CN112680434A - 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。在本发明中通过改造信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本发明通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由0.44U/mL提高到3.2U/mL，酶活提高7.27倍，应用本发明中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。

Description

一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

技术领域

本发明涉及一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase，EC3.5.1.44，简称PG)是一类特异性谷氨酰胺脱酰胺水解酶。蛋白质谷氨酰胺酶主要应用于食品工业，大量研究验证该酶能显著改善小麦谷蛋白、米谷蛋白等植物蛋白的溶解度、乳化性和起泡性等功能，蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺作用不需要提前对蛋白质进行预处理且特异性强，只作用于蛋白质的侧链的谷氨酰胺，对天冬酰胺无脱酰胺作用，且不会对蛋白质的结构造成不良变化。但是目前蛋白质谷氨酰胺酶的应用受到制约，其中蛋白分泌表达量低是其中一个重要因素。

与产蛋白质谷氨酰胺酶的野生解朊金黄杆菌相比，枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌，具有极强的蛋白质分泌能力，是蛋白质谷氨酰胺酶表达和分泌的良好系统。目前研究表明枯草芽孢杆菌的启动子与信号肽等表达元件的选择与优化对外源蛋白表达有重要影响。其中，信号肽最主要功能就是引导分泌蛋白或膜蛋白，在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确定位，可提高外源蛋白质的可溶性，避免因包涵体复性带来的产物纯化等困难。然而信号肽对蛋白的表达分泌往往具有特异性，同一种蛋白质在不同信号肽的作用下，表达分泌效率往往相差甚远，缺乏普适应的规律。

因此，获得高效、特异性的信号肽序列，改善蛋白质谷氨酰胺酶蛋白分泌途径，提高蛋白质谷氨酰胺酶表达效率，是很有难度的事情，但具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示，编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.1所示信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.22所示。编码SEQ ID NO.2所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。编码SEQID NO.3所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。编码SEQ ID NO.4所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。编码SEQ ID NO.5所示信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示。编码SEQ ID NO.6所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。编码SEQ IDNO.7所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。编码SEQ ID NO.8所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。

在本发明的一种实施方式中，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以细菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的出发菌株为枯草芽孢杆菌WB600。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，将SEQ ID NO.9所示基因编码的蛋白质谷氨酰胺酶基因N端融合核苷酸序列为SEQID NO.22～29所示的信号肽形成的重组基因进行表达。

本发明的第二个目的是提供一种重组菌，所述重组菌以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～8任一所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒pP43NMK连接所构成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，抽提质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示；编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组基因是采用基因合成和一步克隆法得到的含有改造信号肽和蛋白质谷氨酰胺酶基因序列的重组基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法如下：合成SEQID NO.22～29任一所示的信号肽，分别通过一步克隆的方法将每条信号肽的DNA片段与插入到目的载体的RBS之后，RBS序列如SEQ ID NO.21所示，得到重组质粒，转入E.coli JM109中，经质粒的抽提后导入宿主菌细胞中，得到重组枯草芽孢杆菌。

本发明另外提供了一种生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，是使用上述的重组菌进行发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶。可选地，所述重组菌为重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌于37℃培养36h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积接种4％的种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种于LB培养基中，于37℃，220rpm培养8～12h，获得种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是先进行种子培养，再进行发酵；所述种子培养是将所构建好的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中，现用现转。从平板上挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接种至装液量为25mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养8～12h，所述摇瓶发酵是将培养10h的种子液以4％(V/V)的接种量接入含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，装液量为25mL/250mL，37℃，220r/min培养36h。

本发明还要求保护所述重组菌在食品、生物领域的应用。

本发明还要求保护SEQ ID NO.8所述的信号肽(YdeJ)在提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达效果或在蛋白质谷氨酰胺酶生产方面的应用。

有益效果：

在本发明中通过改造信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本发明通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由0.44U/mL提高到3.26U/mL，酶活提高7.4倍，应用本发明中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。

附图说明

图1为构建重组质粒的流程图；

图2为电泳图；其中GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ为含有SecA启动子且分别含有GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ信号肽的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB 600感受态得到的重组菌株；

图3为重组菌株发酵酶活。

具体实施方式

信号肽GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ的氨基酸序列依次如SEQID NO.1～8所示，编码上述信号肽的基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.22～29所示。

编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因PG的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

LB/种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。发酵培养基(g/L)：酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油10、K₂HPO₄ 16.43、KH₂PO₄ 2.32。

蛋白质谷氨酰胺酶的酶活测定方法：蛋白质谷氨酰胺酶能特异性地水解蛋白质中谷氨酰胺残基上的氨酰基，释放出游离的氨，氨在硝普钠的催化作用下，以次氯酸钠为氧化剂，与苯酚生成蓝绿色的靛酚蓝染料，对波长为630nm的光谱具有特异的吸收作用，通过测定OD₆₃₀即可反映PG酶的相对活力。

