTCTTTGAXCAGCCCGCGXTCGATAAGCTGACGCGTAATTTTGGTTA CGCTGGCGGGGGCAAGCXGGCITIGCXCGGCAAICTGAATCCGCGAGATTGGCCCGTACX GGXCAAXCAGGCGAXAAACCGCCGCGCXGXXAAGCTGTXXXACGAGAXCAACAXTACCXA XCXGAGCXTGTCCGCCTGGXGXCAXATGXAIATCTCCTXCXXgtcgacTCTAGAXGCAXG CXCGAGAXIACICAACCGTAACCGATTTIGCCAGGTTACGCGGCTGGXCAACGXCGGXGC CXXXGAXCAGCGCGACAXGGXAAGCCAGCAGCXGCAGCGGAACGGXGXAGAAGAXCGGXG CAAXCACCXCXXCCACAXGCGGCAXCICGAXGAIGTGCAXGXTAXCGCXACXXACAAAAC CCGCAXCCTGATCGGCGAAGACATACAACTGACCGCCACGCGCGCGAACTTCITCAAXGX XGGAXXXCAGXXXXXCCAGCAATTCGIXGXXCGGXGCAACAACAAXAACCGGCATAXCGG CATCAATTAGCGCCAGCGGACCGTGTTTCAGTTCGCCAGCAGCGTAGGCTTCAGCGTGAA XGXAAGAGAXCXCXXTCAACXXCAAXGCGCCXXCCAGCGCGATXGGGXACXGAXCGCCAC GGCCCAGGAACAGCGCGTGATGTTTGTCAGAGAAATCTTCTGCCAGCGCTTCAATGCGTT XGXCCXGAGACAGCAXCIGCICAATACGGCTCGGCAGCGCCTGCAGACCAXGCACGAIGX CAXGTXCAAXGGAGGCAXCCAGACCXIICAGGCGAGACAGCITCGCCACCAGCATCAACA GCACAGTXAACXGAGTGGXGAATGCXIXAGTGGAIGCCACGCCGAXTXCTGTACCCGCGX XGGTCAIXAGCGCCAGATCGGATXCGCGCACCAGAGAAGAACCCGGAACGrTACAGAXXG CCAGXGAACCAAGGXAACCCAGCICTXICGACAGACGCAGGCCAGCCAGGGTATCCGCGG XXXCGCCAGACXGXGACAAGGXGAXCAXCAGGCIGTXACGACGCACGGCAGAXXXGCGAX AGCGGAAITCAGAGGCGATITCGACGICGCACGGAATACCIGCTAGCGATTCAAACCAGI AGCGGGAAACCAXACCGGAGXXAXAAGAAGXACCACAGGCGAGGAXCXGAAXAXGCXCAA CCTTCGACAGCAGTTCGTCGGCGTTCGGTCCCAGCTCGCTTAAATCAACCTGACCGTGGC X G A TG CGX CCG GX AA GG G TG TITTIGA TCG CG TICGG CIGITCG TA GA TCTCrX TCTGCA XGXAGXGACGGXAAAXGCCITIAXCGCCCGCGXCATATXGCAGAXXGGAXXCGATAXCCX GACGTXIIACXTCCGCGCCAGITTTAXCGAAGAXGTITACCGAACGGCGAGIGATTTCCG CAATAXCGCCCICXXCAAGGAAGAIAAAGCGACGGGXCACCGGCAACAGCGCCAGCTGGX CAGAAGCGATAAAGTTTTCGCCCATCCCCAGGCCAATCACCAGCGGACTACCAGAACGTG CCGCCAGCAGGGTATCCGGGTGACGGGAGTCCATGATCACTGTACCGTACGCACCACGCA GCTGCGGGATAGCACGCAGAACGGCCTCACGCAGAGTCCCGCCTTGTTTCAGCTCCCAGT TCACCAGATGGGCAATCACTTCGGTGTCGGTTTCAGAAACGAAGGTATAGCCACGCGCTT TTAGCTCTTCACGCAGCGGTTCATGGTTTTCGATGATGCCGTTATGCACCACCACAATGT GTTCAGAAACATGCGGATGCGCATTCACTTCTGAAGGTTCACCGTGGGTCGCCCAGCGAG TGTGAGCAATACCAGTGCCGCCATGCAGAGGATGTTCTTCCGCTGCCTGTGCCAGCATCT GGACTTTACCGAGGCGACGCAGGCGGGTCATATGACCTTCTGCATCAACAACGGCCAGAC CGGCAGAGTCATATCCGCGGTATTCCAGACGACGTAAACCTTCAAGAAGGATTTCTGCTA CATCACGTTGCGCGATCGCGCCAACAATTCCACACATATGtatatCtCCttCttgaaTTC TAACAATTGATTGAATGTATGCAAATAAATGCATACACCATAGGTGTGGTTTAATTTGAT GCCCTTTTTCAGGGCTGGAATGTGTAAGAGCGGGGTTATTTATGCTGTTGTTTTTTTGTT ACTCGGGAAGGGCTTTACCTCTTCCGCATAAACGCTTCCATCAGCGTTTATAGTTAAAAA AATCTTTCGGAACTGGTTTTGCGCTTACCCCAACCAACAGGGGATTTGCTGCTTTCCATT GAGCCTGTTTCTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATCTGGATTCTCC TGTCAGTTAGCTTTGGTGGTGTGTGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACCCCCCGCGATT GGCACATTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTTCGTATCACAC ACCCCAAAGCCTTCIGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTTTAAGAGCGTC ACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTA TGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATGTTTTTTATATG AATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGATCAATTCTGCATTAATGA ATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTGCTAGCGGA GTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTGCTTCATGTGGC AGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCGCT TCCTCGCTCACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTAC GAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGCCAGGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGG CCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCACGAAATCTGAC GCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG GCGGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGT TATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCTGACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCC AAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAAC TATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGT AATTGATTTAGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGAC AAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCCAGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCA GAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAGCAAGAGATTAC GCGCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCTAGGC

ggccgcGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTT CACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTA AACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCT ATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGG CTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGA TTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTT ATCCGCCTCCATCCAGTCIATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGT TAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTT TGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCAT GTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGC CGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATC CGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTAT GCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAG AACTT TAAAAGTGC TCATCAT TGGAAAACGT TC TTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCT T ACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATC T T T TAC T T T CAC CAGCGTTTC TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAA GGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTG AAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAA TAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAAC CATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC SEQ ID NO: 13

>neuC_N-acetylglucosamine-6-phosphate-2-epimerase_GI_15193223_in_pG317 MKKILFITGSRADYSKIKSLMYRVQNSSEFELYIFATGMHLSKNFGYTVKELYKNGFKNI YEFINYDKYYQTDKALATTIDGFSRYANELKPDLIVVHGDRIEPLAAAIVGALNNILVAH IEG G EISG TID D SLR H A ISK LA H 1H LV N D EFA K RR LM Q LG ED EK SIFIIG SPD LELLN D N KISLSEAKKYYDINYENYALLM FHPVTTEITSIKNQADNLVKALIQSNKNYIVIYPNNDL G FE L IL Q SY E E FK N N PR FK L FPSL R FE Y FIT L L K N A D FIIG N SSC IL K E A L Y L K T A G IL V GSRQNGRLGNENTLKVNANSDEILKAINTIHKKQDLFSAKLEILDSSKLFFEYLQSGDFF KLSTQKVFKDIK SEQ ID NO: 14

>neuB_sialic_acid_synthase_GI_15193222_in_pG317

M K E IK IQ N IIISE E K A PLV V PEIG IN H N G SLELA K IM V D A A FSA G A K IIKHQTHIVEDEM SKAAKKVIPGNAKISIYEIMQKCALDYKDELALKEYTEKLGLVYLSTPFSRAGANRLEDM G V SA FK IG SG ECN N Y PLIK H IA A FK K PM IV STG M N SIESIK PTV K ILLD N EIPFV LM H TT NLYPTPHNL\^RLNAMLELKKEFSCMVGLSDHTTDNLACLGAWLGACVLERHFTDSMHRS

G PD IV CSM D TK A LK ELIIQ SEQ M A II RGNNE S KKAAKQEQVTIDFAFASW S I KDIKKGE VLSM DNIW KRPGLGGISAA EFEN ILGKK ALRDIEND AQLSYEDFA SEQ ID NO: 15

>neuA_CMP-Neu5Ac_synthase_GI_15193224_in_pG317

M SLA IIPA R G G SK G IK N K N LV LLN N K PLIY Y TIK A A LN A K SISK V W SSD SD EILN Y A K S QNVDILKRPISLAQDD TTSD KVLLHA LKFYKDYED W FLQPTSPLRTNIH INEAFNLYK N SNANALISVSECDNKILKAFVCNDCGDLAGICNDEYPFM PRQKLPKTYM SNGAIYILKIK EFLNNPSFLQSKTKHFLM DESSSLDIDCLEDLKKVEQIW KK SEQ ID NO: 16

>AAF42258 lacto-N-neotetraosa biosíntesis glicosilo transferasa LgtA [Neisseria meningitidis MC58].

MPSEAFRRHRAYRENKLQPLVSVLICAYNVEKYFAQSLAAVVNQTWRINILDILIVDDGSTD GTLAIAQRFQEQDGRIRILAQPRNSGLIPSLNIGLDELAKSGGGGEYIARTDADDIAAPD WIEKIVGEMEKDRSIIAMGAWLEVLSEEKDGNRLARHHEHGKIWKKPTRHEDIADFFPFG NP1HNNTMIMRRSVIDGGLRYNTERDWAEDYQFWYDVSKLGRLAYYPEALVKYRLHANQV SSKYSIRQHEIAQGIQKTARNDFLQSMGFKTRFDSLEYRQIKAVAYELLEKHLPEEDFER ARRFLY QCFKRT DTLPAGAWLDFAADGRMRRLFTLRQYFGILHRLLKNR SEQ ID NO: 17

>NP_207619 epítopo lipopoligosacárido 5G8 proteína asociada a la biosíntesis Lex2B [Helicobacter pylori 26695]. M RVFAISLNQKVCDIFGLVFRDTTTLLNSINATHHQAQIFDAIYSKTFEGGLHPLVKKHL HPYFITQNIKDM GITTNLISEVSKFYYALKYHAKFM SLGELGCYASHYSLW EKCIELNEA ICILED D ITLK ED FK EG LD FLEK H IQ ELG Y IRLM H LLY D A SV K SEPLSH K N H EIQ ERV G I IKAYSEGVGTQGYVITPKIAKVFLKCSRKW W PVDTIM DATFIHGVKNLVLQPFVIADDE

. ^{t .. 1 ._ i _ t - T - - - T J - - - [■■■■■ r - -}SEQ ID NO: 18

> E.coli_WbgO_YP_003500090 supuesta glicosil-transferasa WbgO [cepa de Escherichia coli O55: H7 CB9615].

