CN117757683B - 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺 - Google Patents

凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN117757683B
CN117757683B CN202311811502.8A CN202311811502A CN117757683B CN 117757683 B CN117757683 B CN 117757683B CN 202311811502 A CN202311811502 A CN 202311811502A CN 117757683 B CN117757683 B CN 117757683B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
bacillus coagulans
mannosamine
culture
density
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311811502.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117757683A (zh
Inventor
喻扬
郁雪平
马新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd
Original Assignee
Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd filed Critical Thankcome Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority to CN202311811502.8A priority Critical patent/CN117757683B/zh
Publication of CN117757683A publication Critical patent/CN117757683A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117757683B publication Critical patent/CN117757683B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺。本发明提供了一种凝结芽孢杆菌的发酵培养基，配方为：葡萄糖5‑10g/L，玉米淀粉8‑15g/L，牛肉膏8‑15g/L，酵母粉OXIOD 5‑10g/L，硫酸镁·7H2O0.3‑0.5g/L，硫酸锰·1H2O 0.1‑0.2g/L，硫酸亚铁·7H2O 0.1‑0.3g/L，氯化钠5‑8g/L，D‑甘露糖胺5‑10g/L，尿苷3‑6g/L。在发酵中通过流加D‑甘露糖胺和(NH4)2HPO4控制pH值为6.5‑7.5，实现高密密度发酵。为凝结芽孢杆菌在食品、医药中的应用提供技术支持。

Description

凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺。
背景技术
凝结芽孢杆菌，不仅具有乳酸菌生产性能的优势，还具有易萌发、可定植、其形成的孢子还具有对不良环境的抗性及可长时间保存等多重优点。首先，凝结芽孢杆菌具备乳酸菌类微生态制剂的特点，可在肠道内定殖，补充有益菌群，调整消化道内环境和微生物区系平衡，在小肠壁形成生物屏障，预防和治疗消化机能紊乱和消化道感染，并可分泌乳酸等酸性物质，调节肠道pH、促进肠道的蠕动，提高消化、吸收功能；其次，凝结芽孢杆菌亦可形成芽孢，具备芽孢菌类微生态制剂的特点，能很好的耐受饲料加工过程中的高温、肠道胃酸、胆碱等，并大大降低运输保藏过程中的失活现象，同时在消化道中能产生多种消化酶、丰富的维生素和未知生长因子等，可起到辅助消化、促进生长的作用。众多研究结果表明：凝结芽孢杆菌能有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能。治疗因肠道菌群失调引起的急、慢性腹泻、慢性便秘、腹胀和消化不良等症。凝结芽孢杆菌还可促进动物机体的消化吸收、改善动物机体免疫功能、提高动物抗病能力等作用，从而促进动物的生长，降低其死亡率、淘汰率和料肉比。由于凝结芽孢杆菌的芽孢具有易保藏、复活率高等特点，因而还是乳酸菌商品化制剂的重要形式。
作为益生菌在饲料应用和临床应用时，凝结芽孢杆菌发酵生产时的活菌数和芽孢率显得尤为重要。凝结芽孢杆菌发酵过程中会产生大量乳酸降低环境pH值，pH值降低到一定程度时会抑制其自身生长；且其芽孢的形成条件也极为苛刻，受营养条件和环境因素等多方面因素影响。要实现高密度发酵和高芽孢转化率需要统筹兼顾，合适的培养基组分和发酵工艺参数缺一不可。
