CN111018957A - 一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种介导PGase分泌表达的Tat信号肽及其应用，属于酶工程和基因工程领域。本发明提供新型Tat信号肽的同时，借助地衣芽胞杆菌Tat信号肽介导PGase分泌表达的新型制备途径，提供的Tat信号肽突变体较野生型信号肽mGlmU介导下制备出的PGase发酵液上清酶活提高了92％，为PGase可能的工业制备奠定理论技术基础；同时，本发明构建的重组菌株性状稳定，繁殖和表达周期短，能稳定的高表达PGase；经发酵条件的优化，制备的PGase可达到550U/L。

Description

一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用

技术领域：

本发明涉及一种介导PGase分泌表达的Tat信号肽及其应用，属于酶工程和基因工程领域。

背景技术：

蛋白质谷氨酰胺氨基水解酶(Protein-L-glutamine amidohydrolase；以下简称PGase，EC3.5.1.44)，一种特殊的脱氨酶，主要针对蛋白质分子中谷氨酰胺残基上的氨酰基，进行特异性脱氨基作用，将其转换为谷氨酸残基。

PGase在食品蛋白改性领域具有广泛的应用前景，可以作为脱酰胺剂作用于多种植物蛋白和酪蛋白及其相关食品。与其它脱酰胺作用的酶类相比较，PGase对小肽分子和蛋白质中的Gln残基都能够进行脱酰胺反应，特异性高，能明显提高蛋白质的功能性质，因而被认为是最有效的脱酰胺改性方法。正因这些优势使得PGase在食品加工方面有广泛的应用前景，但因其酶产量低、且应用方面成本高，目前其应用还仅停留在实验室阶段。故现有的蛋白质谷氨酰胺氨基水解酶的制备方法还有待进一步提高。

本发明在蛋白质谷氨酰胺氨基水解酶的制备方法上创新性的引入地衣芽胞杆菌Tat信号肽介导PGase分泌表达，以及利用具有强大的外源蛋白合成与分泌能力的芽胞杆菌表达系统，实现PGase的高效制备。以溶解性能为指标，初步评价PGase在植物蛋白上的应用。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种介导PGase分泌表达的Tat信号肽，以及采用该信号肽进行蛋白质谷氨酰胺氨基水解酶制备的方法。通过地衣芽胞杆菌Tat信号肽介导PGase分泌表达，以及利用具有强大的外源蛋白合成与分泌能力的芽胞杆菌表达系统，实现PGase的高效制备。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种Tat信号肽，所述Tat信号肽具体为mGlmU1突变体，序列如SEQID NO.2所示，是在野生型Tat信号肽GlmU(SEQ ID NO.1)的基础上发生N3K突变获得的；

进一步地，所述mGlmU1突变体的编码基因如序列表SEQ ID NO.3所示；

进一步地，所述mGlmU1较GlmU介导的PGase分泌表达能力提高92％。

本发明还提供一种包含Tat信号肽mGlmU1的PGase重组载体，是以pHY-WZX为表达质粒，同时将mGlmU1信号肽和PGase编码基因克隆入pHY-WZX的多克隆位点所得；

优选地，所述PGase编码基因在Genbank的Accession no为AB046594；

本发明还提供一种表达PGase的重组菌株，是以地衣芽胞杆菌为宿主，并表达上述重组载体获得的；

优选地，所述宿主为地衣芽胞杆菌CBB3008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 208236；

本发明还提供上述重组菌株在生产PGase中的应用；

进一步地，上述重组菌株用于发酵生产PGase的方法，具体如下：

(1)种子培养条件：37℃培养10-18h，摇床转速200rpm；

(2)种子培养基：LB培养基；

(3)发酵培养条件：4％-12％接种量，37℃、转速200rpm、培养72-120h；经过72-120h的发酵，发酵液中PGase的产量可达321-550U/L。

(4)发酵培养基：乳糖4％(w/v)，豆饼粉2％(w/v)，硫酸铵0.5％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O1.8％(w/v)，KH₂PO₄ 0.3％(w/v)，pH6.0-8.0。

本发明还提供由上述方法生产的PGase在植物蛋白溶解中的应用；

进一步的，溶解条件为pH5.5-7，温度35-55℃，PGase添加量为0.5-5U/g蛋白，反应时间15-35h；

优选地，酶解条件为pH6.5，温度37℃，PGase添加量5U/g蛋白，反应时间30h；

有益效果：

1、本发明提供了一种Tat信号肽突变体，以及借助地衣芽胞杆菌Tat信号肽介导PGase分泌表达的新型制备途径，为PGase可能的工业制备奠定理论技术基础；

2、本发明构建的重组菌株性状稳定,繁殖和表达周期短,能稳定的高表达PGase；经发酵条件的优化，制备的PGase可达到550U/L；

3、本发明提供的制备方法制得的PGase活性高，将其应用在植物蛋白溶解度差的问题上，能有效提高植物蛋白的溶解度；以大豆蛋白为例，在37℃，pH 6.5条件下，将所制备得的500U/L PGase与7％大豆蛋白反应30h，溶解度可达到80％。

附图说明：

图1含不同信号肽系列表达载体pHY-TAT的构建过程示意图。

图2最优重组菌的发酵优化条件确定。

图3PGase改性大豆分离蛋白工艺条件确定。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明首先通过TatP 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TatP/)对地衣芽胞杆菌DSM13全基因组研究，发现共有68个分泌蛋白含有Tat分泌途径典型的信号肽结构，从中遴选出11种信号肽(GlmU、YxaJ、YbxG、YbgF、PhoD、YcgH、YdbS、YhdH、YhjN、AbnA、YesL)；

对上述获得的全部Tat信号肽及PGase编码基因采用酶连接和/或Crossover PCR法进行表达盒的组装；将构建好的表达盒克隆入pHY-WZX的多克隆位点，获得具有不同信号肽结构特征的系列表达载体pHY-SP_Tat-PGase；采用电转化方法转入芽胞杆菌表达系统，获得了系列重组菌；

上述构建获得系列重组菌通过摇瓶发酵，基于上清液PGase酶活力高低获得最优介导PGase分泌的信号肽；

通过易错PCR等随机突变的方式，以含遴选出的待突变信号肽的表达盒为基础，进行随机突变；获得系列突变产物，将其与PGase编码基因采用酶连接和/或Crossover PCR法进行表达盒的组装克隆入pHY-WZX的多克隆位点构建获得含信号肽突变体的系列表达载体pHY-Tat*spPGase；采用电转化方法转入芽胞杆菌表达系统,获得了系列转化子构成的突变体库；

构建获得系列突变重组菌通过摇瓶发酵，基于上清液PGase酶活力高低进一步分析其结构与介导PGase分泌的效率的相关关系，获得最优重组菌，也同时确定最优Tat信号肽突变体；对最优重组菌进行发酵过程的优化，获得目标产物PGase的最大产量。

本发明所使用的质粒pHY-WZX为现有技术，其构建方法已公开在Niu DD,WangZX.Development of a pair of bifunctional expression vectors for Escherichiacoli and Bacillus licheniformis.J Ind Microbiol Biotechnol(2007)34:357-362.DOI 10.1007/s10295-0204-x.公众也可通过天津科技大学化工与材料学院生物催化与生物转化实验室获得。

以下将结合具体实施方式对本发明做进一步地解释说明。

实施例1：含不同信号肽系列表达载体的构建

基于地衣芽胞杆菌ATCC 14580(地衣芽胞杆菌DSM13)基因组，设计编码TAT信号肽(GlmU、YxaJ、YbxG、YbgF、PhoD、YcgH、YdbS、YhdH、YhjN、AbnA、YesL)的引物，所述引物的序列入表1所示的核苷酸序列。以地衣芽胞杆菌ATCC 14580基因组为模板，采用上述引物进行PCR扩增，回收得到TAT信号肽基因片段。质粒pHY-WZX中的信号肽区域，通过使用引物A(5'-GATTCTCCTCCCCTTTCAATG-3')和引物B(5'-TCTGGATCCAGAATTCGAGCTCCCGGGTACCAT-3'；强调引入BamHI位点)进行反向PCR扩增，将其替换。将改造后的pHY-WZX作为模板，插入上述TAT信号肽基因片段，以产生表达质粒pHY-TAT。含不同信号肽系列表达载体pHY-TAT的构建过程如图1所示。

参照GenBank中C.proteolyticum的PGase基因序列(Accession no:AB046594)进行PGase密码子优化与基因全合成，并克隆到pUC18质粒中以获得pUC-PGA重组质粒。通过使用引物Pga1(5’-CGCGGATCCCTTGCGAGCGTTATCCCGGA-3’)和Pga2(5’-TTAGAAGCCGCAGCTGCTAACG-3’)进行PCR扩增出PGase基因。然后将上述PCR产物用BamHI酶切，并将其克隆入上述构建获得的表达载体pHY-TAT质粒中BamHI和SmaI中，获得系列重组质粒pHY-SP_Tat-PGase。

表1 TAT信号肽引物

实施例2：介导PGase分泌最优的Tat信号肽的遴选

将上述构建的具有不同信号肽结构特征的系列重组质粒pHY-SP_Tat-PGase转化到枯草芽胞杆菌WB600中，并获得了系列重组菌。通过对这系列重组菌进行初步发酵试验，并测定发酵液上清液中的PGase酶活，结果见表2。地衣芽胞杆菌Tat信号肽中GlmU，YhdH和YxaJ能够介导PGase分泌。其中，GlmU信号肽介导PGase产生最高的酶活力，为最优介导PGase分泌的信号肽，并选择GlmU信号肽用于进一步的实验。

表2地衣芽胞杆菌Tat信号肽介导PGase表达后发酵液PGase酶活水平

^*N.D.:Not detectable

实施例3：最优突变重组菌的筛选

以含有GlmU信号肽和PGase编码基因的重组质粒pHY-GlmUspPGase为基础，通过易错PCR引入随机突变。将随机突变的产物与PGase编码基因采用酶连接和/或Crossover PCR法进行表达盒的组装克隆入pHY-WZX的多克隆位点构建获得含信号肽突变体的系列表达载体pHY-GlmU*spPGase；采用电转化方法转入芽胞杆菌CBB3008，获得了系列突变重组菌。通过对这系列突变重组菌进行初步发酵试验，比较发酵液上清液中的PGase酶活力。筛选出最优重组菌，并确定最优GlmU信号肽突变体mGlmU1信号肽(SEQ ID NO.2所示)，在最优信号肽mGlmU1介导下制备出的PGase发酵液上清酶活力可达到230U/L，较野生型信号肽GlmU介导下制备出的PGase发酵液上清酶活120U/L提高了92％。

PGase酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下以Cbz-Gln-Gly为底物,每分钟催化底物生成1μmol氨所需要的酶量为一个酶活力单位。

实施例4：最优重组菌的发酵生产PGase

以上述以mGlmU1为信号肽表达PGase的最优重组菌为发酵菌株发酵生产PGase：

(1)种子培养条件：37℃培养14h，摇床转速200rpm；

(2)种子培养基：LB培养基；

(3)发酵培养条件：6％接种量，37℃、转速200rpm、培养96h；经过96h的发酵，发酵液中PGase的产量可达550U/L。

(4)发酵培养基：乳糖4％(w/v)，豆饼粉2％(w/v)，硫酸铵0.5％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O1.8％(w/v)，KH₂PO₄ 0.3％(w/v)，pH6.0。

实施例5最优重组菌的发酵生产PGase

以上述以mGlmU1为信号肽表达PGase的最优重组菌为发酵菌株发酵生产PGase：

(1)种子培养条件：37℃培养10h，摇床转速200rpm；

(2)种子培养基：LB培养基；

(3)发酵培养条件：4％接种量，37℃、转速200rpm、培养72h；经过72h的发酵，发酵液中PGase的产量可达395U/L。

(4)发酵培养基：乳糖4％(w/v)，豆饼粉2％(w/v)，硫酸铵0.5％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O1.8％(w/v)，KH₂PO₄ 0.3％(w/v)，pH6.0-8.0。

最优重组菌发酵优化条件见图2。

实施例6：PGase改性大豆分离蛋白

采用福林酚试剂法测定PGase改性大豆分离蛋白样品中的溶解度变化。准确称取大豆分离蛋白(0.7g)分散于10mL的磷酸盐缓冲溶液中(20mmol/L pH 6.5)。于分散好的蛋白溶液中加入实施例4制备出的PGase，使其终浓度为5U/g蛋白37℃恒温条件下搅拌过夜。然后12000rpm离心5min，收集上层可溶性组分，测定蛋白质的溶解度，用牛血清白蛋白做标准曲线。

溶解度计算公式：

蛋白质溶解度(％)＝上清液中蛋白质含量/样品中蛋白质含量×100

用本发明制备方法得到的PGase，将其应用于改性大豆分离蛋白，其工艺条件见图3。研究结果表明，以大豆蛋白为例，在37℃，pH 6.5条件下，将所制备得的500U/L PGase与7％大豆蛋白反应30h，溶解度可达到80％。可见，本发明提供的制备方法制得的PGase活性高，将其应用在植物蛋白上，能有效提高植物蛋白的溶解度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用

<130> 1

<141> 2019-12-03

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌()

<400> 1

Met Asp Asn Arg Asp Asn Gly Gly Gln Tyr Met Asp Lys Arg Phe Ala

1 5 10 15

Val Val Leu Ala Ala Gly Gln Gly Thr Arg Met Lys Ser Lys Leu Tyr

20 25 30

Lys Val Leu His Pro Val Cys Gly

35 40

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Asp Lys Arg Asp Asn Gly Gly Gln Tyr Met Asp Lys Arg Phe Ala

1 5 10 15

Val Val Leu Ala Ala Gly Gln Gly Thr Arg Met Lys Ser Lys Leu Tyr

20 25 30

Lys Val Leu His Pro Val Cys Gly

35 40

<210> 3

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggataaaa gggataatgg aggccaatac atggataagc ggtttgcagt tgtgttagca 60

gctggtcaag gaacaagaat gaaatcaaag ctatataaag ttcttcatcc t 111

Claims (10)

1.一种Tat信号肽，其特征在于，所述Tat信号肽具体为mGlmU1，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种Tat信号肽，其特征在于，mGlmU1编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

3.包含权利要求2所述Tat信号肽的重组载体或重组菌。

4.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，表达载体为pHY-WZX质粒。

5.如权利要求2所述的重组菌，其特征在于，是同时将mGlmU1信号肽和PGase编码基因克隆入pHY-WZX的多克隆位点，并在宿主地衣芽胞杆菌CBB3008中表达所得。

6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，PGase编码基因在Genbank的Accession no为AB046594。

7.权利要求6所述重组菌在生产PGase中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵生产PGase的方法具体如下：

(1)发酵培养条件：4％-12％接种量，37℃、转速200rpm培养72-120h；

(2)发酵培养基：乳糖4％(w/v)，豆饼粉2％(w/v)，硫酸铵0.5％(w/v)，K₂HPO₄·3H₂O1.8％(w/v)，KH₂PO₄ 0.3％(w/v)，pH6.0-8.0。

9.权利要求8所述方法生产的PGase在植物蛋白溶解中的应用，其特征在于，方法如下：溶解条件为pH5.5-7，温度35-55℃，PGase添加量为3-5U/g蛋白，反应时间15-35h。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，方法如下：酶解条件为pH6.5，温度37℃，PGase添加量5U/g蛋白，反应时间30h。

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