MIIDEAESAESTHPWSVILPVNKKNPFLDEAINSILSQTFSSFEIIIVANCCTDDFYNE LKHKVNDKIKLIRTNIAYLPYSLNKAIDLSNGEFIARMDSDDISHPDRFTKQVDFLKNNP YVDWGTNAIFIDDKGREINKTKLPEENLDIVKNLPYKCCIVHPSVMFRKKVIASIGGYM FSNYSEDYELWNRLSLAKIKFQNLPEYLFYYRLHEGQSTAKKNLYMVMVNDLVIKMKCFF

L T G N IN Y L F G G IR T IA S FIY C K Y IK SEQ ID NO: 19

>BAA35319 regulador doble transcripcional de unión al ADN nagC [cepa de Escherichia coli K-12 sustr. W3110]. M TPGGQA QIGNV DLVKQLNSAAVYRLIDQYGPISRIQIAEQSQLAPASVTKITRQLIERG L I KEVDQQAS TGGRRAISIV TETRN FH AIGVRLGRHD ATI TLFD LS SKVLAEEHYPLPER TQQTLEHALLNA IAQFIDSYQ RK LRELIAISVILPGLV DPD SG KIHYM PHIQVENW GLVE ALEERFKVTCFVGHD IRSLALAEHYFGASQDCEDSILV RV HRG TGAGIISNGRIFIGRNG NVG EIGHIQVEPLGERCHCGNFGCLETIAANAAIEQRVLNLLKQGYQSRVPLDDCTIKTI C K A A N K G D SLA SEV IEY V G R H LG K T IA IA IN LFN PQ K IV IA G EITEA D K V LLPA IESCIN TQALKAFRTNLPW RSELDHRSAIGAFALVKRAM LNGILLQHLLEN SEQ ID NO: 20

>NP_418185 L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa glmS [cepa de Escherichia coli K-12 sustr. MG1655].

MCGIVGAIAQRDVAEILLEGLRRLEYRGYDSAGLAWDAEGHMTRLRRLGKVQMLAQAAE EHPLHGGTGIAHTRW ATHGEPSEVNAHPHVSEHIVW HNGIIENHEPLREELKARGYTFV SETDTEVIAHLVNWELKQGGTLREAVLRAIPQLRGAYGTVIMDSRHPDTLLAARSGSPLV IG LG M G EN FIA SD Q LA LLPV TRRFIFLEEG D IA EITRRSV N IFD K TG A EV K RQ D IESN LQ YDAGDKGIYRHYMQKEIYEQPNAIKNTLTGRISHGQVDLSELGPNADELLSKVEHIQILA CGTSYNSGMVSRYWFES LAGI PCDVEIASEFRYRKSAVRRNSLM ITL SQSGE TADTLAGL RLSKELGYLGSLAICNVPGSSLVRESDLALMTNAGTEIGVASTKAFTTQLTVLLMLVAKL SRLKGLDASIEHDIVHGLQALPSRIEQM LSQDKRIEALAEDFSDKHHALFLGRGDQYPIA LEGALKLKEISYIHAEAYAAGELKHGPLALIDADM PVIW APNNELLEKLKSNIEEVRAR GGQLYVFADQDAGFVSSDNMHIIEMPHVEEVIAPIFYTVPLQLLAYHVALIKGTDVDQPR NLAKSVTVE SEQ ID NO: 21

> BAF92026 beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa [Photobacterium sp. JT-ISH-224].

M K N FL L L T L IL L T A C N N SE E N T Q SIIK N D IN K T IID E E Y V N L E PIN Q SN ISFIK H 5W V Q T CGTQQLLTEQNKESISLSW APRLDDDEKYCFDFNGVSNKGEKYI TKVTLNW APSLEVY VDHASLPTLQQLM DIIKSEEENPTAQRYIAW GRIVPTDEQM KELNITSFALINNHTPADL VQEIVKQAQTKHRLNVKLSSNTAHSFDNLVPILKELNSFNNVTVTNIDLYDDGSAEYVNL YNWRDTLNKTDNLKIGKDYLEDVINGINEDTSNTGTSSVYNWQKLYPANYHFLRKDYLTL EPSLHELRDYIGDSLKQMQWDGFKKFNSKQQELFLSIVNFDKQKLQNEYNSSNLPNFVFT GTTVWAGNHEREYYAKQQINVINNAINESSPHYLGNSYDLFFKGHPGGGI IN IL IM Q N Y P SM V D IPSK ISFE V LM M TD M LPD A V A G IA SSL Y FTIPA EK IK FIV FTSTETITD RET A LR S PLVQVM IKLGIVKEENVLF WADLPNCETGVCIAV

A continuación, se proporciona la secuencia de ADN en formato Genbank de la nueva configuración de genes diseñados en el locus thyA de Escherichia coli en cepas utilizadas para producir oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina.

LOCUS E680_thyA::2.8RBS_lacZ 5877 bp ADN lineal BCT 04 MAR. 2013 DEFINICIÓN cepa de Escherichia coli K-12 sustr. MG1655, genoma completo.

ACCESO NC_000913

VERSIÓN NC 000913.2 GI: 49175990

PALABRAS CLAVE FUENTE cepa de Escherichia coli K-12 sustr. MG1655 (desconocido)

ORGANISMO cepa de Escherichia coli K-12 sustr. MG1655

Bacterias; Proteobacterias; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia.

REFERENCIA 1 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Riley, M., Abe, T., Arnaud, MB, Berlyn, MK, Blattner, FR, Chaudhuri, RR,

Glasner, JD, Horiuchi, T., Keseler, IM, Kosuge, T., Mori, H., Perna, NT, Plunkett, G. III, Rudd, K.E., Serres, M.H., Thomas, G.H., Thomson, N.R., Wishart, D. y Wanner, B.L.

TÍTULO Escherichia coli K-12: a cooperatively developed annotation snapshot--2005 REVISTA Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006)

PUBMED 16397293

OBSERVACIÓN Estado de la publicación: solo en línea

REFERENCIA 2 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Blattner, FR, Plunkett, G. III, Bloch, CA, Perna, NT, Burland, V., Riley, M.,

Collado-Vides, J., Glasner, JD, Rode, CK, Mayhew, GF, Gregor, J., Davis, NW, Kirkpatrick, HA, Goeden, MA, Rose, DJ, Mau, B. y Shao, Y.

TÍTULO La secuencia completa del genoma de Escherichia coli K-12

REVISTA Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)

PUBMED 9278503

REFERENCIA 3 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Arnaud, M., Berlyn, MKB, Blattner, FR, Galperin, MY, Glasner, JD, Horiuchi, T.,

Kosuge, T., Mori, H., Perna, NT, Plunkett, G. III, Riley, M., Rudd, K.E., Serres, M.H., Thomas, G.H. y Wanner, B.L.

TÍTULO Workshop on Annotation of Escherichia coli K-12

REVISTA Sin publicar

OBSERVACIÓN Woods Hole, Massachusetts, el 14-18 Noviembre de 2003 (correcciones de secuencia)

REFERENCIA 4 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Glasner, JD, Perna, NT, Plunkett, G. III, Anderson, B.D., Bockhorst, J., Hu, J.C.,

Riley, M., Rudd, K.E. y Serres, M.H.

TÍTULO ASAP: Escherichia coli K-12 strain MG1655 version m56

REVISTA Sin publicar

OBSERVACIÓN descarga ASAP del 10 de junio de 2004 (actualizaciones de anotación) REFERENCIA 5 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Hayashi, K., Morooka, N., Mori, H. y Horiuchi, T.

TÍTULO Una comparación de secuencias más precisa entre los genomas de las cepas de Escherichia coli K12 W3110 y MG1655

REVISTA Sin publicar

OBSERVACIÓN accesiones GenBank AG613214 a AG613378 (correcciones de secuencia) REFERENCIA 6 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Perna, N. T.

TITULO Escherichia coli K-12 MG1655 yqiK-rfaE intergenic región, genomic sequence correction

REVISIÓN Sin publicar

OBSERVACIÓN accesión GenBank AY605712 (correcciones de secuencia)

REFERENCIA 7 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Rudd, KE

TITULO A manual approach to accurate translation start site annotation: an E. coli K-12 case study

REVISTA Sin publicar

REFERENCIA 8 (bases 1 a 4639675)

CONSRTM Proyecto de genoma NCBI

TITULO Presentación directa

REVISTA Enviado (04-MAR-2013) National Center for Biotechnology Information, NIH,

Bethesda, MD 20894, EE.UU.

REFERENCIA 9 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Rudd, KE

TITULO Presentación directa

REVISTA Enviado (06-FEB-2013) Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Universidad de Miami Miller School of Medicine, 118 Gautier Bldg., Miami, FL 33136, EE.UU.

OBSERVACIÓN Actualización de la secuencia por el remitente

REFERENCIA 10 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Rudd, KE

TITULO Presentación directa

REVISTA Enviado (24-ABR-2007) Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

Universidad de Miami Miller School of Medicine, 118 Gautier Bldg., Miami, FL 33136, EE.UU.

OBSERVACIÓN Actualización de anotación de ecogene.org como una colaboración de base de datos múltiple

REFERENCIA 11 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Plunkett, G. III.

TITULO Presentación directa

REVISTA Presentado (07-FEB-2006) Laboratorio de Genética, Universidad de Wisconsin,

425G Henry Mall, Madison, WI 53706-1580, EE.UU.