中国专利CN102505003B公开了一种畜禽用凝结芽玸杆菌高密度发酵方法及其制备的制剂和应用。首先对凝结芽玸杆菌进行液体发酵，然后进行固体变温连续发酵，固体发酵后期进行通风，继续发酵兼千燥，干燥结束，获得凝结芽袍杆菌制剂初产品，经进一步粉碎过筛，获得高密度凝结芽玸杆菌菌剂终产品，终产品菌体数可达115.5×108cfu/g，芽玸率可达77.2％。
中国专利CN104651274 A公开了一种与现有技术相比，该发明是利用食品豆制品加工中产生的黄浆水作为培养基原料，添加定量的碳源、氮源和无机盐，来进行芽抱杆菌的高密度培养，不仅提高了工业发酵过程中芽抱杆菌的活菌数，同时有效降低了芽抱杆菌高密度培养的成本，芽抱杆菌的细胞生物量可以达到1010个/mL以上，比目前报道的培养结果高出到两个数量级，提高了近百倍。
目前，凝结芽孢杆菌在添加剂方面的应用报道日益增多，因此，研究出更多的高密度凝结芽孢杆菌菌剂的生产方法将会为工业、临床医学以及畜牧业带来无限生机。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了凝结芽孢杆菌高密度发酵方法，发酵的培养基配方为：葡萄糖，玉米淀粉，牛肉膏，酵母粉OXIOD，硫酸镁·7H2O，硫酸锰·1H2O，硫酸亚铁·7H2O，氯化钠，D-甘露糖胺和尿苷。通过反馈补料法控制发酵液的pH进行高密度发酵。
一方面，本发明提供了一种凝结芽孢杆菌高密度发酵的方法，该方法包括以下步骤：
(1)菌株活化，将菌株接种于活化培养基中，培养获得种子液；
(2)将步骤(1)的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
(3)步骤(2)培养一段时间后，通过反馈补料法控制发酵液的pH进行高密度发酵。
具体地，所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖5-10g/L，玉米淀粉8-15g/L，牛肉膏8-15g/L，酵母粉OXIOD 5-10g/L，硫酸镁·7H2O 0.3-0.5g/L，硫酸锰·1H2O0.1-0.2g/L，硫酸亚铁·7H2O 0.1-0.3g/L，氯化钠5-8g/L，D-甘露糖胺5-10g/L，尿苷3-6g/L，pH值6.5-7.5。
优选地，在一些实施例中所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖8g/L，玉米淀粉12g/L，牛肉膏12g/L，酵母粉OXIOD 8g/L，硫酸镁·7H2O 0.4g/L，硫酸锰·1H2O 0.15g/L，硫酸亚铁·7H2O 0.2g/L，氯化钠6g/L，D-甘露糖胺8g/L，尿苷5g/L，pH值7.0。
在另一些实施例中所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉8g/L，牛肉膏15g/L，酵母粉OXIOD 5g/L，硫酸镁·7H2O 0.3g/L，硫酸锰·1H2O 0.2g/L，硫酸亚铁·7H2O 0.1g/L，氯化钠8g/L，D-甘露糖胺10g/L，尿苷3g/L，pH值6.5。
在另一些实施例中所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖5g/L，玉米淀粉15g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉OXIOD 10g/L，硫酸镁·7H2O 0.5g/L，硫酸锰·1H2O 0.1g/L，硫酸亚铁·7H2O 0.3g/L，氯化钠5g/L，D-甘露糖胺5g/L，尿苷6g/L，pH值7.5。
具体地，所述的步骤(2)的种子液接种量按照体积比为1-5％。
优选地，所述的步骤(2)的种子液接种量按照体积比为3％。
具体地，所述的步骤(2)的发酵培养条件为：温度30-35℃，转速150-210r/min，通气量10-15L/min，培养30-48h。
优选地，所述的步骤(2)的发酵培养条件为：温度30℃，转速190r/min，通气量12L/min，培养40h。
具体地，所述的步骤(3)的反馈补料法包括但不限于：流加D-甘露糖胺和(NH4)2HPO4。
具体地，所述的D-甘露糖胺的浓度可以是30-50g/L；(NH4)2HPO4的浓度可以是40-60g/L。
优选地，所述的D-甘露糖胺的浓度可以是40g/L；(NH4)2HPO4的浓度可以是50g/L。
具体地，所述的流加时间为发酵培养10-15h。
优选地，所述的流加时间为发酵培养12h。
具体地，所述的步骤(3)的发酵液的pH为6.5-7.5。
优选地，所述的步骤(3)的发酵液的pH为7.0。
又一方面，本发明提供了前述的方法制备的凝结芽孢杆菌制剂。
具体地，包括但不限于：凝结芽孢杆菌BC01和/或凝结芽抱杆菌BC69；所述的凝结芽孢杆菌BC01的保藏编号为CCTCC NO:M2017813；所述的凝结芽抱杆菌BC69的保藏号为CGMCC No.23766。
又一方面，本发明提供了前述的方法制备的芽孢杆菌的用途，所述的用途选自以下至少一种：