酶活定义：100μL酶液每分钟水解二肽Cbz-Gln-Gly释放1μmol氨为1个酶活力单位(U/ml)。方法：取1mL二肽Cbz-Cln-Gly溶液(称取0.337g二肽Cbz-Gln-Gly，溶于0.176mol/LPBS缓冲液(pH6.5)中，并定容至100mL)，滴加100μL待测样品(100μL无活性的酶液作为空白对照)，混匀后置于37℃恒温箱中孵育30min，滴加1mL 0.4mol/L三氯乙酸溶液，混匀并终止反应。取60μL反应液与240μL蒸馏水、300μL显色试剂A(称取2.023g苯酚和7.5mg亚硝基铁氰化钠，溶于双蒸水并定容至50mL)、150μL显色试剂B(称取2.5g KOH溶于双蒸水并定容至50mL)和300μL显色试剂C(称取10.2g无水K₂CO₃溶于双蒸水，滴加417μL NaClO溶液，加水定容至50mL)充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育20min，冷却，测量体系在630nm处的光吸收值。

实施例1：出发菌株重组质粒的构建

将序列如SEQ ID NO.31所示的6×His组氨酸标签加入蛋白质谷氨酰胺酶(GenBank：AB046594.1)的C端，合成全长共981bp的核苷酸序列(由生工完成)，设计两对引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14经过一步PCR分别得到序列为SEQ ID NO.9的目的片段和SEQ ID NO.10的具有粘性末端的pP43NMK载体片段，用一步克隆法37℃连接30min，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化液涂在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，转化子的测序由上海生工完成，测序无误后得到出发菌株的重组质粒。

实施例2：枯草芽孢杆菌感受态的制备

将出发菌株的重组质粒，柱回收后转化待用，转化枯草芽孢杆菌WB600，具体操作如下：

(1)从甘油管中挑取一环枯草芽孢杆菌WB600菌液，在LB平板上划线，37℃恒温过夜培养；

(2)从平板上挑取枯草芽孢杆菌WB600单菌落，接种至含有2mL SPI的14mL摇菌管中，37℃，220r/min培养过夜；

(3)取200μL步骤2过夜培养物接种至含有2mL SPII的14mL摇菌管中，37℃、220r/min培养1.5～2h；

(4)步骤3分装前10min加入20μL EGTA。

(5)将步骤3培养物分装500μL于1.5mL EP管中，即得到枯草芽孢杆菌WB600感受态。

实施例3：含有启动子SecA重组质粒的构建

设计引物，序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，以实施例1构建的重组质粒为模板进行一步PCR得到具有粘性末端的pP43NMK片段，同时设计引物SEQ ID NO.17和SEQID NO.18，从枯草芽孢杆菌基因组上一步PCR得到启动子SecA片段，将上述PCR得到的两个片段进行一步克隆，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化液涂在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，转化子的测序由上海生工完成，测序无误最终将启动子P43更换成启动子SecA。

实施例4：含有不同信号肽重组枯草芽孢杆菌的构建

设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游序列如SEQ ID NO.20所示，以实施例3的重组质粒为模板进行PCR扩增，得到的片段序列如SEQ ID NO.30所示，作为后续一步克隆的载体片段；合成编码SEQ ID NO.1～8所示信号肽的基因并在每条信号肽上游加入如SEQ ID NO.32所示的同源片段gtaagagaggaatgtacac，下游加入如SEQ IDNO.33所示的同源片段GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG，分别命名为GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ(核苷酸序列分别为SEQ ID NO.22～29所示)作为一步克隆的插入片段插入到目的载体RBS之后，RBS序列如SEQ ID NO.21所示，用一步克隆法连接后转化、测序得到信号肽改造后的重组质粒。将5～10μL重组质粒转入到实施例2制备的枯草芽孢杆菌WB600感受态中，37℃、220r/min培养2h后，8000rpm离心2min，弃去400μL上清后混匀，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，37℃恒温过夜培养得到转化子；挑取LB平板上转化子进行菌落PCR，通过核酸电泳得到大小正确的条带(图2)，说明得到重组枯草芽孢杆菌。

实施例5：构建重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养

将实施例4的信号肽GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ用到重组枯草芽孢杆菌中为生产菌株，同时实施例4构建的GlmU重组枯草芽孢杆菌为对照，挑取实施例4中的8种重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种至装液量为25mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养8～12h，然后按照4％的接种量再次转接至装液量为25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养36h后测发酵液上清酶活。

结果如图3所示，重组枯草芽孢杆菌GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB和YdeJ的发酵酶活分别为0.44U/mL、0.48U/mL、0.02U/mL、0.57U/mL、0.91U/mL、0.54U/mL、2.02U/mL和3.26U/mL。其中菌株YdeJ酶活最高，达3.26U/mL，与菌株GlmU(对照)相比，酶活提高7.4倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQ ID NO.1

