CN107385043A - 包含有环状dna的水土环境污染物示踪剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，包括如下步骤：(1)制备DNA环状分子；(2)将生物降解性高分子化合物溶解于有机溶剂中，得到油相；(3)将环状DNA水溶液，黏土水悬浊液与Fe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；(4)将混合液滴入油相中，加入水溶性高分子化合物水溶液，混合均匀，得到初级乳液；(5)将初级乳液滴入到水溶性高分子化合物水溶液中，室温下，有机溶剂挥发，离心，除去上层清液，分离出微球，洗涤，冷冻干燥，即得。本发明的方法工艺简单、反应可控性强、低耗能、易规模化，所用原料易得、价格便宜；可用于环境污染物的示踪，示踪剂可识别性强，检测灵敏度高，制作费用低。

Description

包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂及制备方法

技术领域

本发明属于环境保护领域，具体涉及一种包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂及制备方法。

背景技术

目前，水土环境污染严重，通过示踪技术可以寻找污染源，从而进行污染控制。氯化物、溴化物、染料、同位素等水土环境示踪剂主要采用化学合成的方法进行制备，这些示踪剂的制作费用普遍较高，并且可能造成环境污染。随着生物工程技术和纳米材料技术的进步，脱氧核糖核酸(DNA)被越来越多地作为一种功能性材料进行推广应用，其在分子传感器、分子计算机、医学检测、药物输送等领域已经有了广泛的应用，并取得了很好的效果。目前尚未包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂及制备方法的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

本发明的第二个目的是提供一种包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过碱裂解法制备DNA环状分子；

(2)按比例，将100-500mg的生物降解性高分子化合物溶解于1-10ml有机溶剂中，得到油相；

(3)将20-200μl的浓度为0.1-1.0μM的环状DNA水溶液，50-300μl的质量浓度为0.5-3％的黏土水悬浊液与5-60mgFe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；

(4)在涡旋的条件下，将步骤(3)获得的混合液滴入油相中，再加入1-10ml的质量浓度为0.5-1.5％水溶性高分子化合物水溶液，混合均匀，得到初级乳液；

(5)将初级乳液滴入到50-150ml的质量浓度为0.1-0.5％水溶性高分子化合物水溶液中，室温下，在转速400-2000转/分钟，搅拌至有机溶剂完全挥发，再在2000-6000转/分钟，离心10-20分钟，除去上层清液，分离出微球，用去离子水洗涤2-5次，冷冻干燥，得到包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

步骤(1)所述的生物降解性高分子化合物为数均分子量8000-250000的聚乳酸，数均分子量20000-100000的聚已内酯或数均分子量10000-150000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)。

优选地，有机溶剂为二氯甲烷，丙酮或氯仿。

优选地，环状DNA为细菌的质粒、真菌的质粒或放线菌的质粒。

优选地，水溶性高分子化合物为数均分子量25000-220000的聚乙烯醇，数均分子量10000-230000的聚乙烯吡咯烷酮或数均分子量2000-300000的聚环氧乙烷。

上述方法制备的包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

本发明的优点：

本发明的包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，其制备工艺简单、反应可控性强、低耗能、易规模化，所用原料易得、价格便宜；可用于环境污染物的示踪，包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂可识别性强，检测灵敏度高，制作费用低。

附图说明

图1为包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂照片。

图2-1为实施例2制备的示踪剂对水样测试标准曲线。

图2-2为实施例2制备的示踪剂水样测试的循环次数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

碱裂解法制备大量DNA环状分子的方法：

(1)提取细菌(或真菌或放线菌)质粒作为环状DNA分子模板，将提取的1μl 50ng/μl的环状DNA分子水溶液与100μl的可吸收外源环状DNA的细菌细胞液，混合静置40min，42℃水浴锅中放置90s后立即置于冰上4min，在无菌条件下加入600μl细菌液体培养基，37℃、200rpm振荡培养90min，之后均匀涂布在细菌固体培养基上，待完全吸收后将固体培养基倒置，置于37℃恒温培养箱中培养12h。

(2)用无菌针挑取细菌固体培养基上的单个菌落，转移至10ml细菌液体培养基中，37℃、200rpm培养活化12h，再吸取培养后的菌液转移至100ml细菌液体培养基中37℃、200rpm培养12h；

(3)将步骤(2)中培养后的菌液10000rpm离心5min，除去上清，获得细菌(或真菌或放线菌)沉淀，向沉淀中加入15ml溶液A，涡旋震荡重新悬浮沉淀；再加入15ml溶液B并混匀；再加入20ml溶液C并混匀。