OBSERVACIÓN Actualizaciones de proteínas por el remitente

REFERENCIA 12 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Plunkett, G . III.

TITULO Presentación directa

REVISTA Presentado (10-JUN-2004) Laboratorio de Genética, Universidad de Wisconsin,

425G Henry Mall, Madison, WI 53706-1580, EE.UU.

OBSERVACIÓN Actualización de secuencia por el remitente

REFERENCIA 13 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Plunkett, G . III.

TÍTULO Presentación directa

REVISTA Presentado (13-OCT-1998) Laboratorio de Genética, Universidad de Wisconsin, 425G Henry Mall, Madison, WI 53706-1580, EE. UU.

REFERENCIA 14 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Blattner, F.R. y Plunkett, G. III.

TÍTULO Presentación directa

REVISTA Presentado (02-SEP-1997) Laboratorio de Genética, Universidad de Wisconsin, 425G Henry Mall, Madison, WI 53706-1580, EE. UU.

REFERENCIA 15 (bases 1 a 4639675)

AUTORES Blattner, FR y Plunkett, G. III.

TÍTULO Presentación directa

REVISTA Presentado (16-JAN-1997) Laboratorio de Genética, Universidad de Wisconsin, 425G Henry Mall, Madison, WI 53706-1580, EE. UU.

COMENTARIO REFSEQ PROVISIONAL: Este registro aún no ha sido sujeto a final revisión de NCBI. La secuencia de referencia es idéntica a U00096. El 24 de junio de 2004, esta versión de secuencia reemplazó gi: 16127994. Las actualizaciones de anotación actuales de U00096 se derivan de EcoGene http://ecogene.org. Las sugerencias para las actualizaciones se pueden enviar al Dr. Kenneth Rudd (krudd@miami.edu). Estas actualizaciones se están generando a partir de una colaboración que también incluye ASAP/ERIC, el Coli Genetic Stock Center, EcoliHub, EcoCyc, RegulonDB y UniProtKB/Swiss-Prot.

COMPLETO: longitud completa.

CARACTERÍSTICAS Ubicación/Calificadores

Gen complemento (<1..245)

/gene = "ppdA"

/locus_tag = "b2826"

/gene_synonym = "ECK2822; JW2794"

/db_xref = "EcoGene: EG12081"

/db_xref = "GeneID: 945393"

CDS complemento (<1..245)

/gene = "ppdA"

/locus_tag = "b2826"

/gene_synonym = "ECK2822; JW2794"

/function = "enzima putativa; No clasificado"

/GO_component = "GO: 0009289 - pilus"

/GO_process = "GO: 0009101 - proceso biosintético de glicoproteína"

/note = "proteína A dependiente de la peptidasa prepilina"

/codon_start = 1

/transl table = 11

/product = "proteína hipotética"

/protein_id = "NP 417303.1"

/db_xref = "GI: 16130730"

/db_xref = "ASAP: ABE-0009266"

/db_xref = "UniProtKB/Swiss: P33554"

/db_xref = "EcoGene: EG12081"

/db_xref = "GeneID: 945393"

/ translation="M K TQ R G Y TLIETLV A M LILV M LSA SG LY G W Q Y W Q Q SQ R LW Q TA S

QARDYLLYLREDANWHNRDHSISVIREGTLWCLVSSAAGANTCHGSSPLVFVPRWPEV

EMSDLTPSLAFFGLRNTAWAGHIRFKNSTGEWWLWSPWGRLRLCQQGETEGCL" (SE Q ID NO: 22 ) fuente enlace (<1..449,4852 .. >5877)

/organism = "cepa de Escherichia coli K-12 sustr. MG1655"

/mol_type = "ADN genómico"

/strain = "K-12"

/sub_strain = "MG1655"

/db_xref = "Taxón: 511145"

cebador 346.. 366

/note = cagtcagtcaggcgccTTCGGGAAGGCGTCTCGAAGA (SEQ ID NO: 23) /label = 0268-THYA-R

característica mixta complemento (388..394)

/feature_type = "Bucle de horquilla"

/label = Terminador

cebador 400.. 449

/note=GGCG TCG G CTCTG G CA G G A TG TTTCG TA A TTA G A TA G CCA CCG G CG CTTTag

G aaacctactA T G A C C A T G A T T A C G G A T T C A C (S E Q ID NO: 24 ) /label="homología del cebador 50bp thyA 3"

cebador 400..483

/note=GGCGTCGGCTCTGGCAGGATGTTTCGTAATTAGATAGCCACCGGCGCTTTat taaacctactATGACCATGATTACGGATTCAC (SEQ ID NO: 25) /labe1=13 89-thyAKANlacZ-R-2-8

cebador 400..483

/note=GGCGTCGG CTCTG G CA G G A TG TTTCG TA A TTA G A TA G CCA CCG G CG CTTTCt

tC a a c c ta ctA T G A C C A T G A T T A C G G A T T C A C (S E Q ID NO: 26 ) /label=1516-thyAKANlacZ-R-0-8

cebador 400..483

/note=G G CG TCG G CTCTG G CA G G A TG TTTCG TA A TTA G A TA G CCA CCG G CG CTTTag

G a aacctactA T G A C C A T G A T T A C G G A T T C A C (S E Q ID NO: 27 ) /label="1041-thyAKANlacZ-R (4-8)"

característica mixta complemento(401..407)

/feature_type="Bucle de horquilla"

/label=Terminador

Cebador 405..472 /note=CGGCTCTGGCAGGATGTTTCGTAATTAGATAGCCACCGGCGCTTTaTTaaac (SEQ ID NO: 28) ctactATGACCATGAT

/label = 1394-2/8-F

gen complemento (unión (429..449,4852..4854))

/gene = 'ThyA"

CDS complemento (unión (429..449,4852..4854))

/gene = "thyA"

/note = "ECK2823: JW2795: b2827"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "timidilato sintetasa"

/protein_id = "BAE76896 .1"

/db_xref = "GI: 85675643" /translation="MKQYLELMQKVLDEGTQKNDRTGTGTLSIFGHQMRFNLQDGFPL VTTKRCHLRSIIHELLWFLQGDTNIAYLHENNVTIWDEWADENGDLGPVYGKQWRAWP

TPDGRHIDQITTVLNQLKNDPDSRRIIVSAWNVGELDKMALAPCHA.FFQFYVADGKLS CQLYQRSCDVFLGLPFNIASYALLVHMMAQQCDLEVGDFVWTGGDTHLYSNHMDQTHL QLSREPRPLPKLIIKRKPESIFDYRFEDFEIEGYDPHPGIKAPVAI" (SEQ TD NO: 4 3)

RBS 450.. 461

/label="2.8 RBS"

fuente 450.. 3536

/organism =" Escherichia coli W3110"

"/mol_type = "ADN genómico"

/strain = "K-12"

/sub_strain = "W3110"

/db_xref = "taxón: 316407"

/note = "sinónimo: cepa de Escherichia coli K12 substr. W3110" característica mixta 450..4851

/feature_type = Inserción

/note = "se origina a partir de KanR-lacZRBS (E403)"

/label = Insertar

característica mixta 449M50

/feature type = "sitio de variación de RBS" /label = "C en 0/8"

característica mixta 450.. 453

/feature_type = "sitio de variación de RBS" /label = "CTTC en 0/8"

característica mixta 451.. 452

/feature_type = "sitio de variación de RBS" /label = "GG en 4/8"

característica mixta 451.. 452

/feature_type = "sitio de variación de RBS" /label = "TT en 2/8"

CDS 462 .. 3536

/gene = "lacZ"

/note = "ECK0341: JW0335: b0344" /codon_start = 1

/transl_table = 11

/producto = "beta-D-galactosidasa" /protein_id= "BAE76126.1"

/db xref = "GI: 85674486" /translation="MTMITDSLAWLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEAR

TDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVWPSNWQMHGYDAPIYT

NVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWV

GYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHK

PTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFG GEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAWELHTADGTLIEAEACDVGFR

EVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSH YPNHPLWYTLCDRYGLYWDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRN

HPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVD

EDQPFPAVPKWSI KKWLS LPGETRPLI LCEYAHAMGN S LGGFAKYWQAFRQYPRLQGG FVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQ

QQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIE

LPELPQPESAGQLWLTVRWQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPH

LTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSE

ATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKT

YRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAA

CFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGIRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMEIS HRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK" (SEQ ID NO: 29)

/label ="lacZ+ CDS natural"

cebador complemento (1325..1345)

/note = TTCAGACGTAGTGTGACGCGA

/label = 1042-thyAlacZcheck

cebador 2754..2776

/note = TTTCTTTCACAGATGTGGATTGG

/label = "1395-mid lacZ-F"

cebador complemento (2779..2801)

/note = CGGCGTCAGCAGTTGTTTTTTAT

/label = "1396-mid lacZ-R"

mutación 2793

/label = "C en MG1655 lacZ (cambio silencioso)"

marca complemento (3549..3567)

/label = "KD13 secuencia de marcas descendente"

fuente 3549..4851

/organism = "Plásmido plantilla pKD13"

/mol_type = "ADN genómico"

/db xref = "taxón: 170493"

cebador 3549..3568

/label = "0339 Plw-P2b"

unidad de repetición 3568..3579

/label = "sitio FLP"

característica mixta complemento (3568..3601)

/feature type = "sitio FRT"

/label = "sitio FRT de 34bp"

nota complemento (3568..4789)

/label = "región suprimida tras la introducción de pCP20"

unidad de repetición complemento (3590..3601)

/label = "sitio de Flp"

característica mixta complemento (3602..3615)

/feature type = "sitio FRT"

/note = "sitio FRT natural"

/label = "sitio FRT ascendente"

unidad de repetición complemento (3604..3615)

/label = "sitio Flp"

característica mixta complemento (3628..4422)

/feature type = "CDS (resistencia KAN)"

/note = "resistencia a la kanamicina"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/producto = "Tn5 neomicina fosfotransferasa " /protein_id="AAL02037.1"

/db_xref = "GI: 15554336" /translatÍon="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGR PVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDWTEAGRDWLLLGEVPGQDL

LSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDE EHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLWTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRY QDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF" ( SEQ 7 D NO: 30)

cebador complemento (3677..3696)

/label ="0389 KD13 K4"

unión de cebador 3791..3810

/label = "sitio de cebado común kt"

cebador 3791..3810

/label = "cebador 0344 Wanner Kt"

mutación 3811

/label = "A en wt (cambio silencioso)"

cebador complemento (4242..4261)

/label = "cebador 0343 Wanner K2"

unión de cebador 4261..4280

/label = "sitio de cebado común k2"

unión de cebador 4352..4371

/label = "sitio de cebado común k1"

cebador 4352..4371

/label = "cebador 0342 Wanner K1"

unidad de repetición 4790..4801

/label = "sitio FLP"

marca complemento (4790..4851)

/label = "marca ascendente KD13"

característica mixta complemento (4790..4823)

/feature type = "sitio FRT"

/label = "sitio FRT de 34bp"

unidad de repetición complemento (4812..4823)

/label = "sitio Flp"

cebador complemento (4832..4851)

/label = "0338 P4w-P1b"

cebador complemento (4832..4901) /note=TCTGGGCATATCGTCGCAGCCCACAGCAACACGTTTCCTGAGGAACCATGAT TCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ ID NO: 31 ) /label=1040-thyAKANlacZ-F

sitio complemento (4858..4863)

/site_type = "sitio de enlace"

/label = "thyA RBS"

gen complemento (4861..5736)

/gene = "lgt"

CDS complemento (4861..5736)

/gene = "lgt"

/note = "ECK2824: JW2796: b2828"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "fosfatidilglicerol-prolipoproteína diacilgliceril transferasa" /proteinJd="BAE76897.1"

/db_xref = "GI: 85675644"

/trans la tion= "M T S S Y LH F P E F D P V IF S IG P V A LH W Y G LM Y LV G F IF A M W LA T R R

ANRPGSGWTKNEVENLLYAGFLGVFLGGRIGYVLFYNFPQFMADPLYLFRVWDGGMSF

HGGLIGVIW M IIFARRTKRSFFQVSDFIAPLIPFGLGAGRLGNFINGELW GRVDPNF

PFAM LFPGSRTEDILLLQ TNPQ W Q SIFDTYG VLPRHPSQ LYELLLEG W LFIILNLYI

RKPRPMGAVSGLFLI GY G A FR IIVEFFRQPDAQFTGAWVQYISMGQI L S IP M IV A G V I MMVWAYRRSPQQHVS" (SEQ ID NO: 32 ) promotor complemento (4957..4962)

/label = "thyA WEAK -10"

promotor complemento (4978..4983)

/label = "thyA -35"

cebador complemento (5076..5099)

/note = cagtcagtcaggcgccTTCCTCAACCTGTATATTCGTAAAC (SEQ ID NO: 33) /label = 0267-THYA-F

Sitio complemento (5739..5744)

/site type = "sitio de enlace"

/label = "Igt RBS"

promotor complemento (5823..5828)

/label = "Igt -10 (fuerte)"

ORIGEN

1 GCAGCGGAAC TCACAAGGCA CCATAACGTC CCCTCCCTGA TAACGCTGAT ACTGTGGICG 61 CGGTTATGCC AGTTGGCATC TTCACGTAAA TAGAGCAAAT AGTCCCGCGC CTGGCTGGCG 121 GTTTGCCATA GCCGTTGCGA CTGCTGCCAG TATTGCCAGC CATAGAGTCC ACXTGCGCTT 181 AGCATGACCA AAATCAGCAT CGCGACCAGC GTTTCAATCA GCGTATAACC ACGTTGTGTT 241 TTCATGCCGG CAGTATGGAG CGAGGAGAAA AAAAGACGAG GGCCAGTTTC TATTTCTTCG 301 GCGCATCTTC CGGACTATXT ACGCCGXXGC AGGACGXXGC AAAAXXXCGG GAAGGCGICX 361 CGAAGAAXXX AACGGAGGGT AAAAAAACCG ACGCACACXG GCGXCGGCXC TGGCAGGAXG 421 XXXCGXAAXX AGAXAGCCAC CGGCGCXXXa t t a a a c c ta c tAXGACCAXG AXXACGGAXX 481 CACXGGCCGI CGXXXXACAA CGICGXGACX GGGAAAACCC XGGCGXXACC CAACXXAAXC 541 GCCXXGCAGC ACAXCCCCCX IXCGCCAGCX GGCGXAAXAG CGAAGAGGCC CGCACCGAXC 601 GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAAXG GCGAAXGGCG CXXIGCCXGG TXXCCGGCAC 661 CAGAAGCGGX GCCGGAAAGC XGGCXGGAGX GCGAXCXXCC TGAGGCCGAX ACXGXCGICG 721 XCCCCTCAAA CTGGCAGAXG CACGGXXACG ATGCGCCCAX CXACACCAAC GXGACCXAXC