MDRRDNGGQYMDKRFAVVLAAGQGTRMKSKLYKVLHP

SEQ ID NO.2

MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA

SEQ ID NO.3

MFESEAELRRIRIALVWIAVFLLFGACG

SEQ ID NO.4

MGLGKKLSVAVAASFMSLSISLPGVQA

SEQ ID NO.5

MRIQKRRTHVENILRILLPPIMILSLILPTPPIHA

SEQ ID NO.6

MLLKRRIGLLLSMVGVFMLLAGCS

SEQ ID NO.7

MRNLTKTSLLLAGLCTAAQMVFVTHASA

SEQ ID NO.8

MKKRRKICYCNTALLLMILLAGCT

SEQ ID NO.9

ATGAAAAACCTTTTTCTGAGCATGATGGCGTTTGTTACAGTTCTGACCTTTAATAGCTGCGCTGATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATGGCAAAGAAAAACTTTCCGTTAATGATTCAAAACTGAAAGATTTTGGCAAAACGGTTCCGGTTGGCATTGATGAAGAAAATGGCATGATTAAAGTCTCTTTTATGCTGACAGCACAATTTTATGAGATTAAACCTACAAAAGAAAATGAACAATATATTGGTATGCTTAGACAAGCAGTTAAAAATGAATCACCGGTCCATATTTTTCTTAAACCGAATAGCAATGAAATTGGCAAAGTTGAATCAGCGAGCCCTGAAGATGTTAGATACTTTAAAACAATTCTCACGAAGGAAGTGAAAGGCCAGACGAATAAACTGGCCAGCGTCATTCCGGACGTGGCGACGCTGAATAGCCTTTTTAACCAAATCAAGAATCAAAGTTGTGGAACATCAACAGCATCAAGCCCGTGCATTACATTTAGATATCCGGTTGATGGCTGCTATGCGAGAGCACATAAAATGAGACAGATTCTTATGAATAATGGCTATGATTGCGAAAAACAATTTGTCTATGGCAATCTGAAAGCAAGCACAGGCACATGCTGCGTCGCATGGAGCTATCATGTGGCAATTCTGGTTTCATATAAAAATGCGTCAGGCGTAACAGAAAAACGCATTATTGATCCGTCATTATTTTCATCAGGCCCGGTGACAGATACGGCATGGAGAAATGCGTGCGTGAATACAAGCTGCGGCTCAGCAAGCGTTAGCAGCTATGCAAATACAGCGGGAAATGTTTATTATCGTTCACCGTCAAATAGCTATCTTTATGATAATAATCTGATTAATACAAATTGCGTTCTGACAAAATTTAGCCTTCTGAGCGGCTGTAGCCCGAGCCCGGCACCGGATGTTTCATCATGCGGCTTTcatcatcatcatcatcatTAA

SEQ ID NO.10

catcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattccttaaggaacgtacagacggcttaaaagcctttaaaaacgtttttaaggggtttgtagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatacca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SEQ ID NO.11

ATGAAAAACCTTTTTCTGAGCATGATGGCGTTTG

SEQ ID NO.12

TTAatgatgatgatgatgatgAAAGCCGCATGATG

SEQ ID NO.13

GAAAAAGGTTTTTCATgtgtacattcctctcttacctataatg

SEQ ID NO.14

catcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatc

SEQ ID NO.15

GAGGTATACATGGACTAGgtaagagaggaatg

SEQ ID NO.16

CAAGCTCTCCTCggatccagttgctcaaaaaaatctcg

SEQ ID NO.17

GAGGAGAGCTTGGACATCGTC

SEQ ID NO.18

CTAGTCCATGTATACCTCTCATTATC

SEQ ID NO.19

GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG

SEQ ID NO.20

Gtgtacattcctctcttac

SEQ ID NO.21

Gtaagagaggaatgtacac

SEQ ID NO.22

ATGGATAggAGGGATAATGGAGGCCAATACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTGTGTTAGCAGCTGGTCAAGGAACAAGAATGAAATCAAAGCTATATAAAGTTCTTCATCCT

SEQ ID NO.23

atgaaatttgtaaaaagaaggatcattgcacttgtaacaattttgatgctgtctgttacatcgctgtttgcgttgcagccgtcagcaaaagcc

SEQ ID NO.24

Atgtttgaaagtgaagcagaactgagacgaatcaggattgcacttgtatggatagctgtctttttactgttcggggcgtgcggg

SEQ ID NO.25

Atgggtttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggct

SEQ ID NO.26

Atgagaatacagaaaagacgaacacacgtcgaaaacattctccgtattcttttgcccccaattatgatacttagcctaatcctcccaacaccacccattcatgca

SEQ ID NO.27

atgttgttgaaaaggagaatagggttgctattaagtatggttggcgtattcatgcttttggctggatgctcg

SEQ ID NO.28

Atgcgcaacttgaccaagacatctctattactggccggcttatgcacagcggcccaaatggtttttgtaacacatgcctcagct