溶液A：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 8.0)，10mmol/L乙

二胺四乙酸(pH 8.0)，余量是水。

溶液B：0.2mol/L氢氧化钠，1％(w/v)十二烷基硫酸钠，余量是水。

溶液C：3mol/L醋酸钾，2mol/L醋酸，余量是水。

(4)将步骤(3)获得的溶液10000rpm离心15min，弃沉淀，取上清置于离心管中，加入与上清等体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液(体积比25：24：1)混匀，10000rpm离心10min，取上清；再加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，10000rpm离心10min，弃上清；加入10ml体积浓度70％的乙醇水溶液，重悬沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥20min后所得到的环状DNA溶解于TE缓冲液中，-80℃保存备用。

TE缓冲液：1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，0.5mol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0，余量是水。

采用上述方法，以大肠杆菌(Escherichia coli)http://www.vigorousbiol.com/制备的环状DNA pKD46，长度为6329bp，其核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示。

采用上述方法，以酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)http://www.vigorousbiol.com/制备的环状DNA pRS406，长度为4384bp，其核苷酸序列用SEQ IDNO.2所示。

采用上述方法，以放线菌(Streptomyces albus)http://www.vigorousbiol.com/制备的环状DNA PSET152，长度为5715bp其核苷酸序列用SEQ ID NO.3让所示。

上述制备大量DNA环状分子的方法的介绍仅是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限定。

实施例2

包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备DNA环状分子(大肠杆菌环状DNA pKD46)的方法见实施例1

(2)将300mg的数均分子量100000的聚乳酸溶解于6ml二氯甲烷中，得到油相；

(3)将80μl的浓度为1μM的SEQ ID NO.1所示环状DNA水溶液，150μl的质量浓度为2％的黏土水悬浊液与25mgFe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；

(4)在涡旋的条件下，将步骤(3)获得的混合液滴入油相中，再加入6ml的质量浓度为1％数均分子量100000的聚乙烯醇水溶液，混合均匀，得到初级乳液；

(5)将初级乳液滴入到150ml的质量浓度为0.3％数均分子量为100000聚乙烯醇水溶液中，室温下，在转速800转/分钟，搅拌至二氯甲烷完全挥发，再在4000转/分钟，离心15分钟，除去上层清液，分离出微球，用去离子水洗涤4次，冷冻干燥，得到包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂；见图1。

实验证明，用数均分子量8000的聚乳酸或数均分子量250000的聚乳酸替代本实施例的数均分子量100000的聚乳酸，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验证明，用数均分子量25000聚乙烯醇或数均分子量220000的聚乙烯醇替代本实施例的数均分子量100000的聚乙烯醇，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实施例3

包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备DNA环状分子(酵母菌环状DNA pRS406)的方法见实施例1

(2)将100mg的数均分子量50000的聚已内酯溶解于1ml丙酮中，得到油相；

(3)将20μl的浓度为1.0μM的SEQ ID NO.2所示环状DNA水溶液，50μl的质量浓度为3％的黏土水悬浊液与5mgFe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；

(4)在涡旋的条件下，将步骤(3)获得的混合液滴入油相中，再加入1ml的质量浓度为1.5％数均分子量50000的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，混合均匀，得到初级乳液；

(5)将初级乳液滴入到50ml的质量浓度为0.5％数均分子量为50000聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，室温下，在转速400转/分钟，搅拌至丙酮完全挥发，再在2000转/分钟，离心20分钟，除去上层清液，分离出微球，用去离子水洗涤2次，冷冻干燥，得到包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验证明，用数均分子量20000的聚已内酯或数均分子量100000的聚已内酯替代本实施例的数均分子量50000的聚已内酯，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验证明，用数均分子量10000聚乙烯吡咯烷酮或数均分子量230000的聚乙烯吡咯烷酮替代本实施例的数均分子量50000的聚乙烯吡咯烷酮，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实施例4

包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备DNA环状分子(放线菌环状DNA PSET152)的方法见实施例1

(2)将500mg的数均分子量100000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)溶解于10ml氯仿中，得到油相；

(3)将200μl的浓度为0.1μM的SEQ ID NO.3所示环状DNA水溶液，300μl的质量浓度为0.5％的黏土水悬浊液与60mgFe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；

(4)在涡旋的条件下，将步骤(3)获得的混合液滴入油相中，再加入10ml的质量浓度为0.5％数均分子量50000的聚环氧乙烷水溶液，混合均匀，得到初级乳液；

(5)将初级乳液滴入到150ml的质量浓度为0.1％数均分子量50000的聚环氧乙烷水溶液中，室温下，在转速2000转/分钟，搅拌至氯仿完全挥发，再在6000转/分钟，离心10分钟，除去上层清液，分离出微球，用去离子水洗涤5次，冷冻干燥，得到包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验证明，用数均分子量10000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)或数均分子量150000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)替代本实施例的数均分子量100000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验证明，用数均分子量2000的聚环氧乙烷或数均分子量300000的聚环氧乙烷替代本实施例的数均分子量50000的聚环氧乙烷，其它同本实施例，制备包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

实验应用的环状DNA可以选用任意环状DNA序列。

实施例5

检测方法：

在被检测水流的上游加入实施例2制备的包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂，在下游取水样，采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)对水样进行检测，检测条件为：第一步在95℃变性3分钟，第二步在95℃变性15秒，在55℃退火35秒，第三步在520-540nm荧光条件下进行检测。测试结果如图2-1图2-2所示。

实验证明，实施例3和4制备的包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂都可以在被检测水流的上游排污工厂中加入，在下游取水样，经过检测，可以确认该水源中的污染物到底是来自于哪个排污工厂。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂及制备方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6329

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60

ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120

cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180

gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240

ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300

tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360

tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420

caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480

tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540

tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600

aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660

ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720

ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780

cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840

cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900

tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960

tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt 1020

aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca 1080

gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat 1140

ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1200

acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga 1260

aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc 1320

atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat 1380

tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga 1440

gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc 1500

gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt 1560

tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac 1620

cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc 1680

gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa 1740

ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc 1800

gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc 1860

tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc 1920

atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca 1980

tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa 2040

tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg 2100

catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga 2160

tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact 2220

gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt 2280

aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc 2340

cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa 2400

gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca 2460

ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc 2520

acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc 2580

gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg 2640

tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg 2700

agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga 2760

tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg 2820

gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg 2880

gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga 2940

cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000

attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg 3060

agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat 3120

ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt 3180

tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca 3240

gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt 3300

gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg 3360

ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg 3420

taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca 3480

agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg 3540

ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact 3600

caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt 3660

ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc 3720

attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc 3780

aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt 3840

gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa 3900

ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat 3960

atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat 4020

agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa 4080

ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa 4140

cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc 4200

cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct 4260

actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct 4320

tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc 4380

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agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag 4500

tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac 4560

ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg 4620

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ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa 4800

aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata 4860

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tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa 5160

tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5220

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5280

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5340

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ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5880

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ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6120

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gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg 6329

<210> 2

<211> 4384

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240

ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300

agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360

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cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480

ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 540

aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 600

tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 660

ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 720

aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 780

acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 840

aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 900

gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 960

ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 1020

ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 1080

atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 1140

gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 1200

gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260

aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac 1320

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 1380

tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 1440

tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 1500

agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 1560

gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 1620

aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 1680

cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 1740

gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 1800

gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 1860

cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 1920

taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat 1980

acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata 2040

agcttgatat cgaattcctg cagcccgggg gatccactag ttctagagcg gccgccaccg 2100

cggtggagct ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca 2160

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatagga 2220

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgaggtaact cacattaatt 2280

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 2340

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 2400

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 2460

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 2520

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 2580

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 2640

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 2700

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 2760

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 2820

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 2880

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 2940

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3000

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3060

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3120

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3180

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 3240

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 3300

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 3360

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 3420

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 3480

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 3540

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 3600

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 3660

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 3720

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 3780

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 3840

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 3900

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 3960

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 4020

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 4080

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 4140

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 4200

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 4260

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 4320

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 4380

cgtc 4384

<210> 3

<211> 5715

<212> DNA

<213> Streptomyces albus

<400> 3

atctacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 60

gctctcgcag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 120

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttg atcggcactt 180

tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattta tgcggtgtga 240

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 300

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 360

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 420

ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagag gatccgcggc 480

cgcgcgcgat atcgaattcg taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 540

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 600

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 660

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 720

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 780

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 840

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 900

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 960

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1020

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1080

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1140

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 1200

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 1260

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 1320

gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 1380

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 1440

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1500

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1560

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg ttcatgtgca 1620

gctccatcag caaaagggga tgataagttt atcaccaccg actatttgca acagtgccgt 1680

tgatcgtgct atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt gcaatgtcgt gcaatacgaa 1740

tggcgaaaag ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg gggttacccc cggcggtgtg 1800

ctgctggtcc acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg aagatgggcc acttggactg 1860

atcgaggccc tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc tcgtcatgcc ctcgtggtca 1920

ggtctggacg acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg ttacaccgga ccttggagtt 1980

gtctctgaca cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca gcgcccatcc atttgccttt 2040

gcggcagcgg ggccacaggc agagcagatc atctctgatc cattgcccct gccacctcac 2100

tcgcctgcaa gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg ggcaggtact tctcctcggc 2160

gtgggacacg atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt tgatggcaaa ggttccctat 2220

ggggtgccga gacactgcac cattcttcag gatggcaagt tggtacgcgt cgattatctc 2280

gagaatgacc actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca ggtggctcaa ggagaagagc 2340

cttcagaagg aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt tgatccgctc ccgcgacatt 2400

gtggcgacag ccctgggtca actgggccga gatccgttga tcttcctgca tccgccagag 2460

gcgggatgcg aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg gctgagctca tgagcggaga 2520

acgagatgac gttggagggg caaggtcgcg ctgattgctg gggcaacacg tggagcggat 2580

cggggattgt ctttcttcag ctcgctgatg atatgctgac gctcaatgcc gtttggcctc 2640

cgactaacga aaatcccgca tttggacggc tgatccgatt ggcacggcgg acggcgaatg 2700

gcggagcaga cgctcgtccg ggggcaatga gatatgaaaa agcctgaact caccgcgacg 2760

tatcgggccc tggccagcta gctagagtcg acctgcaggt ccccggggat cggtcttgcc 2820

ttgctcgtcg gtgatgtact tcaccagctc cgcgaagtcg ctcttcttga tggagcgcat 2880

ggggacgtgc ttggcaatca cgcgcacccc ccggccgttt tagcggctaa aaaagtcatg 2940

gctctgccct cgggcggacc acgcccatca tgaccttgcc aagctcgtcc tgcttctctt 3000

cgatcttcgc cagcagggcg aggatcgtgg catcaccgaa ccgcgccgtg cgcgggtcgt 3060

cggtgagcca gagtttcagc aggccgccca ggcggcccag gtcgccattg atgcgggcca 3120

gctcgcggac gtgctcatag tccacgacgc ccgtgatttt gtagccctgg ccgacggcca 3180

gcaggtaggc cgacaggctc atgccggccg ccgccgcctt ttcctcaatc gctcttcgtt 3240

cgtctggaag gcagtacacc ttgataggtg ggctgccctt cctggttggc ttggtttcat 3300

cagccatccg cttgccctca tctgttacgc cggcggtagc cggccagcct cgcagagcag 3360

gattcccgtt gagcaccgcc aggtgcgaat aagggacagt gaagaaggaa cacccgctcg 3420

cgggtgggcc tacttcacct atcctgcccg gctgacgccg ttggatacac caaggaaagt 3480

ctacacgaac cctttggcaa aatcctgtat atcgtgcgaa aaaggatgga tataccgaaa 3540

aaatcgctat aatgaccccg aagcagggtt atgcagcgga aaagatccgt cgacctgcag 3600

gcatgcaagc tctagcgatt ccagacgtcc cgaaggcgtg gcgcggcttc cccgtgccgg 3660

agcaatcgcc ctgggtgggt tacacgacgc ccctctatgg cccgtactga cggacacacc 3720

gaagccccgg cggcaaccct cagcggatgc cccggggctt cacgttttcc caggtcagaa 3780

gcggttttcg ggagtagtgc cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggggcg 3840

tagggtcgcc gacatgacac aaggggttgt gaccggggtg gacacgtacg cgggtgctta 3900

cgaccgtcag tcgcgcgagc gcgagaattc gagcgcagca agcccagcga cacagcgtag 3960

cgccaacgaa gacaaggcgg ccgaccttca gcgcgaagtc gagcgcgacg ggggccggtt 4020

caggttcgtc gggcatttca gcgaagcgcc gggcacgtcg gcgttcggga cggcggagcg 4080

cccggagttc gaacgcatcc tgaacgaatg ccgcgccggg cggctcaaca tgatcattgt 4140

ctatgacgtg tcgcgcttct cgcgcctgaa ggtcatggac gcgattccga ttgtctcgga 4200

attgctcgcc ctgggcgtga cgattgtttc cactcaggaa ggcgtcttcc ggcagggaaa 4260

cgtcatggac ctgattcacc tgattatgcg gctcgacgcg tcgcacaaag aatcttcgct 4320

gaagtcggcg aagattctcg acacgaagaa ccttcagcgc gaattgggcg ggtacgtcgg 4380

cgggaaggcg ccttacggct tcgagcttgt ttcggagacg aaggagatca cgcgcaacgg 4440

ccgaatggtc aatgtcgtca tcaacaagct tgcgcactcg accactcccc ttaccggacc 4500

cttcgagttc gagcccgacg taatccggtg gtggtggcgt gagatcaaga cgcacaaaca 4560

ccttcccttc aagccgggca gtcaagccgc cattcacccg ggcagcatca cggggctttg 4620

taagcgcatg gacgctgacg ccgtgccgac ccggggcgag acgattggga agaagaccgc 4680

ttcaagcgcc tgggacccgg caaccgttat gcgaatcctt cgggacccgc gtattgcggg 4740

cttcgccgct gaggtgatct acaagaagaa gccggacggc acgccgacca cgaagattga 4800

gggttaccgc attcagcgcg acccgatcac gctccggccg gtcgagcttg attgcggacc 4860

gatcatcgag cccgctgagt ggtatgagct tcaggcgtgg ttggacggca gggggcgcgg 4920

caaggggctt tcccgggggc aagccattct gtccgccatg gacaagctgt actgcgagtg 4980

tggcgccgtc atgacttcga agcgcgggga agaatcgatc aaggactctt accgctgccg 5040

tcgccggaag gtggtcgacc cgtccgcacc tgggcagcac gaaggcacgt gcaacgtcag 5100

catggcggca ctcgacaagt tcgttgcgga acgcatcttc aacaagatca ggcacgccga 5160

aggcgacgaa gagacgttgg cgcttctgtg ggaagccgcc cgacgcttcg gcaagctcac 5220

tgaggcgcct gagaagagcg gcgaacgggc gaaccttgtt gcggagcgcg ccgacgccct 5280

gaacgccctt gaagagctgt acgaagaccg cgcggcaggc gcgtacgacg gacccgttgg 5340

caggaagcac ttccggaagc aacaggcagc gctgacgctc cggcagcaag gggcggaaga 5400

gcggcttgcc gaacttgaag ccgccgaagc cccgaagctt ccccttgacc aatggttccc 5460

cgaagacgcc gacgctgacc cgaccggccc taagtcgtgg tgggggcgcg cgtcagtaga 5520

cgacaagcgc gtgttcgtcg ggctcttcgt agacaagatc gttgtcacga agtcgactac 5580

gggcaggggg cagggaacgc ccatcgagaa gcgcgcttcg atcacgtggg cgaagccgcc 5640

gaccgacgac gacgaagacg acgcccagga cggcacggaa gacgtagcgg cgtagcgaga 5700

cacccgggaa gcctg 5715

Claims (6)

1.包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)通过碱裂解法制备DNA环状分子；

(2)按比例，将100-500mg的生物降解性高分子化合物溶解于1-10ml有机溶剂中，得到油相；

(3)将20-200μl的浓度为0.1-1μM的环状DNA水溶液，50-300μl的质量浓度为0.5-3％的黏土水悬浊液与5-60mgFe₃O₄纳米颗粒混合均匀，得混合液；

(4)在涡旋的条件下，将步骤(3)获得的混合液滴入油相中，再加入1-10ml的质量浓度为0.5-1.5％水溶性高分子化合物水溶液，混合均匀，得到初级乳液；

(5)将初级乳液滴入到50-150ml的质量浓度为0.1-0.5％水溶性高分子化合物水溶液中，室温下，在转速400-2000转/分钟，搅拌至有机溶剂完全挥发，再在2000-6000转/分钟，离心10-20分钟，除去上层清液，分离出微球，用去离子水洗涤2-5次，冷冻干燥，得到包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)所述的生物降解性高分子化合物为数均分子量8000-250000的聚乳酸，数均分子量20000-100000的聚已内酯或数均分子量10000-150000的聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述有机溶剂为二氯甲烷，丙酮或氯仿。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述环状DNA为细菌的质粒、真菌的质粒或放线菌的质粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述水溶性高分子化合物为数均分子量25000-220000的聚乙烯醇，数均分子量10000-230000的聚乙烯吡咯烷酮或数均分子量2000-300000的聚环氧乙烷。

6.权利要求1-5之一所述的方法制备的包含有环状DNA的水土环境污染物示踪剂。