(a)制备预防和/或治疗肠炎的药物；
(b)制备预防和/或治疗过敏性疾病的药物；
(c)制备辅助治疗和/或预防肠炎的食品。
具体地，所述的肠炎包括但不限于：结肠炎、小肠炎和/或直肠炎。
具体地，所述的过敏性疾病是由肠道组织水肿以及肠黏膜屏障被破坏引起的过敏性疾病、由肠道菌群失衡引起的过敏性疾病或由肺部组织发生病变引起的过敏性疾病。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料选自润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、抑菌剂、悬浮剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
进一步具体地，所述的药物的剂型可以是粉剂、片剂、胶囊或丸剂。
具体地，所述的食品还包括食品学上可接受的辅料。
进一步具体地，所述的食品学上可接受的辅料选自润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述食品学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
更具体地，所述的食品包括但不限于：茶饮、咖啡、汽水、饮料、果汁、饼干、蛋糕、面包、月饼、乳制品、奶制品、糖果和/或巧克力。
又一方面，本发明提供了前述的方法制备的凝结芽孢杆菌在保健品中的应用。
具体地，所述的保健品能够维护肠道健康。
具体地，所述的保健品还包括保健品中可接受的辅料。
进一步具体地，所述的辅料选自填充剂、胶囊壳材料、溶剂、稳定剂、赋味剂、甜味剂、色素一种或两种以上的组合。
优选地，所述的填充剂选自淀粉、玉米粉、葡萄中的至少一种；
所述的胶囊壳材料选自明胶、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇中的至少一种；
所述的溶剂选自水、酒精、甘油、乙醇中的至少一种；
所述的稳定剂选自抗氧剂、防腐剂中的至少一种；
所述的赋味剂选自天然香料、人工香精中的至少一种；
所述的甜味剂选自天然甜味剂、人工甜味剂中的至少一种；
所述的色素选自天然色素、人工色素中的至少一种。
又一方面，本发明提供了前述的方法制备的凝结芽孢杆菌在饲料中的应用。
具体地，所述的饲料包括但不限于：禽类饲料、牲畜饲料和水产饲料。
具体地，所述的禽类包括但不限于：鸡、鸭和鹅。
具体地，所述的牲畜包括猪、牛、羊、马、狗、猫和兔。
具体地，所述的水产包括鱼类、虾类、蟹类和贝类。
具体地，所述的饲料中添加一定有效含量的凝结芽孢杆菌。
本发明所取得的技术效果：通过本发明的方法获得的凝结芽孢杆菌BC01的活菌数高达9.67×1010，芽孢数8.86×1010，芽孢率为91.6％；凝结芽抱杆菌BC69的活菌数高达7.95×1010，芽孢数7.16×1010，芽孢率为90.0％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.1菌株
凝结芽孢杆菌BC01，保藏编号为CCTCC NO:M2017813；凝结芽抱杆菌BC69，保藏号为CGMCC No.23766。由于以上菌株为公开菌株，因此，本发明不涉及保藏证明。
1.2高密度发酵培养方法
1.2.1菌株的活化
将保藏于-80℃的菌株冻存管取出，室温解冻，混匀，以体积分数3％的接种量接种于活化培养基中，于30℃、160r/min条件下震荡培养24h，传代培养2-3代获得种子液。
活化培养基的配方(g/L)为：葡萄糖8，玉米淀粉12，牛肉膏12，酵母粉OXIOD 8，氯化钠6。用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸调pH值7.0。
1.2.2发酵培养
将1.2.1的种子液以4％(v/v)的接种量接种于10L的发酵罐中，发酵温度为30℃，190r/min，通气量12L/min，震荡培养40h。发酵12h开始流加D-甘露糖胺40g/L、(NH4)2HPO450g/L，使pH保持在7.0，直至发酵结束。
发酵培养的配方(g/L)为：葡萄糖8，玉米淀粉12，牛肉膏12，酵母粉OXIOD 8，硫酸镁·7H2O 0.4，硫酸锰·1H2O 0.15，硫酸亚铁·7H2O 0.2，氯化钠6，D-甘露糖胺8，尿苷5，pH值7.0。
1.2.3计数方法
凝结芽孢杆菌的活菌总数采用稀释平板计数法；芽孢计数则采用把培养后菌液于82℃水浴10min后稀释涂平板计数。
实施例2
活化条件同实施例1中的1.2.1。
发酵条件为：将种子液以1％(v/v)的接种量接种于10L的发酵罐中，发酵温度为30℃，210r/min，通气量15L/min，震荡培养30h。发酵10h开始流加D-甘露糖胺30g/L、(NH4)2HPO4 40g/L，使pH保持在6.5，直至发酵结束。
活化培养基的配方(g/L)为：葡萄糖5，玉米淀粉15，牛肉膏8，酵母粉OXIOD 10，氯化钠5。用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸调pH值6.8。