SEQ ID NO.29

Atgaagaaacgcagaaagatatgttattgcaatactgccctgctgcttatgattttgcttgctggatgtacg

SEQ ID NO.30

GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATGGCAAAGAAAAACTTTCCGTTAATGATTCAAAACTGAAAGATTTTGGCAAAACGGTTCCGGTTGGCATTGATGAAGAAAATGGCATGATTAAAGTCTCTTTTATGCTGACAGCACAATTTTATGAGATTAAACCTACAAAAGAAAATGAACAATATATTGGTATGCTTAGACAAGCAGTTAAAAATGAATCACCGGTCCATATTTTTCTTAAACCGAATAGCAATGAAATTGGCAAAGTTGAATCAGCGAGCCCTGAAGATGTTAGATACTTTAAAACAATTCTCACGAAGGAAGTGAAAGGCCAGACGAATAAACTGGCCAGCGTCATTCCGGACGTGGCGACGCTGAATAGCCTTTTTAACCAAATCAAGAATCAAAGTTGTGGAACATCAACAGCATCAAGCCCGTGCATTACATTTAGATATCCGGTTGATGGCTGCTATGCGAGAGCACATAAAATGAGACAGATTCTTATGAATAATGGCTATGATTGCGAAAAACAATTTGTCTATGGCAATCTGAAAGCAAGCACAGGCACATGCTGCGTCGCATGGAGCTATCATGTGGCAATTCTGGTTTCATATAAAAATGCGTCAGGCGTAACAGAAAAACGCATTATTGATCCGTCATTATTTTCATCAGGCCCGGTGACAGATACGGCATGGAGAAATGCGTGCGTGAATACAAGCTGCGGCTCAGCAAGCGTTAGCAGCTATGCAAATACAGCGGGAAATGTTTATTATCGTTCACCGTCAAATAGCTATCTTTATGATAATAATCTGATTAATACAAATTGCGTTCTGACAAAATTTAGCCTTCTGAGCGGCTGTAGCCCGAGCCCGGCACCGGATGTTTCATCATGCGGCTTTcatcatcatcatcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattccttaaggaacgtacagacggcttaaaagcctttaaaaacgtttttaaggggtttgtagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgggataaagtaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgcctcgtagtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgcgcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagctggactaaaaggcatgcaatttcataatcaaagagagcgaaaaagtagaacgaatgatgatattgaccatgagcgaacacgtgaaaattatgatttgaaaaatgataaaaatattgattacaacgaacgtgtcaaagaaattattgaatcacaaaaaacaggtacaagaaaaacgaggaaagatgctgttcttgtaaatgagttgctagtaacatctgaccgagatttttttgagcaactggatccGAGGAGAGCTTGGACATCGTCCGTCAGAAACGCTTTAATTTAAAGCCGATGGATAGTGAAGAAGCGATCTTGCAAATGAATATGCTCGGCCATAATTTCTTTGTTTTCACAAATGCGGAAACAAACCTTACAAATGTCGTGTACCGCAGAAATGACGGGAAATATGGCTTAATTGAACCGACTGAATAATGAAGAGAAGCCTTCCGTGATGTCCGCGGAAGGTTTTTGTTTTTCTTATTTGCAAATTCTTTGGAAATAACAAAAGGTATGATATGATAATGAGAGGTATACATGGACTAGgtaagagaggaatgtacac

SEQ ID NO.31

catcatcatcatcatcat

SEQ ID NO.32

Gtaagagaggaatgtacac

SEQ ID NO.33

GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Asp Arg Arg Asp Asn Gly Gly Gln Tyr Met Asp Lys Arg Phe Ala

1 5 10 15

Val Val Leu Ala Ala Gly Gln Gly Thr Arg Met Lys Ser Lys Leu Tyr

20 25 30

Lys Val Leu His Pro

35

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Ile Ala Leu Val Thr Ile Leu Met

1 5 10 15

Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala

20 25 30

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Phe Glu Ser Glu Ala Glu Leu Arg Arg Ile Arg Ile Ala Leu Val

1 5 10 15

Trp Ile Ala Val Phe Leu Leu Phe Gly Ala Cys Gly

20 25

<210> 4

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala

20 25

<210> 5

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Met Arg Ile Gln Lys Arg Arg Thr His Val Glu Asn Ile Leu Arg Ile

1 5 10 15

Leu Leu Pro Pro Ile Met Ile Leu Ser Leu Ile Leu Pro Thr Pro Pro

20 25 30

Ile His Ala

35

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Met Leu Leu Lys Arg Arg Ile Gly Leu Leu Leu Ser Met Val Gly Val

1 5 10 15

Phe Met Leu Leu Ala Gly Cys Ser

20

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Met Arg Asn Leu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Thr

1 5 10 15

Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala

20 25

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Met Lys Lys Arg Arg Lys Ile Cys Tyr Cys Asn Thr Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Met Ile Leu Leu Ala Gly Cys Thr

20

<210> 9

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgaaaaacc tttttctgag catgatggcg tttgttacag ttctgacctt taatagctgc 60