781 CCAXXACGGX CAATCCGCCG TTTGTTCCCA CGGAGAATCC GACGGGTTGT TACTCGCTCA

841 CATTTAATGT TGATGAAAGC TGGCTACAGG AAGGCCAGAC GCGAATTATT TTTGATGGCG

901 TTAACTCGGC GTTTCATCTG TGGTGCAACG GGCGCTGGGT CGGTTACGGC CAGGACAGTC

961 GTTTGCCGTC TGAATTTGAC CTGAGCGCAT TTTTACGCGC CGGAGAAAAC CGCCTCGCGG

1021 TGATGGTGCT GCGCTGGAGT GACGGCAGTT ATCTGGAAGA TCAGGATATG TGGCGGATGA

1081 GCGGCATTTT CCGTGACGTC TCGTTGCTGC ATAAACCGAC TACACAAATC AGCGATTTCC

1141 ATGXTGCCAC TCGCTTTAAT GATGATTTCA GCCGCGCTGT ACTGGAGGCT GAAGTTCAGA

1201 TGTGCGGCGA GTTGCGTGAC TACCTACGGG TAACAGTTTC TTTATGGCAG GGTGAAACGC

1261 AGGTCGCCAG CGGCACCGCG CCTTXCGGCG GXGAAAXXAX CGAXGAGCGX GGXGGXXAXG

1321 CCGAXCGCGX CACACXACGT CXGAACGXCG AAAACCCGAA ACTGXGGAGC GCCGAAAXCC

1381 CGAATCXCXA TCGXGCGGXG GXTGAACTGC ACACCGCCGA CGGCACGCXG ATXGAAGCAG

1441 AAGCCXGCGA TGTCGGXTTC CGCGAGGXGC GGAXTGAAAA TGGTCTGCTG CTGCTGAACG

1501 GCAAGCCGXX GCXGAXXCGA GGCGXXAACC GXCACGAGCA XCAXCCXCXG CAXGGXCAGG

1561 XCAXGGATGA GCAGACGAXG GXGCAGGAXA XCCXGCXGAX GAAGCAGAAC AACXXXAACG

1621 CCGXGCGCXG XXCGCAXXAX CCGAACCAXC CGCXGXGGXA CACGCXGTGC GACCGCXACG

1681 GCCXGXATGX GGTGGAXGAA GCCAAXAXXG AAACCCACGG CAXGGXGCCA AXGAAXCGXC

1741 XGACCGATGA XCCGCGCXGG CXACCGGCGA XGAGCGAACG CGXAACGCGA AXGGXGCAGC

1801 GCGAXCGXAA TCACCCGAGX GXGAXCAXCX GGXCGCXGGG GAAXGAAXCA GGCCACGGCG

1861 CXAAXCACGA CGCGCXGXAX CGCXGGAXCA AAXCXGXCGA XCCXXCCCGC CCGGXGCAGT

1921 AXGAAGGCGG CGGAGCCGAC ACCACGGCCA CCGAXAXXAI XXGCCCGAXG TACGCGCGCG 1981 XGGAXGAAGA CCAGCCCIXC CCGGCXGXGC CGAAAXGGXC CAXCAAAAAA TGGCXXXCGC 2041 XACCTGGAGA GACGCGCCCG CXGAXCCXXX GCGAAXACGC CCACGCGAXG GGXAACAGXC 2101 XXGGCGGXXX CGCXAAAXAC XGGCAGGCGX XXCGXCAGXA XCCCCGXXXA CAGGGCGGCX 2161 TCGTCTGGGA CIGGGTGGAT CAGICGCTGA XTAAATAXGA IGAAAACGGC AACCCGXGGX 2221 CGGCTXACGG CGGXGATXXX GGCGAXACGC CGAACGAXCG CCAGXXCXGX ATGAACGGXC 2281 XGGXCXIXGC CGACCGCACG CCGCAXCCAG CGCTGACGGA AGCAAAACAC CAGCAGCAGX 2341 XXXTCCAGXX CCGXXXAXCC GGGCAAACCA XCGAAGXGAC CAGCGAAXAC CXGXXCCGXC 2401 AXAGCGAXAA CGAGCICCXG CACTGGAXGG XGGCGCXGGA TGGTAAGCCG CTGGCAAGCG 2461 GXGAAGXGCC TCXGGATGXC GCTCCACAAG GXAAACAGXX GAXXGAACXG CCXGAACXAC 2521 CGCAGCCGGA GAGCGCCGGG CAACICXGGC XCACAGXACG CGXAGTGCAA CCGAACGCGA 2581 CCGCAXGGXC AGAAGCCGGG CACAXCAGCG CCXGGCAGCA GXGGCGXCXG GCGGAAAACC 2641 ICAGIGIGAC GCICCCCGCC GCGICCCACG CCAICCCGCA ICIGACCACC AGCGAAAIGG 2701 AXXTTTGCAX CGAGCTGGGT AATAAGCGTT GGCAATTXAA CCGCCAGTCA GGCTXTCTTT 2761 CACAGAXGXG GAXXGGCGAX AAAAAACAAC XGtTGACGCC GCXGCGCGAX CAGXXCACCC 2821 GXGCACCGCX GGAXAACGAC ATTGGCGTAA GXGAAGCGAC CCGCATTGAC CCTAACGCCX 2881 GGGXCGAACG CXGGAAGGCG GCGGGCCAXX ACCAGGCCGA AGCAGCGXXG TXGCAGXGCA 2941 CGGCAGAXAC ACXXGCTGAX GCGGXGCTGA XXACGACCGC XCACGCGXGG CAGCAXCAGG 3001 GGAAAACCXX AXXXAXCAGC CGGAAAACCX ACCGGAXXGA XGGTAGTGGX CAAAXGGCGA 3061 XXACCGXXGA TGXXGAAGXG GCGAGCGAXA CACCGCAXCC GGCGCGGAXT GGCCXGAACX 3121 GCCAGCXGGC GCAGGXAGCA GAGCGGGXAA ACXGGCXCGG AXXAGGGCCG CAAGAAAACX 3181 AXCCCGACCG CCXXACTGCC GCCXGXXXXG ACCGCXGGGA XCXGCCAXXG TCAGACAXGX 3241 AXACCCCGXA CGXCXXCCCG AGCGAAAACG GXCTGCGCXG CGGGACGCGC GAAXXGAAXX 3301 AXGGCCCACA CCAGXGGCGC GGCGACXTCC AGXTCAACAX CAGCCGCXAC AGXCAACAGC 3361 AACTGATGGA AACCAGCCAX CGCCAXCTGC XGCACGCGGA AGAAGGCACA TGGCXGAAXA 3421 XCGACGGXXX CCAXAXGGGG AXTGGXGGCG ACGACXCCXG GAGCCCGXCA GTAXCGGCGG 3481 AAXXCCAGCX GAGCGCCGGX CGCXACCAXX ACCAGXXGGX CXGGXGXCAA AAAXAAGCGG 3541 CCGCtXXAXG TAGGCXGGAG CTGCXXCGAA GXXCCXAXAC XXXCTAGAGA ATAGGAACXX 3601 CGGAAXAGGA ACXXCAAGAX CCCCXXAXXA GAAGAACXCG XCAAGAAGGC GAXAGAAGGC 3661 GAXGCGCXGC GAAXCGGGAG CGGCGAIACC GXAAAGCACG AGGAAGCGGX CAGCCCAXXC 3721 GCCGCCAAGC XCXXCAGCAA XAXCACGGGX AGCCAACGCX AXGXCCXGAX AGCGGXCCGC 3781 CACACCCAGC CGGCCACAGX CGAXGAAXCC tGAAAAGCGG CCAXXXICCA CCAXGAXAXX 3841 CGGCAAGCAG GCAXCGCCAX GGGXCACGAC GAGAXCCXCG CCGXCGGGCA XGCGCGCCXX 3901 GAGCCXGGCG AACAGXTCGG CTGGCGCGAG CCCCXGAXGC XCXXCGXCCA GAXCAICCXG 3961 AXCGACAAGA CCGGCXTCCA XCCGAGXACG XGCTCGCXCG AXGCGAXGXX TCGCXXGGXG 4021 GICGAATGGG CAGGTAGCCG GATCAAGCGX ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCAXGAT 4081 GGAXACXXXC TCGGCAGGAG CAAGGXGAGA XGACAGGAGA XCCXGCCCCG GCACXXCGCC 4141 CAATAGCAGC CAGXCCCTXC CCGCTTCAGX GACAACGXCG AGCACAGCXG CGCAAGGAAC 4201 GCCCGXCGXG GCCAGCCACG AXAGCCGCGC XGCCXCGXCC XGCAGXXCAX XCAGGGCACC 4261 GGACAGGXCG GXCXXGACAA AAAGAACCGG GCGCCCCXGC GCXGACAGCC GGAACACGGC

4321 GGCAXCAGAG CAGCCGAXXG XCXGXXGXGC CCAGXCAXAG CCGAAXAGCC XCXCCACCCA

4381 AGCGGCCGGA GAACCXGCGT GCAAXCCAXC XXGXXCAAXC AXGCGAAACG AXCCXCAXCC 4441 TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA AGAAAGCCAT 4501 CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC GCCCCAGCTG GCAATTCCGG 4561 TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC 4621 TACCTGCTTT CTCTTTGCGC TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT 4681 CAXCCGGGGX CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTXXAGCA 4741 GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAGCTTCAA AAGCGCTCTG AAGTTCCTAT 4801 ACIIXCXAGA GAATAGGAAC TTCGAACTGC AGGTCGACGG ATCCCCGGAA TCATGGTTCC 4861 TCAGGAAACG TGTTGCTGTG GGCTGCGACG ATATGCCCAG ACCATCATGA TCACACCCGC 4921 GACAATCATC GGGATGGAAA GAATTTGCCC CATGCTGATG TACTGCACCC AGGCACCGGT 4981 AAACTGCGCG TCGGGCTGGC GGAAAAACTC AACAATGATG CGAAACGCGC CGTAACCAAT 5041 CAGGAACAAA CCTGAGACAG CTCCCATTGG GCGTGGTTTA CGAATATACA GGTTGAGGAT 5101 AATAAACAGC ACCACACCTT CCAGCAGCAG CTCGTAAAGC TGTGATGGGT GGCGCGGCAG 5161 CACACCGTAA GTGTCGAAAA TGGATTGCCA CTGCGGGTTG GTTTGCAGCA GCAAAATATC 5221 TTCTGTACGG GAGCCAGGGA ACAGCATGGC AAACGGGAAG TTCGGGTCAA CGCGGCCCCA 5281 CAATTCACCG TTAATAAAGT TGCCCAGACG CCCGGCACCA AGACCAAACG GAATGAGTGG 5341 TGCGATAAAA TCAGAGACCT GGAAGAAGGA ACGTTTAGTA CGGCGGGCGA AGATAAXCAX 5401 CACCACGATA ACGCCAATCA GGCCGCCGTG GAAAGACATG CCGCCGTCCC AGACACGGAA 5461 CAGAXACAGC GGATCGGCCA TAAACTGCGG GAAAXTGTAG AACAGAACAX AACCAAXACG 5521 TCCCCCGAGG AAGACGCCGA GGAAGCCCGC ATAGAGTAAG IIT IC A A C IT CATTTTXGGT 5581 CCAGCCGCXG CCCGGACGAX XCGCCCGXCG XGXXGCCAGC CACAXXGCAA AAAXGAAACC 5641 CACCAGAXAC AXCAGGCCGX ACCAGXGAAG CGCCACGGGX CCIAXXGAGA AAAXGACCGG 5701 AXCAAACXCC GGAAAAXGCA GAXAGCIACX GGXCAXCXGX CACCACAAGX XCXXGXXAXX 5761 XCGCTGAAAG AGAACAGCGA XXGAAAIGCG CGCCGCAGGT IXCAGGCGCX CCAAAGGTGC 5821 GAAXAAXAGC ACAAGGGGAC CXGGCXGGTI GCCGGAXACC GXXAAAAGAX ATGXAXA

(SEQ ID NO: 34)

Se proporciona a continuación la secuencia de ADN en formato Genbank de la configuración de genes en el locus de Escherichia coli nan, y los detalles de los puntos finales de eliminación encontrados en las cepas diseñadas por ingeniería genética E1017 y E1018.

LOCUS W3110_nanRATEKyhcH_region 5861 pb ADN lineal BCT 19FEB. 2009 DEFINICIÓN cepa de Escherichia coli K-12 sustr. W3110 cepa K-12.

ACCESO AC_000091

VERSIÓN AC_000091.1 GI: 89106884

PALABRAS CLAVE FUENTE cepa de Escherichia coli K-12 sustr. W3110 (desconocido)

ORGANISMO cepa de Escherichia coli K-12 sustr. W3110

Bacterias; Proteobacterias; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia.

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TÍTULO Nucleotide sequence of the thrA gene of Escherichia coli

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PUBMED 7003595

REFERENCIA 134

AUTORES Ogden, S., Haggerty , D., Stoner, CM, Kolodrubetz, D. y Schleif, R.

TÍTULO The Escherichia coli L-arabinose operon: binding sites of the regulatory proteins and a mechanism of positive and negative regulation

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PUBMED 6251457

REFERENCIA 135

AUTORES Smith, D.R. y Calvo, J.M.

TÍTULO Nucleotide sequence of the E coli gene coding for dihydrofolate reductase REVISTA Nucleic Acids Res. 8 (10), 2255-2274 (1980)

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AUTORES Johnsrud, L.

TÍTULO DNA sequence of the transposable element IS1

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REFERENCIA 137

AUTORES Smith, B.R. y Schleif, R.

TÍTULO Nucleotide sequence of the L-arabinose regulatory region of Escherichia coli K12 REVISTA J. Biol. Chem. 253 (19), 6931-6933 (1978)

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REFERENCIA 138

AUTORES Greenfield, L., Boone, T. y Wilcox, G.

TITULO DNA sequence of the araBAD promoter in Escherichia coli B/r

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PUBMED 368797

REFERENCIA 139

AUTORES Young, R.A. y Steitz, J.A.

TÍTULO Complementary sequences 1700 nucleotides apart form a ribonuclease III cleavage site in Escherichia coli ribosomal precursor RNA

REVISTA Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 (8), 3593-3597 (1978)

PUBMED 358189

REFERENCIA 140

AUTORES Ohtsubo, H. y Ohtsubo, E.

TÍTULO Nucleotide sequence of an insertion element, IS1

REVISTA Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (2), 615-619 (1978)

PUBMED 273224

REFERENCIA 141

AUTORES Musso, R., Di Lauro, R., Rosenberg, M. y de Crombrugghe, B.

TÍTULO Nucleotide sequence of the operator-promoter region of the galactose operon of Escherichia coli

REVISTA Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1), 106-110 (1977)

PUBMED 319453

REFERENCIA 142(bases 1 a 4646332)

CONSRTM NCBI Genome Project

TÍTULO Envío directo

REVISTA Enviado (10-NOV-2005) National Center for Biotechnology Information, NIH,

Bethesda, MD 20894, EE.UU.

REFERENCIA 143 (bases 1 a 4646332)

AUTORES Mori, H., Horiuchi, T. y Hirai, A.