发酵培养的配方(g/L)为：葡萄糖10，玉米淀粉8，牛肉膏15，酵母粉OXIOD 5，硫酸镁·7H2O 0.3，硫酸锰·1H2O 0.2，硫酸亚铁·7H2O 0.1，氯化钠8，D-甘露糖胺10，尿苷3，pH值6.5。
实施例3
活化条件同实施例1中的1.2.1。
发酵条件为：将种子液以5％(v/v)的接种量接种于10L的发酵罐中，发酵温度为35℃，150r/min，通气量10L/min，震荡培养48h。发酵15h开始流加D-甘露糖胺50g/L、(NH4)2HPO4 60g/L，使pH保持在7.5，直至发酵结束。
活化培养基的配方(g/L)为：葡萄糖10，玉米淀粉8，牛肉膏15，酵母粉OXIOD 5，氯化钠8。用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸调pH值7.2。
发酵培养的配方(g/L)为：葡萄糖5，玉米淀粉15，牛肉膏8，酵母粉OXIOD 10，硫酸镁·7H2O 0.5，硫酸锰·1H2O 0.1，硫酸亚铁·7H2O 0.3，氯化钠5，D-甘露糖胺5，尿苷6，pH值7.5。
对比例
参照实施例1进行对比例的设置，与实施例1的区别见下表：
对比例 与实施例1的区别
对比例1 发酵培养基中不添加尿苷
对比例2 发酵培养基中的D-甘露糖胺以及流加均替换为等浓度的D-半乳糖胺
对比例3 发酵培养基中尿苷替换为等浓度的尿嘧啶
对比例4 发酵中流加D-甘露糖胺40g/L替换为NaHCO3 40g/L。
实施例1-3和对比例1-5凝结芽孢杆菌的活菌总数以及芽孢总数见下表：
由以上结果可知，相对于对比例1-4，实施例1-3的培养基配方以及发酵条件更有利于提高凝结芽孢杆菌BC01和凝结芽抱杆菌BC69的活菌数以及产芽孢的能力。

Claims (6)

1.一种凝结芽孢杆菌高密度发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株活化，将菌株接种于活化培养基中，培养获得种子液；
（2）将步骤（1）的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
（3）步骤（2）培养一段时间后，通过反馈补料法控制发酵液的pH进行高密度发酵；
所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖5-10g/L，玉米淀粉8-15g/L，牛肉膏8-15g/L，酵母粉OXIOD 5-10g/L，硫酸镁·7H2O 0.3-0.5g/L，硫酸锰·1H2O 0.1-0.2g/L，硫酸亚铁·7H2O0.1-0.3g/L，氯化钠5-8g/L，D-甘露糖胺5-10g/L，尿苷3-6g/L，pH值6 .5-7.5；
所述的步骤（3）的反馈补料法包括流加D-甘露糖胺和(NH4)2HPO4 。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）的种子液接种量按照体积比为1-5%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）的发酵培养条件为：温度30-35℃，转速150-210 r/min，通气量10-15L/min，培养30-48h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流加D-甘露糖胺的浓度为30-50g/L；(NH4)2HPO4 的浓度为40-60g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流加时间为发酵培养10-15h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）的发酵液的pH为6.5-7.5。
CN202311811502.8A 2023-12-26 2023-12-26 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺 Active CN117757683B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311811502.8A CN117757683B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311811502.8A CN117757683B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117757683A CN117757683A (zh) 2024-03-26
CN117757683B true CN117757683B (zh) 2024-06-18

Family