gctgattcaa atggcaatca agaaattaat ggcaaagaaa aactttccgt taatgattca 120

aaactgaaag attttggcaa aacggttccg gttggcattg atgaagaaaa tggcatgatt 180

aaagtctctt ttatgctgac agcacaattt tatgagatta aacctacaaa agaaaatgaa 240

caatatattg gtatgcttag acaagcagtt aaaaatgaat caccggtcca tatttttctt 300

aaaccgaata gcaatgaaat tggcaaagtt gaatcagcga gccctgaaga tgttagatac 360

tttaaaacaa ttctcacgaa ggaagtgaaa ggccagacga ataaactggc cagcgtcatt 420

ccggacgtgg cgacgctgaa tagccttttt aaccaaatca agaatcaaag ttgtggaaca 480

tcaacagcat caagcccgtg cattacattt agatatccgg ttgatggctg ctatgcgaga 540

gcacataaaa tgagacagat tcttatgaat aatggctatg attgcgaaaa acaatttgtc 600

tatggcaatc tgaaagcaag cacaggcaca tgctgcgtcg catggagcta tcatgtggca 660

attctggttt catataaaaa tgcgtcaggc gtaacagaaa aacgcattat tgatccgtca 720

ttattttcat caggcccggt gacagatacg gcatggagaa atgcgtgcgt gaatacaagc 780

tgcggctcag caagcgttag cagctatgca aatacagcgg gaaatgttta ttatcgttca 840

ccgtcaaata gctatcttta tgataataat ctgattaata caaattgcgt tctgacaaaa 900

tttagccttc tgagcggctg tagcccgagc ccggcaccgg atgtttcatc atgcggcttt 960

catcatcatc atcatcatta a 981

<210> 10

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

catcatcatt aatgatgaaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 60

ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 120

gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 180

gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 240

tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 300

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 360

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 420

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 480

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 540

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 600

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 660

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 720

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 780

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 840

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 900

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 960

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 1020

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 1080

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 1140

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 1200

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 1260

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 1320

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 1380

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 1440

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 1500

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 1560

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 1620

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 1680

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 1740

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 1800

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 1860

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 1920

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 1980

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 2040

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 2100

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 2160

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 2220

aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 2280

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 2340

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 2400

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 2460

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 2520

ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 2580

atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 2640

aacgacggcc agtgaattcc ttaaggaacg tacagacggc ttaaaagcct ttaaaaacgt 2700

ttttaagggg tttgtagaca aggtaaagga taaaacagca caattccaag aaaaacacga 2760

tttagaacct aaaaagaacg aatttgaact aactcataac cgagaggtaa aaaaagaacg 2820

aagtcgagat cagggaatga gtttataaaa taaaaaaagc acctgaaaag gtgtcttttt 2880

ttgatggttt tgaacttgtt ctttcttatc ttgatacata tagaaataac gtcattttta 2940

ttttagttgc tgaaaggtgc gttgaagtgt tggtatgtat gtgttttaaa gtattgaaaa 3000

cccttaaaat tggttgcaca gaaaaacccc atctgttaaa gttataagtg actaaacaaa 3060

taactaaata gatgggggtt tcttttaata ttatgtgtcc taatagtagc atttattcag 3120

atgaaaaatc aagggtttta gtggacaaga caaaaagtgg aaaagtgaga ccatggagag 3180

aaaagaaaat cgctaatgtt gattactttg aacttctgca tattcttgaa tttaaaaagg 3240

ctgaaagagt aaaagattgt gctgaaatat tagagtataa acaaaatcgt gaaacaggcg 3300

aaagaaagtt gtatcgagtg tggttttgta aatccaggct ttgtccaatg tgcaactgga 3360

ggagagcaat gaaacatggc attcagtcac aaaaggttgt tgctgaagtt attaaacaaa 3420

agccaacagt tcgttggttg tttctcacat taacagttaa aaatgtttat gatggcgaag 3480

aattaaataa gagtttgtca gatatggctc aaggatttcg ccgaatgatg caatataaaa 3540

aaattaataa aaatcttgtt ggttttatgc gtgcaacgga agtgacaata aataataaag 3600

ataattctta taatcagcac atgcatgtat tggtatgtgt ggaaccaact tattttaaga 3660

atacagaaaa ctacgtgaat caaaaacaat ggattcaatt ttggaaaaag gcaatgaaat 3720

tagactatga tccaaatgta aaagttcaaa tgattcgacc gaaaaataaa tataaatcgg 3780

atatacaatc ggcaattgac gaaactgcaa aatatcctgt aaaggatacg gattttatga 3840

ccgatgatga agaaaagaat ttgaaacgtt tgtctgattt ggaggaaggt ttacaccgta 3900

aaaggttaat ctcctatggt ggtttgttaa aagaaataca taaaaaatta aaccttgatg 3960

acacagaaga aggcgatttg attcatacag atgatgacga aaaagccgat gaagatggat 4020

tttctattat tgcaatgtgg aattgggaac ggaaaaatta ttttattaaa gagtagttca 4080

acaaacgggc cagtttgttg aagattagat gctataattg ttattaaaag gattgaagga 4140

tgcttaggaa gacgagttat taatagctga ataagaacgg tgctctccaa atattcttat 4200

ttagaaaagc aaatctaaaa ttatctgaaa agggaatgag aatagtgaat ggaccaataa 4260

taatgactag agaagaaaga atgaagattg ttcatgaaat taaggaacga atattggata 4320

aatatgggga tgatgttaag gctattggtg tttatggctc tcttggtcgt cagactgatg 4380

ggccctattc ggatattgag atgatgtgtg tcatgtcaac agaggaagca gagttcagcc 4440

atgaatggac aaccggtgag tggaaggtgg aagtgaattt tgatagcgaa gagattctac 4500

tagattatgc atctcaggtg gaatcagatt ggccgcttac acatggtcaa tttttctcta 4560

ttttgccgat ttatgattca ggtggatact tagagaaagt gtatcaaact gctaaatcgg 4620

tagaagccca aacgttccac gatgcgattt gtgcccttat cgtagaagag ctgtttgaat 4680

atgcaggcaa atggcgtaat attcgtgtgc aaggaccgac aacatttcta ccatccttga 4740

ctgtacaggt agcaatggca ggtgccatgt tgattggtct gcatcatcgc atctgttata 4800

cgacgagcgc ttcggtctta actgaagcag ttaagcaatc agatcttcct tcaggttatg 4860

accatctgtg ccagttcgta atgtctggtc aactttccga ctctgagaaa cttctggaat 4920

cgctagagaa tttctggaat gggattcagg agtggacaga acgacacgga tatatagtgg 4980

atgtgtcaaa acgcatacca ttttgaacga tgacctctaa taattgttaa tcatgttggt 5040

tacgtattta ttaacttctc ctagtattag taattatcat ggctgtcatg gcgcattaac 5100

ggaataaagg gtgtgcttaa atcgggccat tttgcgtaat aagaaaaagg attaattatg 5160

agcgaattga attaataata aggtaataga tttacattag aaaatgaaag gggattttat 5220

gcgtgagaat gttacagtct atcccggcat tgccagtcgg ggatattaaa aagagtatag 5280

gtttttattg ggataaagta ggtttcactt tggttcacca tgaagatgga ttcgcagttc 5340

taatgtgtaa tgaggttcgg attcatctat gggaggcaag tgatgaaggc tggcgcctcg 5400

tagtaatgat tcaccggttt gtacaggtgc ggagtcgttt attgctggta ctgctagttg 5460

ccgcattgaa gtagagggaa ttgatgaatt atatcaacat attaagcctt tgggcatttt 5520

gcaccccaat acatcattaa aagatcagtg gtgggatgaa cgagactttg cagtaattga 5580

tcccgacaac aatttgatta gcttttttca acaaataaaa agctaaaatc tattattaat 5640

ctgttcagca atcgggcgcg attgctgaat aaaagatacg agagacctct cttgtatctt 5700

ttttattttg agtggttttg tccgttacac tagaaaaccg aaagacaata aaaattttat 5760

tcttgctgag tctggctttc ggtaagctag acaaaacgga caaaataaaa attggcaagg 5820

gtttaaaggt ggagattttt tgagtgatct tctcaaaaaa tactacctgt cccttgctga 5880

tttttaaacg agcacgagag caaaaccccc ctttgctgag gtggcagagg gcaggttttt 5940

ttgtttcttt tttctcgtaa aaaaaagaaa ggtcttaaag gttttatggt tttggtcggc 6000

actgccgcgc ctcgcagagc acacacttta tgaatataaa gtatagtgtg ttatacttta 6060

cttggaagtg gttgccggaa agagcgaaaa tgcctcacat ttgtgccacc taaaaaggag 6120

cgatttacat atgagttatg cagtttgtag aatgcaaaaa gtgaaatcag ctggactaaa 6180

aggcatgcaa tttcataatc aaagagagcg aaaaagtaga acgaatgatg atattgacca 6240

tgagcgaaca cgtgaaaatt atgatttgaa aaatgataaa aatattgatt acaacgaacg 6300

tgtcaaagaa attattgaat cacaaaaaac aggtacaaga aaaacgagga aagatgctgt 6360

tcttgtaaat gagttgctag taacatctga ccgagatttt tttgagcaac tggatcctga 6420

taggtggtat gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa 6480

taactgacaa acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt 6540

gcgtttttgc cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat 6600

ggctgaaaat tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg 6660

attatgtaaa atataaagtg atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacacatg 6720

aaaaaccttt ttc 6733

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgaaaaacc tttttctgag catgatggcg tttg 34

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ttaatgatga tgatgatgat gaaagccgca tgatg 35

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gaaaaaggtt tttcatgtgt acattcctct cttacctata atg 43

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

catcatcatt aatgatgaaa gcttggcgta atc 33

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gaggtataca tggactaggt aagagaggaa tg 32

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

caagctctcc tcggatccag ttgctcaaaa aaatctcg 38

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gaggagagct tggacatcgt c 21

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ctagtccatg tatacctctc attatc 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gattcaaatg gcaatcaaga aattaatg 28

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gtgtacattc ctctcttac 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gtaagagagg aatgtacac 19

<210> 22

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

atggatagga gggataatgg aggccaatac atggataagc ggtttgcagt tgtgttagca 60

gctggtcaag gaacaagaat gaaatcaaag ctatataaag ttcttcatcc t 111

<210> 23

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

atgaaatttg taaaaagaag gatcattgca cttgtaacaa ttttgatgct gtctgttaca 60

tcgctgtttg cgttgcagcc gtcagcaaaa gcc 93

<210> 24

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

atgtttgaaa gtgaagcaga actgagacga atcaggattg cacttgtatg gatagctgtc 60

tttttactgt tcggggcgtg cggg 84

<210> 25

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60

agcctgccag gtgttcaggc t 81

<210> 26

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

atgagaatac agaaaagacg aacacacgtc gaaaacattc tccgtattct tttgccccca 60

attatgatac ttagcctaat cctcccaaca ccacccattc atgca 105

<210> 27

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

atgttgttga aaaggagaat agggttgcta ttaagtatgg ttggcgtatt catgcttttg 60

gctggatgct cg 72

<210> 28

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

atgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agct 84

<210> 29

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

atgaagaaac gcagaaagat atgttattgc aatactgccc tgctgcttat gattttgctt 60

gctggatgta cg 72

<210> 30

<211> 7642

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gattcaaatg gcaatcaaga aattaatggc aaagaaaaac tttccgttaa tgattcaaaa 60

ctgaaagatt ttggcaaaac ggttccggtt ggcattgatg aagaaaatgg catgattaaa 120

gtctctttta tgctgacagc acaattttat gagattaaac ctacaaaaga aaatgaacaa 180

tatattggta tgcttagaca agcagttaaa aatgaatcac cggtccatat ttttcttaaa 240

ccgaatagca atgaaattgg caaagttgaa tcagcgagcc ctgaagatgt tagatacttt 300

aaaacaattc tcacgaagga agtgaaaggc cagacgaata aactggccag cgtcattccg 360

gacgtggcga cgctgaatag cctttttaac caaatcaaga atcaaagttg tggaacatca 420

acagcatcaa gcccgtgcat tacatttaga tatccggttg atggctgcta tgcgagagca 480

cataaaatga gacagattct tatgaataat ggctatgatt gcgaaaaaca atttgtctat 540

ggcaatctga aagcaagcac aggcacatgc tgcgtcgcat ggagctatca tgtggcaatt 600

ctggtttcat ataaaaatgc gtcaggcgta acagaaaaac gcattattga tccgtcatta 660

ttttcatcag gcccggtgac agatacggca tggagaaatg cgtgcgtgaa tacaagctgc 720

ggctcagcaa gcgttagcag ctatgcaaat acagcgggaa atgtttatta tcgttcaccg 780

tcaaatagct atctttatga taataatctg attaatacaa attgcgttct gacaaaattt 840

agccttctga gcggctgtag cccgagcccg gcaccggatg tttcatcatg cggctttcat 900

catcatcatc atcattaatg atgaaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 960

gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 1020

agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 1080

tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 1140

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 1200

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 1260

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 1320

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1380

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1440

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1500

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1560

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1620

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1680

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 1740

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 1800

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 1860

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 1920

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 1980

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 2040

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 2100

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 2160

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 2220

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 2280

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 2340

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2400

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2460

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2520

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2580

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2640

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2700

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2760

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2820

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2880

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2940

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 3000

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 3060

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 3120

gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 3180

tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 3240

ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 3300

ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 3360

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 3420

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 3480

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 3540

ttgtaaaacg acggccagtg aattccttaa ggaacgtaca gacggcttaa aagcctttaa 3600

aaacgttttt aaggggtttg tagacaaggt aaaggataaa acagcacaat tccaagaaaa 3660

acacgattta gaacctaaaa agaacgaatt tgaactaact cataaccgag aggtaaaaaa 3720

agaacgaagt cgagatcagg gaatgagttt ataaaataaa aaaagcacct gaaaaggtgt 3780

ctttttttga tggttttgaa cttgttcttt cttatcttga tacatataga aataacgtca 3840

tttttatttt agttgctgaa aggtgcgttg aagtgttggt atgtatgtgt tttaaagtat 3900

tgaaaaccct taaaattggt tgcacagaaa aaccccatct gttaaagtta taagtgacta 3960

aacaaataac taaatagatg ggggtttctt ttaatattat gtgtcctaat agtagcattt 4020

attcagatga aaaatcaagg gttttagtgg acaagacaaa aagtggaaaa gtgagaccat 4080

ggagagaaaa gaaaatcgct aatgttgatt actttgaact tctgcatatt cttgaattta 4140

aaaaggctga aagagtaaaa gattgtgctg aaatattaga gtataaacaa aatcgtgaaa 4200

caggcgaaag aaagttgtat cgagtgtggt tttgtaaatc caggctttgt ccaatgtgca 4260

actggaggag agcaatgaaa catggcattc agtcacaaaa ggttgttgct gaagttatta 4320

aacaaaagcc aacagttcgt tggttgtttc tcacattaac agttaaaaat gtttatgatg 4380

gcgaagaatt aaataagagt ttgtcagata tggctcaagg atttcgccga atgatgcaat 4440

ataaaaaaat taataaaaat cttgttggtt ttatgcgtgc aacggaagtg acaataaata 4500

ataaagataa ttcttataat cagcacatgc atgtattggt atgtgtggaa ccaacttatt 4560

ttaagaatac agaaaactac gtgaatcaaa aacaatggat tcaattttgg aaaaaggcaa 4620

tgaaattaga ctatgatcca aatgtaaaag ttcaaatgat tcgaccgaaa aataaatata 4680

aatcggatat acaatcggca attgacgaaa ctgcaaaata tcctgtaaag gatacggatt 4740

ttatgaccga tgatgaagaa aagaatttga aacgtttgtc tgatttggag gaaggtttac 4800

accgtaaaag gttaatctcc tatggtggtt tgttaaaaga aatacataaa aaattaaacc 4860

ttgatgacac agaagaaggc gatttgattc atacagatga tgacgaaaaa gccgatgaag 4920

atggattttc tattattgca atgtggaatt gggaacggaa aaattatttt attaaagagt 4980

agttcaacaa acgggccagt ttgttgaaga ttagatgcta taattgttat taaaaggatt 5040

gaaggatgct taggaagacg agttattaat agctgaataa gaacggtgct ctccaaatat 5100

tcttatttag aaaagcaaat ctaaaattat ctgaaaaggg aatgagaata gtgaatggac 5160

caataataat gactagagaa gaaagaatga agattgttca tgaaattaag gaacgaatat 5220

tggataaata tggggatgat gttaaggcta ttggtgttta tggctctctt ggtcgtcaga 5280

ctgatgggcc ctattcggat attgagatga tgtgtgtcat gtcaacagag gaagcagagt 5340

tcagccatga atggacaacc ggtgagtgga aggtggaagt gaattttgat agcgaagaga 5400

ttctactaga ttatgcatct caggtggaat cagattggcc gcttacacat ggtcaatttt 5460

tctctatttt gccgatttat gattcaggtg gatacttaga gaaagtgtat caaactgcta 5520

aatcggtaga agcccaaacg ttccacgatg cgatttgtgc ccttatcgta gaagagctgt 5580

ttgaatatgc aggcaaatgg cgtaatattc gtgtgcaagg accgacaaca tttctaccat 5640

ccttgactgt acaggtagca atggcaggtg ccatgttgat tggtctgcat catcgcatct 5700

gttatacgac gagcgcttcg gtcttaactg aagcagttaa gcaatcagat cttccttcag 5760

gttatgacca tctgtgccag ttcgtaatgt ctggtcaact ttccgactct gagaaacttc 5820

tggaatcgct agagaatttc tggaatggga ttcaggagtg gacagaacga cacggatata 5880

tagtggatgt gtcaaaacgc ataccatttt gaacgatgac ctctaataat tgttaatcat 5940

gttggttacg tatttattaa cttctcctag tattagtaat tatcatggct gtcatggcgc 6000

attaacggaa taaagggtgt gcttaaatcg ggccattttg cgtaataaga aaaaggatta 6060

attatgagcg aattgaatta ataataaggt aatagattta cattagaaaa tgaaagggga 6120

ttttatgcgt gagaatgtta cagtctatcc cggcattgcc agtcggggat attaaaaaga 6180

gtataggttt ttattgggat aaagtaggtt tcactttggt tcaccatgaa gatggattcg 6240

cagttctaat gtgtaatgag gttcggattc atctatggga ggcaagtgat gaaggctggc 6300

gcctcgtagt aatgattcac cggtttgtac aggtgcggag tcgtttattg ctggtactgc 6360

tagttgccgc attgaagtag agggaattga tgaattatat caacatatta agcctttggg 6420

cattttgcac cccaatacat cattaaaaga tcagtggtgg gatgaacgag actttgcagt 6480

aattgatccc gacaacaatt tgattagctt ttttcaacaa ataaaaagct aaaatctatt 6540

attaatctgt tcagcaatcg ggcgcgattg ctgaataaaa gatacgagag acctctcttg 6600

tatctttttt attttgagtg gttttgtccg ttacactaga aaaccgaaag acaataaaaa 6660

ttttattctt gctgagtctg gctttcggta agctagacaa aacggacaaa ataaaaattg 6720

gcaagggttt aaaggtggag attttttgag tgatcttctc aaaaaatact acctgtccct 6780

tgctgatttt taaacgagca cgagagcaaa accccccttt gctgaggtgg cagagggcag 6840

gtttttttgt ttcttttttc tcgtaaaaaa aagaaaggtc ttaaaggttt tatggttttg 6900

gtcggcactg ccgcgcctcg cagagcacac actttatgaa tataaagtat agtgtgttat 6960

actttacttg gaagtggttg ccggaaagag cgaaaatgcc tcacatttgt gccacctaaa 7020

aaggagcgat ttacatatga gttatgcagt ttgtagaatg caaaaagtga aatcagctgg 7080

actaaaaggc atgcaatttc ataatcaaag agagcgaaaa agtagaacga atgatgatat 7140

tgaccatgag cgaacacgtg aaaattatga tttgaaaaat gataaaaata ttgattacaa 7200

cgaacgtgtc aaagaaatta ttgaatcaca aaaaacaggt acaagaaaaa cgaggaaaga 7260

tgctgttctt gtaaatgagt tgctagtaac atctgaccga gatttttttg agcaactgga 7320

tccgaggaga gcttggacat cgtccgtcag aaacgcttta atttaaagcc gatggatagt 7380

gaagaagcga tcttgcaaat gaatatgctc ggccataatt tctttgtttt cacaaatgcg 7440

gaaacaaacc ttacaaatgt cgtgtaccgc agaaatgacg ggaaatatgg cttaattgaa 7500

ccgactgaat aatgaagaga agccttccgt gatgtccgcg gaaggttttt gtttttctta 7560

tttgcaaatt ctttggaaat aacaaaaggt atgatatgat aatgagaggt atacatggac 7620

taggtaagag aggaatgtac ac 7642

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

catcatcatc atcatcat 18

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gtaagagagg aatgtacac 19

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

gattcaaatg gcaatcaaga aattaatg 28

Claims (10)

1.一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌是以细菌为宿主。

5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌；所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～8任一所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒pP43NMK连接所构成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，抽提质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中。

7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，将SEQ ID NO.9所示基因编码的蛋白质谷氨酰胺酶基因N端融合核苷酸序列为SEQ ID NO.22～29所示的信号肽形成的重组基因进行表达。

8.一种生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，是使用权利要求5-7任一所述的重组菌进行发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶。

9.权利要求5-7任一所述的重组菌在食品、生物领域的应用。

10.SEQ ID NO.8所述的信号肽在提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达效果或在蛋白质谷氨酰胺酶生产方面的应用。

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