TÍTULO Presentación directa

REVISTA Enviado (22-AUG-2005) Hirotada Mori, Graduate School of Biological Sciences,

Nara Institute of Science and Technology; 8916-5 Takayama, Ikoma, Nara 630­ 0101, Japón (Correo electrónico: hmori@gtc.naist.jp, Tel: 81-743-72-5660, Fax: 81-743-72- 5669)

COMENTARIO REFSEQ PROVISIONAL: Este registro aún no ha sido sometido a revisión final del NCBI . La secuencia de referencia se derivó de partir de AP009048. COMPLETO: longitud completa.

CARACTERÍSTICAS Ubicación/Calificadores

fuente complemento (<1 ..> 5861)

/organism = "cepa de Escherichia coli K-12 sustr. W3110" /mol_type = "ADN genómico"

/strain = "K-12"

/sub_strain = "W3110"

/db_xref = "Taxón: 316407"

gen complemento (<1..6)

/gene = "dcuD"

CDS complemento (<1. .6)

/gene = "dcuD"

/note = "ECK3216: JW3196: b3227"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/producto = "transportador predicho"

/protein_id = "AP 003769.1"

/db xref = "GI: 89109989"

/ t r a n s l a t i o n = " M F G I I I S V IV L I TMGYLILKNYKPQW LAAAGI FLMMCGVWLGF

GGVLDPTKSSGYLIVDIYNEILRMLSNRIAGLGLSIMAVGGYARYMERIGASRAMVSL

LSRPLKLIRSPYIILSATYVIGQIM AQFITSASGLGM LLM VTLFPTLVSLGVSRLSAV

AVIATTM SIEW GILETNSIFAAQVAGMKIATYFFHYQLPVASCVIISVAISHFFVQRA

FDKKDKNINHEQAEQKALDNVPPLYYAILPVMPLILMLGSLFLAHVGLMQSELHLVW

MLLSLTVTMFVEFFRKHNLRETMDDVQAFFDGMGTQFANWTLWAGEIFAKGLTTIG

TVDAVIRGAEHSGLGGIGVMIIMALVIAICAIVMGSGNAPFMSFASLIPNIAAGLHVP

AW M IM PM HFATTLARAVSPITAW W TSG IAG VSPFAW KRTAIPM AVG FW NM IAT IT L F Y " (SEQ ID NQ: 35 ) cebador 330.. 348

/label="ck nanR3 control primer"

gene 386.. 1177

/gene="nanR"

CDS 386.. 1177

/gene="nanR"

/note="ECK3215:JW3195:b3226"

/codon start=1

/transl_table=11

/product="regulador doble transcripcional de enlace de ADN" /protein_id="AP_003768.1"

/db_xref="GI:89109988"

/ translation="MGLMNAFDSQTEDSSPAIGRNLRSRPLARKKLSEMVEEELEQMI

RRREFGEGEQLPSERELMAFFNVGRPSVREALAALKRKGLVQINNGERARVSRPSADT

IIGELSGMAKDFLSHPGGIAHFEQLRLFFESSLVRYAAEHATDEQIDLLAKALEINSQ

SLDNNAAFIRSDVDFHRVLAEIPGNPIFMAIHVALLDWLIAARPTVTDQALHEHNNVS YQQHIAIVDAIRRHDPDEADRALQSHLN SVSATWHAFGQTTNKKK" ( SEQ ID NQ; 36)

cebador 1005.. 1025

/label = "cebador de control nanR ck2"

cebador 1126.. 1146

/label = "cebador de control nanAFck"

promotor 1178.. 1278

/label = "región promotora del operón nan"

Sitio 1187.. 1191

/site_type = "sitio de enlace"

/label = "enlace CAP"

Sitio 1198 .. 1202

/site_type = "sitio de enlace"

/label = "enlace de CAP"

promotor 1241..1246

/label = -10

enlace de cebador 1252..1301

/note = "para eliminaciones de dnanA:: o dnanATE::marca" /label = "cebador H1-dnanA lambda rojo"

mRNA 1255

/label = 1

mRNA 1267

/label = 13

mRNA 1279

/label = 25

gen 1299.. 2192

/gene = "nanA"

CDS 1299.. 2192

/gen = "nanA"

/note = "ECK3214: JW3194: b3225"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "N-acetilneuraminato liasa"

/protein_id = "AP 003767.1"

/d b_xref = "GI: 89109987"

/ transla tion="M ATN LR G VM AALLTPFD Q Q Q ALD KASLR R LVQ FN IQ Q G ID G LYV

GGSTGEAFVQSL S E REQVL E I VAEEAKGKIK L IAHVGCVS TAE S QQLAASAKRYGF DA

VSAVTPFYYPFSFEEHCDHYRAIIDSADGLPMVVYNIPALSGVKLTLDQINTLVTLPG

VGALKQTSGDLYQMEQIRREHPDLVLYNGYDEIFASGLLAGADGGIGSTYNIMGWRYQ

GIVKALKEGDIQTAQKLQTECNKVIDLLIKTGVFRGLKTVLHYMDW SVPLCRKPFGP VDEKYLPELKALAQQLMQERG" (SEQ ID NO: 37 ) Región 1302..4424

/label ="DELECIÓN nanATE"

enlace de cebador complemento (2175..2224)

/label = "H2-dnanA lambda rojo cebador"

gen 2301..3791

/gene = "nanT"

CDS 2301..3791

/gene = "nanT"

/note = "ECK3213: JW3193: b3224"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "transportador de ácido siálico"

/protein_id = "AP 003766.1"

/db_xref = "GI: 89109986"

/translation="MSTXXQNIPW YRHLNRAQW RAFSAAW LGYLLDGFDFVLIALVLX

EVQGEFGLUVQAASLISAAFISRWFGGLMLGAMGDRYGRRLAMYXSIVLFSAGXI^jAC

GF APGYI IMF IAR L V I GMGMAGE YG S S ATYVI E SWPKHLRNKASGFLISGF S VG A W A

AQVY S LWPVWG WRALFFI GI LP11FALWLRKNIPEAE DWKEKHAGKAPVRTMVDIL Y

RGEHRIANIVMTLAAATALWFCFAGNLQNAAIVAVLGLLCAAIFISFMVQSAGKRWPT

GVMLMVWLFAFLYSWPIQALLPTYLKIDLAYNPHTVANVLFFSGFGAAVGCCVGGFL

GDWLGTRKAYVCSLLASQLLIIPVFAIGGANVWVLGLLLFFQQMLGQGIAGILPKLIG

GYFDTDQRAAGLGFTYNVGALGGALAPIIGALIAQRLDLGTALASLSFSLTFWILLI GLDMPSRVQRWLRPEALRXHDAIDGKPFEGAVPFGSAKNDLVKXKS" ( SEQ ID NO: 38 )

cebador complemento (2329..2350)

/label = "cebador de control nanARck"

enlace de cebador 3792.. 3841

/label = "cebador H1-dnanE lambda rojo"

gen 3839..4528

/gene = "nanE"

CDS 3839..4528

/gene = "nanE"

/note = "ECK3212: JW3192: b3223"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "N-acetilmannosamina-6-P epimerasa predicha" /protein_id = "AP 003765.1"

/db xref = "GI: 89109985"

/ t r a n s l a t ion="MSLLAQLDQKIAANGGLIVSCQPVPDSPLDKPEIVAAMALAAEQ

AGAVA IR I EGVANLQATRAWSVP11GIVKRDLEDSPVRIT A Y IEDVDAL AQAGAD11

AIDGTDRPRPVPVETLLARIHHHGLLAMTDCSTPEDGLACQKLGAEIIGTTLSGYTTP

ETPEEPDLALVKTLSDAGCRVIAEGRYNTPAQAADAMRHGAWAVTVGSAITRLEHICQ WYNTAMKKAVL" (SEQ ID NO: 39 ) enlace de cebador complemento (4425..4474)

/note =" para la eliminación de dnanato:: marca"

/label = "cebador H2-dnanE lambda rojo"

RBS 4425.. 4448

/label = "péptido incomprensible C-terminal fusionado al péptido de marca K^d 13"

RBS 4449.. 4451

/label = "péptido incomprensible NEW STOP péptido después de la resolución del casete"

enlace de cebador 4486.. 4530

/label = "cebador nanK-H1 lambda rojo"

RBS 4515.. 4520

/label = "nanK RBS"

gen 4525.. 5400

/gene = "nanK"

CDS 4525 .. 5400

/gene = "nanK"

/note = "ECK3211: JW5538: b3222"

/codon_start = 1

/transl_table = 11

/product = "N-acetilmannosamina quinasa predicha"

/protein_id = "AP 003764.1"

/db_xref = "GI: 89109984"

/ translation="M ITLAID IG G IKLAAALIG ADG Q IRDRRELPTPASQ TPEALRDA LSALVSPLQAHAQRVAIASTGIIRDGSLLALNPHNLGGLLHFPLVKTLEQLTNLPTIA

INDAQAAAWAEFQALDGDITDMVFITVSTGVGGGWSGCKLLTGPGGLAGHIGHTLAD PHGPVCGCGRTGCVEAIASGRGIAAAAQGELAGADAKTIFTRAGQGDEQAQQLIHRSA

RT L ARLI ADIKATTDCQCVWGGSVGLAEGY L ALVET Y LAQEPAAFHVDL LAAH YRH D AGLLGAALLAQGEKL" ¡SEQ ID NO: 40 RBS 4526..4528

/label = "Native Stop para NanE"

cebador complemento (5065..5083)

/label = "cebador de control nanKckl"

enlace de cebador complemento (5380..5424)

/label = "cebador nanK-H2 lambda rojo"

gen 5397..5861

/gene = "yhcH"

CDS 5397..5861

/gene = "yhcH"

/note = "ECK3210: JW3190: b3221"

/codon_start = 1

/transl table = 11

/product = "proteína hipotética"

/protein_id = "AP 003763.1"

/db_xref = "GI: 89109983"

/ translation="MMMGEVQSLPSAGLHPALQDALTLALAARPQEFvAPGRYELQGDN IFMNVMTFNTQSPVEKKAELHEQYIDIQLLLNGEERILFGMAGTARQCEEFHHEDDYQ LCSTIDNEQAIILKPGMFAVFMPGEPHKPGCWGEPGEIKKVWKVKADLMA"

(SEQ ID NO: 41)

ORIGEN

1 GAACATTGTT GAACTCCGTG TCAAAAGAAA ACGGTCAATC CCATAAACGG CAGATTGAAA 61 ACAACGATGT XAXAXXXIXX GCAAGGCTAT XTATGGTGCG GAXGXCGXGX XIXXAAXIGX 121 AGGXGAGGXG AXXXXXCAXX AAAAAAXAXG CGCXXAXGAX XAXXXXGXAA GAACACAXXC 181 A IA A IA IX C A XAAXGCXCGI GAAIAGICIX AIAAAXAAXI CAAACGGGAX GXIXIXAICX 241 GCGXXACAXX AAXXXXXCGC AAXAGXXAAX XAXXCCGXXA AXXAXGGXAA XGAXGAGGCA 301 CAAAGAGAAA ACCCXGCCAX XXXCCCCXAC XXXCAAXCCX GXGAXAGGAX GXCACXGAXG 361 ^{a x g x x a a x c a c a c x g a c c x x a c a g a a x g g g c c x x a x g a a c g c a x x x g a x x c g c a a a c c g a} 421 AGAXXCXXCA CCXGCAAXTG GXCGCAACXT GCGXAGCCGC CCGCXGGCGC GXAAAAAACX 481 CXCCGAAAXG GTGGAAGAAG AGCTGGAACA GAXGATCCGC CGXCGXGAAX XXGGCGAAGG 541 TGAACAATXA CCGXCXGAAC GCGAACXGAT GGCGTTCXXX AACGXCGGGC GXCCXXCGGX 601 GCGXGAAGCG CTGGCAGCGX XAAAACGCAA AGGXCXGGXG CAAAXAAACA ACGGCGAACG 661 CGCXCGCGXC XCGCGXCCXX CXGCGGACAC XAXCAXCGGX GAGCXXXCCG GCAXGGCGAA 721 AGAXXXCCXT XCXCAXCCCG GXGGGAXXGC CCAXXXCGAA CAATXACGXC XGXXCXXXGA 781 AXCCAGXCXG GXGCGCXAXG CGGCXGAACA XGCCACCGAX GAGCAAAXCG AXXXGCIGGC 841 AAAAGCACXG GAAAXCAACA GXCAGXCGCX GGAXAACAAC GCGGCAXXCA XXCGXICAGA 901 CGXXGAXXXC CACCGCGXGC TGGCGGAGAX CCCCGGXAAC CCAAXCXXCA XGGCGAXCCA 961 CGXXGCCCXG CXCGACXGGC IIAIXGCCGC ACGCCCAACG GXXACCGAXC AGGCACIGCA 1021 CGAACAXAAC AACGIXAGXX AXCAACAGCA XAXTGCGAIC GXIGATGCGA ICCGCCGTCA 1081 XGAXCCXGAC GAAGCCGAXC GXGCGXXGCA AXCGCAXCXC AACAGCGXCX CXGCXACCXG 1141 GCACGCXXXC GGXCAGACCA CCAACAAAAA GAAATAAXGC CACXXTAGXG AAGCAGATCG 1201 CATTAXAAGC TXTCXGTAXG GGGXGXIGCX TAATTGAXCT GGXATAACAG GTATAAAGGX 1261 AXAXCGXXXA XCAGACAAGC AXCACXXCAG AGGXAXXXAX GGCAACGAAX XXACGXGGCG 1321 XAAXGGCXGC ACXCCXGACX CCXXXXGACC AACAACAAGC ACXGGAXAAA GCGAGXCXGC 1381 GXCGCCXGGX XCAGXXCAAX AXXCAGCAGG GCAXCGACGG XXXAXACGXG GGXGGTTCGA 1441 CCGGCGAGGC CXXXGXACAA AGCCXXXCCG AGCGXGAACA GGXACXGGAA AXCGXCGCCG 1501 AAGAGGCGAA AGGXAAGAXX AAACXCAXCG CCCACGXCGG TXGCGXCAGC ACCGCCGAAA 1561 GCCAACAACI XGCGGCAXCG GCIAAACGXX AXGGCXXCGA XGCCGXCXCC GCCGXCACGC 1621 CGXXCXACXA TCCXXXCAGC XXXGAAGAAC ACXGCGAXCA CXAXCGGGCA AXXAXIGAXX 1681 CGGCGGAIGG TIXGCCGAIG GXGGTGTACA ACATICCAGC CCTGAGXGGG GIAAAACXGA 1741 CCCXGGAXCA GAXCAACACA CXXGXXACAX XGCCXGGCGX AGGXGCGCXG AAACAGACCX 1801 CXGGCGAXCX CXAXCAGAXG GAGCAGAXCC GXCGTGAACA XCCXGAXCXX GTGCXCXAXA 1861 ACGGXXACGA CGAAAXCTXC GCCXCXGGTC XGCTGGCGGG CGCXGAXGGX GGXAXCGGCA 1921 GTACCXACAA CAXCAXGGGC XGGCGCXATC AGGGGAXCGX XAAGGCGCXG AAAGAAGGCG 1981 AXAXCCAGAC CGCGCAGAAA CXGCAAACXG AAXGCAAXAA AGXCAXXGAX XXACXGAXCA 2041 AAACGGGCGX AXXCCGCGGC CXGAAAACXG XCCXCCAXXA XAXGGAXGXC GXXXCXGXGC 2101 CGCXGXGCCG CAAACCGXXX GGACCGGXAG AXGAAAAATA XCXGCCAGAA CXGAAGGCGC 2161 XGGCCCAGCA GXXGAXGCAA GAGCGCGGGX GAGXXGXXXC CCCXCGCXCG CCCCXACCGG 2221 GXGAGGGGAA AXAAACGCAX CXGXACCCXA CAAXXXXCAX ACCAAAGCGX GXGGGCAXCG 2281 CCCACCGCGG GAGACXCACA AXGAGXACXA CAACCCAGAA XAXCCCGXGG XAXCGCCAXC 2341 ICAACCGXGC ACAATGGCGC GCAXIIICCG C IG CCIG G II GGGAIAXCXG CTXGACGGXI 2401 XXGAXXXCGX XXXAAXCGCC CXGGXACXCA CCGAAGXACA AGGXGAAXXC GGGCXGACGA 2461 CGGXGCAGGC GGCAAGTCXG AXCXCXGCAG CCXTTAXCXC ICGCXGGXXC GGCGGCCTGA 2521 XGCXCGGCGC TAXGGGXGAC CGCXACGGGC GXCGXCXGGC AAXGGTCACC AGCAXCGTXC 2581 XCXICXCGGC CGGGACGCTG GCCXGCGGCX IXGCGCCAGG CIACAXCACC A IG X IIA IC G 2641 CXCGXCXGGX CAXCGGCAXG GGGAXGGCGG GXGAAXACGG XXCCAGCGCC ACCXAXGXCA 2701 XTGAAAGCXG GCCAAAACAX CXGCGXAACA AAGCCAGXGG TXTXXTGAXX XCAGGCXTCX 2761 CTGTGGGGGC CGTCGTTGCC GCTCAGGTCT ATAGCCTGGT GGTTCCGGTC TGGGGCTGGC 2821 GTGCGCTGTT CTTTATCGGC ATTTTGCCAA TCATCTTTGC TCTCTGGCTG CGTAAAAACA 2881 TCCCGGAAGC GGAAGACTGG AAAGAGAAAC ACGCAGGTAA AGCACCAGTA CGCACAATGG 2941 TGGATATTCT CTACCGTGGT GAACATCGCA TTGCCAATAT CGTAATGACA CTGGCGGCGG 3011 CTACTGCGCT G1'GGTTCTGC TTCGCCGGTA ACCTGCAAAA TGCCGCGATC GTCGCTGTTC 3061 TTGGGCTGTT ATGCGCCGCA ATCTTTATCA GCTTTATGGT GCAGAGTGCA GGCAAACGCT 3121 GGCCAACGGG CGTAATGCTG ATGGTGGTCG TGTTGTTTGC TTTCCTCTAC TCATGGCCGA 3181 TTCAGGCGCT GCTGCCAACG TATCTGAAAA CCGATCTGGC TTATAACCCG CATACTGTAG 3241 CC AATGTGCT GTTCTTTAGT GGCT7 TGGCG 3GGCGGTGGG ATGCTGCGTA GGTGGCTTCC 3331 TCGGTGACTG GCTGGGAACC CGCAAAGCGT ACGTTTGTAG CCTGCTGGCC TCGCAGCTGC 336 1 TGATTATTCC GGTATTTGCG ATTGGCGGCG CAAACGTCTG GGTGCTCGGT CTGTTACTGT 3421 TCTTCCAGCA AATGCTTGGA CAAGGGATCG CCGGGATCTT ACCAAAACTG ATTGGCGGTT .3431 ATTTCGATAC CGACCAGCGT GCAGCGGGCC TGGGCTTTAC CTACAACGTT GGCGCATTGG 3541 GCGGTGCACT GGCCCCAATC ATCGGCGCGT TGATCGCTCA ACGTCTGGAT CTGGGTACTG 3631 CGCTGGCATC GCTCTCGTTC AGTCTGACGT TCGTGGTGAT CCTGCTGATT GGGCTGGATA 3661 TGCCTTCTCG CGTTCAGCGT TGGTTGCGCC CGGAAGCGTT GCGTACTCAT GACGCTATCG 3721 ACGGTAAACC ATTCAGCGGT GCCGTGCCGT TTGGCAGCGC CAAAAACGAT TTAGTCAAAA 3781 CCAAAAGTTA ATCCTGTTGC CCGGTCTATG TACCGGGCC7 TTCGCTAAGG GAAGATGTAT 3841 GTCGTTACTT GCACAACTGG ATCAAAAAAT CGCTGCTAAC G G1' G GC C T G A 1' T G1' C T C C T G 3931 CCAGCCGÜT" CCGGACAGCC CGCTCGATAA ACCCGAAATC GTCGCCGCCA TGGCATTAGC 3961 GGCAGAACAG GCGGGCGCGG TTGCCATTCG CATTGAAGGT GTGGCAAATC TGCAAGCCAC 402 1 GCGTGCGGTG GTGAGCGTGC CGATTATTGG AATTGTGAAA CGCGATCTGG AGGATTCTCC 4081 GGTACGCATC ACGGCC'I'A'!A TTGAAGATGT TGATGCGCTG GCGCAGGCGG GCGCGGACAT 4141 TATCGCCATT GACGGCACCG ACCGCCCGCG TCCGGTGCCT GTTGAAACGC TGCTGGCACG 4231 TATTCACCAT CACGGTTTAC TGGCGATGAC CGACTGCTCA ACGCCGGAAG ACGGCCTGGC 4261 ATGCCAAAAG CTGGGAGCCG AAATTATTGG CACTACGCTT TCTGGCTATA CCACGCCTGA 4321 AACGCCAGAA GAGCCGGATC TGGCGCTGGT GAAAACGTTG AGCGACGCCG GATGTCGGGT 4381 GATTGCCGAA GGGCGTTACA ACACGCCTGC TCAGGCGGCG GATGCGATGC GCCACGGCGC 4 -141 GTGGGCGGTG ACGGTCGGTT CTGCAATCAC GCGTCTTGAG CACATTTGTC AGTGGTACAA 4501 CACAGCGATG AAAAAGGCGG TGCTATGACC ACACTGGCGA TTGATATCGG CGGTACTAAA 4561 CT7GCCG2CG CGCTGATTGG CGCTGACGGG CAGATCCGCG ATCGTCGTGA ACTTCCTACG -1621 CCAGCCAGCC AGACACCAGA AGCCTTGCGT GATGCCTTAT CCGCATTAGT CTCTCCGTTG 4681 CAAGCTCATG CGCAGCGGGT TGCCATCGCT TCGACCGGGA TAATCCGTGA CGGCAGCTTG 4741 CTGGCGCTTA ATCCGCATAA TCTTGGTGGA TTGCTACACT TTCCGTTAGT CAAAACGCTG 4821 GAACAACTTA CCAATTTGCC GACCATTGCC ATTAACGACG CGCAGGCCGC AGCATGGGCG 4861 GAGTTTCAGG CGCTGGATGG CGATATAACC GATATGGTCT TTATCACCGT TTCCACCGGC 4921 GTTGGCGGCG GTGTAGTGAG CGGCTGCAAA CTGCTTACCG GCCCTGGCGG TCTGGCGGGG 4981 CATATCGGGC ATACGCTTGC CGATCCACAC GGCCCAGTCT GCGGCTGTGG ACGCACAGGT 5041 TGCGTGGAAG CGATTGCTTC TGGTCGCGGC ATTGCAGCGG CAGCGCAGGG GGAGTTGGCT 5101 GGCGCGGATG CGAAAACTAT TTTCACGCGC GCCGGGCAGG GTGACGAGCA GGCGCAGCAG 3161 CTGATTCACC GCTCCGCACG TACGCTTGCA AGGCTGATCG CTGATATTAA AGCCACAACT 5221 GA7TGCCAGT GCGTGGTGGT CGGTGGCAGC GT 7GGTC7GG CAGAAGGGTA TCTGGCGCTG 528 1 GTGGAAACGT ATCTGGCGCA GGAGCCAGCG GCATTTCATG TTGATTTACT GGCGGCGCAT 5341 TACCGCCATG ATGCAGGTTT ACTTGGGGCT GCGCTGTTGG CCCAGGGAGA AAAATTATGA 5401 TGATGGGTGA AGTACAGTCA TTACCGTCTG CTGGGTTACA TCCTGCGTTA CAGGACGCGT 5461 TAACGCTGGC ATTAGCTGCC AGACCGCAAG AAAAAGCGCC GGGTCGTTAC GAATTACAGG 5521 GCGACAATAT CTTTATGAAT GTCATGACGT TTAACACTCA ATCGCCCGTC GAGAAAAAAG 5581 CGGAATTGCA CGAGCAATAC ATTGATATCC AGCTGTTATT AAACGGTGAG GAACGGATTC 5641 TGTTTGGCAT GGCAGGCACT GCGCGTCAGT GTGAAGAGTT CCACCATGAG GATGATTATC 5701 AGCTTTGCAG CACCATTGAT AACGAGCAAG CCATCATCTT AAAACCGGGA ATGTTCGCCG 5761 TGTTTATGCC AGGTGAACCG CATAAACCAG GATGCGTTGT CGGCGAGCCT GGAGAGATTA 5821 AAAAGGTTGT GGTGAAGGTT AAGGCTGATT TAATGGCTTA A (SEQ ID NO: 42)

n

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un oligosacárido sialilado en una bacteria que comprende:

proporcionar una bacteria, comprendiendo dicha bacteria una sialil-transferasa exógena, una ruta catabólica de ácido siálico deficiente, una capacidad sintética de ácido siálico, un gen de lactosa permeasa funcional y una mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, tal que la bacteria produce al menos 10% más UDP-GlcNAc que una bacteria natural; y

cultivar dicha bacteria en presencia de lactosa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde

(a) dicha ruta catabólica deficiente en ácido siálico comprende una mutación en cualquiera de los genes seleccionados del gen endógeno de N-acetilneuraminato liasa (nanA), gen endógeno de N-acetilmanosamina quinasa (nanK), gen endógeno de N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa (nanE), y el gen endógeno del transportador del ácido N-acetilneuramínico (nanT), o cualquier combinación de los mismos; o

(b) dicha ruta catabólica deficiente en ácido siálico comprende una mutación en el gen endógeno de la N-acetilneuraminato liasa (nanA), y opcionalmente, una mutación en el gen endógeno del transportador del ácido N-acetilneuramínico (nanT), de preferencia en donde dicho ruta catabólica deficiente en ácido siálico comprende además un gen endógeno de N-acetilmanosamina quinasa (nanK) y un gen endógeno de N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa (nanE) que no están mutados; o

(c dicha ruta catabólica deficiente en ácido siálico comprende una mutación en el gen endógeno de la N-acetilneuraminato liasa (nanA), una mutación en el gen endógeno de la epimerasa N-acetilmanosamina-6-fosfato (nanE), y opcionalmente, una mutación en el gen endógeno del transportador del ácido N-acetilneuramínico (nanT), preferiblemente en el que dicha ruta catabólica deficiente en ácido siálico comprende además un gen endógeno de quinasa N-acetilmanosamina (nanK) que no está mutado.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mutación comprende una mutación nula.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha capacidad sintética del ácido siálico comprende un gen exógeno de la sintetasa CMP-Neu5Ac (neuA), un gen exógeno de la sintasa del ácido siálico (neuB) y una UDP-GlcNac 2-epimerasa exógena (neuC).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho gen exógeno de sialiltransferasa es a(2,3) sialil-transferasa, a(2,6) sialil-transferasa, o a(2,8) sialiltransferasa.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho oligosacárido sialilado comprende 3'-sialillactosa (3'-SL) o 6'-sialillactosa (6'-SL).

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha bacteria comprende un gen de p-galactosidasa endógeno eliminado o inactivado, por ejemplo, dicho gen de p-galactosidasa eliminado o inactivado comprende el gen de E. coli lac z.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha bacteria comprende un gen de p-galactosidasa recombinante que proporciona un nivel bajo, pero detectable, de actividad de p-galactosidasa.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha bacteria comprende además un gen lac A delecionado, inactivado o mutado.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que

(a) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende además la sobreexpresión de un gen glmS, un gen glmY, un gen glmZ o cualquier combinación de los mismos; o

(b) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmS; o (c) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmY; o (d) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmZ.

11. Un método para producir un oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina en una bacteria que comprende: proporcionar una bacteria, comprendiendo dicha bacteria un gen exógeno UDP-GlcNAc:Gala/pR p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa, un gen funcional de la lactosa permeasa y un aumento de la capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produce al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa; y

cultivar dicha bacteria en presencia de lactosa.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha bacteria comprende una mayor capacidad de producción de UDP-GIcNAc,

por ejemplo

(a) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende además la sobreexpresión de un gen glmS, un gen glmY, un gen glmZ o cualquier combinación de los mismos; o

(b) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmS; o (c) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmY; o (d) dicha mayor capacidad de producción de UDP-GlcNAc comprende la sobreexpresión de nagC y glmZ.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el que dicho oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina comprende cualquiera seleccionado de Lacto-N-triosa 2 (LNT2), Lacto-N-tetraosa (LNT), Lacto-N-neotetraosa (LNnT), Lacto-N-fucopentaosa I (LNF I), Lacto-N-fucopentaosa II (LNF II), Lacto-N-fucopentaosa III (LNF III), Lacto-N-fucopentaosa V (LNF V), Lacto-N-difucohexaosa I (LDFH I), Lacto-N-difucohexaosa II (LDFH II), y Lacto-N-neodifucohexaosa II (LFNnDFH II).

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicha bacteria es E. coli.

15. Una bacteria E. coli aislada que comprende

(a) un gen de p-galactosidasa endógeno eliminado o inactivado, un gen de sialil-transferasa exógeno, una ruta catabólica deficiente en ácido siálico, una capacidad sintética de ácido siálico, un gen funcional de lactosa permeasa y una mayor capacidad de producción UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de manera que la bacteria produce al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa, por ejemplo, dicha bacteria comprende además un gen de p-galactosidasa recombinante que proporciona un nivel bajo, pero detectable, de actividad de p-galactosidasa; o

(b) un gen exógeno UDP-GlcNAc:Gala/p-R p 3-N-acetilglucosaminiltransferasa, un gen funcional de lactosa permeasa y un aumento de la capacidad de producción de UDP-GlcNAc que comprende la sobreexpresión de nagC, de modo que la bacteria produce al menos un 10% más de UDP-GlcNAc que una bacteria nativa.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además recuperar dicho oligosacárido sialilado de dicha bacteria o de un sobrenadante de cultivo de dicha bacteria; o el método de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, que comprende además recuperar dicho oligosacárido que contiene N-acetilglucosamina de dicha bacteria o de un sobrenadante de cultivo de dicha bacteria.

17. El método de la reivindicación 1, en el que dicha bacteria comprende un gen endógeno de N-acetilmanosamina quinasa (nanK) que no está mutado, y un gen endógeno de N-acetilneuraminato liasa (nanA) y un gen endógeno de N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerasa (nanE) que están mutados.