ID=90321771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311811502.8A Active CN117757683B (zh) 2023-12-26 2023-12-26 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117757683B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6652334B2 (ja) * 2014-05-31 2020-02-19 Ｊｃｒファーマ株式会社 ウリジンとｎ−アセチル−ｄ−マンノサミンとを含有する培地
CN107267576B (zh) * 2016-04-05 2020-08-21 孙镧 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法
US20200325505A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 Ut-Battelle, Llc Filamentous fungi capable of producing very long chain fatty acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究;赵丽娜;中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑;20180115(第2018/01期);正文第37页第1-2段 *
利用Biolog系统进行乳酸生产菌代谢能力的快速分析;柏中中;许婷婷;何小丹;何冰芳;;食品与生物技术学报;20090515(第03期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117757683A (zh) 2024-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103981118B (zh) 一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用
CN103392911B (zh) 一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法
CN102212495B (zh) 一株嗜酸乳杆菌及其应用
CN106260504B (zh) 一种利用啤酒酵母泥生产微生物发酵湿饲料的方法
CN110226673A (zh) 一种加州鲈鱼养殖中保肝健肠的复合制剂及其制备方法
CN101946850A (zh) 一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途
WO2008023580A1 (fr) Additif pour alimentation animale
CN110982753B (zh) 凝结芽孢杆菌mes847、菌剂、鸡饲料、制备方法及应用
CN113907208B (zh) 一种预防仔猪腹泻的饲料添加剂及其制备方法和应用
CN101199558A (zh) 一种禽用复合益生菌制剂及其制备方法
CN109593666A (zh) 一种复合微生态制剂及其制备方法和应用
CN103289910A (zh) 一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法
CN112136965B (zh) 一种增免促生长型发酵中草药饲料添加剂及其制备方法
WO2007034627A1 (ja) 動物用飼料添加剤
RU2437563C1 (ru) Пробиотическая кормовая добавка
CN106884000B (zh) 一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌富硒菌剂的制备及应用
CN106754549A (zh) 可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末及其制备方法
CN105994937A (zh) 一种绿色富有机硒饲料及其制备方法
CN106011019A (zh) 一种噬菌蛭弧菌制剂的生产方法
CN104388338B (zh) 一种复合菌制剂及其应用
CN104312961A (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN117757683B (zh) 凝结芽孢杆菌高密度发酵代谢调控工艺
KR100351754B1 (ko) 가축사료 첨가제용 조성물
CN106819470A (zh) 猪饲料添加剂及其制备方法和应用
CN114015626A (zh) 一种具有抑菌功能的类植物乳杆菌及其复合制剂及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant