CN101517064B

CN101517064B - 糖醇存在下含有木糖的混合糖的发酵中改进的乙醇产量

Info

Publication number: CN101517064B
Application number: CN2007800345363A
Authority: CN
Inventors: P·V·维塔宁; C·M·麦卡钦; X·李; M·埃姆普塔奇; P·G·凯米; M·张; Y·-C·仇; M·A·弗兰登
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Midwest Research Institute
Current assignee: Midwest Research Institute; EIDP Inc
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP5232156B2; EP2066779B1; WO2008051349A3; WO2008051349A2; JP2010504757A; US7629156B2; CA2659452A1; CN101517064A; EP2066779A2; BRPI0715243A2; US20080081358A1; CA2659452C

Abstract

发现了利用木糖的运动发酵单胞菌株在含有包括木糖在内的混合糖的培养基中生长时，如果培养基中包括山梨糖醇或甘露糖醇，则具有改进的乙醇生产。对各种浓度的混合糖都见到了这个效果，其中没有发生生长延迟期，在更高的糖浓度下也是如此。

Description

糖醇存在下含有木糖的混合糖的发酵中改进的乙醇产量

本申请要求2006年9月28日提交的美国临时申请No.60/847997的优先权，将其整体作为一个部分引入本文用于所有目的。

政府权利声明

本发明是根据能源部授予的合同Nos.04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146由美国政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及微生物和遗传工程领域。更具体地说，开发了在含有木糖的混合糖发酵过程中改进乙醇产量的方法。

背景

由可再生资源生产的燃料乙醇是全球化石燃料短缺、能源成本上升以及与大气二氧化碳增加相关的全球温室效应的长期解决方案之一。来自可再生资源的燃料乙醇是通过糖的发酵来生产的。目前在美国，源自玉米粒的葡萄糖是用于乙醇生产的最丰富的糖源。由于玉米粒作为饲料和食品供应的需求，因此正在开发将各种类型的纤维素生物质(包括半纤维素)转化为可发酵糖的方法。源自这种生物质来源的糖是己糖和戊糖的混合物，主要是葡萄糖和木糖。由于纤维素生物质加工的发展，这些糖可以高浓度释放并被用于高浓度发酵中生产乙醇，减少了水的消耗，并且提高了流通量。因此，生物质转化为乙醇与化石燃料乙醇生产相比，提出了改善环境影响的极大可能性。此外，它提供了化石燃料乙醇生产的潜在的经济可行的替代方式。

除了生物质加工的改进，也已经使用了遗传工程来进行能够产生乙醇的微生物的改良。为了增强来自纤维素生物质的糖的利用，已经使产乙醇发酵单胞菌(ethanologen Zymomonas)(也就是运动发酵单胞菌(Z.mobilis))能够利用木糖，这是通过工程化菌株以表达四种酶：1)木糖异构酶，它催化木糖到木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，它使木酮糖磷酸化，形成木酮糖-5-磷酸；3)转酮醇酶；以及4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107；Zhang et al.(1995)Science 267：240-243)。尽管这些菌株确实代谢木糖，但是在高木糖浓度时并不充分利用木糖，以致无法获得理论上的乙醇产量。乙醇产量也由于作为木糖代谢副产物的木糖醇的合成而受到了限制(Feldmann et al.(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361；Kim et al.(2000)Applied and Environmental Microbiology66：186-193)。木糖醇对细胞有毒，因为它磷酸化形成的木糖醇-5-磷酸是细胞中累积并抑制生长的化合物。乙醇产量也由于木糖醇的合成而被减少了，因为利用木糖的运动发酵单胞菌重组株不能转化木糖醇为乙醇。此外，木糖醇是木糖异构酶的潜在抑制剂，木糖异构酶催化工程化的木糖代谢途径中木糖利用的第一步。因此，在包括木糖的高糖培养基的发酵中，使用利用木糖的运动发酵单胞菌不会实现最大木糖利用和乙醇产量。

由利用木糖的运动发酵单胞菌完全利用含有4％葡萄糖的糖混合物中的8％木糖，花费2-3天(Lawford and Rousseau(1999)Appl Biochemand Biotech.77-79：235-249)。完全利用含有65g/L葡萄糖的混合物中的65g/L木糖需要48小时(Joachimsthal and Rogers(2000)Appl Biochemand Biotechnol 84-86：343-356)，使用更高浓度的糖(75g/L木糖和75g/L葡萄糖)导致了不完全的木糖利用。

山梨糖醇已经作为渗透保护剂被加入以增强非工程化运动发酵单胞菌在高浓度葡萄糖中的生长(Loos et al.(1994)J Bacterid176：7688-7693)。山梨糖醇在胞内累积。此外，在高蔗糖上生长时，显示山梨糖醇是由细胞产生的并累积起来。在包括木糖的糖混合物存在下生长时，山梨糖醇对由已被工程化而利用木糖的运动发酵单胞菌菌株所进行的乙醇生产的任何影响都还没有在以前被确定过。

仍然存在开发在包括木糖的糖培养基中增加乙醇产量的发酵条件的需求，以使得利用木糖的菌株能够在减少的时间中用最大的木糖利用来达到它们的最大乙醇产量。

发明概述

本发明提供了用于改进通过发酵所制备的乙醇的产量的方法。在目前的方法中，已经被工程化而表达参与木糖利用的基因的运动发酵单胞菌细胞是在含有混合糖的培养基中生长的，该混合糖包括木糖和至少一种另外的糖。培养基也包括山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇或者核糖醇(也称为侧金盏糖醇)，这导致了增加的木糖利用和增加的乙醇产量。副产物木糖醇的产量也减少了。在本发明的一个实施方案中，该方法包括：

a)提供能够将木糖转化为乙醇的重组发酵单胞菌细胞；

b)提供合适的培养基，所述培养基包括(i)含有木糖和至少一种另外的糖的混合糖组合物，以及(ii)至少一种选自山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇和核糖醇的糖醇；以及

c)使(a)与(b)接触，由此发酵单胞菌细胞生产乙醇。

在某些实施方案中，上述步骤(c)的接触发生至少大约24小时。上述接触可以在大约25℃-大约40℃、或者大约30℃-大约37℃的温度发生。上述接触可以在大约4.5-大约7.5的pH，或者大约5.0-大约6.0的pH发生。

在另一实施方案中，接触是通过将(a)的细胞接种到(b)的培养基中而发生的，使用的接种比是大约0.01％-大约20％(v/v)、或者大约0.1％-大约20％。

在一个实施方案中，木糖和至少一种另外的糖是从已被处理的和/或糖化的生物质产生的。

在另一实施方案中，混合糖组合物包括至少大约10％的木糖，或者在备选实施方案中，混合糖组合物包括大约40％-大约60％的木糖。

在另一实施方案中，(a)和(b)的接触在不供气的发酵条件下发生。

本发明的另一方面是利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，其在本文中称为ZW658，ATCC保藏号PTA-7858，于2006年9月12日保藏。

附图简述、序列描述和生物保藏

根据下面详细的说明书、附图以及所附的序列描述能够更充分地理解发明，这些都构成本申请的一部分。

图1显示了转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)和木酮糖激酶(D)的酶测定策略。

图2显示了pMODPgaptaltktCm的质粒图谱。

图3显示了pMODPgapxylABCm的质粒图谱。

图4显示了用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C系中木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性图。

图5显示了用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C系中转醛醇酶(TAL)和转酮醇酶(TKT)活性图。

图6显示了所选择的已适应的利用木糖的菌落的理论乙醇产量百分比和木糖利用百分比图。

图7显示了已适应的利用木糖的菌株在含有5％葡萄糖的RM(RMG)中生长50代之前和之后在含有5％木糖的RM(丰富培养基)(RMX5％)上生长第70小时的生长图。

图8显示了所选择的菌株ZW658与对照8b相比，在RM+10％葡萄糖(RMG 10％)(A，B)和RM+8％木糖(RMX8％)(C，D)中的生长、葡萄糖或木糖利用以及乙醇和木糖醇产量的图。

图9显示了所选择的菌株ZW658与对照8b相比，在没有乙酸盐(A，B)或者含有0.6％乙酸盐(C，D)的RM+10％葡萄糖和8％木糖中的生长、葡萄糖和木糖利用以及乙醇和木糖醇产量的图。

图10显示了山梨糖醇对生长在单独的葡萄糖或者单独的木糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长(A)和乙醇产量(B)的影响图。

图11显示了在山梨糖醇存在下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长、葡萄糖利用、木糖利用、乙醇产量、乙酸产量和木糖醇产量图。

图12显示了不存在山梨糖醇的条件下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长、葡萄糖利用、木糖利用、乙醇产量、乙酸浓度和木糖醇产量图。

图13显示了在乙酸盐和山梨糖醇存在下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长、葡萄糖利用、木糖利用、乙醇产量、乙酸浓度和木糖醇产量图。

图14显示了存在乙酸盐但不存在山梨糖醇的条件下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长、葡萄糖利用、木糖利用、乙醇产量、乙酸浓度和木糖醇产量图。

图15显示了在谷氨酸盐存在下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长、葡萄糖利用、木糖利用、乙醇产量、乙酸浓度和木糖醇产量图。

图16显示了在0-10mM的各种量的山梨糖醇存在下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长图。

图17显示了在10mM-200mM的各种量的山梨糖醇的存在下，生长在葡萄糖和木糖混合糖上的利用木糖的运动发酵单胞菌的生长(A)和乙醇产量(B)图。

图18显示了不同多元醇存在下的生长(A)、木糖利用(B)和乙醇产量(C)图。

图19显示了乙酸盐和不同多元醇存在下的生长(A)、木糖利用(B)和乙醇产量(C)图。

图20显示了不同糖醇存在下的生长(A)和葡萄糖利用(B)图。

图21显示了不同糖醇存在下的木糖利用(A)和乙醇产量(B)图。

图22显示了不同糖醇存在下的生长(A)和葡萄糖利用(B)图。

图23显示了不同糖醇存在下的木糖利用(A)和乙醇产量(B)图。

下面的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(细则5.2和49.5(a-bis)，以及管理规程的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822提出的规则。

在此将序列表提供在光盘上。因此含有序列表的光盘的内容按照37CFR 1.52(e)，通过引用而并入本文。光盘是双份提交的并且互相一致。盘上标记了″Copy 1-Sequence Listing″(“拷贝1-序列表”)和″Copy 2Sequence listing″(“拷贝2序列表”)。盘上含有下面的文件：CL3425seq list.ST25。

SEQ IDs NO：1和2是用于扩增DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段含有来自pZB4的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(P_gap)。

SEQ IDs NO：3和4是用于扩增DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段含有来自pZB4的tal编码区。

SEQ IDs NO：5和6是用于扩增DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段含有来自P_gap和tal片段的P_gaptal。

SEQ IDs NO：7和8是用于扩增DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段含有来自pZB 186的loxP::Cm。

SEQ ID NO：9是pMODP_gaptaltktCm质粒的完整核苷酸序列。

SEQ IDs NO：10和11是用于扩增接受了pMODP_gaptaltktCm的转化体中的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段含有tal和tkt编码区。

SEQ ID NO：12是pMODP_gapxylABCm质粒的完整核苷酸序列。

SEQ IDs NO：13和14是用于扩增1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段来自含有pMODP_gapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合体。

SEQ IDs NO：15和16是用于扩增1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列，所述DNA片段来自含有pMODP_gapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合体。

申请人按照关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209进行了下面的生物保藏：

发明详述

申请人明确地引入本公开文本中所有引用参考文献的全部内容。此外，当数量、浓度或者其它值或参数是作为范围、优选范围或者一系列上限优选值和下限优选值给出时，就要理解为明确公开了任一对任何上限范围或优选值与任何下限范围或优选值所形成的所有范围，无论这些范围是否被分别公开了。当本文列举的是数值范围时，除非另有说明，该范围将包括其端点以及该范围内的整数和分数。当定义了范围时，不打算将本发明的范围限定为所列举的特定值。

本发明提供了使用发酵来生产乙醇的方法，其包括将山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇或核糖醇加入到含有包括木糖的混合糖的培养基中。包括山梨糖醇的培养基提供利用木糖的运动发酵单胞菌菌株生长，从而增加了这些菌株从混合糖生产乙醇的能力。

在本公开文本中，使用了许多术语。提供以下定义：

RM是丰富培养基。

RMG5％是RM+5％葡萄糖。

RMG10％是RM+10％葡萄糖。

RMX8％是RM+8％木糖。

RMX2％是RM+2％木糖。

RMX5％是RM+5％木糖。

RMGX10％8％是RM+10％葡萄糖和8％木糖。

RMGX5％8％是RM+5％葡萄糖和8％木糖。

术语“可发酵的糖”是指在发酵过程中可被微生物用作碳源的寡糖和单糖。

如文本所使用的，“合适的培养基”是指支持运动发酵单胞菌在各种条件下生长的培养基。合适的培养基包括木糖和至少一种另外的糖以及一种或多种糖醇，糖醇可以是山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或其混合物。此外，如果培养基中不存在足够浓度的糖醇，那么该培养基就是一种虽然支持生长、但是不提供最佳木糖利用的培养基。

术语“木质素纤维素”是指包含木质素和纤维素两者的组合物。木质素纤维素材料也包括半纤维素。

术语“纤维素”是指包含纤维素和另外组分的组合物，另外组分包括半纤维素。

术语“糖化”是指从多糖产生可发酵的糖。

术语“预处理的生物质”是指在糖化之前已进行预处理的生物质。

“生物质”是指任何纤维素或木质纤维素材料，包括含有纤维素以及任选进一步含有半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。生物质也可含有另外的组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可以来自单一来源，或者生物质可以含有来自一种以上来源的混合物；例如，生物质可以含有玉米芯和玉米秸的混合物，或者草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能源农作物、农业废弃物、城市固体废物、工业固体废物、造纸污泥、庭院废物、木材和林业废物。生物质的例子包括但不限于玉米粒，玉米芯，农作物废弃物诸如玉米壳、玉米秸，草，小麦，麦秆，大麦，大麦秆，干草，稻秆，柳枝稷，废纸，甘蔗渣，高粱，大豆，获自谷物碾磨的组分，树，枝，根，叶，木片，锯屑，灌木和灌木丛，蔬菜，水果，花以及动物粪肥。

“生物质水解物”是指生物质糖化得到的产物。生物质也可在糖化前进行预处理。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”或“野生型基因”是指天然发现的带有它自己的调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，含有未发现天然在一起的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可以含有来自不同来源的调节序列和编码序列，或者来自同一来源的调节序列和编码序列，但以不同于天然发现的方式进行排列。“内源基因”是指天然位于生物基因组中的天然基因。“外源”基因是指通常不在宿主生物中发现的、但是通过基因转移而引入到宿主生物中的基因。外源基因可以包括插入到非天然宿主中的天然基因，或者嵌合基因。

术语“遗传构建体”是指编码一种或多种特定蛋白质的表达的核酸片段。在基因构建体中，基因可以是天然的、嵌合的或者是外源的。典型的遗传构建体将含有“编码序列”。“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“起始控制区”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常而言，编码序列位于启动子的3’。启动子可以整体来自天然基因，或者由来自天然发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至含有合成的DNA区段。本领域技术人员能够理解的是，不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或者在不同发育阶段的表达，或者反应于不同的环境条件的表达。引起基因在大多数细胞类型中大多数时间都表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。

本文使用的术语“表达”是指源自基因的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达也可以指mRNA翻译成多肽。

本文使用的术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物中，产生遗传上稳定的遗传。被转移的核酸可以在宿主细胞中保持质粒的形式，或者一些被转移的核酸可以整合到宿主细胞的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物。

本文使用的术语“质粒”和“载体”是指通常携带基因的染色体外元件，它们不是细胞中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。这些元件可以是来自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组为独特的构建体，所述构建体能够将选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3’非翻译序列一起引入细胞。

术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上进行缔合，以便一个片段的功能受到其它片段的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(也就是说编码序列受到启动子的转录控制)时，启动子就是与编码序列可操作地连接的。编码序列可以有义方向或反义方向与调节序列可操作地连接。

术语“选择标记”意指一种鉴别因子，通常是抗生素或化学抗性基因，它能够根据标记基因的效应，即对抗生素的抗性来进行选择，其中使用效应来追踪感兴趣核酸的遗传和/或鉴别已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物。

利用木糖的发酵单胞菌菌株

在根据本发明的方法生产乙醇的发酵中，可以使用已经为木糖代谢而工程化的任何运动发酵单胞菌菌株。典型地，为表达参与木糖代谢的四种酶，将四种基因引入运动发酵单胞菌，如US 5514583所述，通过引用将其引入本文。这些基因包括编码木糖异构酶(它催化木糖到木酮糖的转化)以及木酮糖激酶(它使木酮糖磷酸化形成木酮糖-5-磷酸)的基因。此外，转酮醇酶和转醛醇酶，即戊糖磷酸途径的两种酶，将木酮糖-5-磷酸转化为将戊糖代谢偶联于Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，使得能够将木糖代谢为乙醇。带有编码这些酶的序列的DNA片段可以从能够代谢木糖的许多微生物的任一种获得，诸如肠道细菌和一些酵母以及真菌。将这些基因的编码区可操作地连接到在运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子以及其它调节元件上，所述启动子例如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶或运动发酵单胞菌烯醇酶的启动子。典型地将这些嵌合基因构建在载体中，所述载体转化到运动发酵单胞菌细胞中以便对利用木糖的菌株进行工程化。在本发明的方法中可以使用已知的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株和为利用木糖而工程化的运动发酵单胞菌新菌株。利用木糖的运动发酵单胞菌菌株包括运动发酵单胞菌ZM4(pZB5)(Joachimsthal and Rogers，见上文)、运动发酵单胞菌CP4：pZB5(Lawford et al.，见上文)、运动发酵单胞菌8b(US 20030162271)、ZW658(本文描述；ATCC#PTA-7858)以及ZW800、ZW801-4和ZW801-6(描述在共同拥有和共同未决的美国专利申请60/847813中，通过引用将其引入本文)。特别有用的是以下菌株：运动发酵单胞菌8b、ZW658、ZW800、ZW801-4和ZW801-6。

发现利用木糖的运动发酵单胞菌菌株ZW658具有明显不同于运动发酵单胞菌8b菌株的性质，如本文实施例2所显示的。在相同的发酵条件下，ZW658显示了与8b相比的木糖醇产量的减少、木糖利用的增加以及乙醇产量的增加。在适应过程后，这些性质是显而易见的，该过程不包括8b菌株适应情况下的诱变。

利用木糖的运动发酵单胞菌菌株ZW800具有另外的遗传修饰，其灭活了编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的基因，导致了木糖醇合成的减少。具体地，ZW800在GFOR编码区中插入了选择标记，其破坏了编码的蛋白的表达，如共同拥有和共同未决的美国专利申请60/847813中所详细描述的，通过引用将其引入本文。与表达GFOR的亲本株相比，GFOR敲除突变体在含有木糖的糖混合物上生长时产生了降低量的木糖醇，并且，在山梨糖醇存在下在高糖混合物中生长时消耗了更多的木糖并产生了更高浓度和产率的乙醇。美国专利申请60/847813中也描述了源自ZW800的菌株ZW801-4和ZW801-6，已通过Cre/lox介导的切除而去除了选择标记，产生了GFOR编码区内的缺失和lox位点足迹的添加，其破坏了GFOR编码区。菌株ZW801-4和ZW801-6具有与上述ZW800相同的性质。

本发明的方法中也可使用被另外工程化以利用除木糖以外的天然不使用的糖的运动发酵单胞菌菌株。一个例子是US 5843760中描述的为利用阿拉伯糖而工程化的运动发酵单胞菌菌株，通过引用将其引入本文。

混合糖

在本发明的方法中，利用木糖的运动发酵单胞菌菌株的细胞生长在含有混合糖的培养基中。本文所指的混合糖包括木糖，和至少一种另外的糖，木糖被已经工程化的运动发酵单胞菌细胞利用。可以包括可以提供运动发酵单胞菌细胞的代谢能源的任何糖，或者在含有木糖的混合物中存在的任何糖。理想的是使利用木糖的运动发酵单胞菌细胞生长在由生物质糖化产生的糖上。典型地是将生物质预处理，例如按照专利申请WO2004/081185以及共同拥有的和共同未决的美国申请60/670437中所描述的，然后用糖化酶处理，如Lynd，L.R.，et al.(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)中所综述的。生物质糖化产生糖，所述糖可以典型地包括木糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和/或阿拉伯糖的混合物。

可以将混合糖高浓度地使用在用于运动发酵单胞菌细胞生长的培养基中。这使得能够直接使用生物质糖化的糖，或者几乎不稀释地使用，从而减少发酵体积，这对商业规模的乙醇生产来说是理想的。使用高的糖浓度以便可以生产更高浓度的乙醇。混合糖的浓度典型地是至少大约120g/L以及最高达大约300g/L。在这个混合糖浓度范围，可以将糖醇加入到生长培养基中以提供下面描述的有益效果。特别有用的是大约150g/L-大约235g/L的混合糖浓度。

混合物中不同糖的比例是可变的，木糖典型地为糖总量的至少大约10％。优选地，木糖是大约40％-大约60％。果糖存在于由一些生物质，诸如甘蔗渣的糖化所产生的糖中，并且可以代替部分的木糖或葡萄糖，以便木糖保持为糖混合物的至少大约10％。此外，阿拉伯糖是源自半纤维素的，因此是源自含有半纤维素的糖化生物质的混合糖的典型组分。

改进的乙醇产量

在本方法中，通过在含有包括木糖的混合糖的培养基中包括来自6-碳糖家族的糖醇，改进了利用木糖的运动发酵单胞菌的乙醇产量，所述糖醇选自山梨糖醇(包括D-山梨糖醇或L-山梨糖醇)、甘露糖醇、半乳糖醇以及它们的混合物。除了这些有效的糖醇外，5-碳糖醇核糖醇(也称为侧金盏糖醇)也是有效的，可以使用。尽管如本文实施例3所证明的，将山梨糖醇加入到含有木糖作为唯一糖的培养基中对于乙醇生产没有任何影响，然而意外地发现：当培养基中的混合糖组合物中包括木糖时，山梨糖醇对于利用木糖的运动发酵单胞菌的乙醇产量具有有益效果。申请人发现，在存在山梨糖醇时，包括木糖的混合糖培养基中的乙醇产量显著增加了。在一个实施方案中，混合糖含有木糖以及一种或多种其它糖。在一个实施方案中，一种或多种其它混合糖是葡萄糖。

一般而言，乙醇产量是根据所使用的发酵条件而变化的，所述条件包括培养基的组成。由于高的糖浓度、抑制剂或者其它因素的存在，支持生长的培养基组合物可能不能在利用木糖的运动发酵单胞菌中提供最佳的木糖利用。将山梨糖醇或者任何上述列举的其它糖醇加入到这样的培养基中，就使得它成为了本方法的合适培养基。例如，培养基可能包括抑制剂，诸如乙酸盐(如糖化生物质中所存在的)，它影响乙醇生产水平。本文显示，山梨糖醇加入到含有乙酸盐的混合糖培养基中，改进了利用木糖的运动发酵单胞菌的乙醇产量。在山梨糖醇或者其它指定糖醇的存在下，乙醇产量可以增加至少大约5％，尽管精确的量将根据所使用的合适培养基的组成而变化。当达到最大乙醇产量时，在发酵培养的稳定期进行了比较。

当利用木糖的运动发酵单胞菌生长在含有不发生生长延迟的浓度的混合糖的培养基中生长时，可以发生山梨糖醇或其它指定糖醇存在下的乙醇产量增加。支持无延迟生长的培养基中混合糖的浓度是根据培养基中的其它组分，诸如抑制剂而变化的。例如，当利用木糖的运动发酵单胞菌生长在不含乙酸盐而含有低于大约165g/L浓度的混合糖的培养基中时，典型地就不会出现明显的延迟期。随着无延迟生长的发生，运动发酵单胞菌细胞就不表现为承受着渗透胁迫，因为渗透胁迫的典型特征就是生长延迟。因此，本文所述的山梨糖醇或其它糖醇与混合糖一起在无延迟条件下增加乙醇产量是令人惊讶的，这区别于Loos等人(见上文)在高浓度葡萄糖中观察到的山梨糖醇对野生型运动发酵单胞菌生长的渗透效应。在更高的混合糖浓度下，典型地确实出现了生长延迟，但是本文描述的山梨糖醇或其它糖醇对乙醇产量的同样影响继续在发生着，这是无延迟条件的表现。

在本方法中，本文描述的山梨糖醇或其它糖醇被包括在含有混合糖的培养基中，形成了合适的培养基，利用木糖的运动发酵单胞菌也显示了木糖利用的增加。象上述乙醇生产一样，木糖利用通常根据发酵条件，包括培养基的组成而变化。例如，培养基可包括抑制剂，诸如乙酸盐(如糖化生物质中所存在的)，它可能影响木糖利用。将山梨糖醇加入到含有乙酸盐的混合糖培养基中，改进了利用木糖的运动发酵单胞菌的木糖利用。在存在本文描述的山梨糖醇或其它糖醇时，与同样条件下(但不含本文描述的山梨糖醇或其它糖醇)利用的木糖的水平相比，木糖利用可以增加至少大约5％，尽管精确的量将根据所使用的合适培养基的组成而变化。例如，在本文的实施例4和5中，在培养基不含乙酸盐的条件下，含有100g/L葡萄糖的糖混合物中的85g/L木糖在山梨糖醇存在下在大约30小时内就完全被利用了，而培养基中不含山梨糖醇时，当培养在大约60小时达到稳定期时，还剩余大约20％的木糖。当达到最大木糖利用时，进行了发酵培养稳定期的比较。

此外，根据本文的发现，当在不存在山梨糖醇而生产木糖醇的条件下，使利用木糖的运动发酵单胞菌生长在含有混合糖的培养基上时，所产生的木糖醇的量在培养基中包括山梨糖醇时减少。在山梨糖醇存在时，木糖醇产量减少至少大约6％，尽管精确的量将根据所使用的合适培养基的组成而变化。例如，在本文的实施例4和5中，山梨糖醇的加入使木糖醇减少了大约3倍。

不希望受理论束缚，认为木糖醇产量的减少能够增加木糖利用。木糖利用的增加以及碳流动到副产物木糖醇的减少，将能够增加乙醇产量。因此，木糖醇产量的减少、木糖利用的增加和乙醇产量的增加都是生长在本文描述的合适培养基上的利用木糖的运动发酵单胞菌性能改善的表现，所述培养基中含有混合糖(包括木糖)以及山梨糖醇或如上所述其它糖醇。

诸如赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇这样的糖醇以及经常使用的渗透保护剂谷氨酸盐都不会增加乙醇产量，它们也不会增加生长在含有混合糖的合适培养基上的利用木糖的运动发酵单胞菌的木糖利用。谷氨酸盐确实作为典型的渗透保护剂起作用，当利用木糖的运动发酵单胞菌生长在发生延迟的条件下时，谷氨酸盐可消除初始生长的延迟期。然而，在存在谷氨酸盐时，木糖醇产量不会减少，木糖利用不会增强，乙醇产量也不会改进。因此，作为渗透保护剂的化合物不会象山梨糖醇和甘露糖醇、半乳糖醇或核糖醇那样改善性能。这个发现表明这些糖醇是利用木糖的运动发酵单胞菌的性能增强剂。

可加入的山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或其混合物的量是大约0.5mM-大约200mM。此外，这些糖醇可以任何比例一起使用，总量是大约0.5mM-大约200mM。特别有用的量是大约2mM-大约100mM，优选5mM-20mM。

对于乙醇生产来说，使重组的利用木糖的运动发酵单胞菌与合适的培养基接触，该培养基含有包括木糖的混合糖以及山梨糖醇、其它指定的糖醇或其混合物。典型地是将利用木糖的运动发酵单胞菌接种到合适的培养基中。对于初始化发酵培养来说，大约0.01％-大约20％(v/v)的接种比例是理想的。典型地使用大约0.1％-大约20％(v/v)的接种比例，而更典型的比例是大约1％-大约20％(v/v)。运动发酵单胞菌生长在培养基中，在其中进行发酵并生产乙醇。不提供空气、氧气或其它气体的条件下(可以包括诸如厌氧、微需氧或者微好氧发酵的条件)进行发酵至少大约24小时，可以进行30小时或更久。达到最大乙醇产量的时间是可变的，取决于发酵条件。典型地，如果培养基中含有抑制剂，那么就需要更长的发酵期。典型地是在大约25℃-大约40℃的温度、大约4.5-大约7.5的pH下进行接触和连续发酵。更合适的是在大约30℃-大约37℃的温度进行接触和连续发酵。更合适的是在大约5.0-大约6.0的pH下进行接触和连续发酵。

用于乙醇生产的发酵

在本方法中，利用木糖的运动发酵单胞菌可以在实验室规模发酵罐中和生产商业量乙醇的按规模放大的发酵中的含有包括木糖的混合糖的合适培养基中生长。当期望进行乙醇的商业生产时，可以应用各种各样的培养方法。例如，通过分批培养方法和连续培养方法两者就可以产生利用木糖的运动发酵单胞菌的大规模生产。经典的分批培养方法是一种封闭系统，其中在培养开始时设定培养基的组成，在培养过程中不进行人工改变。因此，在培养过程开始时在培养基中接种期望的生物，并且不向系统中加入任何物质就能够产生生长或代谢活动。然而，典型地，“分批”培养在添加碳源方面是分批的，而且经常尝试控制诸如pH和氧浓度这样的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成是不断变化的，直到培养终止时。在分批培养过程中，细胞通过静止延迟期变化到高生长的对数期，最后变化到生长速度降低或停止的稳定期。如果不进行，稳定期的细胞最终将死亡。对数期细胞经常被用在一些系统中负责终产物或中间体的大量生产。在其它系统中能够获得稳定期或后指数期生产。

对标准分批系统的一种改变是补料-分批(Fed-Batch)系统。补料-分批培养过程也是合适的，并且包括典型的分批系统，例外是底物是随培养进行增量添加的。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢并且当理想的是培养基中包含有限量的底物时，补料-分批系统是有用的。测定补料-分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此是根据可测量因素的变化，诸如pH和废气诸如CO2的分压的变化来估计的。分批培养方法和补料-分批培养方法都是现有技术中普通的和公知的，例子可以在Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，and Brock，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA或者Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36，227，(1992)中找到，上述文献通过引用引入本文。

也可以使用连续培养来实现乙醇的商业生产。连续培养是开放系统，其中是将确定成分培养基连续加入到生物反应器中，同时取出等量的条件培养基进行处理。连续培养通常将细胞保持在恒定的高液相密度，其中细胞主要处于对数期生长。备选地，可以用固定化细胞进行连续培养，在其中连续加入碳和营养物，并从细胞团中连续取出有价值的产物、副产品或者废物。可以使用由本领域技术人员已知的天然和/或合成材料组成的广范围的固相支持物来进行细胞固定化。

连续培养或半连续培养使得能够调节影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任意数量的因素。例如，一种方法将限制性营养物诸如碳源或氮水平维持在固定速率，并且使得能够调节所有的其它参数。在其它系统中，能够连续改变影响生长的许多因素，而通过培养基浊度测定的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态生长条件，因此必须平衡由于培养基去除而导致的细胞损失与培养物中的细胞生长速度。调节用于连续培养过程的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速度最大化的技术都是工业微生物领域公知的，上文中的Brock详细记载了各种方法。

特别适于乙醇生产的是如下的发酵方案。在大约30℃-大约37℃，使期望的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株生长在摇瓶中的半复合培养基中，伴随在定轨摇床中以大约150rpm进行振荡，然后转移到含有相似培养基的1-10L种子发酵罐中。使种子培养物厌氧生长在种子发酵罐中，直到OD₆₀₀为3-6，当将它转移到生产发酵罐时，优化发酵参数以进行乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型接种体积是大约2％-大约20％v/v。典型的发酵培养基含有基本培养基成分诸如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源诸如酵母提取物或基于大豆的产品(0-10g/l)。培养基中存在终浓度为大约5-20mM的山梨糖醇或指定的糖醇。包括木糖和至少一种另外的糖诸如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始分批碳源(50-200g/l)耗尽时，将混合糖连续加入到发酵容器中以使乙醇比率和滴度最大化。动态调整碳源进料速度以确保培养物不累积过量的葡萄糖，过量的葡萄糖可能导致毒性副产品诸如乙酸的增加。为使由所利用的底物产生的乙醇产量最大化，通过磷酸盐的量来限制生物质生长，磷酸盐可以是初始分批加入的，也可以是发酵过程中补料的。使用苛性溶液(诸如氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠)以及硫酸或磷酸将发酵控制在pH 5.0-6.0。将发酵罐温度控制在30℃-37℃。为了使起泡最小，按照需要将消泡剂(任何类型的——基于硅酮的、基于有机物的，等等)加入到容器中。可以任选使用抗生素(菌株中存在针对它的抗生素抗性标记)诸如卡那霉素来使污染最小化。

实施例

在下面的实施例中进一步定义本发明。应当明白的是，尽管这些实施例指明了发明的优选实施方案，但仅仅是作为例子给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且能够在不背离其精神和范围的情况下对发明作出各种改变和修正以使它适应于各种用途和条件。

一般方法

这里使用的标准重组DNA和分子克隆技术是现有技术中公知的，由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)(后文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.etal.，Current Protocols in Molecular Biology，published by GreenePublishing Assoc，and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)所描述。

缩写的含义如下：“kb”意指千碱基，“bp”意指碱基对，“nt”意指核苷酸，“hr”意指小时，“min”意指分钟，“sec”意指秒，“d”意指天，“L”意指升，“ml”意指毫升，“μL”意指微升，“μg”意指微克，“ng”意指纳克，″mM″意指毫重量摩尔浓度，“μM”意指微重量摩尔浓度，“nm”意指纳米，“μmol”意指微摩尔，“pmol”意指皮摩尔，“Cm”意指氯霉素，“Cm^r”意指氯霉素抗性，“Cm^s”意指氯霉素敏感的，“Sp^r”意指壮观霉素抗性，“Sp^s”意指壮观霉素敏感的，“XI”是木糖异构酶，“XK”是木酮糖激酶，“TAL”是转醛醇酶，“TKT”是转酮醇酶，“EFT”意指所经过的发酵时间，“RM”意指含有10g/L酵母提取物加上2g/L KH₂PO₄的丰富培养基，“MM”意指含有10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH₄)₂SO₄和0.2g/LKH₂PO₄的接合培养基(mating medium)。

光密度测定(OD)

从烧瓶或发酵罐中获取大约1ml的充分混合的样品。首先用分光光度计(Amersham Biosciences Ultrospec 3300pro，GE Healthcare，Piscataway，New Jersey，USA)直接测定样品吸光度。如果读数低于0.6单位，不需要稀释。如果读数高于0.6单位，就用培养基稀释样品直到实际读数为0.1-0.6单位。从稀释比例和实际读数计算原始OD。

酶测定

制备发酵单胞菌的无细胞提取物用于酶测定

将细胞在50ml的RM+2％葡萄糖中30℃生长过夜，到1.0-1.2的OD₆₀₀。在4℃下4500rpm离心10min收获细胞。弃去上清液，用25ml冰冷的超声处理缓冲液(10mM Tris，pH 7.6，10mM MgCl₂)漂洗细胞沉淀，然后4500rpm离心10min。将沉淀重悬浮在2.0-2.5ml添加了1mM二硫苏糖醇的超声处理缓冲液中。在eppendorf离心机中4℃离心500μl整分试样1min。弃去大多数上清液，留下约10-20μl以防止沉淀干燥。将细胞冷冻，贮藏在-80℃直到测定。在测定之前，将细胞解冻，重悬浮在500μl的超声处理缓冲液+1mM DTT中。使用Branson超声仪450在62％占空比和2的输出控制下超声处理混合物2次，每次45秒，超声处理之间让样品冷却约3-5min。在Beckman微量离心机中4℃下14000rpm离心样品60min。将上清液转移到新管中，保持在4℃。使用Pierce BCA测定法确定蛋白浓度。

通常首先进行转酮醇酶(TKT)分析，因为该酶比其它酶更不稳定。TKT测定图示于图1A。在微量滴定板测定中，在30℃下将20μl的无细胞提取物加入到每个孔的反应混合物中，该混合物包括如下终浓度的成分：0.37mM NADP，50mM TrisHCl pH 7.5，8.4mM MgCl₂，0.1mMTPP(氯化硫胺素焦磷酸)，0.6mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)，4mM BHP(β-羟基丙酮酸)，4U/ml PGI(磷酸葡萄糖异构酶)以及4U/ml G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。在平板读数仪上读取A₃₄₀3-5min。如下计算TKT活性：

1单位相当于30℃下每分钟形成1μmol的D-果糖-6-磷酸。

U(μ摩尔/min)＝斜率(dA₃₄₀/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADP→NADPH的摩尔数是1cm比色皿中每L每摩尔的6220A₃₄₀)

(微量滴定板中每孔200μl的径长＝0.55cm)

比活性(μ摩尔/min-mg)＝μ摩尔/min/蛋白浓度(mg)

转醛醇酶(TAL)测定的基础示于图1B。在微量滴定板测定中，在30℃下将20μl的无细胞提取物加入到每个孔的反应混合物中，该混合物包括如下终浓度的成分：0.38mM NADH，87mM三乙醇胺，17mMEDTA，33mM F6P(果糖-6-磷酸)，1.2mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)，2.0U/ml GDH(甘油-3-磷酸脱氢酶)以及20U/ml TPI(丙糖磷酸异构酶)。将平板温育5min，然后读取A₃₄₀3-5min。如下计算TAL活性：

1单位相当于30℃下每分钟形成1μmol的D-甘油醛。

U(μ摩尔/min)＝斜率(dA₃₄₀/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD的摩尔数是1cm比色皿中每L每摩尔的6220A₃₄₀)

(微量滴定板中每孔200μl的径长＝0.55cm)

比活性(μ摩尔/min-mg)＝μ摩尔/min/蛋白

木糖异构酶(XI)测定的基础示于图1C。

在微量滴定板测定中，在30℃下将20μl的无细胞提取物加入到每个孔的反应混合物中，该混合物包括如下终浓度的成分：0.256mMNADH，50mM木糖，10mM MgSO₄，10mM三乙醇胺以及1U/ml SDH(山梨糖醇脱氢酶)。在平板读数仪上读取A₃₄₀3-5min。如下计算XI活性：

1单位的XI相当于30℃下每分钟形成1μ摩尔的D-木酮糖。

U(μ摩尔/min)＝斜率(dA₃₄₀/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADHP→NAD的摩尔数是1cm比色皿中每L每摩尔的6220A₃₄₀)

(微量滴定板中每孔200μl的径长＝0.55cm)

比活性(μ摩尔/min-mg)＝μ摩尔/min/蛋白浓度(mg)

酮糖激酶(XK)测定的基础示于图1D。在微量滴定板测定中，在30℃下将20μl的无细胞提取物加入到每个孔的反应混合物中，该混合物包括如下终浓度的成分：0.2mM NADH，50mM Tris HCl pH 7.5，2.0mmMgCl₂-6H₂O，2.0M ATP，0.2M PEP(磷酸烯醇丙酮酸)，8.5mM D-木酮糖，5U/ml PK(丙酮酸激酶)以及5U/ml LDH(乳酸脱氢酶)。在平板读数仪上读取A₃₄₀min。如下计算XI活性：

1单位相当于30℃下每分钟形成1μ摩尔的D-木酮糖-5-磷酸。

U(μ摩尔/min)＝斜率(dA₃₄₀/min)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD的摩尔数是1cm比色皿中每L每摩尔的6220A₃₄₀)

(微量滴定板中每孔200μl的径长＝0.55cm)

比活性(μ摩尔/min-mg)＝μ摩尔/min/蛋白浓度(mg)

HPLC方法

用Agilent 1100系列HPLC和用于LC 3D的Agilent ChemStation软件进行分析。柱子是带有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125-0129)的BioRad Aminex HPX-87H(HPLC有机分析柱125-0140)。

操作条件是：

流速 0.6ml/min

溶剂 0.01N H₂SO₄

停机时间 25min

注射体积 5μl

自动进样器温度控制在10℃或4℃

柱温度 55℃

检测器折射率(40℃)

用外标校正曲线

种子培养

将冷冻在-80℃的种子甘油原种解冻，然后接种到无菌培养管中，管中含有60g/L葡萄糖、20g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、10g/LKH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄和1g/L MgSO₄的混合物。用4N KOH调节初始pH到5.5。将该复苏培养物在37℃静态生长过夜。将它转移到含有75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、10g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄和1g/L MgSO₄的摇瓶中。用4N KOH调节初始pH到5.5。通过测定OD₆₀₀监测生长。当OD达到大约5时，将一定体积的种子取到无菌注射器中用于接种。

实施例1

发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株ZW658的构建

ZW658的构建是通过将含有编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四种利用木糖的基因的两个操纵子P_gapxylAB和P_gaptaltkt经顺序转座事件整合到ZW1(ATCC#31821)的基因组中，然后在含有木糖的选择培养基上进行适应。此前构建了称为8b的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株，如美国专利申请20030162271中所述，这是通过将两个操纵子P_gapxylAxylB和P_enotaltk连同抗生素选择标记一起经同源重组和转座子方法的组合整合到运动发酵单胞菌5C的基因组中，然后进行适应和NTG诱变。在ZW658的制备中，使用了与位点特异性同源重组相反的转座(Epicentre的EZ::Tn体外转座系统)，因为该方法提供了整合位点的多种选择和相对高的插入频率的优点。为了进行整合，将编码木糖利用的四种酶基因进行排列，作为两个分离的操纵子P_gapxylAB和P_gap taltkt进行克隆。将抗生素抗性标记连接到每个操纵子上用于整合体的选择，所述抗生素抗性标记是氯霉素抗性(Cm^r)基因，其侧接两个P1噬菌体Cre-重组酶识别序列(loxP)。两个操纵子的整合是通过两个步骤以顺序方式完成的：P _gap taltkt，然后是P_gapxylAB。在两个整合事件中都使用Cm抗性，因为在每次整合后通过在质粒上表达Cre重组酶然后通过加工质粒就可将它去除。该方法使得能够使用同一抗生素标记进行多次选择。更重要的是，它使得能够将为选择操纵子的整合而引入的抗生素标记去除。该方法消除了抗生素抗性基因对用于商业用途的发酵菌株的负面影响。

用于转座的pMODP _gap taltktCm的构建

如美国专利申请20030162271(其中的实施例9)中所述，经BglII/Xbal消化从pUCtaltkt(美国专利申请20030162271)分离了含有来自大肠杆菌的转酮醇酶(ktk)编码区的2.2kb DNA片段，将其克隆到用BamHI/Xbal消化的pMOD(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)载体中，得到pMODtkt。如下将运动发酵单胞菌gap基因的启动子区(Pgap，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)融合到大肠杆菌转醛醇酶(tal)的编码区，产生称为P_gaptal的PCR片段。使用引物SEQ ID NO：1和2从pZB4扩增P_gap片段，pZB4的构建描述在US 5514583(实施例3)中。pZB4含有P_gap-xylA/xylB操纵子和P_ENO-tal/tkt操纵子。使用引物SEQ ID NO：3和4从pZB4扩增tal编码区片段。使用P_gap和tal片段作为模板，使用引物SEQ ID NO：5和6扩增P_gaptal片段。用Xbal消化该片段，将其克隆到质粒pMODtkt的tkt编码区上游。使用Cmlox(F，sfi)和Cmlox(R，sfi)引物(SEQ ID NO：7和8)以及pZB186作为模板，通过PCR产生loxP::Cm片段。PZB186是天然运动发酵单胞菌质粒和pACYC184的组合，描述在US514583(实施例3)和Zhang et al.((1995)Science 267：240-243)中。最后，将loxP::CmPCR片段插入到含有P_gaptaltkt的质粒的SfiI位点中，形成整合质粒pMODP_gaptaltktCm(图2)。在该质粒中，P_gaptaltkt loxP::Cm片段被插入在pMOD载体的两个嵌合末端(转座酶结合位点)之间。pMODP_gaptaltktCm质粒的完整核苷酸序列在SEQ ID NO：9中给出。

pMODP _gap taltktCm在ZW1中的转座和转化

质粒pMOD是基于pUC的载体，因此是发酵单胞菌中不复制的载体。在Mg²⁺存在下用转座酶室温下处理质粒pMODP_gaptaltktCm一小时，通过电穿孔将其用于转化ZW1细胞(使用BioRad Gene Pulser，设定在200ohms、25μF和16kV/cm)。将电穿孔过的细胞在接合培养基(MM)中于30℃温育6小时，该培养基由补充了50g/L葡萄糖和1mM MgSO₄的10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH)₂SO₄、0.2g/L KH₂PO₄)组成。将转化混合物铺板在含有15g/L Bacto琼脂的琼脂平板上的补充50g/L葡萄糖和120μg/mL氯霉素MM中，在30℃厌氧培养。大约2天后转化体是可见的。转化/转座频率是大约3×10¹/μg DNA。

一共获得39个Cm^r转化体。挑选二十一个菌落，通过PCR和酶活性测定进行进一步分析。使用引物SEQ ID NO：10和11的PCR确认了转化体中含有tal和tkt编码区的3kb DNA片段的存在。用来自21个整合体菌落的质粒DNA进行的反向转化(back transformation)并不在大肠杆菌中产生反向转化体，这表明tal和tkt整合到了ZW1的基因组中。使用用于微量滴定板的修正流程(“一般方法”)测试这些整合体的转醛醇酶和转酮醇酶活性。使用Pierce BCA蛋白测定确定蛋白浓度。将转化体在30℃下生长在50ml锥形离心管中的含有2％(w/v)葡萄糖并补充120μg/ml氯霉素的RM中。对照菌株8b和ZW1也生长(用于ZW1的RM+2％葡萄糖)用于酶测定。当OD₆₀₀达到1.0时收获细胞。将细胞漂洗一次，重悬浮在超声处理缓冲液(10mM Tris-HCI，pH 7.6和10mM MgCl₂)中。按照美国专利申请20030162271所述进行酶测定。设定单位为μ摩尔/min-mg。所有样品都有转醛醇酶和转酮醇酶活性，除了一个例外。

使用tkt探针在用PstI消化的所选整合体的基因组和质粒DNA上进行Southern杂交。ZW1DNA不会与tkt探针杂交。在所有的整合体基因组DNA样品中可见到共同的1.5kb条带，这是tkt中的PstI位点和tal中的PstI位点之间预期的DNA片段。第二条可见的高分子量(6kb或更大)条带在独立系T2、T3、T4和T5之间是独特的，这表明每个系中的基因组整合位点是分开的。令人感兴趣的是，T5的质粒和基因组DNA都与tkt探针杂交，这表明P_gaptaltkt可能也在天然质粒上整合到了T5中。选择这四种菌株(T2、T3、T4和T5)进行进一步的Cre处理以去除Cm^r标记。

进行Cre处理从taltkt整合体中去除Cm ^r 标记

为去除Cm^r标记，用携带具有壮观霉素抗性标记的Cre表达盒的发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pZB188[Zhang et al.(1995)Science267：240-243；US 5514583]的衍生物(pZB188aadACreF)转化T2、T3、T4和T5。在补充了2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的MM琼脂平板上选择转化体。在补充了2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的RM琼脂平板和补充了2％葡萄糖和120μg/mL Cm的RM琼脂平板上挑选Sp^r抗性菌落。所挑选的菌落百分之百都是Cm^s，这显示了Cre对Cm^r的高效切除。在RM+2％葡萄糖中于37℃培养Sp^rCm^s转化体2到5天，每天都转移用于加工pZB188aadACreF。在每次转移时，将细胞稀释，铺板在RM+2％葡萄糖的琼脂平板上，用于挑选到含有或不含200μg/mLSp的同样培养基的另外的平板上。经PCR分析Sp^s菌落以确认丢失了pZB188aadACreF。将经过质粒加工的整合体后代命名为T2C、T3C、T4C和T5C。为检验这些转座整合体是否是稳定的，将这四种菌株生长在RM+2％葡萄糖中，然后转移到10ml的同样培养基中，在37℃下双份试管中生长。每天转移细胞，进行十天或者大约100代。稀释菌落，铺板到RMG平板上，用于第一次和第十次转移后的菌落分离。使用5’P_gap和3’tkt引物(SEQ ID NO：1和11)通过菌落PCR测试来自每个菌株的每次转移的十二个菌落中P_gaptaltkt的阳性存在。对第一次和第十次转移后的分离物也测定了转醛醇酶和转酮醇酶活性(如“一般方法”中所述)。在非选择性培养基上生长100代之后，所有4种整合体都具有相似水平的TAL和TKT活性，这表明这些整合体是遗传上稳定的。

用于转座的pMODP _gap xylABCm的构建

下一步就是进一步将P_gapxylaB loxP::Cm操纵子整合到ZW1::P_gaptaltkt整合体(T2C、T3C、T4C和T5C)中。整合质粒pMODP_gapxylABCm(图3)是基于质粒pMODP_gaptaltktCm(图2)构建的。经SacI/SfiI消化去除P_gaptaltkt DNA片段。通过连接引入含有SacI、NotI和SfiI限制位点的衔接子片段。然后将分离自pZB4(US 5514583)的P_gapxylAB的NotI片段克隆到衔接子的NotI位点中。木糖异构酶(XI)由xylA编码，木酮糖激酶(XK)由xylB编码。pMODP_gapxylaBCm质粒的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：12中。

pMODP _gap xylABCm在T2C、T3C、T4C和T5C中的转座和转化

使用类似于P_gaptaltktCm整合的方法，用经转座酶处理的pMODP_gapxylABCm(如上所述)转化/转座T2C、T3C、T4C和T5C。在Cm选择后的2个转化/转座实验中获得了六个整合体(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1和T5CCmX2)。所有整合体都使用两组引物SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16经PCR确认了xylAB的存在，T2CcmX1和T2CcmX6除外，使用引物SEQID NO：13和14没有在它们中检测到PCR片段。

分析了整合体(包括2个PCR阴性系)的XI、XK、TAL和TKT活性(一般方法)。示于图4和5中的结果表明六个xylAB整合体T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1和T5CCmX2都具有XI、XK、TAL和TKT活性。与阴性亲本对照相比，XI和XK活性是新获得的(图4)。如同亲本对照中那样保持了TAL和TKT活性。所有结果都表明制备了蛋白质并且是有功能的。酶活性水平是可变的，TI和XK活性类似于用同样质粒转化/转座的ZW1整合体的TI和XK活性。XI、XK、TAL和TKT活性水平比菌株8b中的更低。

经Southern杂交确认了xylAB操纵子的整合。用SphI消化6个系的基因组DNA和质粒DNA，与地高辛标记的xylB探针杂交。在所有基因组DNA样品中都存在大约3kb的共同条带，它产生自xylB中的SphI位点和pMOD载体上相邻克隆位点中的另一SphI位点，此外，基因组DNA样品中更高分子量的杂交条带表明染色体中存在P_gapxylAB操纵子的四个整合位点。T3CCmX1和T3CCmX2似乎有同样的整合位点，T3CCmX3和T4CCmX1可能有同样的整合位点，T5CCmX1和T5CCmX2各自有独立的整合位点。用PstI消化同样的DNA，然后用tkt探针进行Southern杂交，证明每个整合体都有与它们各自的亲本菌株相同的杂交模式。

ZW1::P _gap taltktP _gap xylABCm整合体在木糖培养基上的适应

尽管存在用于木糖利用的四种酶活性，然而我们先前的观察结果(美国专利申请20030162271)显示整合体可能不在木糖上立即生长。在木糖上的生长可能发生在木糖培养基上(在试管中或者是在平板上)的长期培养之后，这个过程称为适应。

如下进行菌株适应。将ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm整合体菌株接种到含有RMX(含有10g/l酵母提取物、2g/l KH₂PO₄、20g/l或2％(w/v)木糖)以及RMGX(带有0.025％(w/v)葡萄糖、4％(w/v)木糖的RM)的试管和平板中。使用低水平葡萄糖来支持初始生长以增加适应过程中的突变机会。在培养物和平板中的木糖上进行了至少五次适应的尝试，其中一次成功了。在30℃厌氧培养10天之后，在用T3CCmX1和T3CCmX2细胞铺板的MMGX上分别可见到17和19个菌落。菌落很小，在平板上看起来是不健康的(透明的)。在RMGCm120中接种了十二个菌落(四个来自T3CCmX1铺板：T3CCmX11、T3CCmX12、T3CCmX13和T3CCmX110；八个来自T3CCmX2铺板：T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211和T3CCmX212)，转移到3ml的RMX中进行进一步适应以获得能够在木糖上更快生长的系。

整合体在含有3ml RMX的试管中进行的适应是在30℃进行的。在Spectronic 601分光光度计中不间断监测OD₆₀₀。当生长达到对数中期时，将培养物转移到新鲜RMX管中。继续该过程进行7次转移。生长速度和最终OD(非线性读数)随转移次数而提高了。

在第6次转移时，将培养物划线在RMX平板上以分离单个菌落。三个整合体在RMX划线的平板上比其它整合体生长更快：T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27，它们在下面的表格和论述中被称为X13、X26和X27。为筛选最好的木糖生长菌，我们为TX13、X26和X27各自选择了四个大菌落(L1-4)和四个小菌落(S1-4)，将这些菌落生长在RMX试管中，以便我们能够监测生长、糖利用以及乙醇产量。将菌落在30℃下过夜生长，然后在OD₆₀₀＝0.05时一式两份接种到试管中的3mlRMX中。X27在RMG中比其它培养物生长更慢，6.5小时后将它再次接种。69小时(对于X27为62.5小时)后，取样进行HPLC分析(一般方法)。图6图示了培养物在69小时(对于所有X27培养物为62.5小时)时的平均乙醇产量(％理论产量)和木糖利用(％)。在大菌落和小菌落之间没有显著差异。尽管在木糖上X27的性能比X26更好，然而它在葡萄糖上显示出更慢的生长。因此，选择了最佳性能菌，即X13(X13L3)和X26(X26L1)的大菌落在控制pH的发酵中进行进一步评估。菌株X13L3和X26L1以及对照菌株8b的发酵是在RMG(6％葡萄糖)、RMX(6％木糖)和RMGX(8％∶4％；葡萄糖∶木糖)中于37℃下进行的。生长在RMG(6％)和RMGX(8％∶4％)中的X13L3和X26L1进行的葡萄糖发酵是相当快的。与菌株8b相比，X13L13和X26L1在RMGX(8％∶4％)中的木糖发酵更慢。此外，对于X13L3和X26L1，37℃下在RMX(6％)上的生长是在长的延迟后发生的。从RMX(6％)发酵中回收了几个分离物，即X13b、X13c和X13FL。这些分离物与原始菌株X13a(X13L3的分离物)和X26一起都进行该实施例前述的Cre处理，以从ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm菌株中去除Cm^r标记。所得到的经Cre处理的、不含Cm^r的整合体被命名为X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。

整合体在木糖培养基中通过37℃下在RMX(5％)中的连续转移进行适应

如早先所述，初始ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm菌株在RMX上于30℃进行的适应极大地改善了菌株在这些条件下的生长。然而，适应的菌株在RMX(6％)上于37℃进行的生长和发酵期间经历了很长的延迟。为进一步改善整合体以在优选处理条件包括更高的糖浓度和温度下进行木糖发酵，在RMX(5％)中于37℃下继续进化或适应过程。进行连续转移，选择最好的生长菌。用于该过程的整合体包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。这5个菌株生长在30℃的RMX中进行6次转移，然后转移到37℃的RMX(5％)中再进行5到16次转移。在所有转移期间和之后，将培养物在RMX平板上划线，于37℃培养以分离单个菌落。进一步将大菌落在RMX平板上划线，于37℃培养3到4次以纯化菌落。选择最终的大菌落用于在37℃的RMX(5％)中进行生长测试。

对来自37℃下在RMX(5％)培养基中进行的适应的菌株进行评估

在经连续转移而适应后分离了十八个菌落，在RMX(5％)试管中于37℃初步测试。选择十二个菌落进行第二次试管评估。在所有评估中包括菌株8b用于比较。将这18个菌落在RMG中生长过夜，离心，将细胞接种到37℃的4ml RMX(5％)中，静止地在试管中进行第一次评估。根据生长(OD₆₀₀，非线性的)和终点HPLC结果(低残留的木糖和高的乙醇)，选择12个菌株进行第二次评估。

第二次评估的目的之一是测试菌株在木糖上的改进的生长的稳定性和木糖利用能力。所有12个菌株都进行了稳定性研究以发现适应后的菌株在暴露于非选择性培养基(它们在其中于37℃下连续转移50代)后是否是稳定的。将RMG(5％)转移之前和之后的培养物接种在RMX(5％)试管中，于37℃下生长以进行评估。通过试管在Spectronic 601分光光度计中的直接读数来监测非线性OD。在RMG中生长50代之前和之后，在RMX(5％)中生长70小时时的OD图示在图7中。结果显示大多数菌株在37℃的RMG中生长50代后是稳定的。也按照一般方法中所述经HPLC分析了终点(稳定期)上清液的木糖和乙醇浓度。这些培养物中的低残留木糖和高乙醇浓度支持了菌株很好的生长并发酵木糖的事实。

根据上述试管评估的结果(低残留的木糖，高浓度的乙醇以及更高的OD)以及随后的用高浓度葡萄糖和/或木糖(最高达20％)及葡萄糖和木糖的混合物与乙酸盐进行的微量滴定板生长筛选来选择在高糖和乙酸盐存在下的更好生长菌，焦点就指向了菌株#26，命名为ZW658，其显示了最好的总体性能。

实施例2

改进了木糖利用的最佳菌株在37℃下的发酵评估

下面的实施例说明了改进了木糖利用的发酵单胞菌菌株ZW658在模拟生物质水解物中预期的糖浓度和乙酸水平的发酵条件下的发酵性能。将菌株ZW658接种到含有补充了10％葡萄糖(RMG10％)、8％木糖(RMX8％)、10％葡萄糖+8％木糖(RMGX10％8％)和10％葡萄糖+8％木糖+0.6％乙酸(RMGXAc10％8％0.6％)的RM培养基的发酵罐中。所有发酵都在含有300ml培养基的Sixfors中于150rpm、pH5.5和37℃下进行。将氮气吹过发酵罐中的培养基过夜，在即将接种之前停止。在发酵期间不吹氮气。用于发酵的接种物是将工作原种在RMG5％中复苏后用RMGX(10％，4％)在37℃下于摇瓶(150rpm)中制备的。将菌株8b用作同样条件下的对照。定期取样测定OD₆₀₀并进行葡萄糖、木糖、木糖醇和乙醇的HPLC分析(如一般方法所述)。如图8所示，ZW658与8b相比，在RMG10％上生长更慢(A和B)，在RMX8％上以与8b类似的速度生长(C和D)。尽管生长速度更慢，但图8显示在葡萄糖培养基中发酵结束时，ZW658的乙醇产量(93％)是与8b的产量类似的。在RMX8％培养基中，ZW658的乙醇产量(0.46g乙醇/g糖)比8b(0.44g乙醇/g糖)更高。在RMX8％中，ZW658产生的乙醇比8b多大约4g/l。有趣的是，在RMX8％中的发酵结束时，ZW658不产生任何木糖醇，而8b产生了低水平的木糖醇(0.7g/l)。图9中显示的数据表明，与8b相比，ZW658在含有(C、D)或不含(A、B)乙酸盐的10％葡萄糖+8％木糖的发酵中表现更好，这是通过更多葡萄糖和木糖消耗、更少木糖醇产生以及更高乙醇产量所显示的。两种菌株在RMG10％X8％中于37℃和pH5.5的发酵结束时，大多数的葡萄糖被使用了，基本上剩下的都是残留的木糖，尽管ZW658使用的木糖比8b多8g/l。ZW658在RMG10％X8％中于37℃和pH5.5的发酵结束时的木糖醇产量(4.9g/l)比8b的木糖醇产量(8.2g/l)明显更低。在乙酸盐(6g/l)存在时，两种菌株的细胞生长都显著降低了，导致了在葡萄糖和木糖两者中的不良发酵性能，尽管从更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木糖醇产生和更高的乙醇产量方面来说，ZW658显示了稍微更好的发酵性能。与在RMX8％中不一样，两种菌株在含有或不含乙酸盐的RMG10％X8％中都产生了副产物木糖醇，尽管ZW658比8b产生的木糖醇更少。两种菌株的发酵性能总结在表1中。总的来说，ZW658在纯糖发酵中比8b表现更好。如实施例1所述，ZW658没有抗生素选择标记，这对于商业应用中的发酵生物来说是有价值的性质

表1.用于乙醇生产的ZW658和8b的发酵性能总结

乙醇产量体积产量乙醇 CPIg乙醇/g糖 g/l/h g/l g/g
	8b(Glu) 0.47 5.15 52 21ZW658(Glu) 0.48 4.13 52 158b(Xyl) 0.44 1.66 37 24ZW658(Xyl) 0.46 1.83 41 238b(Glu Xyl) 0.43 1.80 58 52ZW658(Glu Xyl) 0.45 2.03 65 358b(Glu Xyl Ac) 0.46 0.67 48 136ZW658(Glu Xyl Ac) 0.47 1.04 50 90

CPI是细胞生产力指数：g乙醇/g干细胞重

实施例3

由存在和不存在山梨糖醇的条件下生长在高浓度葡萄糖或木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在四个灭菌的125ml Erlenmeyer培养瓶(Cat.No.30180-036，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的10ml ZW658菌株种子培养物接种到含有100ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、4g/L KHCO₃。接种前，第一个瓶中还含有200g/L葡萄糖和20mM山梨糖醇，而第二个瓶中只含有200g/L葡萄糖。第三个瓶中含有200g/L木糖和20mM山梨糖醇，而第四个瓶中只含有200g/L木糖。接种后，将糖浓度稀释到大约180g/L。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃下进行发酵，不控制pH。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图10A显示了0和48小时之间的时间点的OD₆₀₀。48小时后，第一、二、三和四瓶的OD₆₀₀分别是9.94、6.46、5.37和5.45。这些结果显示山梨糖醇明显刺激了高浓度葡萄糖培养物中的生长，但是对高浓度木糖培养物中的生长几乎没有显示影响。

图10B的结果显示，含有山梨糖醇时，葡萄糖中的乙醇生产更快，但是含有和不含山梨糖醇的培养物中的乙醇都在大约20小时后达到了同样的水平。在只有木糖的培养基中，含有和不含山梨糖醇的情况下，乙醇生产速度相同，含有山梨糖醇的样品在第48小时时产生的乙醇比不含山梨糖醇的样品所产生的少。在任何这些培养物中都没有产生木糖醇。

实施例4

由山梨糖醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在灭菌的1升发酵罐(

B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中，将光密度为大约5(在600nm测定)的50ml ZW658菌株种子培养物接种到含有糖和培养基的450ml水溶液中。最终的混合培养液中含有100g/L葡萄糖、85.1g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄和10mM山梨糖醇。用4NKOH溶液调节pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃和pH 5.5下进行发酵。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸盐。也用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图11显示了0和65小时之间的时间点所存在的葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇和乙酸的量以及OD₆₀₀。29小时后，葡萄糖和木糖浓度分别是0和2.08g/L，乙醇浓度达到83.9g/L。细胞生长到13的OD₆₀₀。副产物木糖醇在29小时时的浓度是0.67g/L。在64小时时增加到0.95g/L。

实施例5

由不存在山梨糖醇的条件下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株 ZW658进行的乙醇生产

在灭菌的1升发酵罐(B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中，将光密度为大约5(在600nm测定)的50ml ZW658菌株种子培养物接种到含有糖和培养基的450ml水溶液中。最终的混合培养液中含有103g/L葡萄糖、85.0g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄。用4N KOH溶液调节pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃和pH 5.5下进行发酵。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过“一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇和乙酸盐。也用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图12显示了0和70小时之间的时间点所存在的葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸的量以及OD₆₀₀。葡萄糖浓度直到40小时才达到0，木糖浓度从未降低到2g/L，正如实施例3实验中存在山梨糖醇时一样。在试验结束时，67小时后，木糖仅降低到17.8g/L。木糖醇产量在29小时时是大约0.21g/L，在64小时后增加到3.08g/L，比实施例1实验中所产生的量高3倍多。67小时后，乙醇浓度达到77.2g/L，细胞生长到6.7的OD₆₀₀。

比较实施例3和4，结果显示添加山梨糖醇明显减少了延迟时间，并且改进了糖利用(或吸收)速度、最终乙醇浓度(即产量)以及加倍了生长。产生了更少的木糖醇。

实施例6

由山梨糖醇和乙酸盐存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株 ZW658进行的乙醇生产

在灭菌的1升发酵罐(

B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的50ml ZW658菌株种子培养物接种到含有糖和培养基的450ml水溶液中。最终的混合培养液中含有99.0g/L葡萄糖、82.7g/L木糖、5.8g/L乙酸盐(乙酸钾形式)、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄和10mM山梨糖醇。用4N KOH溶液调节pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃和pH 5.5下进行发酵。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液的中化合物，包括葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸盐。也用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图13显示了0和64小时之间的时间点所存在的葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇和乙酸盐的量以及OD₆₀₀。63.75小时后，葡萄糖和木糖浓度分别是0和29.6g/L，乙醇浓度达到70.0g/L；细胞生长到6.4的OD₆₀₀；副产物木糖醇的浓度是3.55g/L。

实施例7

由存在乙酸盐而不含山梨糖醇的条件下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在灭菌的1升发酵罐(

B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的80ml ZW658菌株种子培养物接种到含有糖和培养基的720ml水溶液中。最终的混合培养液中含有97.2g/L葡萄糖、81.0g/L木糖、5.7g/L乙酸盐(乙酸钾形式)、5g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O。用4N KOH溶液调节pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃和pH 5.5下进行发酵。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇和乙酸。也用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图14显示了0和140小时之间的时间点所存在的葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸的量以及OD₆₀₀。63小时后，葡萄糖和木糖浓度分别是0和50g/L，乙醇浓度达到61.8g/L。细胞生长到3.3的OD₆₀₀。135小时后，木糖浓度达到38g/L，乙醇浓度达到64.4g/L。副产物木糖醇的浓度在63小时时为1.3g/L，135小时后增加到4.4g/L。当将没有山梨糖醇的发酵培养物在稳定期所产生的4.4g/L木糖醇与有山梨糖醇的发酵培养物在稳定期所产生的3.55g/L木糖醇(实施例6)相比时，这些结果表明加入山梨糖醇减少了乙酸盐存在时所产生的木糖醇的量。

实施例8

由谷氨酸盐存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在灭菌的1升发酵罐(B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的50ml ZW658菌株种子培养物接种到含有糖和培养基的450ml水溶液中。最终的混合培养液中含有98.0g/L葡萄糖、81.2g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄和10mM谷氨酸钾。用4N KOH溶液调节pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃和pH 5.5下进行发酵。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇和乙酸。也用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图15显示了0和63.75小时之间的时间点所存在的葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸的量以及OD₆₀₀。谷氨酸盐减少了延迟期，在24小时时葡萄糖浓度达到0。然而，与存在山梨糖醇(实施例4)相比，木糖没有被充分利用，细胞生长和乙醇产量都降低了，而木糖醇产量增加了。63.75小时后，葡萄糖和木糖浓度分别是0和21.2g/L，乙醇浓度达到72.3g/L；细胞生长到6.9的OD₆₀₀；副产物木糖醇的浓度是4.38g/L。这些结果表明谷氨酸盐减少了延迟时间，改进了葡萄糖利用(或吸收)速度，但是与山梨糖醇对木糖利用、细胞生长和木糖醇副产物产量的效果相比，谷氨酸盐的有益效果更小。

实施例9

由各种浓度的山梨糖醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株 ZW658进行的乙醇生产

在五个灭菌的125ml Erlenmeyer培养瓶(Cat.No.30180-036，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约5(在600nm测定)的10mlZW658菌株种子培养物接种到含有100ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有100g/L葡萄糖、80g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/LKH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L MgSO₄·7H2O以及各种浓度的山梨糖醇(0、0.5、1、2和10mM)。接种后，通过种子培养物将总糖浓度稀释到大约160g/L。用4N KOH溶液调节初始pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃下进行发酵，不控制pH。定时取样。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图16显示了0和28小时之间的时间点的OD₆₀₀。含有这个范围内的更高浓度山梨糖醇的培养物生长得更快和更好。14.25小时后，对于0、0.5、1、2和10mM的山梨糖醇浓度，OD₆₀₀分别是4.19、7.10、8.08、8.62和10.1。

实施例10

由最高达200mM的各种浓度的山梨糖醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在五个灭菌的125ml Erlenmeyer培养瓶(Cat.No.30180-036，VWRInternational，USA)中，将光密度(在600nm测定；OD₆₀₀)为大约5的10ml ZW658菌株种子培养物接种到含有100ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有110g/L葡萄糖、90g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/LKH₂PO₄、4g/L KHCO₃以及各种浓度的山梨糖醇(10、20、50、100和200mM)。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃下进行发酵，不控制pH。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的乙醇。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图17显示了0和48小时之间的时间点的OD₆₀₀(A)和所产生的乙醇(B)。24小时后，对于10、20、50、100和200mM的山梨糖醇浓度，OD₆₀₀分别是7.74、7.86、8.04、7.82和7.12。48小时后，对于10、20、50、100和200mM的山梨糖醇浓度，OD₆₀₀分别是8.30、8.26、8.84、8.12和7.72。这些结果显示，含有10-100mM山梨糖醇的培养物生长类似，而含有200mM山梨糖醇的培养物生长稍微更慢些。含有100或200mM山梨糖醇时比含有10、20或50mM山梨糖醇时产生乙醇稍微更慢些，尽管所有的培养物所产生的乙醇都达到了差不多同样的最终量。在任何样品中都没有检测到木糖醇。因此10mM山梨糖醇就足以提供这些条件下的最大乙醇产量。

实施例11

由各种多元醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌ZW658进行的乙醇生产

在五个灭菌的125ml Erlenmeyer培养瓶(Cat.No.30180-036，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的10ml ZW658菌株种子培养物接种到含有100ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有100g/L葡萄糖、80g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、1g/LMgSO₄·7H₂O和4g/L KHCO₃以及10mM的下列多元醇之一：赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇或乳糖醇。接种后。通过种子培养物将总糖浓度稀释到大约160g/L。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃下进行发酵，不控制pH。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、乙醇、木糖醇和乙酸。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图18显示了0和32小时之间的时间点的OD₆₀₀(A)、木糖利用(B)和乙醇产量(C)。有山梨糖醇或甘露糖醇的培养物生长更快和更好。32小时后，补充山梨糖醇或甘露糖醇的培养物的OD₆₀₀分别是13.94和13.92；而补充赤藓糖醇、麦芽糖醇或乳糖醇的培养物的OD₆₀₀分别是9.48、9.02和9.24。培养基中有山梨糖醇或甘露糖醇时，木糖利用更多，乙醇产量也更多。在任何培养物中都没有检测到木糖醇。山梨糖醇或甘露糖醇的存在使得能够更多利用木糖而不产生木糖醇。

本实施例显示，在高浓度糖中，甘露糖醇在改善细胞生长、木糖利用、减少木糖醇和增加乙醇产量方面与同样浓度的山梨糖醇是同样有效的。

实施例12

由乙酸盐和各种多元醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株 ZW658进行的乙醇生产

在五个灭菌的125ml Erlenmeyer培养瓶(Cat.No.30180-036，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约5的10ml ZW658菌株种子培养物接种到含有100ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有100g/L葡萄糖、80g/L木糖、3g/L乙酸盐、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O和4g/L KHCO₃以及10mM的下列多元醇：赤藓糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇或乳糖醇；或者5mM山梨糖醇加上5mM麦芽糖醇，或者5mM山梨糖醇加上5mM乳糖醇。接种后，通过种子培养物将总糖浓度稀释到大约160g/L。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。搅拌速度设定在150rpm。在33℃下进行发酵，不控制pH。定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的化合物，包括葡萄糖、木糖、乙醇和乙酸盐。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。图19显示了0和32小时之间的时间点的OD₆₀₀(A)、木糖利用(B)和乙醇产量(C)。有山梨糖醇或甘露糖醇的培养物比没有任一种这些化合物的培养物生长更快和更好。32小时后，补充10mM山梨糖醇、10mM甘露糖醇、5mM山梨糖醇加上5mM麦芽糖醇以及5mM山梨糖醇加上5mM乳糖醇的培养物的OD₆₀₀分别是7.88、7.40、7.62和7.78；补充赤藓糖醇、麦芽糖醇或乳糖醇的培养物的OD₆₀₀分别是5.20、5.20和5.30。培养基中有山梨糖醇或甘露糖醇时，木糖利用更多，乙醇产量也更多。在任何培养物中都没有检测到木糖醇。山梨糖醇或甘露糖醇的存在使得能够更多利用木糖而不产生木糖醇。

本实施例显示，在含有乙酸盐的高浓度糖中，甘露糖醇在改善细胞生长、木糖利用、减少木糖醇和增加乙醇产量方面与同样浓度的山梨糖醇是同样有效的。山梨糖醇与更高分子量的多元醇(麦芽糖醇或乳糖醇)的组合没有显示出对发酵的协同改善。

实施例13

由各种糖醇存在下生长在高浓度葡萄糖和木糖上的菌株ZW658进行的乙醇生产

在八个灭菌的50ml螺帽离心管(Cat.No.21008-178，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约10的200μl ZW658菌株甘油原种接种到有25ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有92g/L葡萄糖、82g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O以及要么是10mM的山梨糖醇、阿拉伯糖醇、侧金盏糖醇(也称为核糖醇)或半乳糖醇；要么是50mM的阿拉伯糖醇、侧金盏糖醇或半乳糖醇。对照不添加糖醇。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。在33℃下进行发酵，控制pH。在0和48小时之间定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液的葡萄糖、木糖、木糖醇和乙醇。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。生长结果和葡萄糖利用结果分别示于图20A和20B中。木糖利用和乙醇产量的结果分别示于图21A和21B中。有山梨糖醇或半乳糖醇的培养物比对照生长更快和更好。有侧金盏糖醇的培养物也生长更好。40小时后，补充山梨糖醇或半乳糖醇的培养物的OD₆₀₀是7到8；补充侧金盏糖醇的培养物的OD₆₀₀是大约5；而其它培养物的OD₆₀₀小于1。培养基中有山梨糖醇或半乳糖醇或侧金盏糖醇时，木糖利用更多，乙醇产量也更多。在任何培养物中都没有检测到木糖醇。山梨糖醇、半乳糖醇或侧金盏糖醇的存在使得能够更多利用木糖而不产生木糖醇。

本实施例显示，在高浓度糖中，半乳糖醇在改善细胞生长、木糖利用、减少木糖醇和增加乙醇产量方面与同样浓度的山梨糖醇是同样有效的。侧金盏糖醇没有山梨糖醇有效。

实施例14

在六个灭菌的50ml螺帽离心管(Cat.No.21008-178，VWRInternational，USA)中，将OD₆₀₀为大约10的200μl ZW658菌株甘油原种接种到含有25ml水溶液的每个瓶中，水溶液中含有92g/L葡萄糖、82g/L木糖、10g/L酵母提取物(YE)、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O和10mM的D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、D-苏糖醇、肌醇或木糖醇。对照不添加糖醇。用4N H₃PO₄溶液调节初始pH到5.5。在33℃下进行发酵，控制pH。在0和48小时之间定时取样。将样品滤过0.22微米过滤器，通过一般方法中描述的HPLC来分析滤液中的葡萄糖、木糖、木糖醇和乙醇。用培养基稀释样品(如一般方法中所述)，测定OD₆₀₀以监测细胞生长。生长结果和葡萄糖利用结果分别示于图22A和22B中。有D-山梨糖醇或L-山梨糖醇的培养物比对照生长更快和更好。48小时后，补充D-山梨糖醇或L-山梨糖醇的培养物的OD₆₀₀分别是6.2和5.2；而其它培养物的OD₆₀₀小于1。培养基中有D-山梨糖醇或L-山梨糖醇时，木糖利用更多，乙醇产量也更多。在任何培养物中都没有检测到木糖醇。D-山梨糖醇或L-山梨糖醇的存在使得能够更多利用木糖而不产生木糖醇。D-山梨糖醇比L-山梨糖醇更有效。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Company

Li，Max

Viitanen，Paul

<120>糖醇存在下含有木糖的混合糖的发酵中改进的乙醇产量

<130>CL3425

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc 44

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

caatttgtcc gtcatgttta ttctcctaac 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gttaggagaa taaacatgac ggacaaattg 30

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc 29

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc 44

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc 29

<210>7

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cagggccgcc taggccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat cctgtgacgg 60

aagatcactt cgc 73

<210>8

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

cagggcctag gcggccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cctgaaccga 60

cgaccgggtc g 71

<210>9

<211>6882

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pMODPgaptaltktCm

<400>9

cggccataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc ctgaaccgac gaccgggtcg 60

aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcacc 120

aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 180

gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 240

atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 300

ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 360

actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 420

ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 480

atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 540

gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 600

ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 660

cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 720

ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 780

atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 840

tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 900

acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 960

atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggataact 1020

tcgtataatg tatgctatac gaagttatgg cctaggcggc ctctagagtc gacctgcagg 1080

catgcaagct tcagggttga gatgtgtata agagacagct gcattaatga atcggccaac 1140

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1200

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1260

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1320

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1380

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1440

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1500

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1560

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1620

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1680

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1740

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 1800

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 1860

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 1920

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 1980

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2040

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2100

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2160

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2220

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2280

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2340

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2400

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2460

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2520

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2580

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2640

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2700

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2760

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2820

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2880

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 2940

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3000

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3060

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 3120

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gagtcgcgcg tttcggtgat 3180

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 3240

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 3300

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 3360

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 3420

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctgtctctt 3480

atacacatct caaccatcat cgatgaattc gagctcggta cccggggatc tgcgcaaacg 3540

gacattatca aggtaataaa aaaggtcgcc gaagcgacct tttttacccg aaatgctaat 3600

tacagcagtt cttttgcttt cgcaacaacg ttatcaacag tgaagccgaa ctcttcaaac 3660

agcagctctg ccggagcaga ttcaccgaag gtggtcatac cgacgatagc accgttcagg 3720

ccaacatact tgtaccagta gtcagcaata cccgcttcta cagcaacgcg tgcagtaacc 3780

gctttcggca gtacggattc acggtaagca gcatcctgct tgtcaaatgc gtcggtagac 3840

gacatggaca ccacgcgcgc tttcacgcct tcggcagtca gtttttcgta ggcagcaaca 3900

gccagttcaa cttctgaacc ggtagcgatg aaaatcagtt ccggctgacc ggcgcagtct 3960

ttcagcacat aaccaccgcg cgcgatgttt gccagttgct cttcagttcg ttcctgctgc 4020

gccaggttct gacgggagag gatcagtgcg gtcgggccgt cctgacgctc aacaccgtat 4080

ttccacgcga ccgcggattc aacctggtca cacggacgcc atgtagacat gttcggggtt 4140

acgcgcagag aagcgacctg ctcaaccggc tggtgagtcg gcccgtcttc gcccagaccg 4200

atggagtcgt gggtgtaaac catcacctga cgctgtttca tcagcgcagc catacgtacg 4260

gcgttacgtg cgtattccac gaacatcagg aaggtggagg tgtacggcag gaagccaccg 4320

tgcagggaga taccgttagc aatcgcggtc ataccgaact cgcgaacacc gtagtggatg 4380

tagttacccg cagcatcttc gttgattgct ttagaaccag accacagggt caggttagac 4440

ggcgccaggt cagcagaacc gccgaggaat tccggcaaca gcggaccgaa cgcttcgata 4500

gcattctgag acgctttacg gctggcgatt ttcgccggat tagcctgcag tttagcgatg 4560

aactctttcg ctttagcgtc gaagtcagac ggcatttcgc ctttcatacg gcgggtaaat 4620

tcagcggctt cctgcggata agctttcgcg taagcagcga atttctcgtt ccatgcggat 4680

tctttcgcct ggcctgcttc tttcgcatcc cactgagcat agatttcaga cgggatttcg 4740

aacggcgcat atttccagcc cagttgttcg cgggtcaggg caatttcagc gtcgcccagc 4800

ggcgcaccgt gggagtcgtg ggtaccggct ttgttcgggg aaccgaaacc gatgatggtt 4860

ttgcacatca gcagggaagg tttgtcagtc actgcgcgcg cttcttctac tgcgcgtttg 4920

atagatgccg cgtcatgacc gtcgatgtcg cgaataacgt gccagccgta agcttcgaaa 4980

cgcattgcgg tgtcgtcggt gaaccagcct tcaacgtgac catcgataga aataccgttg 5040

tcatcgtaga atgcaatcag tttacccagc ttcagcgtac ccgccagaga gcaaacttcg 5100

tgggagatgc cttccatcat gcagccgtcg cccatgaagg cgtaggtgta gtggtcgaca 5160

atgtcgtggc ccggacggtt aaactgcgcc gccagcgttt tttctgcaat cgccataccg 5220

actgcgttgg caataccctg acccagcgga ccggtggtgg tttccacacc cagcggtgta 5280

accccacttt ccgggtgacc cggagtttta gagtgcagct gacggaagtt tttcagttct 5340

tccatcggca gatcgtaacc ggtgaggtgc agcaggctgt agatcagcat ggagccgtgg 5400

ccgttggaca gcacgaagcg gtcacggtca gcccaggacg gattctgcgg gttgtgtttc 5460

aggaaatcac gccacaggac ttcggcaatg tcagccatac ccataggggc ccccgggtga 5520

ccggatttgg ctttctgtac tgcgtccatg ctcagcgcac gaatagcatt ggcaagctct 5580

ttacgtgagg acattttgac tccagatcgt ctagattaca gcagatcgcc gatcattttt 5640

tccagttttt cctggtcaat agcaaactta cggatacctt ccgccagttt atctactgcc 5700

attggatcct ggttgtgctg ccacaggaac tcggactcag tgatacgcgc cggacgcgct 5760

ttcacttcgc cggtgtaaga cagtttacgt tcgatagccc cttcgctctc cgccagctct 5820

ttcagcagtg ccggtgcgat ggtcagacgg tcgcagcctg ccagttccag aatttcgccg 5880

atgttacgga agcttgcgcc cataaccacg gtttcataac cgtgctcttt gtagtactgg 5940

tagatttcag atacagaaac cacgcccgga tcttctgccg gagcgtactc tttcttatcg 6000

gtattcgctt tgtaccagtc aagaatacgg ccaacaaacg gcgagatcag gaacacgccc 6060

gcttccgcac aagcacgagc ctgagcgaag gagaacagca gggtcaggtt acagttgatg 6120

ccttcttttt ccagctgttc tgcagcacgg ataccctgcc aggtagaagc cagtttgatc 6180

agaatacgat cgttgctaat accagcatcg ttgtagagtt tgatcaggcg ttttgctttc 6240

gcaattgacg cttcggtgtc ataggaaaga cgcgcatcaa cttcagttga gatacggccc 6300

ggaaccagtt tcaggatttc cagaccaata tttactgcca gtttgtcggt cgcgtccacg 6360

atctgctgcg cgcgatcgtt gctctgctgt ttcgcccagg cgacagcatc atcaatcaac 6420

ttacggtatt ccggaatctg cgctgcgtta agaatgagag aagggttggt tgtggcatcc 6480

tgcggttgat acagcttcat tgccgcgatg tccccagtgt cggccactac ggtggtgtac 6540

tgacgaaggg aggtcaattt gtccgtcatg tttattctcc taacttatta agtagctatt 6600

atattccata gctatttttt aacgtgccga cttaccggcg atcgcggcca acaccttgtt 6660

cgtgatgccg actgcggtca agccgaaatg agcatataga tcattcgccg gggccgatgc 6720

accaaaaaca tcaataccat aacgaagacc atttattcca gtataccgtt cccagccaat 6780

tgtcgtccct gcttcgatcg aaacgcgtaa aattgtcgat tgaggctgat cgggcaaaac 6840

atcattacga taggattcgg gttgttgatc gaacggccta gg 6882

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

atgacggaca aattgacc 18

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

agatctgcgc aaacggacat tatcaagg 28

<210>12

<211>7996

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pMODPgapxylABCm

<400>12

ggccgcggcc taggcggcca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatcctgaac 60

cgacgaccgg gtcgaatttg ctttcgaatt tctgccattc atccgcttat tatcacttat 120

tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 180

ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 240

tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 300

taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 360

tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 420

cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 480

agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 540

tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 600

attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 660

ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 720

acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 780

tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 840

ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta 900

tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc 960

cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc 1020

gtcacaggat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atggcctagg cggcctctag 1080

agtcgacctg caggcatgca agcttcaggg ttgagatgtg tataagagac agctgcatta 1140

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 1200

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 1560

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 1620

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 1680

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 1740

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 1800

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 1860

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 1920

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 1980

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 2040

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 2100

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 2160

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 2220

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 2280

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 2340

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 2400

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 2460

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 2520

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 2580

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 2640

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 2700

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 2760

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 2820

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 2880

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 2940

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 3000

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 3060

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 3120

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgagtcg 3180

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 3240

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 3300

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 3360

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 3420

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 3480

gccagctgtc tcttatacac atctcaacca tcatcgatga attcgagctc gcggccgcgt 3540

tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct caatcgacaa 3600

ttttacgcgt ttcgatcgaa gcagggacga caattggctg ggaacggtat actggaataa 3660

atggtcttcg ttatggtatt gatgtttttg gtgcatcggc cccggcgaat gatctatatg 3720

ctcatttcgg cttgaccgca gtcggcatca cgaacaaggt gttggccgcg atcgccggta 3780

agtcggcacg ttaaaaaata gctatggaat ataatagcta cttaataagt taggagaata 3840

aacatgcaag cctattttga ccagctcgat cgcgttcgtt atgaaggctc aaaatcctca 3900

aacccgttag cattccgtca ctacaatccc gacgaactgg tgttgggtaa gcgtatggaa 3960

gagcacttgc gttttgccgc ctgctactgg cacaccttct gctggaacgg ggcggatatg 4020

tttggtgtgg gggcgtttaa tcgtccgtgg cagcagcctg gtgaggcact ggcgttggcg 4080

aagcgtaaag cagatgtcgc atttgagttt ttccacaagt tacatgtgcc attttattgc 4140

ttccacgatg tggatgtttc ccctgagggc gcgtcgttaa aagagtacat caataatttt 4200

gcgcaaatgg ttgatgtcct ggcaggcaag caagaagaga gcggcgtgaa gctgctgtgg 4260

ggaacggcca actgctttac aaaccctcgc tacggcgcgg gtgcggcgac gaacccagat 4320

cctgaagtct tcagctgggc ggcaacgcaa gttgttacag cgatggaagc aacccataaa 4380

ttgggcggtg aaaactatgt cctgtggggc ggtcgtgaag gttacgaaac gctgttaaat 4440

accgacttgc gtcaggagcg tgaacaactg ggccgcttta tgcagatggt ggttgagcat 4500

aaacataaaa tcggtttcca gggcacgttg cttatcgaac cgaaaccgca agaaccgacc 4560

aaacatcaat atgattacga tgccgcgacg gtctatggct tcctgaaaca gtttggtctg 4620

gaaaaagaga ttaaactgaa cattgaagct aaccacgcga cgctggcagg tcactctttc 4680

catcatgaaa tagccaccgc cattgcgctt ggcctgttcg gttctgtcga cgccaaccgt 4740

ggcgatgcgc aactgggctg ggacaccgac cagttcccga acagtgtgga agagaatgcg 4800

ctggtgatgt atgaaattct caaagcaggc ggtttcacca ccggtggtct gaacttcgat 4860

gccaaagtac gtcgtcaaag tactgataaa tatgatctgt tttacggtca tatcggcgcg 4920

atggatacga tggcactggc gctgaaaatt gcagcgcgca tgattgaaga tggcgagctg 4980

gataaacgca tcgcgcagcg ttattccggc tggaatagcg aattgggcca gcaaatcctg 5040

aaaggccaaa tgtcactggc agatttagcc aaatatgctc aggaacatca tttgtctccg 5100

gtgcatcaga gtggtcgcca ggaacaactg gaaaatctgg taaaccatta tctgttcgac 5160

aaataacggc taactgtgca gtccgttggc ccggttatcg gtagcgatac cgggcatttt 5220

tttaaggaac gatcgatatg tatatcggga tagatcttgg cacctcgggc gtaaaagtta 5280

ttttgctcaa cgagcagggt gaggtggttg ctgcgcaaac ggaaaagctg accgtttcgc 5340

gcccgcatcc actctggtcg gaacaagacc cggaacagtg gtggcaggca actgatcgcg 5400

caatgaaagc tctgggcgat cagcattctc tgcaggacgt taaagcattg ggtattgccg 5460

gccagatgca cggagcaacc ttgctggatg ctcagcaacg ggtgttacgc cctgccattt 5520

tgtggaacga cgggcgctgt gcgcaagagt gcactttgct ggaagcgcga gttccgcaat 5580

cgcgggtgat taccggcaac ctgatgatgc ccggatttac tgcgcctaaa ttgctatggg 5640

ttcagcggca tgagccggag atattccgtc aaatcgacaa agtattatta ccgaaagatt 5700

acttgcgtct gcgtatgacg ggggagtttg ccagcgatat gtctgacgca gctggcacca 5760

tgtggctgga tgtcgcaaag cgtgactgga gtgacgtcat gctgcaggct tgcgacttat 5820

ctcgtgacca gatgcccgca ttatacgaag gcagcgaaat tactggtgct ttgttacctg 5880

aagttgcgaa agcgtggggt atggcgacgg tgccagttgt cgcaggcggt ggcgacaatg 5940

cagctggtgc agttggtgtg ggaatggttg atgctaatca ggcaatgtta tcgctgggga 6000

cgtcgggggt ctattttgct gtcagcgaag ggttcttaag caagccagaa agcgccgtac 6060

atagcttttg ccatgcgcta ccgcaacgtt ggcatttaat gtctgtgatg ctgagtgcag 6120

cgtcgtgtct ggattgggcc gcgaaattaa ccggcctgag caatgtccca gctttaatcg 6180

ctgcagctca acaggctgat gaaagtgccg agccagtttg gtttctgcct tatctttccg 6240

gcgagcgtac gccacacaat aatccccagg cgaagggggt tttctttggt ttgactcatc 6300

aacatggccc caatgaactg gcgcgagcag tgctggaagg cgtgggttat gcgctggcag 6360

atggcatgga tgtcgtgcat gcctgcggta ttaaaccgca aagtgttacg ttgattgggg 6420

gcggggcgcg tagtgagtac tggcgtcaga tgctggcgga tatcagcggt cagcagctcg 6480

attaccgtac ggggggggat gtggggccag cactgggcgc agcaaggctg gcgcagatcg 6540

cggcgaatcc agagaaatcg ctcattgaat tgttgccgca actaccgtta gaacagtcgc 6600

atctaccaga tgcgcagcgt tatgccgctt atcagccacg acgagaaacg ttccgtcgcc 6660

tctatcagca acttctgcca ttaatggcgt aaacgttatc ccctgcctga ccgggtgggg 6720

gataattcac atctatatat ctcagtaatt aattaatatt tagtatgaat ttattctgaa 6780

aatcatttgt taatggcatt tttcagtttt gtctttcgtt ggttactcgt aatgtatcgc 6840

tggtagatat ggagatcgtt atgaaaacct caaagactgt ggcaaaacta ttatttgttg 6900

tcggggcgct ggtttatctg gttgggctat ggatctcatg cccattgtta agtggaaaag 6960

gctattttct tggcgtgtta atgacagcaa cttttggcaa ctatgcaagc ttgtttggtg 7020

cagtagcggt gcagaaaaat attcgtgatg ccggaataaa cccaccaaaa gaaacacagg 7080

ttacccagga agaatacagc gaataactca cgtaagcccg gtcagtccaa tgtgaccggg 7140

cttttactta actcactaat ctgtttctgt cgattcgttg taccagcata gaaagtaaca 7200

aactcgctgc caacgtcgcg caaaagatcc aaataatatc cagtattggc caatttttaa 7260

gctcaattcc ccgggtgcgc agcgcatgga taatcaaggc gtggaatccg tatataccca 7320

atgaatggcg ggagattaag ccaagtccgc gaatggtacg cgtatccagc gtgtttttaa 7380

ccagagtcaa tagcgcgatt gcgcagataa aaaccatcgg cccacagtaa agataccagg 7440

tatcggcaaa atttccgcgc cactgcaatt catataatgt cccgcgagag ataataaaaa 7500

cccccgtcgc aaacagcgcg gcgttcaccc acgacagtgc tttatgctgt gtgtccatca 7560

tccctatagc gcggcccaac atgccataca gaatgtagta aaaagtatcg ccattgatat 7620

ataagttaat tggcagccat tcaaaaccgt caattttctg cggcactgtg tttgggttag 7680

cgataatgcc aatcaccgcc attagcacca gcaacatttt tccgccgacg ttcttcacct 7740

gaatcagcgg tgaaaccaga taaatcaccg caatcgcgaa gaaaaaccac aagtggtaaa 7800

acactggctt ttgcagcagg tttttcagcg ctaactccat attgatggag gtaaacagcg 7860

caatgtagag cagtgcgatt gcgctataaa aaatcagaca taagccgata cgcaagaaat 7920

ggcgcggctg ggcgctgcgt tcgccaaaaa agagatagcc ggaaatcatg aaaaatagcg 7980

gcacgctgac acgagc 7996

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

cgatcaacaa cccgaatcct atcg 24

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gccgttattt gtcgaacaga taatgg 26

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

tatgggttca gcggcatgag 20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

atgggcatga gatccatagc c 21

Claims

1.用于改进乙醇产量的方法，包括：

(a)提供重组发酵单胞菌细胞，所述细胞将木糖转化为乙醇，并且其中引入了编码以下酶的基因：

i)木糖异构酶，

ii)木酮糖激酶，

iii)转醛醇酶；和

iv)转酮醇酶；

(b)提供合适的培养基，该培养基包含(i)含有木糖和葡萄糖的混合糖组合物，以及(ii)至少一种选自山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇和核糖醇的糖醇，其中任意所述糖醇的浓度是5mM-20mM；以及

(c)使步骤(a)的发酵单胞菌细胞与步骤(b)的培养基接触，由此发酵单胞菌细胞生产乙醇。

2.权利要求1的方法，其中通过(b)的糖醇的存在改进了重组发酵单胞菌将木糖转化为乙醇的性能。

3.权利要求1的方法，其中重组发酵单胞菌是ATCC保藏号为PTA-7858的ZW658。

4.利用木糖的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ZW658，其ATCC保藏号为PTA-7858。